肝素钠的提取与检测
摘要
本实验主要是对肝素钠提取工艺的研究。对国内外肝素钠的提取和纯化方法进行研究和分析，建立以牛内脏（肝、肺、心）为原料，采用盐解、离子交换的方式与乙醇沉淀相结合提取肝素钠。利用天青A染色法检测肝素钠的效价，测定波长是505nm，与标准曲线对比可得到样品中肝素钠的效价。利用浓硫酸氧化法，在波长为298nm处的吸光度来确定肝素钠的浓度。利用双缩脲法，在波长为540nm处的吸光度来确定蛋白质的含量。试验测得肝素钠的效价平均值为139.483U/mg，肝素钠的浓度平均值为200.8752mg/kg，去除蛋白质效果良好，均在99%以上。
关键词：肝素钠，盐解，树脂，天青A，纯化，蛋白质
1.1研究背景和意义
1.1.1研究背景
肝素钠又称肝素，是重要的生物药品，作为天然的抗凝血物质而受到世界各国的重视。我国是世界上肝素钠主要出口国之一，但是出口产品以低效价的粗品肝素为主。肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在[1]。这种复合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种活性逐渐表现出来。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、
抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。中国具有丰富的畜产品副产物资源，但我国生产的肝素产品效价低，提取率低的问题很突出，这种情况下，只有提出肝素提取纯化新工艺，才能提高畜产品加工副产物的附加值，拓宽利用领域，增加国民收入，提高中国在国际上的地位。
1.1.2研究意义
肝素主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠粘膜细胞内。目前，国内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主，在提取工艺中都必须经过肝素蛋白质复合物的提取、肝素蛋白质复合物的分解和粗品肝素的精制三个过程。
国内每年猪牛屠宰量极大，副产物产量极高，但是目前利用率却很低。其主要原因是加工技术和装备水平落后，产品提纯方面的产业化技术还没有真正突破。
1.1.3肝素效价显色原理
肝素是一种粘多糖，在多糖链上带有很多阴离子基团，如磺酸基、羧基等。因而肝素具有很强的负电性，能与阳离子或带正电荷的分子结合，生成复合物。天青A染料是一种碱性染料，即正电荷部分能与肝素的阴离子结合，生成肝素天青复合物，并能表现因光异色现象，即产生一种较原来染料颜色不同的反应，这一反应程度与肝素结合量有一定关系。1976年，杰奎斯等在贝克曼DK-2分光光度计上利用天青A作肝素定量测定，发现低浓度肝素在波长505nm，pH=8.6的条件下，肝素浓度与吸光值之间符合朗白---比尔定律。该法可用于测定
肝素效价和生产过程的控制。
2实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1试剂和材料
牛内脏秦宝
肝素标准品中国药物生物检定所（北京）
氯化钠上海恒远生物科技有限公司
乙醇（95%）分析纯天津市凯通化学试剂有限公司
巴比妥分析纯西安化学试剂厂
天青A染料生物染色剂天津市天新精细化工开发中心
氢氧化钠分析纯天津市大茂化学试剂厂
硫酸分析纯白银化学试剂厂
硼砂分析纯上海易利生物科技有限公司
陶氏AMBERLITE TM FPA98CL食品级特种聚合物（树脂）上海唯高实业有限公司
2.1.2实验设备
JJ—2B组织捣碎匀浆机金坛市医疗仪器厂
PH-3C计上海佑科仪器仪表有限公司
85-2恒温磁力搅拌器常州国华电器有限公司
电热恒温热水槽HH-S8型北京科伟永兴仪器有限公司
旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂
100目筛浙江上虞市水仙纱筛厂
电磁炉广东美的生活用品制造厂
真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司
真空抽滤机郑州长城科工贸有限公司
756P紫外—可见分光光度计上海光谱仪器有限公司
电子天平慈溪市天东衡器厂
填充柱
2.2实验方法
原料——提取——吸附——洗涤——洗脱——沉淀——脱水干燥——肝素钠粗品——提纯——肝素钠。
2.2.1具体操作控制
(1)提取[2,3]
取牛肺样品100g，加入5倍量的蒸馏水，在组织捣碎机中充分破碎至肉糜状，用NaOH溶液调ph至8.5，加入5%NaCL在60℃下不时搅拌2h，立即升温至100℃10min沉淀蛋白质，用100目的筛过滤，滤液备用。
(2)吸附
滤液冷却至50℃左右，用氢氧化钠调节ph至8.5，加入8%的已处理好的树脂，在恒温磁力搅拌器上维持温度在50℃左右，连续吸附8h，过滤，树脂备用。
(3)洗涤
将树脂装入填充柱，先用蒸馏水冲至无色，虑干。用 1.2mol/L
的氯化钠浸泡洗涤30min。滤液弃掉。
(4)洗脱
在树脂填充柱中加入5mol/L的NaCL浸泡3h，再用3.5mol/L的NaCL浸泡2h，将两次的滤液收集在一起备用。
(5)沉淀蛋白质
将滤液调pH至3.5处理30min，沉淀酸蛋白，过滤；将滤液调pH至10，处理3h沉淀碱蛋白，过滤。
(6)乙醇沉淀
取滤液用1.5倍95%酒精处理2h，真空抽滤，保留固体，滤液收集进行乙醇回收。
(7)干燥
把抽滤固体在60℃下真空干燥。得到肝素粗品。
2.2.2肝素效价检测
