禽病学实验指导
实验一家禽的尸体剖检及病料采取 (2)
实验二家禽具有血凝性病毒病的免疫监测 (5)
实验三MD、IBD及GP琼脂扩散试验 (11)
实验四鸡白痢、鸡毒支原体感染平板凝集试验 (15)
实验五鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断 (17)
课堂讨论一家禽疾病的综合防制措施 (19)
课堂讨论二家禽免疫防制计划的制定 (21)
课堂讨论三常见家禽疾病的临床诊断要点 (23)
实验一家禽的尸体剖检及病料的采取
一、实验目的
掌握家禽尸体剖检的方法、病料的采取及病原分离的具体方法。
二、实验内容
1．病禽的剖检；
2．病料的采取与病原菌的分离。
三、实验仪器、设备及材料
1．剖检病禽的用材：解剖剪、解剖盘、消毒液、洗手盆、毛巾、待检禽等。
2．病料采取及病原(细菌、病毒或其他微生物)分离的用材：消毒的小剪刀、小镊子、灭菌玻璃容器、研钵、酒精棉、酒精灯、接种棒、培养基及上述剖检用材。
四、实验原理
1．家禽机体健康的情况下，各种组织器官具有正常的形态，发病后某些组织器官会发生特征性的变化，通过病禽剖检可以为临床诊断疾病提供依据。
2．家禽健康的状况下体内不携带病原或毒物，发病后，通过特定的组织器官作病原分离鉴定或对中毒病禽作毒物检测，可以为实验诊断禽病提供可靠的依据。
五、实验步骤
1．病禽的剖检
进行剖检之前，应首先了解发病禽群的流行病学，临床症状情况，家禽的品种，饲养情况，疫苗的接种情况，发病后的经过和处理方法等等。剖检时，应注意详细记录各器官的病理变化，如同时剖检多只病死禽，则注意编号，以免混淆。剖检基本术式如下：（1）外貌检查
检查天然孔：注意口、鼻、眼(包括眼下方的羽毛是否干燥，若湿润则表明有流泪的可能)有无异常的分泌物，分泌物的量及性状；注意泄殖腔周围羽毛有无异常粪便粘污，泄殖腔粘膜的变化及内容物的性状等情况。
检查皮肤：注意头、冠、肉髯及身体其他部位的皮肤有无痘疹或结痂；是否发生腐败；检查家禽的趾爪，注意有无赘生物、外伤、化脓、失水及胫骨有无变软等情况。
检查各关节及龙骨：注意各关节有无肿胀、变形及龙骨有无变形、弯曲等表现。
检查病禽的营养状态：可用手触摸病禽的胸骨两侧肌肉及龙骨的显突情况而初步判定家禽的营养情况。
（2）体腔检查
第一步，用消毒水将禽体羽毛浸湿，防止病原扩散及避免羽毛飞扬。
第二步，用剪刀将股内侧连接腹侧的皮肤剪开，将两大腿向外和下方翻压，直至股关节脱臼，使禽体背卧位平放于瓷盆上。
第三步，横向剪开腹部皮肤，使切口与上述股侧皮肤切口相连，握住游离皮肤，向前一直剥离到锁骨部，检查皮下组织和胸肌的状态。横向剪开腹肌、腹膜，并沿胸骨的两侧，向前将各肋骨、锁骨剪断，抓住龙骨的后端，用力向前向上翻拉(此时应注意观察各气囊壁有无混浊、增厚或表面被覆增生物和渗出物变化)，暴露出整个体腔的器官。注意体腔有无积
液，粘附渗出物及其他异常变化。
将腺胃、肌胃、心、肝、脾、肺、肠、肾、卵巢、睾丸、法氏囊等各内脏器官先后从体腔摘出作细致检查，先观察外表形态、大小、色泽、质度等变化，再分别切开检查内部变化，注意有无炎性肿胀、充血、郁血、出血、溃疡、坏死或结节等情况。
（3）颈部检查
将下颌骨、食道、嗉囊剪开，注意观察口腔和食道粘膜有无出血、溃疡、假膜或脓包和等情况；同时，剥离颈部皮肤检查胸腺(尤其是雏禽)有无出血、萎缩等的变化；将小剪刀插入喉头，剪开气管和支气管，检查喉头和气管粘膜有无充血、出血或溃疡等情况及其内分泌物的情况。
（4）头部检查
第一步，眼部检查。主要观察眼的角膜有无异常变化及眼结膜有无出血或溃疡等表现。
第二步，鼻窦部检查。主要在家禽的鼻孔稍偏上的位置将剪刀斜成30o角将上喙剪开约l～3厘米切口，将切口用手分开即可见鼻窦，观察其有无出血或渗出物的特性。
第三步，脑部检查。用剪刀将头部皮肤剪开、以尖剪将整个额骨、颅顶骨剪除，暴露大脑和小脑，先观察脑膜血管的状态，脑膜下有无水肿和积液，然后再以钝器轻轻拨离，将前端嗅脑、脑下垂体及视神经交叉等部逐一剪断，将整个大脑和小脑摘出，观察脑实质的变；
（5）神经检查
主要检查的神经为坐骨神经干，将股部内侧的肌肉钝性分开即可见银白色有横纹的坐骨神经干，观察神经外膜有无水肿或出血及神经干的粗细是否均匀等情况。
