·论著·Toll样受体7、9及其调控分子MyD88、NF?κB
在白癜风患者外周血单个核细胞中的表达
唐亚平盛文婷周欣黎小东田歆钟金宝李振洁林春生刘玉梅
510095广州市皮肤病防治所皮肤科（唐亚平、周欣、黎小东、田歆、钟金宝、李振洁、
林春生、刘玉梅）；广州市红十字会医院皮肤科（盛文婷）
通信作者：唐亚平，Email：tangya1130@https://www.doczj.com/doc/895039692.html,
DOI：10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.004
【摘要】目的探讨Toll样受体7、9（TLR7、TLR9）及调控分子MyD88、NF?κB在白癜风患者以
及健康个体外周血单个核细胞（PBMC）中的表达差异及意义。方法用流式细胞仪检测36例白癜风
患者及22例健康对照PBMC中TLR7、TLR9的表达，并用反转录聚合酶链反应（RT?PCR）检测上述
样本中MyD88、NF?κB mRNA的表达。结果白癜风患者TLR7的表达高于健康对照组，但差异无
统计学意义（t=1.477，P=0.145）；TLR9的表达低于健康对照组，差异无统计学意义（t=-1.761，
P=0.084）。白癜风患者外周血PBMC中MyD88mRNA的表达稍高于对照组，但差异无统计学意
义（t=0.058，P=0.954）；NF?κB mRNA的表达明显高于对照组，差异有统计学意义（t=2.814，
P=0.008）。结论TLR7、TLR9的调控通路中的关键信号分子NF?κB表达升高，提示NF?κB可能参
与白癜风的发病机制。
【关键词】白癜风；Toll样受体7；Toll样受体9；髓样分化因子88；NF?κB
基金项目：广东省科技计划项目（2012A030400050）；广州市医药卫生科技项目（20151A011063）
Expression of Toll?like receptors7and9as well as their regulatory molecules myeloid differentia?
tion factor88and nuclear factor?κB in peripheral blood mononuclear cells of patients with vitiligo
Tang Yaping,Sheng Wenting,Zhou Xin,Li Xiaodong,Tian Xin,Zhong Jinbao,Li Zhenjie,Lin Chunsheng,
Liu Yumei
Department of Dermatology,Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou510095,China（Tang YP,
Zhou X,Li XD,Tian X,Zhong JB,Li ZJ,Lin CS,Liu YM）;Department of Dermatology,Guangzhou Red
Cross Hospital,Guangzhou510220,China（Sheng WT）
Corresponding author:Tang Yaping,Email:tangya1130@https://www.doczj.com/doc/895039692.html,
【Abstract】Objective To compare expression of Toll?like receptors7and9（TLR7,TLR9）as
well as their regulatory molecules myeloid differentiation factor88（MyD88）and nuclear factor?κB（NF?
κB）in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）between patients with vitiligo and healthy individuals,
and to explore their significance.Methods Flow cytometry was performed to measure expression of TLR7
and TLR9in PBMCs among36patients with vitiligo and22healthy controls,and real?time fluorescence?
based quantitative PCR（RT?PCR）was conducted to determine mRNA expression of MyD88and NF?κB in
the above blood samples.Results Compared with healthy controls,patients with vitiligo showed higher expression of TLR7and mRNA expression of MyD88and NF?κB,but lower expression of TLR9.However, significant differences were only observed in the mRNA expression of NF?κB（t=2.814,P=0.008）,but
not in the expression of TLR7and TLR9or the mRNA expression of MyD88between patients and controls
（t=1.477,1.761,0.058,all P>0.05）.Conclusion NF?κB,as a key signaling molecule of TLR7and
TLR9regulation pathways,increases obviously in patients with vitiligo,suggesting that NF?κB may be
involved in the pathogenesis of vitiligo.
【Key words】Vitiligo;Toll?like receptor7;Toll?like receptor9;Myeloid differentiation factor88;NF?
kappa B
Fund programs:Science and Technology Planning Project of Guangdong Province（2012A030400050）;
Key Project of Guangzhou Medical and Health Science and Technology（20151A011063）
白癜风是一种获得性色素脱失性皮肤病，世界人群患病率为0.38%～1.13%［1］。该病的发病机制
目前尚不完全清楚，较多学者认为自身免疫在该病中起着重要作用［2］。Toll样受体（TLR）属于一种病原微生物模式识别受体，体内外试验表明，它们能够识别自身RNA和DNA而引起自身免疫性疾病［3］。目前国内外尚未见白癜风患者与Toll样受体关系的研究报道，我们在前期［4］研究中发现白癜风患者外周血单个核细胞中TLR7mRNA和TLR9
mRNA表达升高，为进一步研究TLR7、TLR9在该病中的作用，我们用流式细胞仪检测白癜风患者TLR7、TLR9的表达情况，并对这两个受体调控通路中的两个关键因子MyD88、NF?κB用RT?PCR检测其表达情况。
对象与方法
一、对象
2015年4-12月，广州市皮肤病防治所门诊初次就诊的白癜风患者36例，诊断标准参考《临床皮肤病学》［5］。所有患者均未伴发其他器质性、自身免疫性及感染性疾病。患者1个月内均未系统应用糖皮质激素、免疫抑制剂、光敏剂、紫外线等治疗，其中男17例，女19例，年龄7～61岁（30.64±19.06）岁，病程10d至15年。白斑主要分布于面颈部、胸前、背部、四肢等，白斑面积占体表面积均小于20%。健康对照组22例来自暨南大学第四附属医院的健康体检者，其中男8例，女14例，年龄23～59岁（34.95±11.70）岁，均无任何系统性疾病、自身免疫性及感染性疾病，且1个月内均未系统应用糖皮质激素、免疫抑制剂、光敏剂及紫外线治疗。各组性别比较：χ2=0.657，P>0.05；年龄比较：t=1.069，P>0.05，两组具有可比性。
