南方红豆杉基因组DNA纯化
摘要：以红豆杉叶为材料，采用CTAB法对红豆杉基因组DNA的进行提取，经紫外
分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。将DNA产量、质量等方面进行总结，发现所
提取得到的基因组DNA中蛋白质、多糖、色素、脂质、多酚以及RNA等去除较彻
底。所得产物可用于下一步的研究工作。
关键词：南方红豆杉；DNA；纯化
Abstract : Taxus leaves genomic DNA were extracted by CTAB method and detected by UV spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. Protein, amylose, pigment, lipid, polyphenol and RNA wiped off thoroughly and we got purify DNA sample that can be used in next research.
Key words：Taxus chinensis，DNA，Purification
红豆杉是红豆杉科 (Taxaceae)红豆杉属 (Taxus)植物的总称，在中国民间一般称“紫杉”[1]。自然分布地域很窄、零星，年净生长量很低，80年代末90年代初以来，很多商人曾通过各种途径在资源相对集中的南岭山地高价收购其树皮，再加上本地区盲目性发掘，成千上万株遭到毁灭。
由于红豆杉植物属于世界珍贵稀有树种，资源稀少，且培育困难，故世界上对紫杉醇的需求较旺、货源紧缺。紫杉醇有“植物黄金”之称，从红豆杉中提炼高纯度的紫杉醇，其价值是黄金的十余倍。在未来15年至20年时间内，紫杉醇是治疗乳腺癌、子宫癌无可替代的药物。红豆杉的提取物紫杉醇，紫杉醇是目前世界上治疗癌症的有效新药，尤其对女性乳腺癌和子宫癌有特效[2]。
所以对红豆杉基因组DNA的提取纯化工艺的研究具有重要的理论和应用意义，纯度是衡量红豆杉基因组DNA质量的一个重要标准。
基因组DNA的功能起着贮存和传递遗传信息的作用。遗传物质必须具有相对的稳定性；能够精确的自我复制，使亲代与子代间保持遗传的连续性；能够指导蛋白质合成，控制新陈代谢过程和性状发育；在特定条件下产生可遗传的变异。DNA的一级结构：脱氧核苷酸在长链上的排列顺序就是；DNA的二级结构：右手双螺旋结构；DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。DNA 通常只能在细胞核的染色体上找到，生殖细胞中DNA的含量是体细胞内DNA含量的一半。DNA含量的这种变化情况，与生殖细胞和体细胞内染色体数量的变化有对应平行关系，蛋白质等物质不具备此种量变特点。同一种生物，不论年龄大小，不论是身体的哪一种组织，
在一定条件下，每个细胞核里的DNA含量，基本上是相同的。而其他物质，包括RNA和蛋白质，在细胞生长的各个阶段，含量变化都比较大[3]。
DNA提取纯化工艺的研究具有重要的理论和应用意义，纯度是衡量产品质量的一个重要标准。DNA是遗传信息的载体, 既是最重要的生物信息分子, 也是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验[4]。红豆杉DNA的提取和纯化是植物基因工程研究的基础操作，实施分子标记，基因文库的构建，基因分离及遗传转化和鉴定等都是以提取DNA为前提。
本试验以细胞生物学研究为基础，以如何获取高质量、高纯度DNA为目的，CTAB
法提取红豆杉基因组DNA，再将提取得到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析和紫外吸收分析，检测所提取的红豆杉基因组DNA的效率和质量进行分析。
1材料与仪器
1.1材料
新鲜南方红豆杉叶 (材料取自四川农业大学都江堰分校)
2×CTAB缓冲液（2﹪CTAB、0.1mol/L Tris-Hcl、20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl、1﹪PVP、0.2﹪β-琉基乙醇）、DNA洗液、TE缓冲液、氯仿/异戊醇（24：1）、无水异丙醇、无水乙醇、75%乙醇、3mol/L NaAc(PH 5.2)、液氮
1.2仪器
