2011年第24卷第11期
国药瑰宝阿胶主要有养血补血、美容养颜、调经安胎、改善睡眠、健脑益智、强筋健骨、延缓衰老、增强体质、增强免疫力等功效。芝牌阿胶口服液以阿胶为原料，配以黄芪、党参、熟地黄、枸杞子、乳酸亚铁、白砂糖、山梨酸钾、净化水等主要原料，制成保健食品，经实验证明对营养不良性贫血有保健功能。
本研究以改进硫酸-苯酚法测定阿胶口服液中粗多糖的含量：食品中分子量＞10000的高分子物质在800m L/L乙醇溶液中沉淀，与水溶性单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应以碳水化合物比色测定其含量，其颜色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖含量。
1材料与方法
1.1仪器T U-1800SP C型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，F A-2004型电子分析天
改进硫酸-苯酚法测定
阿胶口服液中粗多糖含量
谷陟欣1，2，辛秀1，2，刘淑妦1，2，张妮瑜1，2，卢捷1，2△
1九芝堂股份有限公司，湖南长沙410021；2湖南省中药固体制剂工程技术研究中心
［摘要］目的：考察改进硫酸-苯酚法测定阿胶口服液中粗多糖含量生产工艺的稳定性。方法：采用改进
的硫酸-苯酚法连续测定10批阿胶口服液中粗多糖含量。结果：样品经改进苯酚-硫酸显色剂显色后于485nm
波长处测定吸收度，在此波长处溶液的吸收度(y)与葡萄糖含量(x)在0～0.20m g范围内，呈良好线性关系，
y=0.0072x-0.00156，R2=0.9974。加样回收率为103.7%，R SD为2.15％(n=6)；10批口服液多糖含量以葡聚糖计
分别为21.6，21.5，21.8，22.6，21.6，22.0，22.6，22.9，22.8，22.4m g/100m L。结论：改进苯酚-硫酸显色法操作
简便，准确可靠，可作为阿胶口服液质量控制方法之一，其生产工艺稳定，可控。
［关键词］硫酸-苯酚法，改进；粗多糖；含量测定；阿胶口服液
［中图分类号］R282.5［文献标识码］A［文章编号］1004-6852(2011)11-0037-03
D etermination of P olysaccharides
in E-Jiao Oral Gelatin Using Improved P henol-Sulfuric Acid Method
GU Zhi-Xin1,2,XIN Xiu1,2,LIU Shu-feng1,2,ZHANG Ni-yu1,2,LU Jie1,2△
1Jiuzhitang Co.,Ltd.,ChangSha Hunan China410021;
2Hunan Engineering Research Center of TCM Solid Preparation
Abstract Objective:To establish E-Jiao oral liquid polysaccharides determination methods,samples were measured using improved phenol-sulfuric acid method.We observed several groups of continuous oral gelatin factory production of crude polysaccharides and analysis the results to inspect whether production process is stable.Method: Using improved phenol-sulfuric acid method determined polysaccharides content in E-Jiao oral liquid.Result:The results of the improved products of phenol-sulfuric acid after color development the absorbance was measured485nm,
in this wavelength absorption solution(y)and polysaccharides(x)in the range of0~0.20mg,linear relationship
y=0.0072x-0.00156，R2=0.9974,recoveries was103.7%,RSD was2.15%(n=6);5approved by oral dextral total poly-saccharides were21.6，21.5，21.8，22.6，21.6，22.0，22.6，22.9，22.8，22.4mg/100mL.Conclusion:The improved phenol-sulfuric acid method was a simple,accurate and reliable.The results showed that the method can be used as quality control of oral gelatin and gelatin oral production process was stable and controllable.