采用天青A染色法检测肝素效价[4,5]，即先用肝素标准品作光密度标准曲线，然后测定样品的光密度值，对照标准曲线查出样品的效价。具体的检测方法如下：将1.0 gNaOH 用蒸馏水定容于50 mL 容量瓶中，即得到0.5 mol/L 的NaOH 溶液。称取巴比妥5.52 g，溶于上述NaOH 溶液中，待完全溶解后，冷却，用蒸馏水稀释至500 mL，用pH 计校正。称取天青0.5 g，先用少量蒸馏水将其完全溶解，再稀释至500 mL，过滤，将滤液（储存液）冰箱保存。临用时，吸取储存液5mL，加蒸馏水25 mL，混合均匀即得。
精确称取10～15 mg 的待测样品，先用蒸馏水溶解成1 mg/mL，
再取250 mL容量瓶2个，各吸取上述溶液2.5 mL。加水稀释至刻度，即配成0.01 mg/mL 的测定液。吸取测定液1～5 mL 加蒸馏水补足到5 mL，充分摇匀后在505 nm 下测定吸光值，测3 个平行样，取其平均值[6]。
2.2.3肝素浓度的测定
采用浓硫酸氧化法来检测溶液中肝素的含量，使用猪小肠肝素标准品来制作标准曲线，准确称取肝素标准品，配成482μg/mL肝素水溶液，再按0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL的浓度梯度，分别吸取不同体积的肝素水溶液，用蒸馏水定容到1mL，向每份溶液中分别加入3mL含0. 025M硼砂的90 %（v/v）的硫酸溶液，充分摇匀，置于90℃水浴中，经常搅动，10min后取出，冷至室温，半小时后采用紫外-可见分光光度计测定298nm光密度（另做不加肝素，以水代之的空白试验作对照），重复3次（n=3），取平均值。按照各组试验数据可绘制出标准曲线，根据标准曲线方程计算溶液中的肝素含量[7]。
2.2.4蛋白质的测定
蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。
3结果分析
3.1标准曲线的绘制
3.1.1肝素效价标准曲线的绘制
用肝素标准品绘制肝素效价标准曲线，其测定方法和检测结果如表3.1 所示。根据检测结果绘制出的肝素效价标准曲线如图 3.1 所示。
表3.1 肝素效价标准曲线测定数据
Table 3.1 Dctection data of heparin potency standard curve
0 1 2 3 4 5
肝素标准溶液（ml）0 1 2 3 4 5 蒸馏水（ml） 5 4 3 2 1 0
巴比妥缓冲液（ml） 1 1 1 1 1 1
天青A染料（ml） 1 1 1 1 1 1 OD505(nm) 0 0.056 0.104 0148 0.230 0.248
肝素效价（U/mg）
Fig.3.1 Standard curve of heparin potency
以肝素效价为横坐标X，肝素在505nm 的吸光度为纵坐标Y，根据测定结果绘制标准工作曲线，试验结果表明其线性回归方程为：Y=0.0421X+0.001，回归方程的决定系数R2=0.9982，说明方程拟合较好。
3.1.2肝素浓度标准曲线
用肝素标准品进行浓度测定，其测定数据结果如表 2.2 所示，根据测定数据做出肝素浓度标准曲线如图 2.2 所示。
表3.2 肝素浓度标准曲线测定数据
Table 3.2 Data of heparin concentration standard curve
肝素浓度(ug/ml) OD298(nm)
14.46 0.106
28.92 0.223
57.84 0.481
86.76 0.717
115.68 0.930
图3.2 肝素浓度标准曲线
Fig.3.2 Standard curve of heparin concentration
以肝素浓度为横坐标X，肝素在298 nm 的吸光度为纵坐标Y，根据测定结果绘制标准工作曲线，试验结果表明其线性回归方程为：Y=0.0039X+0.052，回归方程的决定系数R2=0.9994，说明方程拟合较好。
3.1.3蛋白质浓度标准曲线
由血浆蛋白质标品得到蛋白质含量的标准曲线如图3.3所示。
图3.3 蛋白质含量标准曲线
Fig.3.3 Standard curve of protein contents
蛋白质含量的线性回归方程为：Y=0.0414X+0.0026，方程中Y 为吸光度，X 为测定液中蛋白质含量（mg/mL），线性回归方程的决定系数R2=0.9993。说明标准曲线相关性好，可用该标准曲线计算肝素提取液中的蛋白质含量。
3.1.4牛内脏肝素钠效价测定
牛内脏（肝脏、肺脏、心脏）肝素钠效价测定，其测定数据如表3.3所示。
肝脏肺脏心脏普通育肥牛27.91 197.15 169.83
秦宝雪花牛33.05 254.16 154.39
由表可知，各个部位肝素钠的含量差别巨大，表明肝素的含量与脏器的部位以及功能有一定的关系。秦宝雪花牛的肝素的效价除心脏外均超过普通育肥牛。宋大巍的肝素的高效提取和分离纯化技术研究中测得肝素粗品的效价为115U/mg，任红媛,何泼,李红心的猪小肠粘膜中肝素钠提取与精制工艺研究中以猪小肠为原料测得粗品肝素钠的效价为73.19U/mg。周先琬[8]研究采用酶水解法精制肝素，其得到的粗肝素效价为50～120 U/mg。
差异源SS df MS F P-value F crit
组间148.9871 1 148.9871 12.64067 0.001772 4.300949
组内259.2992 22 11.78633
总计408.2863 23
由上表可知普通育肥牛和秦宝雪花牛肝素钠效价差异显著。和培育方式有密切的关系，不同牛之间由于生理等因素的影响才导致了差异的显著性。
3.1.5牛内脏肝素钠浓度测定
牛内脏（肝脏、肺脏、心脏）肝素钠含量（mg/kg）测定，其测定数据如表3.4所示。
肝脏肺脏心脏普通育肥牛63.8615 357.2889 39.3296
秦宝雪花牛139.6723 580.5217 49.9720