Eppendorf5804离心机、Eppendorf biophotometer分光光度计、微量移液器 Eppendorf、电泳仪BIORAD Basic、水平电泳槽BIORAD SubCell GT、凝胶成像仪BIORAD GelDoc XR、电子天平、旋转蒸发仪、分液漏斗、三角瓶、吹风、水浴锅。
2提取步骤
（1）取10克原材料放入研钵在加入液氮快速研磨成粉末，迅速将粉末分装到EP管中，每个管中加入65℃预热的2×CTAB溶液，继续在60℃水浴中反应1h，期间定时颠倒混匀数次。
（2）每管加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，10000rpm离心15min，收集上层水相。加入等体积异戊醇，混匀，室温静置30min，离心收集沉淀，得到初步的DNA产物。DNA 沉淀在DNA洗液中浸泡10min，倾去洗液，待洗液中的乙醇成分挥发后，沉淀重新溶于20倍体积TE中。
（3）DNA溶液加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1），混匀，离心，进一步除去蛋白质。收集上层水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），再加入2倍体积的无水乙醇，低温条件静置30min。离心收集沉淀，75%乙醇洗涤，干燥，重溶。
3纯化步骤
（1）取1ml DNA溶液10000rpm离心2min，小心弃上清液，收集沉淀。加入100ul TE缓冲液，震荡混匀。加入1ml GN结合液，轻柔混匀。
（2）将混和液小心转入纯化柱，静置4min。10000rpm离心30秒，倒掉收集管中废液。（3）将剩下的混和液也转入纯化柱，重复第二步。
（4）用0.5ml漂洗液洗2-3次，10000rpm离心30秒。将漂洗完毕的离心纯化柱在离心1min，彻底去除残留漂洗液。再将纯化柱套入一个干净的1.5ml离心管中,开盖放置2-3min使漂洗液挥发，加入100ul TE缓冲液，静置2min后10000rpm离心1min。再将洗脱液又吸入纯化柱，再洗脱一次。即得较高产量的基因组DNA。
4实验结果与检测
4.1紫外分光测定与分析
（1）外观观察：提取得到的红豆杉基因组DNA沉淀为白色，干后较为透明，纯度较高。
（2）紫外分光测定法：在A260和A280处测得的OD值的比值（光密度读数）可作为核酸纯度的指标（A260/A280）。测量260nm处的紫外吸收值，用于定量，每个OD值相当于DNA浓度为50μg/mL。用样品在260nm的读数计算核酸的浓度：
ds DNA：C（ug/ml）=A260 × 50 ×稀释倍数×原液体积
DNA提取率(ug/g)=DNA浓度×体积/取材量(g)
表1 基因组DNA OD值测定表
测量260nm 处的紫外吸收值，用于定量，每个OD 值相当于DNA 浓度为50μg/ml 。表1中的三组数据A 260/A 280的OD 值分别为1.79、1.65、1.79，平均值为1.74333，平均值也很接近1.80,说明经纯化的DNA 的纯度相对较高。纯化后的第1次、第3次提取的基因组DNA 中还含有极少量蛋白质，基因组DNA 非常纯净。只有第2次A 260/A 280的OD 值为
1.65，可以看出基因组DNA 中含有较多蛋白质，有可能在去蛋白质操做过程中出现操作不当使误差增大。
4.2电泳检测与分析
琼脂糖凝胶电泳是最通常用来分离与鉴定DNA 的简单而有效的方法，经过电泳后可知待测DNA 的质与量。
其操作步骤如下：制备琼脂糖凝胶→点样与电泳→观察与照相
本实验采用凝胶浓度为1﹪,电压120V ,电泳1h 。观察提取的DNA 电泳速度，电泳速度慢的样品中含糖类等杂质多，反之则少。DNA 带清晰明亮说明DNA 含量及纯度高，反之则低（图1）。
M 1 1 1 2 2 2 3 3 3
图1 基因组DNA 电泳图谱
项目 第1次 第2次 第3次 平均值 光程(mm) 2 2 2 2 A 260 0.378 0.377 0.372 0.37567 A 280 0.211 0.229 0.208 0.216 A 320 0.073 0.072 0.07 0.07167 A 260/A 280 1.79 1.65 1.79 1.74333 浓度(ug/ml ) 0.0567 0.0568 0.0562 0.05657 提取率(ug/g ) 0.01134 0.01136 0.01124 0.01131 提纯率(ug/g ) 0.01027 0.01032 0.01005
0.01021
1、第1次纯化点样；
2、第2次纯化点样；
3、第3次纯化点样