Keywords improved phenol-sulfuric acid method;polysaccharides;determination;E-Jiao oral liquid
方药·中药制剂
Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2011Vol.24No.11
平(上海天平仪器厂)，LD -2A 型离心机(湖南湘仪仪器有限公司)。
1.2试剂乙醇溶液(800m L /L )，氢氧化钠溶液(100g /L )，铜储备液(称取3.0g C uSO 4·5H 2O ，30.0g 柠檬酸钠，加水溶解并稀释至1L ，混匀，备用)，铜试剂溶液(取铜储备液50m L ，加水50m L ，混匀后加入固体无水硫酸1
2.5g 并使其溶解。临用新配)，洗涤剂(取水50m L ，加入10m L 铜试剂溶液，10m L 氢氧化钠溶液，混匀。临用新配)，葡聚糖标准储备溶液(10g /L )，葡聚糖标准使用液(0.10m g /m L )，显色剂(50m L 浓硫酸缓缓加入10m L 水中，放置冷却后加入0.6g 苯酚，混匀。临用新配)。1.3方法
1.3.1标准曲线制备精密吸取葡聚糖标准使用液，0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、
2.00m L (相当于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20m g )分别置于25m L 比色管中，准确补充水至2.0m L ，在旋转混匀器上混匀，加入显色剂1.0m L ，10.0m L ，于旋转混匀器上小心混匀2分钟，置沸水浴中煮沸30分钟，冷却后用分光光度计在485n m 波长处以试剂空白溶液为参比，1c m 比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。
图1葡聚糖标准曲线
如图1所示，在0～0.20m g 范围内，y =0.0072x -0.00156，葡聚糖含量(y )与吸光度值(x )呈良好线性关系，R 2=0.9974。
1.3.2精密度实验准确吸取样品测定液，连续测定5次，测定其吸光度值，结果显示，R SD 值为0.42%，精密度良好。
1.3.3稳定性实验在0、0.5、2、6、24、48小时取同一样品测定液，测定其吸光度值，结果显示，样品在48小时内稳定，R SD 值为0.77%，稳定性良好。1.3.4加样回收率精密吸取0.1050m g /m L 的葡聚糖标准使用液0.50m L ，加入已知浓度的样品测定液0.50m L ，置于6只25m L 比色管中，分别准确补充水至
2.0m L ，在旋转混匀器上混匀，加入显色剂1.0m L 、10.0m L ，于旋转混匀器上小心混匀2分钟，置沸水浴中煮沸30分钟，冷却后用分光光
度计在485n m 波长处以试剂空白溶液为参比，
1c m 比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖浓度，计算出样品中粗多糖含量。
结果显示，平均加样回收率为103.7%，在95.0～105.0%之间，R SD 值为2.15%，加样回收率良好。1.3.5样品处理
1.3.5.1沉淀粗多糖精密取液体样品10.0m L ，置于100m L 离心管中，加入无水乙醇40m L ，于旋转混匀器上小心充分混匀，静置10分钟。以4000r /s 离心15分钟，弃去上清液。残渣用800m L /L 乙醇溶液5m L 洗涤，4000r /s 离心5分钟后弃上清液，反复操作3次。残渣用水溶解(必要时超声溶解)并定容至25.0m L ，混匀后，供沉淀葡聚糖。
1.3.5.2沉淀葡聚糖精密取1.3.5.1项下溶液5.0m L置于50m L 离心管中，加入100g /L 氢氧化钠溶液5.0m L 、铜试剂溶液5.0m L ，沸水浴中煮沸30分钟，冷却后以4000r /s 离心15分钟，弃去上清液。残渣用洗涤液5m L 洗涤，4000r /s 离心5分钟后弃上清液，反复操作3次后，残渣用100m L /L 硫酸溶液
2.0m L 溶解(必要时超声溶解)并转移至10.0m L 容量瓶中，少量多次用水洗净离心管并加水稀释至刻度，混匀(必要时超声溶解)。此溶液为样品测定液。
1.3.5.3样品测定结果精密吸取样品测定液