（6）剖检时的注意事项
①剖检的场地应尽量远离行人、水源、禽舍，并选择易于消毒的地方，避免由于剖检造成病原扩散。
②剖检前后运载病、死禽只，应采用密封容器，避免沿途遗漏病禽羽毛、分泌物及排泄物等污染环境。
③剖检完毕，应将尸体深埋或焚化，或作其他无害化处理。对剖检场地及器械要随手洗刷消毒。
2．病料采取与病原菌(毒)分离
家禽传染病的确诊，通常必须过实验室诊断，采取病料与病原分离是实验诊断的前提。
（1）采料时间
病毒性病料、中毒性材料(如肉毒梭菌素中毒)的采取一般应在急性感染期，选择典型的濒死病禽，病前不久用过疫苗或药物处理的禽只不宜采料。
（2）采取病料的方法：
①器械消毒：刀、剪：镊子等采料用具可干热灭菌(或临时以酒精灯火焰作局部(剪尖、镊子等需接触病料的部分)烧灼灭菌)或煮沸30分钟灭菌，注射器等器皿应干热灭菌或高压灭菌。
②采料部位：病料采取的部位应根据不同疾病相应地采取其脏器或内容物，一般应采取病原含量高而污染机会少的实质性器官，如肝、脑、脾为好。在无法估计是何种传染病时，可进行全面采取。
A．病毒性病料的采取与病毒分离：用灭菌剪刀及镊子剪取含毒量高的组织(通常为肝脏、脑、脾脏、胰脏等实质脏器)2～3克，投入灭菌瓶中，加盖，有条件的地方可即时将病料用灭菌乳钵研磨，并应用超声波或反复冻融法裂解细胞，以利于细胞内病毒的释放，加入5～10倍的灭菌生理盐水或PBS配成悬液，3000~8000转/分钟，离心15~20分钟，去除沉淀，在每毫升上清液中加入青霉素、链霉素(或其他有效抗生素)各2000~4000IU，置4~8oC 冰箱中感作2～4小时。经无菌检验合格后，接种相应的生物学培养基(禽胚或细胞培养物等)
作病毒分离培养，观察感染禽胚死亡及病变情况，收集胚液做进一步鉴定。如果病料采取后不能立即处理时，应直接放入低温冰箱或相应保存剂(如Hank's液或50％的甘油PBS)中，并置于冰箱保存。应注意病毒性病料最好在急性发病期进行，已使用相应疫苗或抗病毒药物的病禽不宜采取病料。
B．细菌性病料中病原菌分离：对于各种细菌性病，应在病禽剖解前备好相应的培养基对营养要求低的病原菌，如大肠杆菌，可用普通琼脂；对营养要求较高的病原菌，如多杀性巴氏杆菌，可用血液琼脂等；有特殊要求的病原菌，要使用特殊的培养基和方法进行培养。如鸭疫里氏杆菌、鸡副嗜血杆菌等要用巧克力琼脂在含5％～10％CO2的空气条件下培养；怀疑有杂菌污染的病料，应尽量使用要分离细菌的选择性培养基；病原含菌量少时应采用液体培养基，或用相应的增菌培养基增菌培养后，再进行分离培养；未能确定病原菌的种类时，应同时使用多种培养基分离和培养，以提高病原菌的分离成功率。分离病原菌时，用接种棒直接从病禽体内相应脏器钓取病料在固体培养基上划线培养或液体培养基上接种培养；如不能即时分离培养，则应以无菌手续采取病料一小块投入无菌的保存剂中，置4~8oC保存，并应尽早进行分离培养。病原菌的分离应在急性发病期和未使用过敏感药物的情况的前提下进行。
C．血清学材料：一般都应采取双相血清，即在发病初期及后期(病愈期)各采取一份，进行试验，以检查有关抗体的变化情况。具体方法为：采少量血清，可用注射器沿向心端的方向从翅静脉直接采取血液；如需大量血清，则可从心脏采血(方法参见相关资料)。血液先放在经干热灭菌的小瓶或其他容器中自然凝固(若为一次性注射器可吸入一定量的空气，成一定角度放置)，待其自然析出血清，再将血清移至灭菌容器中冻结保存备用。血清若有溶血则会影响试验的结果的准确性。
D．组织学材料的采取：供病理组织切片的材料，应将病禽典型病变部分及其相连的健康组织一并切取，随即投入甲醛或戊二醛的固定液中固定备用。
E．肠道的内容物材料的采取：用棉线将决定采取内容的肠道两端扎紧，然后剪下置于灭菌容器中，必要时可放入20oC保存，并迅速送检。
不论上述哪一种材料，都不应该在死后过长时间(一般不超过死后4～6小时)采取，否则会对正确的诊断造成一定的影响。所有病料采取后均要贴上标签。若要送检时，还要用医用胶布或石蜡封口，置于冰瓶中及时送出。
六、实验报告要求
1．扼要地反映剖检与病料采取的基本程序。
2．注意说明操作的注意事项。
3．陈述实验体会。
七、实验的注意事项
(参阅实验步骤)
八、思考题
家禽尸体剖检、病料采取及病原分离的方法与注意事项如何?