琼脂糖凝胶电泳图片上还可以清楚的看到纯化后的产物中仍然有杂质带。这些现象都是与实验操作步骤密切相关，才用相同方法提取及纯化得到产物只含有相对较少的同一类杂质，说明在调配pH值以及盐析时其值偏高或降低，另外在纯化时室内的温度也对蛋白质的除去有影响。在琼脂糖凝胶电泳时影响电泳条带分析的因素有：琼脂糖凝胶的浓度、电压过高、缓冲液的pH、温度等方面[10]。
结论
CTAB法是改变盐浓度选择性地沉淀DNA，可以早期去除色素、多糖类杂质，避免DNA 与它们共沉淀后再难分离而得到较纯的DNA。
纯化基因组DNA是根据经碱变性，使蛋白质在高盐作用下沉淀，通过离心除去细胞碎片染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀,而质粒DNA在上清夜中与核酸吸附材料在室温条件下质粒DNA特异吸附于其上，经过高盐充分洗涤去杂质，在低盐缓冲液洗脱，获得高浓度的基因组DNA [11]。
可以根据不同研究目的、不同研究对象，建立了红豆杉基因组DNA的提取方法及纯化。是进一步获取一定数量和高质量的DNA样品，是进行限制性酶切、PCR扩增、分子杂交以及基因组学研究的基础。
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中国科学院北京基因组研究所 2006年招收攻读博士学位研究生入学统一考试专业试题 科目名称：生物化学科目代码：234 考试时间：2006年3月18日下午2：00-5：00 考生须知： 1．本试卷满分为100分，全部考试时间总计180分钟。 2．所有答案必须写在答题纸上，写在试题纸上或草稿纸上一律无效。 问答题：（共6题，第1、6小题各20分；第2、3、4、5小题各15分。） 1．有三种同位素标记的丙酮酸，它们在C-1、C-2、和C-3位上分别标记14C。如果它们在丙酮酸脱氢酶的作用下进入三羧酸循环，哪一种标记的丙酮酸分子在三羧酸循环中最先释放14CO2那一种标记的丙酮酸分子在三羧酸循环中最后释放14CO2请解释你的推论并写出酶反应方程。 2.假定原核RNA聚合酶基因可在一个真核细胞中表达，它的蛋白质产物可否催化真核细胞基因的转录请说明你的理由。如果将一个真核细胞的基因转入到原核细胞中表达，请设计三种完全不同的实验方案实现这一目的，并详细说明实验途径。 3．家族性高胆固醇血症是一种LDL受体缺损的人类遗传疾病，患者血液中通常含有远高于常人的胆固醇浓度，而且伴有严重的动脉粥样硬化。请解释为什么这种遗传病会导致高胆固醇血症在这种患者中，组织细胞内的胆
固醇合成是否受到影响为什么如果要发明一种该疾病的基因治疗术，哪些基因会在你的考虑之中为什么 4．Jacob 和Monod 在20世纪60年代初期提出乳糖操纵子模型，开创了基因表达调节研究的新领域。根据该模型，请描述大肠杆菌在含有1）乳糖和葡萄糖、2）葡萄糖或3）乳糖的培养液中培养时，乳糖操纵子的转录速率是如何变化的 5．当小鼠的瘦素受体缺陷时可发展成为一个二型糖尿病的模型，即所谓db/db模型。该模型的血液中胰岛素浓度显着低于正常小鼠。请解释为什么db/db小鼠的血糖浓度远高于正常小鼠 6．PCR是上个世纪生物分子学技术革命的里程碑，然而传统的PCR并不是一个理想的定量分析技术。近年来，定量PCR技术（Realtime PCR）得到了长足的发展。请回答下列问题： a.为什么传统的PCR技术不合适定量分析 b.Realtime PCR是如何实现定量分析的 c.假定有A和B存在于一个细胞系中，它们基因表达在VEGF刺激下发 生改变。试设计一组实验，利用Realtime PCR技术跟踪这些改变。科目名称：生物化学 第1页共1页
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
小鼠血浆中HSV-1 DNA的提取 [目的] 掌握血浆中病毒DNA 提取的原理，熟悉其提取方法。 [原理] E.Z.N.A.?Viral DNA Kit 该试剂盒提供了从小于250ul血浆、血清、无细胞培养液等样品中快速简单地提取病毒DNA的方法，液体样品经Buffer BL和蛋白酶（OB）消化后，经乙醇调节结合条件，过柱吸附DNA，再经过两步快速洗涤后，最后用Elution Buffer (10mM Tris,pH8.5)溶解基因组DNA。纯化的DNA可直接用于PCR，Southern杂交，酶切等实验。 [试剂及仪器]旋涡混合振荡仪；微量DNA定量仪；台式离心机；65℃水浴锅。 1.5ml无菌EP管（2个/人）；EP抗凝管(含100ul抗凝剂)（K）；1000ul枪及枪头；。