标本收集：所有入选者用肝素抗凝管抽取肘静脉血5ml，分为两份，其中3ml用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，分离后样品-80℃冻存，行MyD88mRNA、NF?κB mRNA的测定。另一份全血送流式细胞仪检测TLR7、TLR9的比例。
二、仪器和试剂
1.流式细胞仪（美国BD公司），高速离心机（德国Eppendorf公司），低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），荧光定量PCR仪、普通PCR仪（美国Bio?Rad公司），分光光度计（美国Thermo Fisher 公司）。
2.试剂：抗人Toll样受体9（CD289）、PE（美国eBioscience公司），抗TLR7抗体FITC（美国Abcam公司），HU CD14PE?CY7、Cytofix/Cytoperm试剂盒、Lysing Buffer（美国BD公司），Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（德国罗氏公司），引物由美国Invitrogen公司合成（表1）。
三、方法
1.流式细胞仪检测TLR7、TLR9的表达：标本处理取两管100μl全血，其中一管作为NC对照不加抗体，其余操作步骤一致；加入CD14-PE-CY7，室温避光孵育18min；加入1ml1×BD PharmLyse红细胞裂解液，室温避光孵育10min；500×g离心5min；弃上清，加入400~500μl Fixation/Permeabilization solution，室温避光孵育20min；500×g离心5min后弃上清，用1ml BD Perm/Wash buffer重悬细胞，室温避光10min后500×g离心5min，弃上清；用100μl的BD Perm/Wash buffer重悬细胞，并加入相应的TLR7-FITC和TLR9-PE，室温避光孵育30min；加入1ml BD Perm/Wash buffer洗涤细胞，500×g离心5min后弃上清；用200μl的PBS重悬细胞制成单细胞悬液；BD Accuri C6检测TLR （FITC）、TLR（PE）在单核细胞上表达情况。
2.RT-PCR测MyD88、NF-κB mRNA的表达：用TRIzol法提取细胞样本总RNA，测量A260、A280值，计算总RNA浓度，-80℃保存备用。取2μl RNA溶液，根据M-MLV反转录试剂盒（promega公司）说明书进行反转录反应，所得cDNA模板可立即使用或-20℃冻存备用。根据Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒试剂盒配制实时PCR反应体系，反应体系包括：Fast Start Universal SYBR Green Master12.5μl、Forward Primer（10μmol/L）0.7μl、Reverse Primer（10μmol/L）0.75μl、cDNA模板1μl、RNase-free ddH2O补至25μl。将各个实时PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，按表2所示，设置实时PCR反应程序并启动反应。
反应结束后，电脑自动分析计算出各样本的MyD88、NF?κB及内参照β肌动蛋白基因的拷贝数。考虑到各个样本总RNA浓度的差异，减少由
表1引物序列
引物名称
MyD88?F1
MyD88?R1
NF?κB?F1
NF?κB?R1
肌动蛋白F1
肌动蛋白R1
肌动蛋白F2
肌动蛋白R2
序列（5′?3′）
GGCTGCTCTCAACATGCGA
CTGTGTCCGCACGTTCAAGA
AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG
TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT
AAACTGGAACGGTGAAGGTG
AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT
TTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTGACA
CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT
于操作和其他因素引起的误差，最终计算结果按下列公式换算：A=B1（目的基因）/B2（内参基因），A值是统计时最终需要的数值。所有标本重复试验
3次取其均值进行统计学分析。
四、统计学分析
用SPSS16.0软件进行统计学分析。所有数据以x±s表示，两样本均数比较采用t检验，计数资料采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、白癜风患者和健康对照组外周血中TLR7、TLR9的表达比例
白癜风患者TLR7的表达高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；TLR9的表达比例低于健康对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3，图1～2。
二、白癜风组和健康对照组外周血PBMC中
MyD88、NF?κB mRNA的表达
白癜风组外周血单个核细胞MyD88mRNA的表达稍高于健康对照组，但差异无统计学意义；而NF?κB mRNA的表达明显高于健康对照组，差异有统计学意义。见表4。
讨论
人TLR是近年来发现的一类新的细胞表面信号传导跨膜受体，在人体免疫系统中有着重要的作用。在正常情况下，对TLR刺激会引起免疫系统各种细胞的活化，引起和增强保护性的Th1型免疫应答，然而在某些易感基因的遗传背景下，TLR的刺激可以诱导自身免疫病。人TLR7由1049个氨基酸残基的肽链编码，识别单链RNA（ssRNA）［6］，引发一系列信号转导，导致如肿瘤坏死因
子α、白细胞介素（IL）1、IL?6、IL?12
以及IFN?α等的释放，介导非特异性
免疫应答。人TLR9由1032个氨基酸
编码，识别细菌和病毒DNA中的未甲
基化CpG基序或人工合成的寡脱氧
核糖核酸（CpG?ODN）。CpG?ODN能
刺激免疫细胞产生IFN?γ、IL?12、IL?18
等Th1型细胞因子，上调协同刺激分
子的表达，促进B细胞的增殖，激活
巨噬细胞等。
作为TLR7配体的咪喹莫特可诱
导IFN?α和IL?12以及TNF?α的表达，现已报道可诱发白癜风样色素减退［7］。而TLR9的配体CpG?DNA已经用于治疗小鼠黑素瘤的研究［8］。可以推测TLR7、TLR9可能在白癜风发病中具有一定意义，因此，我们在前期研究中检测了白癜风患者外周血TLR7、TLR9mRNA的表达，结果发现这两个受体的表达升高，初步认为这两个受体与白癜风的发病存在一定相关性［4］。但上述两个受体在蛋白水平的表达及其调控通路的情况并不清楚。为此本研究采用流式细胞仪检测了白癜风组外周血中TLR7、TLR9蛋白的表达，结果发现：白癜风组TLR7的表达高于健康对照组，TLR9的表达低于健康对照组，但差异均无统计学意义。结果和我们前期采用RT?PCR检测的结果稍不一致。我们推测原因在于：①虽然都是检测单个核细胞TLR7、表2MyD88和NF?κB反应程序
阶段
MyD88反应程序
预变性
PCR反应
NF?κB反应程序
预变性
PCR反应
循环
1×
40×
1×
40×
温度
95℃
95℃
63.3℃
72℃
95℃
95℃
59℃
72℃
时间
15min
15s
15s
15s
15min
15s
15s
15s
内容
预变性
变性
退火
延伸
预变性
变性
退火
延伸
荧光信号
采集
否
否
否
是
否
否
否
是
表3白癜风组和健康对照组外周血TLR7、
TLR9百分率比较（%，x±s）
组别
白癜风组
健康对照组
t值
P值
例数
36
22
TLR7
94.189±3.899
92.688±3.499
1.477
＞0.05
TLR9
86.181±10.932
90.611±5.588
1.761
＞
0.05
白癜风组对照组
图1白癜风组和健康对照组单个核细胞的流式细胞检测
TLR9的表达，但采用的方法不一样，我们此次采用流式细胞仪检测，是在蛋白水平上检测上述两个受