实验二家禽具有血凝性病毒病的免疫监测
（以ND为例，兼顾各种病免疫监测技术的特点）
一、实验目的
1.掌握ND等家禽血凝性病毒病免疫监测的基本方法。
2.学会根据ND免疫检测的结果指导禽群的ND等血凝性病毒病免疫接种。
二、实验内容
1.红细胞凝集试验――检测抗原的HA效价。
2.红细胞凝集抑制试验－－检测免疫禽只的HI抗体。
三、实验仪器、设备及材料
1.抗原：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测――ND 抗原；鸽瘟（禽PMV-Ⅰ）免疫监测－PMV-Ⅰ抗原；AI H5免疫监测――H5抗原；AI H9免疫监测――H9抗原；EDS－76免疫监测――EDS抗原。
2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为1％～2％，或每禽群抽取20～40只），取其自然析出的血清作为被检血清。
3. 1％红细胞悬浮液：采取健康公禽血液（每次可采5～10mL），采血后抗凝，加生理盐水离心洗涤3～5次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去），将沉淀的红细胞用生理盐水稀释成1％悬浮液，这种红细胞液在4℃存放，可用3～5天。注意悬浮液颜色变暗应予弃去。
红细胞来源，检测鸡血清――鸡红细胞，检测鸭、鹅血清――鸭红细胞。
4.灭菌生理盐水：pH7.0～7.2。
5.移液器（规格分别为0.1mL、0.4mL、0.5mL、1mL），20孔反应板（每孔的体积为1mL），10mL注射器、玻璃铅笔、剪刀、镊子等。
四、实验原理
鸡群经ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。
五、实验步骤
1.全量法测定抗原原液的血凝效价（红细胞凝集试验，HA试验）
1.1操作方法
在20孔反应板上，取其10孔，第1孔加入灭菌生理盐水0.9mL，第2～10孔各加入0.5mL。用0.1mL移液器吸取ND抗原原液0.1mL加入第1孔中，用0.5mL移液器将第1孔内抗原与生理盐水充分吹打均匀，吸取0.5mL至第2孔，吹打均匀，再吸取0.5mL至第3孔……如此依次倍倍稀释，至第9孔，由第9孔吸出0.5mL弃去。第10孔不加抗原，只加生理盐水作对照。这样，各孔ND抗原原液的稀释度依次为1∶10，1∶20，1∶40……1∶2560。然后向各孔加入1％红细胞悬浮液0.5mL，静置20～30分钟，于第10～15分钟开始观察，一直观察到30分钟，判定并记录抗原原液的HA效价。具体术式见表3－1。
1.2结果判定与记录方法
1.2.1判定结果的方法：当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“完全凝
集”，记录为“#”。当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于孔底3/4面积时，称不完全凝集，记录为“+++”；依次类推为“++”、“+”，均为不完全凝集，这时孔底中央会形成一个小红圆点，是未凝集的红细胞自然沉降集中于孔底中央。当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为完全不凝集，记录为“—”。结果判定与记录如表3－1。
1.2.2判定ND抗原的血凝效价：
凡能使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价，如表3－1，其ND 抗原的血凝集效价为1∶640。其含义是该ND抗原原液作640倍稀释，每0.5mL有一个血凝单位，即每0.5mL抗原原液含有640个血凝单位的抗原。
表2—1 红细胞凝集试验术式与结果（单位：mL）
2.全量法测定血清抗体水平（红细胞凝集抑制试验，HI试验）操作方法
2.1分装生理盐水：在20孔反应板上，取其10孔，第1孔加入灭菌生理盐水0.4mL，第2～9孔加0.25mL，第10孔加0.5mL。
2.2加入被检血清并稀释：用0.1mL移液器，吸取0.1mL被检血清加入第1孔，换取0.25mL 移液器吹打使之充分混合，从中吸取0.25mL加入第2孔，吹打之充分混合，从中吸取0.25mL 至第3孔……如此一直稀释至第8孔，从第8孔中吸出0.25mL弃去，第9、10号孔不含血清。
2.3加4单位抗原：向第1至第9孔加入4个血凝单位ND抗原溶液【经上述HA试验测定血凝效价的抗原原液，根据其血凝效价用生理盐水稀释为4个血凝单位，稀释方法为每1mL抗原原液，加入生理盐水（加入生理盐水体积（mL）＝抗原原液中的血凝单位数/4－1），为提高试验的准确性，可进行4个血凝单位抗原的滴定，即将假定为4个血凝单位的抗原，分别取其原液、1:2、1:4、1：8倍稀释液各0.5mL，各加入0.5mL 1%的红细胞后，观察其凝集的情况，若在1:4倍稀释孔中出现非完全凝集的情况，表明4个单位的抗原浓度偏低；若在1:8倍稀释孔中出现“＋＋”以上的凝集的情况，表明抗原的浓度偏高。并根据以上结果作相应的调整】，每孔0.25mL，第10孔不含抗原作空白对照。
2.4添加红细胞悬液：向第1至第10孔加入1％鸡红细胞悬浮液，每孔0.5mL，轻轻振荡，室温中静置10～30分钟，观察结果并记录。具体方法见表3－2。
2.5结果判定与记录方法
2.5.1判定结果的方法
当红细胞完全不凝集而自然沉降于试管底部中央，形成一个边缘光滑的红圆点，边缘没有分布红细胞凝集颗粒，判定为完全抑制，记录为“－”，当试管底红圆点周围分布少量红细胞凝集颗粒时，判定为不完全抑制，记录为“+”，随着红圆点的逐渐缩小，红细胞凝集颗粒分布的逐步增多，而可依次记录为“++”，“+++”和“#”。结果判定与记录举例见表3－2。
2.5.2确定被检血清的红细胞凝集抑制抗体效价（HI效价）
在本HI试验术式中，凡能使0.25mL 浓度4个凝集单位的ND抗原凝集红细胞的能力完全抑制的血清最高稀释度称为该被检血清的HI效价。如表3－2结果举例，该血清HI效价为1∶80。
3. 根据免疫监测的结果指导鸡群的免疫接种
统计所有被检血清样品（20或40份样品）的HI效价，根据抗体的临界滴度（能够使鸡群免受ND感染的ND HI抗体的最低滴度，通常为1∶20）计算鸡群HI效价的合格率（其公式为：鸡群抗体合格率＝〖被检鸡只数－抗体滴定低于临界滴定的鸡只数）/被检鸡只数×100％〗。并对照各种日龄鸡群能够抵抗ND感染的的抗体合格率参考标准，即：1月龄以下的小鸡，抗体合格率要求在85％以上，且其余15％的被检鸡只的抗体水平不低于1:5；中成鸡群的抗体合格率应在95％以上，且其余5％的被检鸡只的抗体水平应不低于1:5，则说明鸡群抗体水平能够抵抗ND强毒感染，暂时不需要加强ND的免疫接种。）
4.微量血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验技术
4.1材料准备
4.1.1 96孔V型微量反应板，微量移液器（配滴头）。
4.1.2 pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）（配方一：磷酸氢二钠1.10g，二水磷酸二氢钠0.316g，氯化钠8.50g，加水1000mL，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2，高压灭菌备用；配方二：磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.20g，氯化钾0.20g，氯化钠8.00g，加水1000mL，高压灭菌备用）