Hibind DNA 结合柱(1个/人)；2ml收集管（3个/人）；OB蛋白酶（OB）；Buffer B L（含线性丙烯酰胺）(BL)；乙醇(乙)；Buffer HB(HB)；DNA Wash Buffer（W）；Elution Buffer(EB)。 [实验步骤] 一、血浆样品的制备： 1.用微量加样器取100ul抗凝剂加入1.5mlEP管中。 2.右手抓起小鼠尾巴，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子迅速摘除 眼球，将流出的血液滴入含有抗凝剂的1.5ml EP管中，迅速混匀后，10000rpm，离心3min。 上层黄色透明的即为血浆。 二、DNA的提取 1.取血浆250ul（如不足250ul，用Elution Buffer补足250ul）于1.5ml无菌EP管中。 2.加入10ul OB蛋白酶和250ul BL Buffer（含4ul线性丙烯酰胺用于填补病毒DNA在吸附 柱上的本底吸附），于旋涡混合振荡仪上最大速度振荡15sec。 3.65℃孵育10min。孵育过程中，用旋涡混合振荡仪混匀一次。 4.加入260ul乙醇，旋涡混合振荡仪最大速度振荡20sec。12000×g离心10sec，使盖子上的 液体沉于管中。 5.将Hibind DNA结合柱装在2ml收集管中，将第4步离心的上清中所有液体（约760ul） 加入Hibind DNA结合柱装上，8000×g离心1min。卸下收集管，将收集管及其中的液体弃去。 6.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入500ul HB Buffer，8000×g 离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。、 7.向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，卸下收集管，将收集管及其中 的液体弃去。 8.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入700ul DNA Wash Buffer， 8000×g离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。 9.将空的Hibind DNA结合柱15000×g离心2min，以去掉其中残余的液体。卸下收集管， 将收集管及其中的液体弃去。----这一步非常重要 10.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的无菌1.5ml EP管上（事先做好标记），加入50-100ul 65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min后，8000×g离心1min，洗脱液中即含有病毒DNA。 三、DNA定量： 微量DNA定量仪。取1.5ul用于DNA定量。
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
病毒基因组DNA 提取试剂盒 Virus Genomic DNA Kit (目录号：HS0307) 产品包装 自备试剂 无水乙醇 储存条件 蛋白酶K 于-20℃，其他组分室温（15 ~ 25℃） 产品简介 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的血浆、血清和无细胞体液中提取高质量的病毒DNA 。无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提，独特的缓冲液/蛋白酶K 体系能迅速裂解病毒，使病毒蛋白与DNA 分离，在蛋白酶K 的作用下降解病毒蛋白，在高盐状态下将病毒DNA 选择性吸附于硅基质膜上，再通过快速的漂洗、离心步骤，去除蛋白等杂质，最后低盐的洗脱缓冲液将高纯度的病毒DNA 从吸附柱膜上洗脱下来。 本试剂盒操作简单、快速，所得病毒DNA 不含蛋白、核酸酶和其他杂质，可直接用于PCR 、RT-PCR 、Real-Time PCR 、印迹等分子生物学实验。 产品特点 1.简便快速，1小时内可获得高纯度的病毒基因组DNA 。 2.无需有机溶剂抽提，使用安全。 3.重复性好，产量高。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.