由表可知肝素钠的含量每个部位各不相同，肺脏含量最高。同一个部位不同牛种的肝素钠的含量也不相同。秦宝雪花牛的含量均高于普通育肥牛。宋大巍的肝素的高效提取和分离纯化技术研究中测得猪小肠中肝素的提取率为189.19mg/kg，蛋白酶和超声波辅助提取率为230.81mg/kg。根据阅读的文献中提取率达到最高的为780mg/kg。
3.1.6牛内脏提取物粗品中蛋白质测定
牛内脏（肝脏、肺脏、心脏）提取物粗品中蛋白质除去率（%）测定，其测定数据如表3.5所示。
肝脏肺脏心脏
普通育肥牛99.95 99.54 99.83
秦宝雪花牛99.95 99.64 99.46 由表可知，蛋白质的除去效果很好，可见经过碱沉淀和酸沉淀之后蛋白质的含量已经达到很低的水平，对实验结果的影响较小，得出的数据是可靠的。
4讨论
本实验是采用成熟的盐解法测定肝素钠的含量。本方法操作简单，节约成本，重复性好。此方法与酶解盐解结合相比较略现落后，提取率、效价和浓度差别较大，可能由于细胞破碎的不够充分，肝素没有完全转化成肝素钠。下一步要做的就是怎么用盐解法提高肝素钠的提取率，在提取时间、吸附时间和洗脱时间，以及洗脱所用盐的浓度上做进一步的研究，确定最佳提取和洗脱条件，得出更加有说服力的数据。
N-硫酸化程度高和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖。是由D-β-葡糖醛酸（或L-α-艾杜糖醛酸）和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的黏多糖。由紧靠血管的肥大细胞产生，并贮存于肥大细胞的颗粒中，应一定的刺激而释放，具有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。肝素对医学的作用巨大，同时也会有负面的影响肌注可引起局部
血肿，静注后可产生可逆性血小板减少症。偶有过敏反应如哮喘、荨麻疹、鼻炎、结膜炎和发热等，长期使用可产生暂时性秃发症、骨质疏松和自发性骨折。用量过大，主要产生自发性出血，如有严重的出血现象，可静注硫酸鱼精蛋白急救(1μg硫酸鱼精蛋白可中和100单位肝素)。
5参考文献
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肝素钠效价检测方法 试剂：羊血浆（冰冻保存）、0.9%生理盐水、0.25%CaCl2（用生理盐水配置）、8%柠檬酸钠溶液、8IU∕mg肝素钠标准溶液。 4.2.2.2 待检样品溶液的配置：精确称取肝素钠固体待检样品M mg，溶解并用0.9%生理盐水定容至100ml，再取V ml定容至25ml即得待检样品溶液，冷藏保存。 估计M及V的计算公式为：样品估计效价×MV∕100=25×8 估算时V只尽量小于10且取整数，从而计算出M值。 4.2.2.3检测方法：将恒温水域调制37℃恒温，取出冰冻羊血浆，融化，并过滤，待 用。取2组10只试管，分别加入标样110ul、120ul……200ul，然后每管加 入8%柠檬酸钠溶液20ul、0.25%CaCl2 0.8ml 及过滤后的羊血浆1ml，另一组 加入待检样品溶液110ul、120ul……200ul，同样每管加入8%柠檬酸钠溶液 20ul 、0.25%CaCl2 0.8ml及过滤后的羊血浆1ml。并将每只试管盖好管盖， 倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域1h。1h后取出各管，检 查各管的凝固程度，并记录确定标样及待检样的1∕2凝固点及体积。 凝固程度标准： ①完全凝固：溶液完全凝固，倒转试管并猛敲一下时，凝块不从管壁脱落。 ②3∕4凝固：溶液完全凝固，但当猛敲一下时，凝块能从管壁脱落。 ③1∕2凝固：大约一半体积的溶液凝固。 ④1∕4凝固：少量溶液凝固。 ⑤0凝固：溶液悟凝固现象。 若相邻两管跳过1∕2凝固点则1∕2凝固点的计算公式为 V=V2-（V2-V1）×（0.5-S1）∕(S2-S1) (S1：小凝固度；S2：大凝固度；V1：相邻两管大凝固度加入的微升数；V2：相邻两管小凝固度加入的微升数。) 待检样品效价计算公式： 4.2.2.4F=待检样品估计效价×标品1∕2凝固点微升数÷样品1∕2凝固点微升数4.2.2.5 注意事项： 4.2.2.6.1 实验室操作环境必须控制在30℃以下。 4.2.2.6.2在使用新开启羊血浆前，需检测羊血浆是否能够正常使用。取试管一只，加入0.8ml 0.25%CaCl2及过滤后的羊血浆1ml ，盖好管盖，倒转3—4次混匀，使内壁湿润，垂直放入37℃水域5min，5min后检查血浆是否凝固，如血浆凝固则可使用，未凝固则不能使用。 4.2.2.6.3 如在检测过程中，标样的1∕2凝固点高于200ul，则需重新调整羊血浆的1∕2凝固点。方法如下：取3组各10只试管 组一： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标样 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ul 8%柠檬酸钠 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 ul 0.25%CaCl2 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 ml 羊血浆 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml
关于油藏的相渗曲线的以及含水饱和度曲线交点求法 小熊维尼 在油藏的期末复习的时候，我就发现了这个问题，明明很正常的fw-Sw曲线，想当然的会以为直接对它求导，然后求得斜率相等的点就行了。但是往往事与愿违，往往给出的是点的数据，就是测井数据。那么我们怎么来精确地求得那个交点值呢，以下给出一种数值方法，希望对大家有用。 前期准备： 你必须得有mathematical，matlab或者maple，当然如果你对自己的计算能力有信心，那也行的。 步骤： 1，我们从Excel表格中读取数据（以下我以传姐的数据为例） 2，对导入的数据进行插值（三次艾米尔特插值的精度就可以了），画出插值函数，即： 这就是经过插值之后的fw-Sw曲线了，既然我们有了函数表达式，那么后面的步骤我相信很多人都明白了。 3，但是事情往往没这么简单，你可能会想：“对啊，我略懂mathematical或者matlab 我知道切点的斜率和切线的斜率相等，而且切线过（0.32,0）这个点，这个还不好求吗？不就是一个Solve命令嘛。”如果你真要这么想，我只能表示呵呵了。可以明确表示常规的解方程命令在这里都不起作用。原因是你的曲线是插值分段函数，虽然你看起来就像一条完整的曲线一样。 4，穷则思变，我们采用的是牛顿切线法或者割线法，这是一种线性收敛的计算方法，但是对于这道题的要求够了。在mathematical下命令是FindRoot，matlab我就不知道了（求教）。本质上牛顿切线法是一种迭代方法，也就是说必须给出迭代初始点 以上是mathematical下的FindRoot函数的调用格式，和普通解方程的格式一致，看看
实验室测定尿碘的质量控制 杨志琼雷航琪万衍罗燕朱万明冯鑫 （乐山市疾病预防控制中心乐山614000） 尿碘的测定目前我国的标准方法是砷铈催化分光光度法。该法测定尿碘的灵敏度高，结果准确，但由于尿碘含量的微量性加上尿碘测定的干扰因素较多。因此对实验人员和实验条件及实验过程要求严格。今年由于国家的十二五规划，我们实验室做了大量的尿碘样品，积累了一定的经验。现对以往的经验进行总结并从以下几个方面谈谈砷铈催化分光光度法测定尿碘的质量控制。 1.实验前准备 1.1实验人员的素质要求实验室检验结果的准确性与实验人员素质有着最直接的关系，为确保尿碘检测结果的准确可靠，尿碘检测工作必须由经过尿碘检测培训合格的人员担任，必须严格熟悉检验标准，掌握相关仪器的性能指标、正确操作方法和注意事项，并按照实验室内部质量控制体系进行实验。 1.2实验室环境的要求实验室环境条件的正常和稳定是检验工作正常开展的保障，也是确保检验结果有效性和准确性所必需的。实验室的环境因素是指实验室内的温度、湿度、照明、采暖、通风、压力、气体污染以及空气悬浮微粒等条件。这些因素都直接或间接对仪器的性能、或者反应本身产生影响从而影响实验结果。本实验的环境条件要求：（1）由于尿碘的含量很低，为避免污染，建议采用专用实验室，条件实在不够的情况，必须与碘盐实验室分开且室内不能存放含碘的其他试剂和样品；（2）操作台面用1%的硫代硫酸钠搽洗。（3）本实验最好保证温度在20℃-30℃之间进行，且波动不能超过1℃，最好在0.5℃之内。如果外界环境温度达不到要求或者温度波动过大时，可采用空调或者超级恒温水浴箱进行温度控制。 1.3仪器设备的要求本实验要求控温消解仪、超级恒温水浴箱、723分光光度计、加样枪等进行了检定，误差在可接受范围之内，并保证这些仪器设备的稳定性和准确性。 1.4玻璃器皿的要求本实验所有采用的玻璃器皿：（1）移液管、容量瓶、刻度吸管均需要进行强制检定；（2）浸泡前清洗至不挂水珠，宜用品牌洗衣粉（雕牌、白猫等）洗刷有较好效果，不宜用洗洁精；（3）采用10%左右的盐酸浸泡过夜，必须保证浸泡盐酸浓度足够，也可先采用稀硫代硫酸钠溶液（10%）浸泡。只要漂洗干净，两种浸泡液处理后没有明显差异。（4）浸泡后必须用自来水冲洗数次，再用纯水冲洗数次；（5）加样枪头建议采用一次性，因为枪头不易清洗，重复使用会导致交叉污染，导致实验失败。（6）注意切不可与测定碘盐的玻璃器皿混用；另外还要避免和水质检验中氨氮的纳氏比色法、砷的银盐比色法用过的玻璃器皿混用，同时还要避免这些高浓度的碘对分光光度计和比色皿的污染。 1.5实验用水和化学试剂的要求本实验用水为去离子水，最好能满足GB/T6682中一级水的要求。化学试剂的纯度不能低于标准方法的规定。其中的氢氧化钠和氯化钠有可能会含有较高浓度的碘杂质，宜采用专用的优级纯试剂。为了保证酸度的准确和少带来杂质，浓硫酸也最好采用优级纯。 1.5.1 过硫酸铵溶液 正常的过硫酸铵固体试剂的颗粒应为透明状晶体，如果受到潮解则不适合使用，否则会导致消化效果大受影响，致使标准曲线的空白管吸光度值偏小，标准曲线的线性和斜率都不理想。 标准中配制过硫酸铵的操作是称取114.1g过硫酸铵溶于500ml去离子水中，由于过硫酸铵溶解有10%的正体积效应，溶液将变成550ml左右，实际浓度为0.9mol/L，并非标准中
1208 肝素生物测定法
本法系比较肝素标准品（Ｓ）与供试品（Ｔ）延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝 结时间的作用，以测定供试品的效价。
标准品溶液的制备 精密称取肝素标准品适量，按标示效价加灭菌注射用水 溶解使成每 1ml 中含 100 单位的溶液，分装于适宜的容器内，4～8℃贮存，经验 证保持活性符合要求的条件下，可在 3 个月内使用。
标准品稀释液的制备 试验当日，精密量取标准品溶液，按高、中、低剂量 组（dS3、dS2、dS1）用 0.9％氯化钠注射液配制成 3 种浓度的稀释液，相邻两浓度 的比值（r）应相等；调节剂量使低剂量组各管的平均凝结时间较不加肝素对照 管明显延长，一般以大于 1.5 倍空白血浆的凝固时间为宜。高剂量组各管的平均 凝结时间，用兔全血法者，以不超过 60 分钟为宜，其稀释液一般可制成每 1ml 中含肝素 2~5 单位，r 为 1：0.7 左右；用血浆复钙法者，以不超过 30 分钟为宜， 其稀释液一般可制成每 1ml 中含肝素 0.5~1.5 单位，r 为 1：0.85 左右；用活化 部分凝血活酶时间测定法（APTT 法）者，一般以不超过 90 秒为宜，其稀释液浓 度一般可制成每 1ml 含肝素 0.4～1.7 单位，r 为 1:0.85 左右，可根据实验情况 调整。