体，且得到的结果是以比例的形式表达，而非定量的检测，因此结果可能存在一定的差异；②我们此次选取的人群并非之前研究的人群，结果可能因选
取的白癜风患者的不同分型、分期而存在一定的差异；③mRNA 的表达水平并不总与蛋白水平的表达一致［9］，推测白癜风组与健康对照组TLR7、TLR9在基因表达水平上可能存在差异而最终未必在蛋白水平上表达存在差异。在上述两个受体的调控通路研究方面，我们选取了MyD88、NF?κB 两个调控分子，MyD88分子是大多数TLR 信号转导中的接头分子，它的C 端含TIR 结构域与TLRs 胞内区的TIR 结合，N 端通过死亡结构域（death domain ，DD ）募集下
游含有DD 结构域的信号分子使信号下传，可激活NF?κB 和AP?1，控制炎症因子的分泌，MyD88的缺陷可导致许多TLRs 功能受损［10?11］。作为TLR7、TLR9重要的下游调控通路的信号分子，MyD88、NF?κB 的表达又如何？因此，我们用RT?PCR 法检测白癜风组和健康对照组PBMC 中MyD88、NF?κB mRNA 的表达水平，结果显示两组中MyD88mRNA 的表
达水平无明显差异。我们推测原因有以下几个方面：①MyD88作为下游通路中的分子，尚有其他受体对其产生影响或者存在负调控机制；②白癜风存在不同的分型、分期，不同的分型和分期是否对该因子的表达产生影响，以后，我们将进行详细的亚组分析。而在NF?κB 的检测方面，我们发现NF?κB mRNA 的表达水平显著高于健康对照组，差异有统计学意
义。结合我们前期［4］的研究，间接支持了TLR7、TLR9可能在白癜风的发病中起一定的作用，但并不能排除其
他的TLR 和其他未知因素的影响。
本次研究结果并未发现白癜风患者外周血中
TLR7、TLR9在蛋白水平上的表达差异，也未发现上述两个受体的关键调控因子MyD88mRNA 的表达异常。但是发现该通路中下游的关键信号分子NF?κB 表达升高，提示TLR7、TLR9可能与白癜风的发病存
在相关性，但具体作用机制仍需扩大样本量、进一步分型分期采用更多的研究方法进一步证实。
参考
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图2
白癜风组和健康对照组单个核细胞中TLR7与TLR9的表达量
白癜风组
健康对照组
表4
白癜风组和健康对照组单个核细胞MyD88、
NF?κB mRNA 的表达（x ±s ）
组别白癜风组健康对照组t 值P 值
例数3622
MyD88mRNA 0.050±0.1360.048±0.1060.058
＞0.05NF?κB mRNA 0.926±1.5050.201±0.2772.814
＜0.05
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（收稿日期：2016?09?23）
（本文编辑：吴晓初）
《中华皮肤科杂志》2015年度优秀论文获奖名单
《中华皮肤科杂志》2015年度优秀论文评选活动已经结束。由编辑部从2015年刊出的全部文章中选出论著38篇，技术与方法、综述、病例报告、Meta分析类21篇共59篇论文；然后将初评结果发给编委及通讯编委进行第二轮评选；最后由编辑部根据得票数排序，产生了一等奖1篇，二等奖3篇，三等奖6篇，优胜奖5篇共15篇论文。2015年《中华皮肤科杂志》刊出专论类文章8篇，指南与共识6篇，这14篇文章作为特殊贡献奖直接给予奖励。现将获奖结果公布如下。
一等奖1篇，奖励5000元：系统性红斑狼疮患儿Epstein?Barr病毒基因异常表达的研究（丁艳，何小解，廖旺，等），2015，48（1）：15?18。
二等奖3篇，奖励3000元/篇：①中国部分地区淋球菌耐药监测点产青霉素酶淋球菌及其bla TEM?135突变体的流行调查（陈绍椿，尹跃平，戴秀芹，等），2015，48（5）：312?316；②过表达NF?E2相关因子2对白癜风黑素细胞PIG3V线粒体生物合成和功能的影响（朱龙飞，田军，坚哲，等），2015，48（6）：373?377；③常染色体隐性遗传念珠状发一例及其家系基因突变研究（王沛，周城，王雨馨，等），2015，48（3）：158?161。
三等奖6篇，奖励2000元/篇：①皮肤血管内NK/T细胞淋巴瘤五例分析（宋琳毅，薛燕宁，钟连生，等），2015，48（9）：603?605；②银屑病患者皮损和外周血中CD8α+α+T细胞的研究（孙秀文，李冰，张伟刚，等），2015，48（4）：229?232；③上海某中学青少年特应性皮炎和鱼鳞病FLG基因型的研究（钱秋芳，程茹虹，李明，等），2015，48（9）：629?632；④梅毒螺旋体粘附于人脑微血管内皮细胞的实验研究（吴凡，张瑞丽，张津萍，等），2015，48（11）：770?773；⑤D2?40/S100、CD34/S100检测在皮肤恶性黑素瘤脉管转移诊断中的应用（朱小红，张熔熔），2015，48（4）：266?269；⑥携人乳头瘤病毒6型全基因细胞的组织工程皮片培养的初步研究（王飞，郭宗科，张红叶，等），2015，48（5）：321?325。
优胜奖5篇，奖励1000元/篇：①抗链球菌治疗寻常性银屑病的系统评价（刘芳，刘海波，谢其美，等），2015，48（9）：663?665；②外显子组测序技术对疑似鱼鳞病患儿进行分子诊断的方法学研究（余蕾，张蕾，顾峻嫣，等），2015，48（3）：208?211；③感染与荨麻疹（陈奇权，郝飞），2015，48（4）：292?294；④眼睑红斑肿胀性疾病的鉴别诊断（陈军，孔庆涛，曾梅华，等），2015，48（10）：746?748；⑤银屑病共患疾病的临床研究进展（景璟，郑敏），2015，48（12）：899?901。
特殊贡献奖14篇，奖励2000元/篇：感染、免疫与皮肤病新认识（高兴华，陈洪铎），2015，48（1）：1?3；血清过敏原特异性IgE 检测中存在问题及对策（李邻峰），2015，48（1）：4?7；分子流行病学及其在转化医学中的作用（吴息凤，赵华），2015，48（3）：147?150；银屑病免疫学研究新进展（王刚），2015，48（4）：223?226；银屑病基础与临床研究现状和展望（郑敏，满孝勇），2015，48（4）：226?228；尖锐湿疣的复发与防治（徐金华），2015，48（5）：297?300；重视新现和疑难真菌病的诊疗（冯佩英，席丽艳），2015，48（8）：523?525；规范书写皮肤恶性黑素瘤组织病理报告（陈浩，张经纬，孙建方），2015，48（9）：599?602；斑贴试验临床应用专家共识（通信作者：李邻峰，顾恒），2015，48（1）：8?10；规范外用糖皮质激素类药物专家共识（通信作者：李邻峰，顾恒），2015，48（2）：73?75；中西医结合系统药物治疗湿疹皮炎类皮肤病专家共识（2015版）（主要执笔者：李邻峰，刘巧，顾恒，温海），2015，48（3）：151?153；光斑贴试验临床应用专家共识（通信作者：顾恒，李邻峰），2015，48（7）：447?450；氨基酮戊酸光动力疗法临床应用专家共识（主要执笔者：王秀丽，顾恒，郑和义），2015，48（10）：675?678；梅毒血清固定临床处理专家共识（主要执笔者：王千秋，范瑞强），2015，48（11）：753?755。
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1 JAK-STAT 信号通路 1) JAK 与STAT 蛋白 JAK-STAT 信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体( tyrosine kinase associated receptor ) 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT 信号通路来传导信号，这包括白介素2?7 (IL-2?7 )、GM-CSF (粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)、GH (生长激素)、EGF (表皮生长因子)、PDGF (血小板衍生因子)以及IFN (干扰素)等等。