2.0m L 置于25m L 比色管中，加入显色剂10.0m L 后于旋转混匀器上混匀2分钟，置沸水浴中煮沸30分钟，冷却至室温后用分光光度计在485n m 波长处，以试剂空白为参比，1c m 比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖质量，计算样品中粗多糖含量。同时作样品空白实验。2结果
样品含量测定结果，按照以上方法处理10批小试生产的芝牌阿胶口服液(m g /m L )，测定结果见表1。
表1芝牌阿胶口服液中粗多糖含量
批号粗多糖含量/(×102m g ·m L -1)
2011022121.62011022321.52011030221.82011030822.62011031221.62011041222.020********.62011050121.92011050422.820110505
22.4
由表1可见，粗多糖含量以葡聚糖计分别为
葡萄糖浓度/(μg ·m L -1)
吸光度值/A B S
方药·中药制剂
2011年第24卷第11期
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《西部中医药》
2012年
《西部中医药》（原《甘肃中医》）杂志由甘肃省卫生厅主管，甘肃省中医药研究院、中华中医药学会主办，是中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊)、中文生物医学期刊文献数据库———C M C C 收录期刊、中国生物医学期刊引文数据库———C M C I 收录期刊、中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊、中文科技期刊数据库（全文版）收录期刊、中国核心期刊（遴选）数据库收录期刊、中国期刊全文数据库全文收录期刊。曾荣获全国中医药优秀期刊三等奖，2008年荣获“甘肃省优秀期刊”称号。本刊为月刊，大16开，112页。
办刊宗旨反映西部地区中医药研究、开发和应用成果，传播中医药信息与研究动态，继承发扬中医中药传统，促进中医药理论研究与学术交流。
主要栏目论著：理论论著、临床论著；方药：道地药材、方剂配伍、药学研究、中药制剂、本草新证；论坛：学术传承、博士论坛、医史文献、中医文化、教学研究、医疗管理、学术观点、杏林留芳、释古博今、医理溯源；专题：丝路医药、民族医药、灾害医学、流行病学、政策法规、调查分析、标准规范；报道：临证经验、衷中参西、特色医疗、临床护理、诊断剖析；动态：前沿探索、研究进展、品墨闻香、译林新意。
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21.6，21.5，21.8，22.6，21.6，22.0，22.6，22.9，22.8，22.4m g /100m L ，R SD=2.17%，结果表明阿胶口服液生产工艺稳定、可控。3讨论用硫酸苯酚法［1-9］
进行测定时采用吸取样品
测定液2.0m L 置于25m L 比色管中，加入50g /L
苯酚溶液1.0m L ，在旋转混匀器上混匀后，小心加
入浓硫酸10.0m L ，加热煮沸使其显色。静置冷却
后于485n m 波长处检测其吸光度。由于加入硫酸
时，系统显色温度相差较大，而造成相应的偶然误差，经过考察实验，硫酸滴入的位置以及速度对其结果造成显著性差异。
而改进后的方法［10］
，先将水和硫酸混合，对
浓硫酸起到了稀释的作用，冷却后加入苯酚，配置
成显色液。通过沸水浴加热使其显色，保证了反应系统温度一致，很好地解决了检测的重现性和准确度不佳的问题。经过考察实验，硫酸滴入的位置
以及速度对其结果不会造成显著性差异。
为使检测值落在良好线性范围内，并使得操作
过程的误差对其结果造成的影响较小，将样品的取样量增大至10.0m L ，用无水乙醇沉淀样品后，经过考察，离心时间和转速必须达到以4000r /s
离心15分钟，才能使得沉淀完全，滤饼较为紧凑。而第一步沉淀粗多糖时，使用水将其溶解并定容，由于存在皂苷等因素的影响极易定容不准确，故将其定容量增大至25.0m L 。第二步沉淀葡聚糖时，为使检测样品浓度落在良好线性范围内，故将
其定容量缩小至10.0m L 。
改进后的方法最低检测限、精密度、稳定性、加样回收率均较理想，操作简便，可重复性强。考虑到各批次药材中多糖含量的波动及有效期内多糖含量有略微的降低等因素，最终规定：
本品每批次粗多糖以葡聚糖计，含量不得少于0.18m g /m L ，以便控制该制剂的质量。参考文献［1］沈向红.保健食品中粗多糖测定方法研究［J ］.实用预防医
学，2001，8(6)：461-462.