供试品溶液与稀释液的制备 按供试品的标示量或估计效价（AT），照标准 品溶液与稀释液的制备法制成高、中、低（dT3、dT2、dT1）3 种浓度的稀释液。相 邻两浓度之比值（r）应与标准品相等，供试品与标准品各剂量组的凝结时间应 相近。
血浆的制备 迅速收集兔或猪血至预先放有 109mmol/L 枸橼酸钠溶液的容 器中，枸橼酸钠溶液与血液容积之比为 1：9，边收集边轻轻振摇，混匀，室温 下 1500×g 离心不少于 15 分钟（g 为重力常数）。立即吸出血浆，并分成若干份 分装于适宜容器内，低温冻结贮存。临用时置 37±0.5℃水浴中融化，用两层纱 布或快速滤纸过滤，使用过程中在 4～8℃放置。血浆复钙法可使用兔或猪血浆； APTT 法使用兔血浆。
测定法 （1）兔全血法 取管径均匀（0.8cm×3.8cm 或 1.0cm×7.5cm）、清洁干燥的 小试管若干支，每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液 0.1ml，每种浓度不
肝素钠 Gansuna Heparin Sodium ■本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质，是由不同分子量的糖链组成的混合物，由α-D-氨基葡萄糖（N-硫酸化，O-硫酸化，或N-乙酰化）和O-硫酸化糖醛酸（α-L-艾杜糖醛酸或β-D葡萄糖醛酸）交替连接形成聚合物，具有延长血凝时间的作用。按干燥品计算，每1mg中抗Ⅱa因子效价不得少于180 IU，抗Xa因子效价与抗IIa因子效价比为0.9～1.1。■[修订] ■核酸取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含4mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA）测定，在260nm的波长处，吸光度不得大于0.10。■[增订] ■蛋白质取本品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含30mg的溶液，作为供试品溶液；另取牛血清白蛋白对照品适量，分别加水制成每1ml中各含0、10μg、20μg、30μg、40μg与50μg的溶液，作为对照品溶液，照蛋白质含量测定法（附录ⅦM 第二法）测定。按干燥品计，含蛋白质不得过0.5%。■[增订] ■有关物质取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含100mg的溶液，涡旋混合至完全溶解，取0.5ml，加入1 mol/L盐酸溶液0.25ml和25%亚硝酸钠溶液0.05ml，振摇混匀，反应40分钟，加入1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml终止反应，作为供试品
溶液；取肝素对照品250mg，加水2ml，涡旋混匀至完全溶解，作为对照品溶液（1）；取对照品溶液（1）1.2ml，加2%硫酸皮肤素对照品0.15ml与2%多硫酸软骨素对照品0.15ml，作为对照品溶液（2）；取对照品溶液（2）0.1ml，加水稀释至1ml，作为对照品溶液（3）；取对照品溶液（1）0.4ml，加水0.1ml，混匀，加1 mol/L盐酸溶液0.25ml和25%亚硝酸钠溶液0.05ml，振摇混匀，反应40分钟，加1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml终止反应，作为对照品溶液（4）；取对照品溶液（2）0.5ml，加1 mol/L盐酸溶液0.25ml和25%亚硝酸钠溶液0.05ml，振摇混匀，反应40分钟，加1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml终止反应，作为对照品溶液（5）。照高效液相色谱法（附录V D）测定，以烷醇季铵为功能基的乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合物树脂为填充剂（如AS11-HC阴离子交换柱，2mm×250mm,与AG11-HC保护柱，2mm ，用 ] μg 均应符合规定。 干燥失重取本品，置五氧化二磷干燥器内，在60℃减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%（附录ⅧL）。 炽灼残渣取本品0.50g，依法检查（附录ⅧN），遗留残渣应为28.0%～41.0%。 钠精密称取本品约50mg，置100ml量瓶中，加0.1ml/L盐酸溶液（每1ml中含氯化铯1.27mg）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取钠单元素标准溶液（每1ml中含Na+200μg），用上述盐酸溶液分别定量稀释制成每1ml中含Na+25μg，50μg，75μg 的对照品溶液。取对照品溶液与供试品溶液，照原子吸收分光光度法（附录IV D第一法），