这些细胞 因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK 的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK ( Janus kinase ) 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体( receptor tyrosine kinase, RTK )，而JAK 却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK 是英文Janus kinase 的缩写，Janus 在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定 SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域(JAK homology domain, JH )，其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT ( signal transducer and activator of transcription ) STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性 的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具 有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“ GTFLLRFSS ”。 2) JAK-STAT 信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT 信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残 基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位
Ｔｏｌｌ样受体信号通路的研究进展 摘要Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是近年来发现的一类模式识别受体，通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)激活天然免疫。而髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR信号通路中的一个关键接头分子，在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用。本文对Toll样受体、髓样分化因子88的分子结构和基本功能，及Toll样受体的信号传导通路进行了综述。 关键词Toll样受体；髓样分化因子88；信号通路；负调控机制 免疫系统识别“非我”和“自我”的过程是依赖于不同的受体来完成的,作为先天性免疫系统的重要组成部分及连接获得性免疫与先天性免疫的“桥梁”, TLRs 是生物的一种模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR),它主要通过识别病原相关分子模式PAMPs来启动免疫反应。而MyD88是Toll受体信号通路中的一个关键接头分子，是第一个被鉴定的含TIR结构域的接头蛋白分子，在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用。 1TLR的结构与基本功能 Toll样受体一词来自对果蝇的研究,是决定果蝇背腹分化的基因所编码的一种跨膜受体蛋白,同时还参与果蝇的免疫反应,具有介导抗真菌感染信号转导的功能[1]。后来在哺乳动物也发现有与Toll受体同源的受体分子，统称为称为Toll 样受体TLRs。 TLRs是广泛分布在免疫细胞尤其非特异免疫细胞以及某些体细胞表面的一类模式识别受体，它们可以直接识别结合某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，即病原相关分子模式。迄今为止,已经发现哺乳动物至少有13种toll样受体,其中人的toll样受体鉴定出11种(TLR1-TLR11) [2]。TLRs识别的配基各不相同，其中TLR1-TLR5的结构已被确定,但只有TLR2与TLR4的功能被部分揭示。TLR4主要介导G-菌感染后LPS的信号转导,而TLR2主要介导G+感染后脂蛋白、脂多肽等的信号转导。它们都最终导致该转录因子的转位与相应免疫基因的活化而转录,释放前炎症因子及辅助刺激分子起到调节炎症反应的作用,从而提示TLRs可能在先天性免疫系统中起重要作用[3-4]。 TLRs家族成员具有相似的结构特征。它们均为Ⅰ型跨膜受体,由胞外区、跨膜区和胞内区3个功能区组成。胞外区序列差异大,是与配体结合的特异部位,主要包括十几至二十几个串联的富亮氨酸重复基序(leucine-rich repeats, LRRs),LRR
1 JAK-STAT信号通路 1) JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3
TLR结构：TOLL样受体（TLR）为I型跨膜蛋白，其胞外段为富含亮氨酸重复序列，参与配体识别;胞内段含有保守的TIR (TOLL样/IL一IR)结构域，招募衔接分子如MYD88、TIRAP、TRIF、TRAM｛1｝进行信号转导。 TLR识别配体：TLR是结合病原微生物成分的受体，其配体包括合成的激动药、微生物产物、内源性配体｛1｝其所识别的病原微生物成分包括脂多糖(lipoPolysaeeharide，LpS)、革兰氏阳性细菌的肤聚糖(peptidoglyean，pGN)、脂磷壁酸(liPoteiehoieaeid，LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖(11-poarabinomannan，LAM)等。 TLR分类：在人类已发现10种TLR(TLRI一TLmo)，表达于参与天然免疫的细胞上，不同的TLR在不同细胞表面有不同的表达，其所识别的配体亦不同。髓系DC表达TOLL 样受体1-6、8，而浆系DC表达TOLL样受体7、9。与DC成熟关系密切的是TLR2、TLR4。其中TLR2识别脂蛋白类，肽多糖类如革兰氏阳性细菌的肤聚糖(peptidoglyean，pGN)、脂磷壁酸(liPoteiehoieaeid，LTA)。而TLR4识别LPS、OK432等。 TLR与DC成熟的关系：｛2｝｛5｝
TLR信号转导机制：｛3｝
TLR受体激动药在肿瘤微环境下的免疫调节作用：｛1｝ TLR基因定位：｛4｝ 特异性引物序列： TLR2(forward GCAAACGCTGTTCTGCTCAG) (reverse AG GCGTCTCCCTCTA TTGTA TT) TLR4 (forward ATGGCATGGCTTACACCACC) (reverse GA GGCCAA TTTTGTCTCCACA)
cAMP信号通路 信号分子：1.激素 2.局部介质3.神经递质 受体：G蛋白偶联受体 胞内应答过程：激素→G蛋白耦联受体→G蛋白→腺苷酸环化酶→cAMP→依赖cAMP的蛋白激酶A→基因调控蛋白→基因转录 举例：1.多发性骨髓瘤：通过调变细胞内环腺苷酸浓度可以诱导多种肿瘤细胞增殖阻滞和凋亡，成为肿瘤治疗新途径。 2.肝损伤：对乙酰氨基酚致药物性肝脏损伤可能与cAMP-PKA 信号通路有关。 3.研究人员已经确定了这其中的机制，现在，一种能抑制Epac的新的候选药物——称为ESI Epac特异性抑制剂，也已经被证明能够保护正常小鼠免受致命性立克次氏体感染。目前，研究人员正在设计第二代ESI——更有效，即使在最高剂量也无毒。也有来自预备试验的迹象表明，ESI能够保护动物抗击一些致命的病毒感染。 磷脂酰肌醇信号通路 信号分子：1.激素 2.局部介质3.神经递质 受体：酶耦联型受体 胞内应答过程：Ca2+活化各种Ca2+结合蛋白引起细胞反应，钙调素（calmodulin，CaM）由单一肽链构成，具有四个钙离子结合部位。结合钙离子发生构象改变，可激活钙调素依赖性激酶（CaM-Kinase）。细胞对Ca2+的反应取决于细胞内钙结合蛋白和钙调素依赖性激酶的种类。 IP3信号的终止是通过去磷酸化形成IP2，或被磷酸化形成IP4。Ca2+由质膜上的Ca2+泵和Na+-Ca2+交换器将抽出细胞，或由内质网膜上的钙泵抽进内质网 DG通过两种途径终止其信使作用：一是被DG-激酶磷酸化成为磷脂酸，进入磷脂酰肌醇循环；二是被DG酯酶水解成单酯酰甘油。由于DG代谢周期很短，不可能长期维持PKC活性，而细胞增殖或分化行为的变化又要求PKC长期活性所产生的效应。现发现另一种DG生成途径，即由磷脂酶催化质膜上的磷脂酰胆碱断裂产生的DG，用来维持PKC的长期效应。 举例：1.肿瘤治疗：该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。 2.肝癌：PIK3R1在肝癌组织中表达上调,PIK3R1可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进HepG2细胞的增殖. 生物技术15-1 曹文祥