4.1.3 阿氏（Alsevers）液配制:葡萄糖 2.05g，柠檬酸钠 0.8g，柠檬酸 0.055g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。
4.1.4 1%红细胞悬液制备：采集至少3只SPF公禽或无禽流感和新城疫等抗体的健康公禽的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min 离心10min，洗涤后用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，4℃保存备用。
4.1.5血凝性病毒病抗原和标准血清以及阴性血清。
4.2操作方法
4.2.1 血凝（HA）试验（微量法）
4.2.1.1在微量反应板的1-12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。
4.2.1.2吸取0.025mL抗原加入第l孔，混匀。
4.2.1.3从第1孔吸取0.025mL抗原PBS混合液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。
4.2.1.4每孔再加入0.025mL PBS。
4.2.1.5每孔均加入0.025mL 1%（V/V）鸡红细胞悬液（加入前，应将鸡红细胞悬液充分摇匀）。
4.2.1.6振荡混匀，在室温（20℃-25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下1hr）。对照孔红细胞将成明显的圆点状沉到孔底。
4.2.1.7结果判定。将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。
表2-3 HA试验微量法操作术式
4.2.2 血凝抑制（HI）试验（微量法）
4.2.2.1根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。
4.2.2.2在微量反应板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
4.2.2.3吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸取0.025mL置于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。
4.2.2.4 1-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。
4.2.2.5每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下1hr），对照红细胞将呈显圆点状沉于孔底。
表2-4 HA试验微量法操作术式
4.3结果判定
在对照孔出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。免疫鸡群血清抑制滴度在4log2的鸡群保护率为50％左右；在4log2以上的保护率达90％－100％；在4log2以下的非免疫鸡群保护率约为9％，免疫过的鸡群约为43％。鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何均值表示，如平均水平在4log2以上，表示该鸡群为免疫鸡群。
六、实验报告要求
1.扼要反映本实验步骤。
2.报告实验结果应包括各孔的反应结果和被检血清的HI效价。
3.叙述影响试验结果的因素和注意事项。
4.说明应用本试验结果指导ND临床免疫的方法。
七、影响免疫监测的因素及注意事项
1.病毒（抗原）
1.1病毒抗原应避免反复冻融和污染；
1.2在凝集抑制试验中，不足量的抗原，有可能被大多数血清非特异性抑制之倾向，即假阳性。因此，有必要用足量的抗原避免误差。但过量的抗原也会大大降低试验的敏感度，在配制4单位抗原时，一定要准确。
2.红细胞
2.1来自不同公禽个体的红细胞，对抗原的敏感性存在着差异。配备红细胞时，如需用来自几只公禽的血液则应将之混合进行洗涤配制。采血禽只若注射过相应疫苗时，则需彻底洗涤5次以上。另外，成年公禽是最好的红细胞供体。
2.2为使1％红细胞的悬液的浓度准确，在红细胞洗涤过程，最后一次离心必须统一用3000转/分钟，离心10分钟，并充分吸干上清液，然后将沉淀的红细胞按1％的比例进行稀释。
2.3保存红细胞的阿氏液，内含柠檬酸钠葡萄糖，因此易于生长细菌，而污染杂菌的红细胞悬液易发生溶血和自凝。如果保存于阿氏（Alserer）液中红细胞，一旦发生变色或溶血就不能再用。无污染情况下，使用阿氏液保存的红细胞的时间最长不宜超过1周。
2.4红细胞浓度的标准化：为使在试验中红细胞浓度一致，常用的方法是：a.灯光比色计；b.用细胞计数板数血球；c.最方便的方法是最后一次离心的速度和时间恒定,使红细胞泥压实后的密度基本一致。
3.血清
3.1非特异性抑制现象：血清常含有对病毒凝血素作用的非异性抑制物质，这些物质为粘液素类脂蛋白或类脂质等。血清中抑制因子结构性质与红细胞表面（类粘液蛋白）相似，因而夺去病毒与红细胞结合的机会，为了消除这些抑制，可采用白陶土处理法，即将血清56℃30分钟灭活后，以生理盐水作1∶5稀释，再加等量25％白陶土混合均匀，置室温处理20分钟，时时摇动，然后以2000转/分钟离心5分钟，取上清液即为1∶10稀释的无非特异血凝抑制因子血清。
3.2对于ND HI试验，被检鸡若用鸡新城疫Ⅱ系或La Sota系疫苗作基础免疫时，则应于免疫接种后14～16天采血，方能测出稍高水平的抗体，若用上述疫苗进行再次免疫，则免疫接种后7～10天，HI抗体即可达到最高水平。若怀疑鸡群受新城疫侵袭，应在疫情开始及两周后，随机取样采血。各做一次HI试验，如第二次血清样品HI抗体水平比第一次血清样品HI抗体水平明显升高（通常高2个滴定以上），则可证实为NDV感染，其它血凝性病毒病的HI试验亦可参照ND HI试验上述情况。
3.3血清反复冻融或半冻融易使血清蛋白变性而沉淀，使抗体遭受破坏，降低血清抗体滴度，一般应在－20℃条件下保存。应加1∶10000硫柳汞防腐，也是可取的。
3.4在HI试验中，凝集的红细胞有时会自然滑下，出现血凝抑制的假象，故要及时判结果。
4.操作因素
4.1试验所用的吸管、反应板及有关的玻璃皿必须充分洗净、干燥。避免留有酸、碱，影响结果。
4.2采血及装血的注射器、瓶子要经灭菌和干燥，避免溶血。
4.3生理盐水或磷酸缓冲液的pH值应准确，过酸（pH
5.8以下）会出现红细胞自凝或自溶；过碱（pH7.8以上）凝集容易解离而使结果判断不准确。较为合适的pH值为7.0～7.2。
4.4本试验一般规定在20～30℃室温下进行，在37℃时，由于病毒表面的神经氨酸酶易使红细胞表面蛋白受体的N—乙酰基神经氨酸水解，从而使病毒与红细胞解离，使被凝集的红细胞脱落。
4.5在一定温度条件下，抗原与抗体的感作时间越长，HI的滴度越高。因此，一般规定在温室条件下感作10分钟，然后加入红细胞。这样才能使试验结果取得一致。
八、思考题
1.家禽具有血凝性病毒病免疫监测的基本方法如何？
2.如何根据免疫监测的结果指导鸡群的免疫接种工作（以ND免疫监测的结果为例作叙述）？
3.影响免疫监测的因素有哪些？
4.红细胞凝集抑制试验可用于哪些家禽传染病的免疫监测?