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出版社，2002：77.［3］周跃斌，王伟，周向荣，等.苯酚-硫酸比色法测定毛竹叶多
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收稿日期：2011-08-21作者简介：谷陟欣(1978—)，男，硕士学位。研究方向：药物制剂。
△通讯作者：卢捷(1958—)，女，高级工程师。研究方向：药物制剂。
方药·中药制剂
苯酚硫酸法测多糖含量 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制 1. 浓硫酸：分析纯，% 2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。 3. 标准葡聚糖（Dextran,Pharmacia）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。 2、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取、、、、、、及，各以蒸馏水补至，然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 123456780 标准葡萄糖溶液 （mL） 蒸馏水（mL） 5%苯酚（mL） 浓硫酸（mL） 3 注意事项
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数校正μg数。（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在——之间。比如：小于之下可以考虑取样品时取2克，仍取样品液，如大于可以减半取的样品液测定。 （5）正常的反应溶液是深棕色。糖越多颜色越深。注意硫酸的纯度。空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明你的酚的难度过大，一般是5%但是没遇到你说的那么严重，不是深红色的做的好的时候颜色很浅，颜色深点也有肯能。 操作的时候有几条你需要注意的，这些对你的检测结果影响极大 1、苯酚需要重蒸，配制的苯酚溶液需要妥善保存。 2、样品检测的时候，向样品中加了苯酚溶液需要迅速摇匀，加入硫酸基本操作：硫酸沿壁加，最好能旋转比色管，让硫酸能均匀的沿壁流下。 3、加完硫酸需要立即摇匀，前提是塞子要配套，不怕烫热、冷水浴，要准确。
实验一 硫酸－苯酚法测多糖含量 1．目的要求 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量 2．方法原理 糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。 3．主要实验仪器及材料 浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。 ４．掌握要点 硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。 ５．试剂配制 1）葡萄糖标准液的配制 准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。2）90%苯酚液的配制 准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存 3）6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。 6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤 管号0 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL软件求得回归方程 2）待测样品多糖的测定与计算 将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚-硫酸法 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 [试剂] 6%苯酚： 先配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 再配置6%苯酚：取75ul的80%苯酚于烧杯中，加入960ul水（每次测定均需现配），测定的时候就用6%的苯酚来测！ 浓硫酸 [操作] 1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2．样品含量测定： 吸取2.0ml样品，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置30分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 可能有以下问题需要注意:
1。苯酚是否重蒸、其溶液浓度、是否现配现用 2。加入硫酸后是否加热、显色时间的确定 3。阁下所选波长：这个最为重要，因为已糖及其甲基化衍生物在490nm下有最大吸收峰，而戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在480nm下有最大吸收峰。如果阁下的多糖样品不是单一品而是数种混合（纯化也难一达到100%纯），则波长一定要扫描过再做 4。加浓硫酸前要摇匀，加之后也要摇匀。 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 试剂 1．浓硫酸：分析纯，95.5% 2．80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3．6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。 5．15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6．5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制 ①浓硫酸：分析纯，95.5% ②80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） ③5%苯酚：取苯酚100 g，加铝片0. 1 g和碳酸钠0. 05 g，常压蒸馏,收集182℃馏分。称取 该馏分(100%苯酚)5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中， 冰箱中冷藏储存备用。 ④标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g经105℃干 燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。 2、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入6%（5%，9%）苯 酚0.5ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同 样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL）0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 6%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3 注意事项 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
多糖浓度测定及标准曲线谭夕东 苯酚-硫酸法 1. 对照品的溶液的制备取干燥至恒重的无水葡萄糖0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。 供试品的溶液的制备精密量取本品50ml，置250ml量瓶中，加30%硫酸锌溶液5ml，在水浴中加热5分钟后，在振摇下立即加入亚铁氰化钾试液5ml，冷却后加水至刻度，摇匀，滤过，弃取初滤液，取续滤液25ml，置500ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。 测定方法精密量取对照品溶液与供试品溶液各2ml，分别置10ml量瓶中，各加2%苯酚溶液0.5ml，硫酸5ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法测定。 2.标准曲线的绘制： 精密称取千燥恒重的葡萄糖100mg，用水溶解并稀释至100ml，备用。精密吸取备用液10ml加水稀释至100ml定容，得葡萄糖标准液。精密吸取标准液100、200、…700微升，分别置于试管内，各加水使成2ml，再各加5%苯酚试剂1.0ml，各管迅速滴加浓硫酸5.0ml，立刻摇匀。沸水加热15分钟，迅速冷却，另取2ml水，同法操作加入试剂作空白对照．用紫外可见分光光度计在入=490nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程 海藻酸钠样品1g,用100mL蒸馏水溶解并定容。 壳聚糖溶液的配制： ①先将50mL冰醋酸溶于1000mL的蒸馏水中制成5%的乙酸水溶液1000mL待用。 ②称取壳聚糖5g溶于500mL5%的乙酸水溶液中配成10g/L的壳聚糖乙酸溶液。或精密称取壳聚糖40 mg于100 mL量瓶中，用0. 5 mol·L-1’醋酸溶解并定容。 几丁质不溶于水、稀酸、稀碱及绝大部分溶剂中，据目前所知，几丁质仅能溶于少数溶剂，如六氟异丙酮，六氟丙酮水合物、吡咯烷酮的氯化锂溶液，一些氯醇和浓酸等。 1