Rheumatol Int DOI 10.1007/s00296-014-3137-5 Role of integrins and their ligands in osteoarthritic cartilage Jian Tian · Fang?Jie Zhang · Guang?Hua Lei Received: 25 May 2014 / Accepted: 17 September 2014 ? Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 [1]. Radiographic evidence of OA occurs in the majority of people by 65 years of age, and among them about 80 % in people who aged over 75 years [2]. However, the pathogen-esis of this disease is not fully elucidated. Cartilage damage is one of the major pathological changes in OA. Articular cartilage is an avascular, a neu-ral, alymphatic, and viscoelastic connective tissue that functions autonomously to bear loads and provide almost friction-free movement of diarthrodial joints [3]. Chondro-cytes, the only cell population of adult articular cartilage, are strongly involved in maintaining the dynamic equi-librium between synthesis and degradation of the extra-cellular matrix (ECM) [4]. Collagens represent the major structural components of the articular cartilage. Cartilage is made up of two main ECM macromolecules: type II collagen and aggrecan, a large aggregating proteoglycan [5, 6]. Cartilage destruction is thought to be mediated by two main enzyme families: the matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the cartilage collagen break-down, whereas enzymes from disintegrin and metallopro-teinase domain with thrombospondin motifs (ADAMTS) family mediate cartilage aggrecan loss [7]. Activation of biochemical pathways involves the production of proin-flammatory cytokines, inflammation, degradation of the ECM by MMPs and ADAMTS, and cessation of ECM syn-thesis via dedifferentiation and apoptosis of chondrocytes [8, 9]. Therefore, the ECM is a vital cellular environment, and interactions between the cell and ECM are important in regulating many biological processes, which include cell growth, differentiation, and survival [10, 11]. Cell–matrix interactions control cell function and behav-ior by signal transduction through a variety of cell sur-face receptors. The integrins are the major family of ECM receptors, which can transmit information from the matrix to the cell. Integrin binding of ECM ligands results in the Abstract Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease, which is characterized by articular cartilage destruction, and mainly affects the older people. The extracellular matrix (ECM) provides a vital cellular environment, and interactions between the cell and ECM are important in reg-ulating many biological processes, including cell growth, differentiation, and survival. However, the pathogenesis of this disease is not fully elucidated, and it cannot be cured totally. Integrins are one of the major receptors in chondro-cytes. A number of studies confirmed that the chondrocytes express several integrins including α5β1, αV β3, αV β5, α6β1, α1β1, α2β1, α10β1, and α3β1, and some integrins ligands might act as the OA progression biomarkers. This review focuses on the functional role of integrins and their extracellular ligands in OA progression, especially OA car-tilage. Clear understanding of the role of integrins and their ligands in OA cartilage may have impact on future develop-ment of successful therapeutic approaches to OA.Keywords Chondrocyte · Integrin · Fibronectin · Tenascin C · Osteopontin · Osteoarthritis · Cartilage Introduction Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease and is char-acterized by articular cartilage destruction along with changes occurring in other joint components including bone, menisci, synovium, ligaments, capsule, and muscles Rheumatology INTERNATIONAL J. Tian · F.-J. Zhang · G.-H. Lei (*) Department of Orthopaedics, Xiangya Hospital, Central South University, No. 87 Xiangya Road, Changsha 410008, Hunan, China e-mail: gh.lei9640@https://www.doczj.com/doc/895039692.html,; lgh9640@https://www.doczj.com/doc/895039692.html,