实验三 MD 、IBD 、GP 琼脂扩散试验
一、实验目的
了解AGP 试验的原理并掌握MD 、IBD 、GP 琼脂扩散试验的的操作方法和临床应用的 方法。
二、实验内容
1．MD 琼脂扩散试验。 2．1BD 琼脂扩散试验。 3．GP 琼脂扩散试验。
三、实验仪器、设备及材料
(详见“实验内容”中“材料准备”项)
四、实验原理
琼脂扩散试验(AGP)是血清学沉淀试验的一种，以琼脂凝胶作为抗原抗体免疫扩散和形成沉淀反应的载体。琼脂凝胶的含水量在90％以上，能允许分子量在200000以下的大分子物质自由通过和扩散，绝大多数的可溶性抗原与免疫球蛋白的分子量都在200000以下，所以能在凝胶内自由扩散。若特异的抗原、抗体在凝胶中各以其固有的扩散系数扩散，当两者在比例最合适的区域内相遇，即发生沉淀反应形成不透明的白色沉淀线。由于反应生成的沉淀物的颗粒较大，停留在凝胶中不再扩散。AGP 试验简易、敏感、特异、快速，已广泛应用于多种人、畜、禽传染病的诊断，但常易受免疫接种的影响，因而对试验结果的临诊意义，要注意综合分析。下面具体介绍MD 、IBD 、GP 琼脂扩散试验的方法。
五、实验步骤
（一）MD 琼脂扩散试验(MD AGP 试验) 马立克氏病AGP 试验，可用已知MD 阳性血清检查被检鸡的羽髓(抗原)(方法一)，亦可用已知MD 沉淀抗原检查被检鸡的血清抗体(方法二)。
1．材料准备
（1）标准MD 抗原：由兽医生物药品厂提供本品，可在琼脂凝胶板上扩散，与MD 阳性血清反应，于24~48小时出现明显致密的白色沉淀线。冻结保存。 （2）MD 阳性血清：由兽医生物药厂提供，可在琼脂凝胶板上扩散，与MD 抗原反应24~48小时出现明显致密的白色沉淀线。冻结保存，避免反复冻融。
（3）被检抗原：采取受检鸡含羽髓较多的羽毛数根(幼鸡6根，大鸡2～4根)，将毛根按被检鸡编号后，剪下放入干净的西林瓶内，每瓶滴1～2滴蒸馏水，用干净的玻璃棒挤压出羽髓液，去掉羽毛渣．即为受检抗原。如采用“方法二”．则不必采取受检抗原。
（4）受检血清：采取受鸡羽静脉血液1～2mL ．使其自然凝固，析出血清即为受检血清。如用“方法一”，则不必采取受检血清，临床检验多采用“方法一”。 （5）琼脂凝胶板的制备与打孔：
①琼脂凝胶液配制，方法如下：
琼脂糖 0.7～1.2克 ， NaCI 8克，磷酸盐缓冲液100mL (0.01M 磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法为：O H HPO Na 24212. 0.29克， O H HPO Na 2422. 0.03克溶解于100mL 蒸馏水中。)
将上述各试剂混合后，水浴加热使琼脂糖充分溶解后，加入1/2500叠氮钠防腐，4oC~8oC 保存备用。
②倒制琼脂凝胶板，方法如下：
将已制备好的琼脂凝胶水浴加热充分溶化后，用注射器配上较大号针头，吸取溶化的琼脂凝胶液，慢慢注射到洁净的水平放置的玻璃板或平皿上，使其在室温中凝固，凝胶厚度以3毫米为宜。
③打孔，在制备好的琼脂凝胶扳上打孔，(其打孔图形按需要而定，一般采用七孔梅花图形，操作时，先用一张与凝胶板大小相仿的白纸片，按要求画好打孔图形，然后，将图形放在凝胶板底下，用打孔器依样打孔。
2．方法
方法一：用MD阳性血清检测鸡羽髓抗原(MD抗原)
（1）用移液器吸取MD阳性血清加入中心孔内，外周任何相对的两孔加入标准MD抗原，其余外周孔分别加入受检鸡羽髓液，加入量以平孔面为度。注意不要溢出孔外，不要有气泡，并记录点样顺序。
（2）所有样品加完后，放入温盒置35~37"C恒温箱中过夜，次日观察并记录结果。
方法二：用MD沉淀抗原检测受检鸡的血清抗体
（1）用移液管吸取标准MD抗原加入中心孔内，外周任何两个相对孔加入MD阳性血清，其余各外周孔加入各被检鸡的血清，容量以平孔面为度，注意不要溢出孔外，不要有气泡，并记录点样顺序。
（2）所有样本加入完毕，放入湿盒35~37℃恒温中过夜，次日观察并记录结果。
3．结果判定
（1）若受检血清有MD特异抗体或受检羽髓含有MD病毒抗原，则在抗原与抗体孔之间产生肉眼可见的清晰的白色沉淀线，此为阳性反应。相反，如抗原、抗体之间不出现沉淀线则为阴性。
（2）沉淀线一般出现在抗原抗体孔之中间，但有时由于抗原浓度与抗体浓度不一，沉淀线往往偏近抗原孔或抗体孔，有时可能出现一条以上的沉淀线，这些情况均属阳性反应。（3）如果被检孔没有出现白色沉淀线，但邻接的阳性对照孔的沉淀线末端向该被检孔内侧偏弯，可认为该被检孔样品为阳性：若邻近的阳性对照孔的沉淀线末端向该被检孔直伸或一向其外侧偏弯，或该被检孔虽然有沉淀线，但该沉淀线与阳性对照孔沉淀线交叉(属非特异性沉淀线)，则此被检样品为阴性。