简介 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 原理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 试剂 1．浓硫酸：分析纯，95.5% 2．80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3．6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。 5．15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6．5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 7．6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8．6mol/L 盐酸 操作 1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2．样品含量测定： ①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 ②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。） ③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。 ④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小
实验硫酸苯酚法测多糖 含量 GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-
实验一 硫酸－苯酚法测多糖含量 1．目的要求 2．测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量 3．2．方法原理 4．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。 5．3．主要实验仪器及材料 6．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。7．４．掌握要点 8．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。 9．５．试剂配制 10．1）葡萄糖标准液的配制 11．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。 12．2）90%苯酚液的配制 13．准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存 3）6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。 6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤 7.管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8.葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 9.苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10.浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 11.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL软件求得回归方程 12.2）待测样品多糖的测定与计算
硫酸苯酚法测可溶性总糖含量 一、测定原理 可溶性糖主要有能溶于水及乙醇的可溶性单糖和寡聚糖。糖在浓硫酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚所合成一种橙红色化合物，在10~100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，因此可用比色法在此波长下测定。硫酸苯酚法可以用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高且不受蛋白质存在的影响，产生的颜色稳定时间160min以上。 二、实验试剂 1．90%苯酚溶液：称取90g苯酚，加蒸馏水定容至100ml。 2．9%苯酚溶液：取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现配先用。 3．浓硫酸（比重） 4．1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在 80 ℃下烘至恒重，精确称取 1.000 g ，加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。 5．100μg/L 蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液lml加入 100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。 三、仪器设备 分光光度计，50ml比色管7支，移液管 四、实验步骤 1．标准曲线的制作 取20 ml刻度试管6支，从0～5分别编号，按表1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1ml 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20 s 时间加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在室温下放置30 min ，显色。然后以空白为参比，在485 nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。 2 膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25 ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 3．测定吸取样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水 ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，计算测试样品中糖
总糖的测定：苯酚硫酸法 2008-12-06 22:38:00 作者：来源：互联网浏览次数：758 文字大小：【大】【中】【小】 苯酚-硫酸法测定总糖 [原理] 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 [试剂] 1．浓硫酸：分析纯，95.5% 2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。 5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8． 6mol/L 盐酸 [操作] 1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0. 4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5. 0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2．样品含量测定：
①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 ②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。） ③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。 ④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 [注意] 测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
苯酚—硫酸法测定党参总糖 1．材料与方法 1．1 材料与试剂，仪器 1.1.1 材料、试剂 党参（肉党、普通纹党、产于中寨的纹党）；95％乙醇；苯酚；浓硫酸均为分析纯。 1.1.2 仪器与设备 FA-2400分析天平，101A型电热鼓风干燥箱，Mb型可调式电热板，电热恒温水浴锅，SK5200H超声清洗器，UV-9100紫外-可见分光光度计 1.2 方法 1.2.2 供试品溶液的制备 取党参粉末2g，置圆底烧瓶中，加95％乙醇3次（20.20.20ml）每次2h,过滤，蒸干乙醇，残渣用水溶解，在电热板上加热，提取3次（50.50.50ml）,每次2h，过滤，滤液置于50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度摇匀。 1.2.3 标准溶液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖10mg置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度摇匀，得0.1mg／mL的储备溶液，备用。 1.2.3 5％苯酚溶液的制备 精确量取6.3ml 80％的苯酚溶液转移至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后置于棕色试剂瓶中，备用。(实验室苯酚为师姐配好的80％的溶液，避光密封保存于冰箱中，用时水浴加热使其成为透亮的溶液) 1.2.4 标准曲线的制备 精确吸取葡萄糖标准液0、1、2、3、4、5、6 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，以蒸馏水补至 10 mL摇匀，依次吸取2ml加入试管中，加入苯酚液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，混匀，在室温放置30 min后，于波长490 nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 (10*10-2mg.ml*1/10=10*10-3mg.ml-1=10μg/ml.20.30.40.50.60) 1.2.5 样品的测定 准确吸取供试品溶液0.1 mL加水定容至10mL，精确吸取此稀释液2mL于试管中，按标准曲线制备的方法测定吸光度值，并根据回归方程，求得其浓度，计算样品中总糖的含量。（党参溶液的浓度=2/50*0.1/10=1/2500g.ml-1=1/2.5 mg.ml-1=400μg.ml-1） 2 结果与分析