Toll样受体信号通路图 TLR家族成员(TLR3除外)诱导的炎症反应都经过一条经典的信号通路(图1)，该通路起始于TLRs的一段胞内保守序列—Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1receptorhomologousregion，TIR)．TIR可激活胞内的信号介质—白介素1受体相关蛋白激酶(IL-1Rassociatedkinase，IRAK)IRAK-1和IRAK-4、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFR-associatedfactor6,TRAF-6)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)和IκB激酶(IκBkinase，IκK)，进而激活核因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)，诱导炎症因子的表达。 Toll-liker Receptor Signaling 本信号转导涉及的信号分子主要包括： CD14，MD-2，TRAM，TRIF，TIRAP，MyD88，TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，IRAK-1，IRAK-2，IRAK-4，IRAK-M，TRAF6，TRIAD3A，ST2L，SOCS1，RIG-I，FADD，TOLLIP，RIP1，A20，UEV1A，Ubc13，ECSIT，MEKK-1，TAK1，
TBK1，MKK3/6，p38，TAB1/2，MKK4/7，JNK，IKKα，IKKβ，IKKγ，IKKε，NEMO，IκBα，NF-κB，p65/RelA，Casp-8，IRF-3，IRF-7，MA VS等
细胞受体类型、特点 及重要的细胞信号转导途径 学院：动物科学技术学院 专业：动物遗传育种与繁殖 姓名：李波
学号：2015050509
目录 1、细胞受体类型及特点 (4) 1.1离子通道型受体 (4) 1.2 G蛋白耦联型受体 (4) 1.3 酶耦联型受体 (5) 2、重要的细胞信号转导途径 (5) 2.1细胞内受体介导的信号传递 (5) 2.2 G蛋白偶联受体介导的信号转导 (6) 2.2.1激活离子通道的G蛋白偶联受体所介导的信号通路 (7) 2.2.2激活或抑制腺苷酸环化酶的G蛋白偶联受体 (7) 2.2.3 激活磷脂酶C、以lP3和DAG作为双信使 G蛋白偶联受体介导的信号通 路 (8) 2.2 酶联受体介导的信号转导 (9) 2.2.1 受体酪氨酸激酶及RTK-Ras蛋白信号通路 (10) 2.2.2 P13K-PKB(Akt)信号通路 (10) 2.2.3 TGF-p—Smad信号通 (11) 2.2.4 JAK—STAT信号通路 (12)
1、细胞受体类型及特点 受体(receptor)是一种能够识别和选择性结合某种配体(信号分子)的大分子物质，多为糖蛋白，一般至少包括两个功能区域，与配体结合的区域和产生效应的区域，当受体与配体结合后，构象改变而产生活性，启动一系列过程，最终表现为生物学效应。受体与配体问的作用具有3个主要特征：①特异性；②饱和性；③高度的亲和力。 根据靶细胞上受体存在的部位，可将受体分为细胞内受体(intracellular receptor)和细胞表面受体(cell surface receptor)。细胞内受体介导亲脂性信号分子的信息传递，如胞内的甾体类激素受体。细胞表面受体介导亲水性信号分子的信息传递，膜表面受体主要有三类：①离子通道型受体(ion—channel—linked receptor)；②G蛋白耦联型受体(G—protein —linked receptor)；③酶耦联的受体(enzyme—linked recep—tor)。第一类存在于可兴奋细胞。后两类存在于大多数细胞，在信号转导的早期表现为激酶级联事件，即为一系列蛋白质的逐级磷酸化，借此使信号逐级传送和放大。 1.1离子通道型受体 离子通道型受体是一类自身为离子通道的受体，即配体门通道(1igand—gated channel)，主要存在于神经、肌肉等可兴奋细胞，其信号分子为神经递质。神经递质通过与受体的结合而改变通道蛋白的构象，导致离子通道的开启或关闭，改变质膜的离子通透性，在瞬间将胞外化学信号转换为电信号，继而改变突触后细胞的兴奋性。如：乙酰胆碱受体以三种构象存在，两分子乙酰胆碱的结合可以使之处于通道开放构象，但该受体处于通道开放构象状态的时限仍十分短暂，在几十毫微秒内又回到关闭状态。然后乙酰胆碱与之解离，受体则恢复到初始状态，做好重新接受配体的准备。离子通道型受体分为阳离子通道，如乙酰胆碱、谷氨酸和五羟色胺的受体，和阴离子通道。 1.2 G蛋白耦联型受体 三聚体GTP结合调节蛋白(trimeric GTP—binding regulatory protein)简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由a、p、-／三个亚基组成，a和7亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当a亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，“亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的ATP 水解，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS(regulator of G protein signaling)增强。RGS也属于GAP(GTPase activating protein)。 G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白(图10—6)，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内
TOLL样受体7（TLR7）增殖分化信号通路论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】目的探讨TLR7的激活对HaCaT细胞增殖与分化的影响及其可能的机制。方法培养HaCaT细胞，以不同剂量的TLR7配体Gardiquimod经不同的时间体外刺激HaCaT细胞，MTT及流式细胞术分析TLR7的激活对HaCaT细胞增殖的影响。以不同剂量的TLR7配体Gardiquimod经不同的时间体外刺激HaCaT细胞，加入氯化钙诱导HaCaT细胞分化，Western-Blot分析HaCaT细胞的分化Markers（颗粒层：Keratin1，基底层：Keratin5和棘层：Involucrin）并以此分析TLR7的激活对氯化钙诱导HaCaT细胞分化的影响。 Western-blotting分析TLR7在HaCaT细胞中激活的信号通路 PI3K-AKT和RAS-MAPK等。在TLR7配体Gardiquimod处理HaCaT细胞前1h，分别加入特异性阻断剂(PD98059及LY2940002)阻断TLR7配体Gardiquimod激活的相关信号通路，然后分析阻断剂对TLR7配体Gardiquimod调控HaCaT细胞增殖及分化影响，从而探讨PI3K-AKT 和RAS-MAPK信号通路在TLR7配体Gardiquimod对HaCaT细胞增殖及分化调控中的作用。结果MTT及流式细胞分析结果显示：TLR7配体Gardiquimod促进HaCaT细胞增殖，且具有时间及剂量依赖性；TLR7配体Gardiquimod能够抑制氯化钙诱导的HaCaT细胞分化markers （Keratin1及Involucrin）的表达，存在时间效应及剂量效应；信号通路分析揭示TLR7配体Gardiquimod能够增加ERK1/2和MAPK的水平；阻断剂的研究发现TLR7配体Gardiquimod部分依赖PI3K-AKT