（二）传染性法氏囊病琼脂扩散试验(IBDAGP试验)
传染性法氏囊病琼脂扩散试验，如MD AGP一样，可以用标准抗原检测血清，也可以标准血清检测抗原。本实验以前者为例。
1．材料准备
（1）标准IBD抗原：采用鸡传染性法氏囊病标准强毒感染鸡，以其法氏囊制备，或由生物药品厂提供，-20oC保存，避免反复冻融。
（2）标准阳性血清：能与标准IBD抗原作AGP试验在24小时内产生明显致密的沉淀线者，即可作为标准阳性血清，可由生物药厂提供，-20oC保存，注意应尽量避免反复冻融。（3）受检血清：被检鸡血液自然释出的血清，不腐败不溶血，勿加防腐剂或抗凝剂。（4）琼脂凝胶板的制备与打孔，方法如下：
琼脂糖0.7～1.2克，氯化钠8克，苯酚0.1mL，蒸馏水100mL
将各种试剂依次加入后，用5.6％碳酸氢钠溶液调pH 6.8~7.6，水浴加热使琼脂糖充分溶解。将溶化的琼脂凝胶倾注于清沽的玻板上，制成厚度约为3毫米的琼脂凝胶板。注意不要产生气泡。打孔方法同马立克氏病琼脂扩散试验。
2．方法
（1）加样：用微量移液器吸取标准IBD抗原，加入中心孔中，外周孔分别加入受检鸡的血清、标准血清，其量以平孔面为度，注意不要有气泡，不要溢出孔外，并记录点样顺序。（2）所有样本加完后，放入温盒置35~37oC恒温箱中进行扩散反应，次日观察结果。若24小时内未出现沉淀线，可继续观察至48~72小时。
3．结果判定同MDAGP试验。
三、小鹅瘟琼脂扩散试验(GP AGP试验)
小鹅瘟琼脂扩散试验，可用标准抗原检测血清抗体，亦可用标准血清检测GP抗原，前者阳性检出率为100％，后者检出率达50％以上。
1、材料准备
（1）标准GP抗原：将已知GPV种毒按1：10稀释，接种于12~14日龄的无相应抗体的鹅胚尿囊腔内，0．2mL／只，继续孵化，每天照蛋，收集接种后72~120小时之间死亡胚，气室向上静置4℃冰箱4～12小时，收获尿囊液及具有典型病变的胚体，取l份胚体，2份尿囊液捣碎制成匀浆，加等量三氯甲烷(氯仿)震摇30分钟，以3500转/分钟离心30分钟，吸取上清液装入透析袋，包埋于干燥硅胶中越夜，至袋内溶液完全干燥，向袋内加入原液容量1/20的去离子水，使内容物溶解，即为沉淀抗原。
（2）标准阳性血清：小鹅瘟高免血清。
（3）被检抗原：无菌采取具有典型病变的患病雏鹅肝组织，捣碎加2倍量离子水，制备成组织悬液，参照制各标准GP抗原方法用氯仿处理硅胶包埋浓缩加入原悬浮1／20的去离子水为被检抗原。
（4）被检血清：受检雏鹅血液自然析出的血清。
（5）琼脂板制备与打孔：同IBD AGP试验。
2．方法
在琼脂板中心孔加标准抗原(以标准抗原检测抗体者)或标准血清(以标准血清检测抗原者)，外周加入抗体(或抗原)。将琼脂板置37oC，恒温箱中感作24小时后观察结果。
3．结果判定(同MDAGP试验)
理论上，大多数传染病都可应用AGP试验作检验，目前常应用AGP试验检测的家禽传染病还有的家禽脑脊髓炎、病毒性关节、滑液囊霉形体病、禽流感、禽霍乱等，基本原理和方法同上，具体操作可按试剂说明书进行。．
六、实验报告要求
1．说明琼扩试验的基本原理、方法。
2．准确报告本次试验的结果，分析存在的问题。
3．说明本试验还可以应用于哪些家禽传染病的检验。
七、实验注意事项．
1．配制琼脂凝胶时，琼脂浓度的大小很重要，要根据经验而定，琼脂浓度较大时，制成的琼脂胶较硬，较易打孔，但过硬的凝胶板容易在反应过程中千裂，而且由于密度大，还会影响样本的扩散速度；而浓度太小时，琼脂凝胶板则很软，难于打孔，而且打孔后，孔内容易渗出水来，影响加样量；气温高时，浓度应大些，气温低时，浓度应小些。通常浓度为0.65％～1.2％o
2．为了避免打孔时孔周边琼脂脱离漏底，可在制各琼脂板前，将玻璃板浸入充分溶化的琼脂凝胶液中，取出放在恒温箱中烘干。再行倒板，这样由于玻璃板面较粗糙，与琼脂结合较牢，打孔时孔周琼脂不易脱离。
3．点样时，其加样量应统一以加至各孔满为标准，不要时多时少。如果抗原抗体的比例不当，最易影响反应结果。
4．反应温度必须始终相对恒定，否则可能会造成假阳性。
5．观察结果最好在日光灯下进行，必要时可借助放大镜。
八、思考题
1．家禽传染病的AGP试验基本操作方法与注意事项如何?结果判定方法如何?
2．本方法常可用于哪些家禽病的检测?