实验一硫酸－苯酚法测多糖含量 1．目的要求 2．测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量3．2．方法原理 4．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。 5．3．主要实验仪器及材料 6．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。7．４．掌握要点 8．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。 9．５．试剂配制 10．1）葡萄糖标准液的配制
11．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。 12．2）90%苯酚液的配制 13．准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存 3）6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。 6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤 7.管号0 1 2 3 4 5 6 7 8.葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 9.苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10.浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 11.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml 的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL软件求得回归方程12.2）待测样品多糖的测定与计算
生物药物 随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。 １ 苯酚－硫酸比色法原理 苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。 ２ 实验方法 ２．１ 标准溶液的配制 精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。 ２．２ 供试品贮备液的配制 将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。 ２．３ 苯酚溶液的配制 称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。２．４ 测定条件选择 ２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。 ２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。另取供试品液和对照品液０．６ｍＬ各５份，分别加苯酚液１．０ｍＬ，再分别滴加浓硫酸２．０，３．０，４．０，５．０，６．０ｍＬ，并均用水稀释至８．０ｍＬ，根据Ａ的稳定性，计算硫酸的最佳加入体积。 ２．４．３ 反应时间选择及稳定性 分别取供试品液和对照品溶液１．０ｍＬ４份，各加苯酚液１．０ｍＬ，浓硫酸５．０ｍＬ，于选定温度分别恒温１０，２０，３０，４０ｍｉｎ。测得Ａ值，加热到一定时间以后，Ａ值不再变化，说明加热该时间即可使反应完全。另测反应完成后样品在不同时间内的Ａ值，结果应在１ｈ以上稳定。 ２．５ 标准曲线的绘制 依据２．４确定的测定条件，精密吸取葡萄糖标准 苯酚－硫酸比色法测定多糖含量张青 张天民 （山东正大福瑞达制药有限公司 济南 ２５００１４）
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制 1. 浓硫酸：分析纯，95.5% 2. 5%苯酚：取苯酚5 g ，置100 ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。 3. 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia ）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g 经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml 容量瓶中，蒸馏水溶解定容。 2、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg 于250ml 容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml ，各以蒸馏水补至1.0ml ，然后加入5%苯酚1ml 及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min 以后于490nm 测光密度，以1.0ml 水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL ） 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 蒸馏水（mL ） 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL ） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
葡萄糖标准曲线 y = 54.353x + 0.0018 R 2 = 0.9994 00.10.20.30 0.0010.0020.003 0.0040.0050.006 葡萄糖浓度（mg/ml） 吸光值 3 注意事项 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg 数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml 样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml 的样品液测定。 （5）正常的反应溶液是深棕色。糖越多颜色越深。注意硫酸的纯度。空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明你的酚的难度过大，一般是5%但是没遇到你说的那么严重，不是深红色的做的好的时候颜色很浅，颜色深点也有肯能。 操作的时候有几条你需要注意的，这些对你的检测结果影响极大 1、苯酚需要重蒸，配制的苯酚溶液需要妥善保存。 2、样品检测的时候，向样品中加了苯酚溶液需要迅速摇匀，加入硫酸基本操作：硫酸沿壁加，最好能旋转比色管，让硫酸能均匀的沿壁流下。
硫酸－苯酚法测多糖含量 1．目的要求 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量，如1型。 2．方法原理 糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。 3．主要实验仪器及材料 浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。 ４．掌握要点 硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。 ５．试剂配制 1）葡萄糖标准液的配制 准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。2）90%苯酚液的配制 准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存可达半年。 3）6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。 6. 实验步骤 表1 标准曲线的制作步骤 管号0 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL软件求得回归方程 2）待测样品多糖的测定与计算 将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意
苯酚-硫酸法测多糖含量 一、原理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 二、试剂 1、浓硫酸：分析纯，95.5% 2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。 5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8、6mol/L 盐酸 三、操作 1、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2、样品含量测定 1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 2）离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。 3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。 4）定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,