4.所得病毒DNA纯度高，无污染物和抑制剂，方便下游应用。 注意事项 1.血清或血浆避免反复冻融，否则会使蛋白变性或产生沉淀，导致提取的DNA片段小，提取量下降。 2.如缓冲液Buffer GB、Buffer GD结晶或产生沉淀，可在56℃水浴溶解。 3.所有离心步骤均为室温下操作。 操作步骤 1. 取1.5 ml离心管（自备），加入20 ul的Proteinase K溶液。 2. 向离心管中加入200 ul血清或血浆，然后再加入200 ul Buffer GB，涡旋震荡15 sec。（注意：1、样本体积不足200 ul可以加入0.9% NaCl（自备）补足。2、为确保样本有效裂解，加入Buffer GB后，需将样本与Buffer GB充分混匀。） 3．56℃孵育15 min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。 4. 加入250 ul无水乙醇，涡旋震荡15 sec，室温放置5 min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。 (注意：如果环境温度超过25℃，无水乙醇应在冰上预冷后使用。) 5．将一个Spin Columns CG*放入Collection Tubes(2 ml)中，将上一步所得溶液转移到离心吸附柱中，10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱内加入500 ul的Buffer GD，室温10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中废液。（注意：Buffer GD中含有乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 7. 向吸附柱内加入500 ul的Buffer PW，室温10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中废液。（注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7一次。Buffer PW中含有乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 8．向吸附柱中加入500 ul无水乙醇，10 000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9．室温12 000 rpm离心3 min，甩干残留液体。 （注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用） 10. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 ml塑料离心管（自备）中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3 min，使吸附膜完全变干。加入30 ~ 100 ul的洗脱液，室温放置2 ~ 5 min。12 000 rpm
中国科学院北京基因组研究所 2007年招收攻读博士学位研究生入学统一考试专业试题 科目名称：生物化学 考试时间：2007年3月17日下午2：00-5：00 考生须知： 1．本试卷满分为100分，全部考试时间总计180分钟。 2．所有答案必须写在答题纸上，写在试题纸上或草稿纸上一律无效。 1. 采用Sanger方法测定一段寡核苷酸，其序列为dAGA TGCCTGACT，该双脱氧反应的产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳给以分离。使用图解方法表示反应产物的电泳结果。（10分） 2. 如果在无氧条件下培养的酵母菌可表达一个名为nox的基因，但是在有氧条件下酵母菌却不能表达nox。假定nox的表达受到氧敏感性操纵子的调节，请设计一个实验来证明这个假设。（20分） 3. 有两种酶抑制剂，A和B, 它们的化学结构与该酶的底物和产物完全不同，但是能够在底物存在的条件下，有效地结合在该酶的同一位点上。其酶抑制常数分别为，K iA=123 M和K iB=37mM. 请回答下列问题（15分）： a) 这两种化合物的抑制机制是否相同？为什么？ b) 采用Michaelis-Menton作图法，描述三种情况下可能的酶动力学曲线：仅有底物、底物和10mM 的A抑制剂、以及底物和10mM的B抑制剂。 4. 现有一个质粒, pTet, 它含有四环素(tet)抗性，可被三个核酸内切酶，EcoRI, XbaI,和SspI，所完全消化，产生如下几个核酸片段: EcoRI 0.5 1.1 2.4kb Xba I 4.5kb EcoRI+XbaI 0.5 1.0 1.1 1.4kb XbaI+SspI 1.4 3.1kb EcoRI+SspI 0.4 0.5 0.7 2.4kb 如果将一个基因插入XbaI位点，质粒的生物抗性会丧失；插入SspI位点，质粒不能复制。请根据上述信息，绘制pTet质粒图，将质粒的大小、内切酶的位置、tet基因的位置和复制起始点的位置一一标注。（15分） 5. 采用Northern Blot 和Western Blot方法，一个研究小组发现X基因在BGC823细胞（一种胃癌细胞系）中的高度表达与细胞生长周期的缩短呈负相关性。请设计进一步的实验方案（采用至少两种不同的技术），寻找直接的实验证据以证明X基因的确是BGC823细胞生长的一个调控因素。（20分） 6. 在活细胞内NAD+/NADH和NADP+/NADPH广泛地参与了许多代谢反应。在正常生理条件下，NAD+ /NADH的比例大于一，还是NADP+/NADPH的比例大于一？请给出合理的解释。（20分） 科目名称：生物化学第1页共1页