实验四鸡白痢、支原体病平板凝集试验
一、实验目的
1．掌握平板凝集试验的基本原理与方法。
2．了解本试验在建立无鸡自痢或无支原体病种鸡群中的应用。
二、实验内容
1．鸡白痢平板凝集试验操作。
2．支原体病平板凝集试验的操作。
三、实验仪器、设备及材料
1．鸡白痢抗原：是用鸡白痢沙门氏杆菌培养物加入0.3％的甲醛溶液灭活后，制成每毫升含菌100亿的悬浮液，并加入抗凝剂和色素制成。由兽医生物制品厂提供。
2．鸡白痢阳挫血清：由兽医生物制品厂提供。’
3．被检血清或全血：采至被检鸡群。鸡白痢凝集实验用玻扳、微量移液器等。
4．MG抗原是用国际标准“S6”株鸡败血性支原体经牛心汤培养并浓缩后制成，用于鸡败血支原体感染的检测。4~8oC保存，有效期为半年。由兽医生物制品厂提供。
5．MS抗原是采用鸡滑液囊支原体SG株培养物经浓缩后制成，用于鸡滑液囊支原体感染的检测。4~8oC保存，有效期为半年。由兽医生物制品厂提供。
6．MG阳性血清、MS阳性血清及相应的阴性血清，由兽医生物制品厂提供，-20oC以下保存。
7．玻璃板、滴管、采血针头、不锈钢丝环、混合棒及被检鸡若干只。
四、实验原理
在平板上，先滴一滴抗原、然后加入含有相应抗体的血清或全血，在有电解质存在的条件下，抗原和相应的抗体发生特异性凝集反应，即凝集成肉眼可见的凝集颗粒，根据颗粒的大小与出现时间的快慢判定试验反应结果。参与反应的抗原与抗体分别称为凝集原和凝集素。平板凝集试验具有由于简易、快速、敏感、特异的特点，长期以来，广泛用于人畜多种传染病的快速诊断，在家禽最常用的是鸡白痢鸡与败血支原体感染的检验。
五、实验步骤
(一)鸡白痢平板凝集试验
1．操作程序先将抗原充分振荡混匀，用滴管吸取鸡白痢抗原，垂直滴一滴(约0．05mL)于平板上，用针头刺破被检鸡的翅静脉或鸡冠，用不锈钢丝环沾取血液一环(约0．05mL)于抗原中，用牙签迅速将被检鸡全血与抗原混匀并散开至直径约为2厘米的薄层后，观测至5分钟，判定结果并记录。
2．结果判定标准在阳性对照和阴性对照反应均成立的前提下，抗原与血液或血清混和后，于1分钟内出现很多大块的凝集颗粒且底液清亮者为强阳性反应，记录为“#”；1～3 分钟内出现很多大小不等的凝集颗粒且底液略有混浊者为中强度阳性反应，记录为“++～+++”；3～4分钟后，出现少量细微颗粒，-底液较混浊者为弱阳性反应，记录为“+”；未见凝集现象发生或在4分钟以后出现不明显的凝集现象者为阴性反应，记录为“一”。
(二)败血性支原体病及滑液囊支原体病平板凝集试验
1．操作程序用滴管吸取MG(MS)抗原一滴置于玻璃板上，将干净的针头刺破被检鸡
的翅静脉或鸡冠后，以不锈钢丝环沾取血液一环置于MG(MS)抗原上；迅速用牙签将其混和并散开成1一2厘米的薄层后，将凝集板轻轻摇动1～2分钟后，判定反应结果。
2．判定标准同鸡白痢平板凝集试验。
六、实验报告要求
1．应将试验的结果写清楚，分析阳性结果的判断标准。
2．将本试验在生产中应用及应注意的主要问题列出纲要。
七、实验注意事项
1．鸡白痢和鸡败血支原体病(鸡滑液囊支原体病)平板凝集试验的应用：
鸡白痢和鸡败血支原体感染(鸡滑液囊支原体病)是流行普遍、危害严重的家禽传染病，其传播的重要途径之一是经卵垂赢传播。因此，搞好种鸡群中对该病的控制甚至净化工作是防制工作中的重要手段。鸡白痢和鸡败血支原体病(鸡滑液囊支原体病)平板凝集试验以简便、快捷、特异、敏感等特点在国内外普遍用于该病的临床检验，监视该病的控制与净化效果，指导控制与净化措施的修订与实施。为更好地发挥本试验在相应疾病控制中的作用，在实施检验时应注意如下事项。
2．对一般性商品生产种鸡群作鸡白痢和鸡败血支原体病(鸡滑液囊支原体病)检疫时应注意以下问题：
(1)检验样品抽检比例一般为1％～2％。
(2)检验出的阳性鸡只可淘汰也可不淘汰。
(3)检验的时间间隔对后备鸡群，首次检验应在40~70日龄，第二次检验在全面开产后每年检测2～3次。
(4)检验工作一定要配合有效的防疫工作。
(5)检验后对结果作统计，计算感染的阳性率并与上次检验结果比较，以便评估上次检验后相应防疫措施的效果，以便修订防疫计划，直至鸡群感染率下降至最低水平。
3．对以建立净化鸡白痢和鸡败血支原体病(鸡滑液囊支原体病)为目的的SPF鸡群作检疫时应注意以下问题：
(1)检验样品的比例应为100％。
(2)检验出的阳性鸡只应予淘汰。
(3)检验时间间隔应为每月1次，或根据具体净化计划确定间隔时间。
(4)对阴性鸡群实施特别严格的隔离、卫生消毒措施和药物防制措施。
(5)鸡群完全净化的基本标准是以最后连续三次检验全为阴性，且鸡群在该段时间未用过对相应疾病敏感的药物。
4、注意事项
(1)鸡白痢抗原应保存于8~10oC、避光、干燥处，使用过程中应不断摇匀。
(2)鸡向痢抗原适用于检查产蛋母鸡及一年以上的公鸡，对幼龄鸡的敏感性较差。
(3)平板凝集反应应在20oC以上的室温下进行。
(4)使用蓝紫色鸡白痢抗原作试验，最好衬以白色背景以便于观察。
(5)本试验还可以以被检鸡卵黄液作被检材料，判断标准同上。
八、思考题
1．鸡自痢平板凝集试验应注意哪些内容，判定结果的标准如何?
2．支原体病平板凝集试验同鸡白痢平板凝集试验的区别，在生产中应结合本试验采取怎样的措施控制该病?