Toll 样受体(TLRs)是一个模式识别受体家族，它们在进化上高度保守，从线虫到哺乳 动物都存在TLRs，目前在哺乳动物中已发现 12 个成员[1]．TLRs 主要表达于抗原递 呈细胞及一些上皮细胞，为玉型跨膜蛋白，胞外区具有富含亮氨酸的重复序列，能够 特异识别病原微生物进化中保守的抗原分子———病原相关分子模式 (pathogen-associatedmolecular patterns, PAMPs)[2]．为了有效地抵抗入侵的病原体，机体需要对多种 PAMPs 产生适当的免疫应答，TLRs 可以通过识别 PAMPs 诱发抵抗病原体的免疫反应．而且 TLRs 也参与识别有害的内源性物质．TLRs 的激活可诱导很强的免疫反应，有利于机体抵抗病原体感染或组织损伤，但是过度的免疫反应也会带来不利影响，如产生内毒素休克、自身免疫性疾病等．为了保证 TLRs 介导正确的免疫应答，机体 存在精密的负调控机制，及时抑制 TLRs 信号，维持机体的免疫平衡[3]TLR 家族成员(TLR3 除外)诱导的炎症反应都经过一条经典的信号通路(图 1)，该通路起始于TLRs 的一段胞内保守序列———Toll/IL-1 受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)．TIR可激活胞内的信号介质———白介素 1 受体相关蛋白激酶 (IL-1R associated kinase， IRAK) IRAK-1 和IRAK-4、肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TNFR-associated factor 6, TRAF-6)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和 I资B激酶 (I资B kinase， I资K )，进而激活核因子资 B(nuclear factor 资B，NF-资B)，诱导炎症因子的表达．TLRs 信号通路上的许多接头蛋白都具有 TIR结构域：髓系分化因子 88(myeloid differentiationfactor 88， MyD88)、MyD88- 接头蛋白相似物(MyD88-adaptor like，Mal)、含有 TIR 结构能诱导干扰 素茁的接头分子 (TIR domain-containingadaptor inducing interferon 茁，TRIF)、TRIF 相关接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)和SARM (sterile 琢 and armadillo motif-containingprotein)[4]．它们参与 TLRs 所介导的信号转导，其中 MyD88 最重要，参与了除 TLR3 外所有 TLRs介导的信号转导．MyD88 首先通过 TIR 与 TLRs 相结合，接着募集下游信号分子 IRAK-4，IRAK-4 磷酸化激活IRAK-1，随后 活化 TRAF6．活化的 TRAF6 具有泛素连接酶(E3)的活性，能够结合泛素结合酶(E2)，进而泛素化降解 IKK-酌．这种泛素化降解可以活化TGF-茁激酶(TGF-茁 activated kinase 1， TAK1) 和TAK1 结合蛋白 (TAK1 binding protein， TAB1、TAB2、 TAB3)．活化的 TAK1 会催化 IKK-茁磷酸化，最终激活 NF-资B，促使炎症因子的表达．除了共同的 NF-资B 激活通路，不同的 TLRs 还存在着其特有的信号通路，一些TLRs 具有募集 Mal、TRAM 和 TRIF 的作用．不同的接头分子在信号传导中发挥的作 用不同[5]，TRIF 在脂多糖(LPS)激活的 TLR4 途径和 Poly(I∶C)激活的 TLR3 途径中都起到了重要的作用，而 TRAM 仅在 TLR4 的途径中发挥作用．TLRs 的激活是一把双刃剑，它可以通过刺激先天性免疫应答和提高获得性免疫反应来保护机体，但是它所引 起的持续性炎症反应也会对机体产生损伤，自身免疫、慢性炎症和感染性疾病都与它 有一定关系．例如LPS 持续刺激TLR4 就可以引起严重的败血病和感染性休克，此外，类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺心病、结肠炎、哮喘、心肌病、狼疮和动脉粥样硬化
Toll样受体、信号通路及其免疫的研究 Toll样受体最早是在研究果蝇胚胎发育过程中发现的，它不仅是果蝇胚胎发育过程中的必需蛋白，而且在免疫应答过程中具有重要作用[1]。Toll 样受体(TLRs)是一个模式识别受体家族，它们在进化上高度保守，从线虫到哺乳动物都存在TLRs，它能识别病原微生物进化中保守分子，如脂多糖(LPs)、肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等等．脂多糖受体TLR4是发现的第一个TLRs，至今在动物中已经发现15种TLRs(在人体已经发现11个成员，即TLRl～TLRl0和TLRl4，小鼠不表达TLR10，但发现了TLR11—13[2]，在鸡中发现了TLR15[3]。哺乳动物的TLRs同果蝇的TLRs一样，同属于I型跨膜蛋白，主要由3个功能区构成：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区具有富含亮氨酸的重复序列，能够特异识别病原微生物进化中保守的抗原分子——病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)[4]。为了有效地抵抗入侵的病原体，机体需要对多种PAMPs产生适当的免疫应答，TLRs可以通过识别PAMPs诱发抵抗病原体的免疫反应。而且TLRs也参与识别有害的内源性物质． 1. Toll样受体 1.1 Toll样受体的发现Toll是在昆虫中发现的一个受体蛋白，参与昆虫胚胎发育时背腹肌极性的建立。进一步研究发现，Toll胞内区与哺乳动物中自介素-1受体(IL-1R)的胞内区具有很高的同源性，下游的信号转导通路通过NF—kB样因子发挥作用。IL-1R是免疫相关分子，而且昆虫中抗微生物的多肽基因上游大多有NF—kB样因子结合位点，是否Toll蛋白也参与昆虫的天然免疫反应调控?研究证实Toll参与昆虫的抗真菌免疫．真菌感染时果蝇Toll 通路被激活，诱导大量的抗真菌肽Drosomycin，Toll的突变导致果蝇极易受到真菌的感染[1]。．哺乳动物存在Toll的同源分子，即TLRs。TLRs是一个受体家族。 1.2 TLRs分子特征TLRs为一类Ⅰ型跨膜蛋白，其细胞外区域存在由18～31个氨基酸组成的富含亮氨酸的重复单位（LRR motif)XLXXLXLXXL(X代表任何氨基酸，L为亮氨酸)每个LRR由24～29个氨基酸组成，为8折叠一环一a螺旋的结构。整个LRR结构域形成一个马蹄型的结构，参与识别各种病原体。它们的细胞外区域较长，在550～980氨基酸之间，而且同源性较差，如TLR2与TLR4细胞外区域的同源性只有24%。提示TLRs各个分子之间所结合的配体具有不同的结构、性质；但各个分子种属间的差异较小，如人和小鼠的TLR4胞外区有53％相同，而胞质区则高达83％，提示着它们是一组非常保守的分子，执行着相似的功能。TLRs的胞内区含有Toll/IL-1受体同源(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR), 其中包括3个保守盒(conserved boxes)，参与信号转导。TIR是一个保守结构，其中的23个氨基酸的位置是固定的，所形成的三个结构域分别为这些分子的标志区域和信号介导区域。具有TIR结构域[5]分子现在发现的共有31种，如MyD88、IL-1相关蛋白激酶(IRAK)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)等。 1.3 TLRs的配体（PAMP）及其特异性TLRs配体按来源可分为外源性和内源性配体。外源性配体主要来自病原微生物，是微生物进化过程中的保守成分，如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等。内源性配体来自宿主细胞，如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等等，内源性配体在机体应激或是组织损伤时释放[6，7]。TLR4识别G-菌的LPS；TLR2可识别G+菌、分枝杆菌及真菌的PAMP。TLR9识别细菌特殊序列胞嘧啶磷酸鸟（CpG-DNA）；TLR5 识别细菌鞭毛蛋白。 目前对TLR生物学作用研究的焦点集中在介导对LPS的反应，而LPS的生物活性成分是脂质A。3种天然对大剂量LPS耐受的小鼠C3H/HeJ、C57BL/10ScCr、C57BL/10ScN，