肝素市场分析 2010年我国肝素及其盐的出口沿袭了2009年的强劲增长势头,再度走出火爆行情,出口量价同创历史新高:出口量为114.4吨,同比增长2.42%;出口金额达11.92亿美元,同比增长71.68%;出口平均价格10475.11美元/公斤,同比增长67.63%。肝素及其盐出口额已超过VC,跃居为我国第一大西药重点出口商品。 2010年,我国肝素及其盐共出口到51个国家和地区,出口集中度很高,前五大出口市场为法国、美国、德国、奥地利和意大利,所占出口比重累计高达86.32%。不同市场出口情况差异较大,如对法出口量价同比大幅增长,因为赛诺菲-安万特继续加大了采购订单;但是对美国、意大利的出口量同比则明显萎缩,可能是由于肝素价格过高,影响了客户采购积极性。 肝素作为抗凝血剂，于1935年正式应用于临床治疗，至今已有70余年历史。至今，它仍是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，已被收入世界各主要国家《药典》。 肝素首先从新鲜的健康生猪的小肠粘膜中提取并制成肝素粗品，肝素粗品中含有病毒及蛋白质，不能直接应用于临床治疗，需进一步提纯以制成肝素原料药，通常以钠盐或钙盐的形式存在，称为肝素钠（Heparin Sodium）或肝素钙，在使用中尤以肝素钠为主。肝素原料药主要的质量指标为效价，含义为每毫克（mg）肝素原料药含有的肝素活性单位（IU）。肝素原料药每毫克含有的活性单位（IU）越多，表示其品质越好、抗凝血的生物活性越强。各国《药典》均对肝素原料药规定了最低效价标准，以规范和控制肝素原料药的质量。一般而言，肝素原料药的效价为150－200IU/mg。 肝素原料药可直接被用于制成标准肝素制剂，或进一步加工制成低分子肝素原料药，再制成低分子肝素制剂。标准肝素制剂和低分子肝素制剂可直接应用于临床治疗。肝素类产品主要包括：肝素粗品、肝素原料药、标准肝素制剂、低分子肝素原料药以及低分子肝素制剂。其中肝素粗品是肝素原料药的原料，肝素原料药是标准肝素制剂和低分子肝素原料药的原料，低分子肝素原料药是低分子肝素制剂的原料。
国家物价局财政部 关于发布中央管理的卫生系统行政事业性收费项目及标准 的通知 价费字[1992]314号 卫生部： 根据中发［1990］16号《中共中央、国务院关于坚决制止乱收费、乱罚款和各种摊派的决定》的精神，对中央管理的卫生系统行政事业性收费进行了重新审定，经全国治理“三乱”领导小组同意，就有关规定通知如下： 一、卫生监督防疫收费。卫生监督防疫（包括食品卫生监督、公共场所卫生监督、劳动卫生监督、学校卫生监督、放射性同位素与射线装置防护监督、化妆品卫生监督和传染病防治等）收费按《卫生监督防疫收费管理办法》（附件一）执行。 二、药品审批监督检验费 （一）证件工本费根据国务院有关规定，卫生部印制、颁发《药品生产企业许可证》、《药品经营企业许可证》、《制剂许可证》，每证可收取工本费3元；考虑到证件发放过程中的损耗及有关费用支出，经省级物价、财政部门批准，省级卫生管理部门发放过程中可以适当提高收费标准，但最高不得超过10元。 （二）新药审批费新药审批（包括新药临床研究审批、生产审批和试生产转正式生产审批）收费按《新药审批收费标准》（附件二）执行。 （三）已生产药品注册登记费生产企业：每个品种20元； 医院制剂：每个品种2元。 （四）首次进口药品审批费每个品种50元。 （五）国外药品在中国注册费每种500至1000美元。 （六）麻醉药品、精神药物进出口准许证费每份100元。
（七）特殊化学品出口准许证费签发醋酸酐、乙醚、三氯甲烷三种化学品出口准许证，每份100元。 （八）药品检验费法定药品检验实行抽验制度，包括对药品生产企业、经营企业和医疗单位药品的抽验。药品的抽验由受检单位交纳检验费，抽验无论合格与否，均按《药品检验收费标准》（附件三）执行。 （九）新药技术复核审查检验费一类：600至800元；二类：500至700元；三类：300至500元；四、五类：200至300元。 （十）进口药品检验费按《进口药品检验收费标准》（附件四）执行。 （十一）出口药品检验费。出口药品检验按药品检验项目收费标准执行。 （十二）申请生产《中华人民共和国药典》、《卫生部药品标准》收载品种的审批费，每个品种250元。 生产省、自治区、直辖市药品标准收载品种的审批费，由省级物价部门会同财政部门制定。 三、新生物制品审批检验费。 （一）新生物制品审批费。申请新生物制品审批（包括申请人体观察审批、申请生产审批、试生产转正式生产审批）的单位，在提交申报资料的同时，应向卫生部药品审评委员会办公室交纳新生物制品审批费，收费标准见附件五。 （二）新生物制品检验费。研制单位在申请新生物制品人体观察或生产时，应向中国药品生产制品检定所交纳检验费。收费标准按附件六执行。 四、生物制品检验费按《生物制品检验收费标准》（附件七）执行。 生物制品检验机构利用受检单位的仪器设备，并由受检单位提供水、电、材料进行检验时，不得收取检验费，只收取每人每天20元劳务费；利用自带仪器设备或部分使用受检单位仪器设备的，在检验成本核算时应扣除受检单位所提供的仪器设备和水电材料费用，远程（单程200公里以外）抽样或检验的差旅费另行计收，但同一地区多家抽样或检验的差旅费应分摊，不得重复计算；远程样品的运输费，由被检单位支付。