实验五鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断
一、实验目的
1．了解鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断程序与方法。
2．熟悉鸭疫里默氏杆菌的形态特点、培养性状和生化特征。
二、实验内容
1．鸭疫里默氏杆菌病的病原分离和培养。
2．以鸭疫里默氏杆菌为例，了解细菌培养性状的观察。
3．鸭疫里默氏杆菌的生化试验的内容和方法。
4．鸭疫里默氏杆菌病的动物试验。
5．鸭疫里默氏杆菌病的药物敏感试验。
三、实验仪器、设备及材料
1．显微镜、糖类发酵管、恒温培养箱、烛光培养皿（或CO2培养箱）、接种棒、酒精灯、放大镜、药物纸片、镊子、棉签等。
2．试验动物、鲜血琼脂平板、微量生化发酵管等。
四、实验原理
根据鸭疫里默氏杆菌的培养特性和生化特征，可以同其他细菌性病原导致的家禽传染病分开。
五、实验步骤
（一）鸭疫里默氏杆菌病病原分离与鉴定
鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起各种家禽的急性或慢性传染病。患病家禽多数病例具有纤维索性渗出性炎症，可以作为初诊的重要依据。明确的诊断常需要依赖于病原分离鉴定。鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定基本要点如下：
1．鸭疫里默氏杆菌病病原分离
本病的败血性感染，病原菌分布于全身各器官组织和体液，可从肝、心血（心包）、脑等组织作细菌分离。采料时应避免体污染，死后时间过长或投药后的病例不宜作病原分离。
2．菌体形态
本菌为革兰氏阴性，无运动性，不形成芽孢，有荚膜，瑞氏染色呈两极浓染（故旧称鸭疫巴氏杆菌病），镜下呈单个、成双或链状排列。
3．培养性状
本菌在普通培养基上不生长，在鲜血琼脂、巧克力琼脂及胰酶大豆琼脂，烛缸或5%～10%CO2条件下生长良好。鲜血琼脂上培养24小时，形成1～2mm凸起、边缘整齐、透明、有光泽的奶油状、无血素的光滑型菌落，无溶血现象。在麦康凯琼脂上不生长。
4生化特征
鸭疫里默氏杆菌不同血清型或同一血清型不同分离株的生化反应也不尽相同。总的生化特点是发酵糖的能力弱，少数菌株只发酵葡萄糖、麦芽糖、肌醇和果糖，产酸不产气；不产生吲哚和H2S，不利柠檬酸盐，甲基红和V-P试验阴性，不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，不水解淀粉，氧化酶和过氧化氢酶阳性。
5．动物试验
鸭疫里默氏杆菌致病性菌株24~48小时的血清肉汤培养液，接种2~3周龄（主要侵害2~7周龄）易感鸭，2~5天出现发病及死亡。兔和小鼠对该菌有抵抗力，豚鼠腹腔大剂量接种则可引起死亡。
鸭疫里默氏杆菌病病原分离鉴定程序如下：
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六、实验报告要求
1．鸭疫里默氏杆菌的实验诊断基本程序与方法
2．实验报告应体现鸭疫里默氏杆菌的形态和染色特点、培养特性与生化特征。
七、实验注意事项
1．注意鸭疫里默氏杆菌的染色方法及显微镜下的形态特点。
2．注意鸭疫里默氏杆菌的培养方法与生化特征。
八、思考题
1．鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断程序如何?
课堂讨论一家禽疾病的综合防制措施
一、实验目的
掌握家禽疾病综合防制的基本原则和方法。
二、实验内容
（一）平时的预防措施
1．现代养禽业对疾病的防制坚持“预防为主，防重于治”的原则。尽可能减少饲养管理或防制工作失误导致的规模发病而造成的损失。这其中包括传染病、寄生虫病、营养缺乏病或药物中毒病等。
2．坚持进出口消毒，防止病原传入和传出。
3．坚持环境清洁与消毒。
4．坚持“全进全出”的饲养制度。
5．带禽消毒要经常化，以便随时扑灭带菌禽排出的病原。实施时，每天作带禽喷雾，平时每周2～3次，有疫情时每天1～2次，对于预防疾病的发生，控制疫情的发展，减少场地污染，净化环境有重要意义。
6．适时进行药物预防。根据当地或本场以往疫病发生的情况，在一些细菌性疾病、真菌病或寄生虫病可能发生前，选用有效药物拌料或饮水，以达到预防相应疾病的目的。
7．结合实际，制订适合本场使用的免疫程序。选择适宜的疫苗、正确的接种途径和合适接种日龄是预防家禽疫病取得成功的先决条件。
8．对于新城疫和传染性法氏囊病等主要传染病要坚持免疫监测制度，据其结果及时修正这些疫病的免疫程序。
9．保持禽舍的空气清鲜，光照、通风、温度、湿度应符合饲养管理卫生要求，定期杀虫及灭鼠，杜绝飞鸟进入和进行粪便的无害化处理等工作。
10．做好检疫和诊断工作，及时采取可靠的措施预防和控制疫情。
11．严格执行种蛋及孵化室的兽医卫生防疫要求，防止经卵传播疾病的发生。
（二）发生疫病时的扑灭措施
1．经常深入禽舍观察了解禽群动态，应对疫病早发现、早确诊、早处理、早扑灭，将疫情限制在最小范同内及尽量减少损失。
2．迅速隔离病禽，禁止无关人员串栋。及时清理病死家禽，并做无害化处理。必要时可迫杀病禽，集中处理，并进行必要的场地消毒。
3．发生禽流感、鸭瘟等烈性传染病时，应立即封锁现场，并向上级主管部门报告．以利于采取果断措施，控制疫病的散播。
4．在正确诊断的前提下，采取果决措施，如紧急接种，全群投药等消除病因。
5．病禽处理完毕后，其栏舍及设备应严格清洁消毒，并空置一定时间(2～3周)，避免新进入的禽群又发生同样的疫病。
三、实验仪器、设备及材料
幻灯片、图片、光碟和录像带等。
四、实验报告要求
应体现家禽疾病综合防制措施的平时预防和发生疫病时的扑灭措施，同时提出个人的见解。
五、实验注意事项
应注意家禽疾病综合防制的原则“防重于治，预防为主”的主要方针。
六、思考题
家禽疾病综合防制措施的要点有哪些?