分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。 2. 适用范围 参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。 3.仪器 （1）分光光度计 （2）离心机 （3）旋转混匀器 （4）恒温水浴锅 4.试剂 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 （1）80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。 （2）2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无水硫酸钠至饱和。（3）铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2周。 （4）铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。（5）洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。（6）1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。 （7）20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。 （8）葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h 至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/ml。 （9）葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。 5. 操作方法 5.1 样品处理 （1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml （V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。 （2）沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml （V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。 （3）沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml （V3），混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。（4）测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水浴煮沸2分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。 5.2 标准曲线制备： 精密吸取葡聚糖标准应用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml（分别相当于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），补充水至2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，浓硫酸10ml，混匀，沸水浴2分钟，混匀，沸水浴2分钟，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值（A），以葡聚糖浓度为横坐标，A 为纵坐标绘制标准曲线。
苯酚-硫酸法 1. 原理 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 2. 试剂 浓硫酸 6%苯酚： 先配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。再配置6%苯酚：取75ul的80%苯酚于烧杯中，加入960ul 水（每次测定均需现配）。 3. 操作步骤 (1) 制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 (2) 样品含量测定： 吸取1.0ml样品，补水至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置30分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意事项: 1、苯酚是否重蒸、其溶液浓度、是否现配现用 2、加入硫酸后是否加热、显色时间的确定 3、所选波长：这个最为重要，因为已糖及其甲基化衍生物在490nm下有最大吸收峰，而戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在480nm下有最大吸收峰。如果阁下的多糖样品不是单一品而是数种混合（纯化也难一达到100%纯），则波长一定要扫描过再做 4、加浓硫酸前要摇匀，加之后也要摇匀。
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。（5）正常的反应溶液是深棕色。糖越多颜色越深。注意硫酸的纯度。空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明苯酚的浓度过大。 操作的时候有几条你需要注意的，这些对你的检测结果影响极大 1、苯酚需要重蒸，配制的苯酚溶液需要妥善保存。 2、样品检测的时候，向样品中加了苯酚溶液需要迅速摇匀，加入硫酸基本操作：硫酸沿壁加，最好能旋转比色管，让硫酸能均匀的沿壁流下。 3、加完硫酸需要立即摇匀，前提是塞子要配套，不怕烫热、冷水浴，要准确。
实验一 硫酸-苯酚法测多糖含量 1. 目的要求 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量 2?方法原理 糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈 线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖 含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。 3?主要实验仪器及材料 浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。 4.掌握要点 硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。 5 .试剂配制 1）葡萄糖标准液的配制 准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液， 摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。 2）90%苯酚液的配制 准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存 3）6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。 6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤 AvV 口吕号0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 苯酚液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 取8支干净的具塞试管按表 2方法在操作，先在冰水浴中加入 0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n, 取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用 exceL软件求得回归方程 2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测
实验一硫酸苯酚法测多糖 含量 The pony was revised in January 2021
实验一 硫酸－苯酚法测多糖含量 1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量 2．2．方法原理 3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。 4．3．主要实验仪器及材料 5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。 6．４．掌握要点 7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。 8．５．试剂配制 9．1）葡萄糖标准液的配制 10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。 11．2）90%苯酚液的配制
12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制 将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。 6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤 7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 7 8.葡萄糖 9. 10.苯酚液 11.浓硫酸? 12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL 软件求得回归方程 13.2）待测样品多糖的测定与计算 14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。