肝素钠：是一种含有硫酸基的酸性粘多糖类天然抗凝血物质。肝素是分子量大小各异的一簇酸性粘多糖混合物的统称，具有由六糖或八糖重复单位构成的线形链状分子，分子量在3,000到30,000Da之间，平均分子量15,000Da左右。结构式：主要由两个结构单位构成：结构单位Ⅰ是： GlcNHR-6-OSO3-GlcA-GlcNSO3-3,6-二- OSO3-IdoA-2-OSO3- GlcNSO3-6- OSO3 结构单位Ⅱ是：IdoA-2-OSO3-GlcNSO3-6-OSO3 肝素广泛存在于哺乳动物肝、肺、肠黏膜中，多与蛋白质结合成复合体存在·。酶解蛋白可分离肝素，肝素是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在pH8-9时，带负电荷，可与阴离子交换剂进行离子交换，进行粗分离，多糖液在高浓度乙醇中沉淀进行精纯。 肝素在组织内和其它粘多糖一起与蛋白质结合成复合物，因此肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取，解离和肝素的分离纯化两个步骤。 肝素分子中含有硫酸基与羧基，呈强酸性，为聚阴离子，能与阳离子反应成盐。这些阳离子包括金属阳离子：Ca2+,Na+,K+,有机碱的长链吡啶化合物，如十六烷基氯化吡啶（CPC）、番木鳖碱、碱性染料-天青A，阳离子表面活性剂（长链季铵盐）如十六烷基三甲基溴化铵；阳离子交换剂和带正电的蛋白质如鱼精0蛋白等。 肝素结构中的N-硫酸基与抗凝血作用密切相关，如遭到破坏其抗凝血活性则降低。N-硫酸基对酸水解敏感，在碱性条件下相当稳定。肝素分子中游离羟基被酯化，如硫酸化，抗凝活性也下降，乙酰化不影响其抗凝活性。 肝素钠为白色或类白色粉末，无臭无味，有引湿性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂。 碱性不足造成提取液偏酸，则在高温的情况下，肝素迅速破坏，升温过急会使蛋白质早凝固，影响肝素的分解和溶出。利用蛋白水解酶专一水解蛋白的特点，并结合调酸除蛋白和氧化除蛋白方法,采用酶解除蛋白法，该法能在除去蛋白质时较少影响肝素总效价。在调酸除蛋白过程中，为防止肝素失活,加入亚硫酸氢钠作保护剂。在低温下离心脱除蛋白。
肝素钠含量检验操作规程 1范围 1.1适用于肝素钠生产车间过程控制中各控制点肝素钠含量的检测。 2定义 2.1肝素钠化验指对肝素效价的检测过程。 3参考 《美国药典》 4职责 4.1相应职责由车间化验员承担。 5操作程序 5.1仪器、用具与试剂 5.1.1恒温水浴锅 5.1.2试管架 5.1.310ml具塞试管 5.1.4100ul或250ul微量进样器 5.1.510ml刻度吸管 5.1.62ml刻度吸管 5.1.71ml可调式加液器 5.1.820ml带塞样瓶 5.1.90.9%氯化钠溶液 5.1.100.25%氯化钙溶液 5.1.11经过标定的绵羊血浆 5.1.128.0u/ml肝素钠标准溶液 5.1.13计时器 5.2操作步骤 5.2.1取样 5.2.1.1根据车间生产实际，一般酶解液、洗涤液、沉淀废液取样量为8±2ml，吸附废液为20±2ml。特殊情况可适当多取，取样要做到均匀有代表性。 5.2.2样品检测 5.2.2.1根据实际情况将试管摆放在试管架上。 5.2.2.2用100ul微量进样器取8.0u/ml肝素标准溶液，加标准品之前，用标准液冲洗进样器两次，根据标定的血浆灵敏度n，分别按n-20ul、n-10ul、n ul、n+10ul、n+20ul的量加入一排5支10ml具塞试管中，作为标准溶液的浓度梯度。 5.2.2.3.1酶解液、洗涤液、沉淀废液进样：用同一个进样器取供试液，取之前先用供试液将进样器冲洗三次，然后再按n-20ul、n-10ul、n ul、n+10ul、n+20ul的量加入另一排5支10ml具塞试管中，作为供试液浓度梯度。 5.2.2.3.2吸附废液进样：用2ml刻度吸管取供试液，取之前先用供试液将刻度吸管冲洗三次，然后再按600ul、800ul、1000ul、1200ul、1400ul进样量
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程 【原理】 新生儿溶血病HDN发生的主要原因在于母子血型不合，血型系统最主要的类型为ABO血型系统，本实验采用微柱凝胶检测孕妇血清中的抗A（B）IgG抗体效价。 【试剂】 6%牛血清白蛋白；生理盐水；凝胶卡 【标本采集】 孕妇静脉血3毫升，肝素钠抗凝，孕妇爱人静脉血3毫升，肝素钠抗凝。将孕妇标本制作成血清标本，孕妇爱人标本制成0.5%红细胞标本（用生理盐水洗涤后配制）。 【操作步骤】 1．取孕妇血清标本50微升加入等体积的牛血清白蛋白，37度水浴温育30～60分钟；2．将血清倍比稀释成9管，依次为1：4、8、16、32、64、128、512、1024、2048管；3．将卡作好标记，在所有孔中加入经处理好的孕妇血清标本50ul； 4．然后在所有孔中加入50ul的孕妇爱人0.5%红细胞标本； 5．37度孵育15分钟（专用孵育箱）； 6．专用离心机离心5分钟；900rpm2分钟，1500rpm3分钟； 7．取出判定结果； 【结果判定】 阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中； 阴性结果：红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。 【结果报告】 产生1+阳性凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 【注意事项】 1．红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应，尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本试验。 2．血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。 3．如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所臻溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。 4．本凝胶卡价格不菲，成本较高，请您节约使用。 【临床意义】 有人观察1632例孕妇血清中IgG抗A（B）≥1：64者249例；ABO-HDN发生率随IgG抗A（B）效价升高而上升；HDN与妊娠史的频率有关，随着年龄上升，孕妇个体IgG抗A（B）抗体效价也随之上升。夫妇间ABO血型不合者应及时检查产前血型抗体水平，用于预防不良妊娠的发生；IgG抗A（B）效价的高低与HDN的发病率成正比；孕妇血清IgG抗A（B）效价≥1：64需定期检测抗体效价水平及时用药降低抗体效价，以预防新生儿溶血病的发生。