Toll样受体的结构及免疫功能探究 发表时间：2011-09-06T11:23:55.560Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第7期供稿作者：何玉林刘小双叶狄 [导读] TLR是一类从线虫到哺乳动物序列高度保守的模式识别受体。 何玉林刘小双叶狄 基金项目：贵州省遵义医学院博士启动基金 (F-332号) 作者简介：何玉林（1969-），男，甘肃天水人，副教授，博士 【摘要】Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫系统中特异的Ⅰ型跨膜受体及病原体模式识别受体，它通过识别病原体，能立即启动先天性免疫，并能通过信号传导启动获得性免疫，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用。目前已发现TLR家族共有13个受体，分布于各个器官脏器，针对不同的病原体发挥其识别作用。该文对TLRs的结构和分布、相应配体及免疫功能等方面作简要综述。 【关键词】Toll样受体（TLRs）；配体；天然免疫应答；免疫功能 【中图分类号】R441【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)07-0002-02 TLR是一类从线虫到哺乳动物序列高度保守的模式识别受体。最早的Toll基因是在研究果蝇背腹极性时发现的，因与果蝇的Toll分子高度同源而得名。后来的研究发现Toll在果蝇的天然免疫应答中扮演了重要角色。TLR通过识别外源性微生物，启动先天性免疫反应，清除侵入的病原微生物。同时活化的TLR也能激活T细胞，启动获得性免疫反应。 TLR在天然免疫方面的特殊意义及在沟通天然免疫和获得性免疫方面的桥梁作用，使生物学界和医学界对其投入了极大的热情。随后，人类和小鼠中先后克隆出多个Toll的同源蛋白，共同构成Toll受体家族。目前为止，已经鉴定了至少13种TLRs，其中TLR1TLR9是人类与老鼠共有，TLR似乎只在人类中有功能，而TLR11TLR13为小鼠所特有。 1TLRs的生物特点 1.1TLR的结构:TLRs属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是具有类似结构的跨膜型式识别受体（pattern recongnition receptors,PRR)，由胞外区、跨膜区和胞质区组成。胞外区是由1831个串联的富含亮氨酸的重复基序（leucine-rich repeat，LRR)形成的亮氨酸结构域，空间结构如马蹄形且高度保守，其中亮氨酸在三维空间的一侧排列形成疏水界面，该区为序列多变的Ig样结构域，与宿主对感染反应的特异性有关，其空间结构的细微变化就会影响TLR对病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP)的识别；跨膜区是富含半胱氨酸结构域，一般认为跨膜结构域决定了TLRs分子的亚细胞定位；胞质区和白介素受体-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族的胞质区有高度的同源性，称为TIR（Toll/IL-1R)结构域，约200个氨基酸组成。 TLRs识别存在于各种病原体细胞表面分子，如酵母细胞壁的甘露糖以及细菌细胞壁的脂多糖、多肽糖及胞壁酸等各种成分，统称病原体相关的分子模式(PAMP). 1.2TLR的分布: 1.2.1细胞分布和亚细胞定位:TLRs是固有免疫细胞膜上的识别系统中重要组成部分，他们分布于各种组织的细胞膜上，分布十分广泛。如TLR1广泛表达于单核细胞、T和B淋巴细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC)、多形核白细胞、NK细胞；TLR2/4/5主要分布于除T、B、NK细胞以外的免疫细胞；TLR3主要表达于未成熟的DC等。但TLR因其识别的PAMP性质不同人在细胞中有不同的分布区。 TLR1/2/4/6分布于细胞表面，并能聚集到接触微生物的吞噬体上；TLR3/7/8/9则定位在细胞内，尤其是内质网上，并用于识别核酸。 1.2.2组织分布:不同的TLR在各种组织中有不同程度的表达，其中在淋巴组织尤其是脾和外周血的白细胞中表达最强。TLR1广泛分布且表达明显，如卵巢、脾脏；TLR2在肺、心脏、脑和肌肉组织可测到TLR2mRNA的表达；TLR3主要表达于胎盘和胰腺；TLR4表达于胎盘组织等;TLR5表达与前列腺和外周血单核细胞；TLR6、TLR9广泛表达于多种细胞；TLR10主要表达于淋巴样组织和脾脏细胞。 2TLR的配体 虽然TLR家族具有相似的结构，但TLR通过识别相应的配体来激活免疫反应。不仅外来病原体的产物，而且宿主自身的某些物质也可以是不同的TLR的配体。配体包括脂多糖（LPS)、病毒蛋白F、透明质酸酶、硫酸肝素、纤维蛋白原、酵母多糖、白色念珠菌以及宿主来源的热休克蛋白60（HSP-60)、纤维连接蛋白等。TLR1能识别细菌的三酰脂肽；TLR2识别的配体包括G+细菌、分支杆菌、疏密螺旋体、酵母菌和支原体的某些成分，如脂蛋白、脂肽、脂磷壁酸、肽聚糖和酵母多糖等；TLR3构成同源二聚体或与TLR4形成异源二聚体，识别鞭毛蛋白，还可识别多聚肌苷胞苷（poly riboinosinic polyribocytidylic acid， poly I:C)；TLR4形成同源二聚体，识别LPS及牛型结核杆菌胞壁的骨架、链球菌来源的脂质酸；TLR5特异识别细菌的鞭毛蛋白，有选择的识别渗透过肠上皮的细菌，并引起反应；TLR6主要识别细菌的肽聚糖和脂肽；TLR7、TLR8均能识别单链RNA病毒；TLR9主要识别细菌中非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG DNA)；TLR11能识别来源于尿路细菌的配体。 除了同型二聚体表现出来的功能外，TLR的一些功能也来自于异型二聚体。 3TLR的免疫功能 美国免疫学家Janeway（2000年）首次提出固有免疫细胞识别模式理论，被科学家观察杂志列为2001年十大生物科学重要进展之一。固有免疫细胞膜上不表达特异性抗原受体，但他们具有模式识别受体（PRR),能直接识别并结合各种病原微生物表达的固有保守基序的分子，即PAMPS,其中TLRs是固有免疫细胞膜上最重要的模式识别受体。 天然免疫细胞借助PRR中TLR,识别各种病原微生物的相关分子模式（PAMPs）。因此，天然免疫细胞可以区分自身和非自身成分，识别PAMPs后的天然免疫细胞，迅速被活化，无需这些细胞再克隆分化增殖，此时巨噬细胞通过胞内氧依赖性杀菌系统和氧非依赖行杀菌系统，杀伤病原体。同时把一些具有免疫原性的小分子抗原肽，借助主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)提供各相应T细胞，启动获得性免疫应答，分泌多种细胞因子，参与免疫调节或杀伤肿瘤细胞等生物学功能。因此，把天然免疫和获得性免疫紧密联系起来。 尽管目前所发现的TLR家族成员种类有限，但同一细胞或不同细胞间TLRs各成员间的相互组合及不同协助蛋白共同作用，组织有效的天然免疫应答，对相对广泛的病原微生物进行特异性识别，引起一系列特异的天然免疫和获得性免疫反应，以对抗微生物感染乃至慢性炎