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液
飞蝗基因组图谱问世：中国科学家破译迄今最 大的动物基因组 “飞蝗蔽日，食禾至尽”，蝗灾长久以来都对农业生产造成重要威胁。作为世界性的农业害虫，飞蝗（Locustamigratoria）群聚成灾的机制一直是世界科学家力求攻克的关键课题。现在，中国科学院动物研究所康乐院士领衔的科研团队破译了飞蝗的全基因组序列图谱，研究结果昨日发表在《自然-通讯》上。就此，果壳网编辑前往中科院动物所，对康乐团队进行了采访。 经过测序、组装、注释等工作，研究者构建出约6.3Gb大小的飞蝗基因组图谱——这是迄今已测序最大的动物基因组。飞蝗基因组大小约是果蝇基因组大小的30余倍，约为人类基因组的两倍多。飞蝗基因组中有大量的重复序列（占全基因组的60%），其中DNA转座子和重复序列（LINE）反座子居多，分别占基因组的24%和17%，而这些序列在飞蝗基因组中的丢失率较低，因此飞蝗基因组才会那么大。“直翅目在进化上处于比较基部的位置，包括蝗虫在内的直翅目昆虫，基因组通常都比较大，”康乐院士推测：“这可能是出于适应环境的需要而采取的策略，它们会保留一些重要的序列，以更好地应对环境变化。”这些重复序列的具体意义，还有待进一步研究查明。
昆 虫纲中一些完全变态昆虫（Holometabolous）、不完全变态昆虫（Hemimetabolous）与鳃足纲蚤状蚤（D. pulex）的系统发育关系及基因组大小。DPU：蚤状蚤；LMI：飞蝗；API：碗豆蚜；PHU：体虱；NVI：金小蜂；AME：蜜蜂；TCA：赤拟谷盗；BMO:家蚕；AGA：冈比亚按蚊；DME：黑腹果蝇。图片来源：Xianhui Wang, et al. (2014) Nature Communications 飞蝗之所以能够对农业造成极大危害，主要原因在于蝗群的长途迁飞能力和强 大的摄食能力。蝗虫个体1天能够摄入与自身重量相等的食物，这种食量大概 是人每天进食量的60~100倍之多。“禾草皆光”之后，蝗群又迁飞到其他田地继续为患。通过分析飞蝗基因组信息，研究者发现了多个与脂肪酸代谢相关的 基因，这些基因组成了高效的能量供应体系，为飞蝗长距离“飞”的能力提供 了能量保障。另外，飞蝗基因组中含有68个编码糖苷键转移酶的基因，是所有昆虫中最多的。这类代谢解毒酶类能够降解禾本科植物（水稻、小麦等）中的
试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次(RN2201) 裂解液VLB 室温20 ml Poly Carrier -20℃200μl 去蛋白液RE 室温25 ml 漂洗液RW 室温10 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温10 ml RNase-free 吸附柱RA和收集管 室温50套 室温储存12个月不影响使用效果，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 产品介绍： 采用特异性结合病毒DNA/RNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，病毒DNA/RNA提取试剂盒适合于从无细胞体液，包括血浆、血清、腹水、培养细胞上清液、脑脊髓液及尿液等中快速提取高纯的病毒DNA/RNA。该产品可以满足绝大多数的病毒RNA/DNA的同时提取要求，如病毒RNA：HCV（丙肝病毒）,HIV（艾滋病毒）,和HTLV（人类嗜T淋巴细胞病毒）；病毒DNA：HBV（乙肝病毒）和CMV（巨细胞病毒）等等。病毒裂解后，DNA/RNA后在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的病毒DNA/RNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的病毒核酸无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR/RT-PCR分析。 产品特点：
1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。 3.多次柱漂洗确保高纯度，提取的病毒DNA/RNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用 于各种常规操作，包括PCR/RT-PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。 注意事项： 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2.开始实验前将需要的水浴先预热到特定温度备用。 3.裂解液VLB和去蛋白液RE中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染 皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4.Poly Carrier： Poly Carrier使用方法：如果起始处理量很少，我们推荐使用Poly Carrier，如果预期有较大量核酸产量，用户可以根据需要选择是否加入Poly Carrier。使用时在每个样品提取所需裂解液VLB中加入4μl Poly Carrier储存溶液，将裂解液VLB与Poly Carrier溶液充分颠倒混匀即可(裂解液VLB容易起泡沫，请勿使用涡旋振荡混匀)。也可根据样品数量，在总共需要的裂解液VLB中加入总共需要的Poly Carrier混匀备用。混合液在室温24小时内稳定。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示：第一次使用前请先在10ml漂洗液RW中加入40ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 1.200μl血清等体液（需回复到室温，不足可用0.9% NaCl或者PBS补足）转入上 述1.5ml离心管，加入400μl 裂解液VLB，立刻涡旋振荡充分混匀。
（一）细菌基因组DNA的提取 1.试剂 1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。 2.操作步骤： 1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2）加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。 3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 （二）细胞基因组DNA的提取 Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C. （三）Chelex法抽提DNA 1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。 2.取1.5mL试管，加双蒸去离子水1mL，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20 分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出 3.12000rpm离心5分钟，弃上清 4.加5% chelex-100 200μL、蛋白酶K 5μL，置50℃水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟， 灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性 5.取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20℃保存备用
老一辈科学家的高瞻远瞩—中国人类基因组研究成绩斐然 看着中南大学夏家辉教授“克隆的神经性高频耳聋的致病基因”；中国医学科学院沈岩研究员和中国科学院生物工程中心孔祥银研究员“克隆的遗传乳光牙本质的致病基因”以及上海交通大学贺林教授“克隆的A-1型短指基因”这3篇我国科学家近年来发表在《Nature genetics》上的论文，非常高兴，倍感振奋。所有他们的这些研究工作都是在国内做的，充分利用了我国丰富的遗传资源，具有显著的理论和实际意义，具有鲜明的创新性，是我国人类基因组研究成果的重要体现。 中国人类基因组研究之所以取得今天这样令人瞩目的成绩，应该归功于老一辈科学家对科学发展的准确预见。 20世纪90年代初，美国科学家提出了一个大胆而宏伟的计划，要在15年或更长一些时间里，搞清人类30亿个核酸碱基的排列次序。当时世界各国的科学家虽有不同看法，但是，美国的科学家坚定而又艰难地起步了。英国、日本等国的科学家也相继投入了这一宏伟的计划。中国究竟要不要搞？那时存在不同的意见。根据国际发展的态势和我国国情，原国家科委决定我国基因组研究应以水稻为主，于1992年底实施了“水稻基因组”计划。国家自然科学基金委员会生命科学部在广泛地听取了国内科学界的不同意见基础上，决定在无锡召开会议。 1993年那个春寒料峭的二月，在无锡，核医学国家重点实验室的小小的会议室里，吴旻院士主持了会议，陈竺、强伯勤、陈仁彪等十几位教授对我国要不要搞人类基因组研究；如果决定搞，那么怎么做；选择一个什么样的切入点等问题进行了热烈的讨论。最后，作出了3点决定： 1．中国一定要搞人类基因组计划，参加到国际人类基因组计划中去； 2．中国不走外国人的路，不从测序开始，而是根据我国的资源优势，从中国多民族的特点出发以中华民族基因组中若干位点的基因结构为切入点，启动中国的人类基因组计划； 3．推荐陈竺、强伯勤二位当时较年轻的教授为这一计划南北两方的负责人。 根据会议决定，1993年我国的人类基因组计划以国家自然科学基金委重大项目的形式开始实施。此后，“863”计划在1996年以“重大疾病相关基因的
中国科学家在真核生物基因组设计与合成中获重大突破 “化学合成酵母一方面可以帮助人类更深刻地理解一些基础生物学的问题，另一方面可以通过基因组重排系统，实现快速进化，得到在医药、能源、环境、农业、工业等领域有重要应用潜力的菌株。Sc2.0计划旨在重新设计并合成酿酒酵母的全部16条染色体。2014年Sc2.0已创建了一个单一的人工酵母染色体，这次科学家们共完成了5条染色体的化学合成，其中中国科学家完成了4条，占完成数量的66.7%，把Sc2.0计划向前推进了一大步，意味着已经成功合成了酵母基因组的约三分之一。元英进带领的天津大学团队完成了5号、10号染色体的化学合成，并开发了高效的染色体缺陷靶点定位技术和染色体点突变修复技术。戴俊彪研究员带领清华大学团队完成了当前已合成染色体中最长的12号染色体的全合成。深圳华大基因研究院团队联合英国爱丁堡大学团队完成了2号染色体的合成及深度基因型－表型关联分析。同时，Sc2.0计划国际化的高效运作模式也给国际性大型旗舰项目提供了很好的参考模板，该计划的实施是基因组编写计划的重要基础。元英进认为，”多国组成大型国际联合团队使突破重大科学问题和技术难题具有必然性，中国的研究者在本次国际计划中发挥了举足轻重的作用。在这个过程中，我们培养了大批具有国际视野的拔尖创新青年人才，中国的基因组设计合成能力也提升到了前所未有的高度。此次国际合作取得的巨大成功将鼓励更多的中国的学者更积极地参与到大型国际合作项目中去。在历届合成基因组年度会议上，天津大学均向国际合作联盟介绍了自己的项目研究进展。2016年7月，第五届Sc2.0和合成基因组会议在英国爱丁堡举行，吴毅和谢泽雄介绍了天津大学化学全合成酿酒酵母染色体的最新
RNA病毒基因组提取试剂盒使用说明 货号：R2000 规格：50T/100T 保存：室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。产品内容： 试剂盒组成R2000-50R2000-100 蛋白酶K1ml2ml 洗柱液50ml2ml 结合液25ml50ml×2 漂洗液15ml50ml RNase free ddH2O15ml15ml×2 RNase free吸附柱50个100个 RNase free收集管(2ml)50个100个 产品介绍： RNA病毒基因组提取试剂盒适合于从血清、细胞上清、淋巴液中提取RNA病毒基因组，不适合于细胞等组织内RNA病毒基因组的提取。使用本试剂盒提取的基因组RNA可用于RT-PCR实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入一瓶新开启的无水乙醇，加入到离瓶口约0.5-1cm距离，盖好摇匀。所有离心步骤均在2-8℃条件下进行。 1、取病毒上清液0.5ml，12000rpm离心5min，尽量吸尽上清使用，弃去沉淀（如无沉淀
可省去此步）。 2、向病毒上清中加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化10min，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、吸附柱前处理：从包装中取出吸附柱，放入收集管中，加入700ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中待用。 4、向病毒上清中加入500ul结合液，充分混匀。再向管中加入400ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响RNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。（吸附柱的最大容积为750ul，可分两次加入。一次吸附完离心后再将余下的混合液体加入柱中静置离心。） 5、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。 9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50ul-100ul经65℃水浴预热的RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm离心2min。即可得到高质量的病毒基因组RNA。 注意事项： 1、经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。 2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的RNA提取量也下降。
实验报告 课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师： 同组学生： 廖杰 成绩：__________________ 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱 的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。 一、 真核生物基因组DNA 的提取 本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。 DNP 在0.14mol/L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。 用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。 １温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性， ２可以变性Dnase ， ３还可以去除部分的蛋白。 ４使核蛋白体从DNA 上解离。 然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法： 酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。 专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 3100105256 日期： 2012.5.10 地点： 生化实验室 装 订 线
若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。 异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。 变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。 该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。 但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。 砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。 收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。 二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度 1．紫外分光光度法测定核酸含量： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。 2．紫外分光光度法测定DNA纯度： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。