一、肝素分类 肝素是哺乳动物体内含的一种粘多糖，它与蛋白质结合在一起存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化，心脑血管疾病的显效药物。 (1) 普通(标准)肝素是由猪或羊黏膜提取，平均分子量为15000，相当稳定。 (2) 通常把分子量小于6000的称为低分子肝素。低分子肝素与普通肝素比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，有取代普通肝素的趋势。近年临床常用的有：达肝素钠(法安明)、依诺肝素钠(克赛)、低分子肝素钙(速避凝、那屈肝素钙)。 (3) 目前正在深入研究的肝素制剂中还有低抗凝活性肝素、改构型肝素、类肝素等, 这些药物特点是具有低抗凝、高抗栓、作用时间长和出血作用少的优点，很有开发前途。 二、肝素钠简介 拼音名：Gansuna 英文名：Heparin Sodium 本品系自猪的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，属粘多糖类物质，通过激活抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)而发挥抗凝作用。它对凝血过程的三个阶段均有影响，在体内外均有抗凝作用，可延长凝血时间、凝血酶原时间和凝血酶时间。口服不吸收，皮下、肌肉或静脉给药均吸收良好。
三、肝素钠检测（药典版） 拼音名：Gansuna 英文名：Heparin Sodium 本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质，具有延长血凝时间的作用。按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于150 单位。 【性状】本品为白色或类白色的粉末；有引湿性。本品在水中易溶。【比旋度】取本品，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml 中含40mg 的溶液，依法测定（附录Ⅵ E），比旋度应不小于＋35°。 【鉴别】 (1) 取本品与肝素标准品，分别加水制成每1ml 中含2.5mg 的溶液，照电泳法（附录Ⅴ F第三法）试验，供试品和标准品所显斑点的迁移距离之比应为0.9 ～1.1 。 (2) 本品的水溶液显钠盐的鉴别反应（附录Ⅲ）。 【检查】酸碱度取本品0.10g ，加水10ml溶解后，依法测定（附录Ⅵ H），pH 值应为5.0 ～7.5 。 溶液的澄清度与颜色取本品0.50g ，加水10ml溶解后，溶液应澄清无色；如显浑浊，照分光光度法（附录Ⅳ A），在640nm 的波长处测定，吸收度不得大于 0.018；如显色，与黄色1 号标准比色液（附录Ⅸ A 第一法）比较，不得更深。 吸收度取本品，加水制成每1ml 中含4mg 的溶液，照分光光度法（附录Ⅳ A）测定，在260nm 的波长处，其吸收度不得大于0.20；在280nm 的波长处，其吸收度不得大于0.15。 黏度精密称取本品（按实际测得的单位计算相当于40万单位），加水
如何开展尿碘检测项目 尿碘水平是直接评价人体碘营养状况的重要指标。开展尿碘检测为诊断人们是否缺碘提供了重要的科学依据。 一、检测对象 1、新婚育龄妇女、孕、产、哺乳期妇女； 2、学龄前儿童。 二．缺碘的判断标准 以尿碘水平为指标，人体最适宜的碘含量水平是100-400μg/L。人体对碘的安全耐受量是1000μg/L。不同人群缺碘的判断标准如下： 人群缺碘标准（μg/L）严重缺碘标准（μg/L） 儿童＜100＜50 新婚育龄妇女＜150＜80 孕、产、哺乳妇女＜200 ＜100 三、检测次数 1、孕妇：孕早、中、晚期各一次； 2、哺乳期妇女：三个月一次； 3、2岁以内儿童：半年一次； 4、如测出缺碘者，立即进行补碘，一周后复查。 四．缺碘的治疗 1．轻微缺碘者，以食补为好，食用海带、紫菜等海植物产品； 2．严重缺碘者，用卫药准字号补碘药品补碘。（武汉第四制药厂的碘油胶囊，深圳海王制药的金碘口服片等）。 五．检测方法——尿碘快速定量检测试剂盒介绍 本试剂盒是“九五”国家攻关计划专题《缺碘性智力损伤防治研究》的主要成果之一，首创了现场快速、简易、定量测定尿碘的方法，鉴定为国际先进水平。检测范围5-800μg/L，灵敏度5μg/L，相对误差<10%。是孕早期及时诊断碘缺乏病，防止脑发育损伤的关键技术。适宜医疗、防疫、保健和计划生育专业机构特别是其基层单位使用。 1．1998年12月通过了湖北省卫生厅组织的科技成果鉴定，评定为国际先进水平。2000年11月获得湖北省科技进步二等奖。 2．该项目在成果鉴定前后，通过了国家碘缺乏病参照实验室等7个权威实验室的技术论证。
国家碘缺乏病参照实验室发文向全国推广应用。 3．1999年8月，卫生部碘缺乏病专家组对该成果进行了审定，全体与会专家一致高度评价了本项成果，并建议卫生部向全国推广应用。 4．本项目已纳入国家母婴碘营养项目和国家出生缺陷干预工程。 5．本产品，通过全国1000多个医疗机构使用，检测100万份样品，普遍反映其操作简捷、准确度高、稳定性好 6．本方法属国内外首创。以往检测尿碘的方法需要特殊的仪器设备，价格昂贵，仅限于少数专业实验室开展。本方法不需仪器设备，仅用一般实验室具备的实验器皿就可测定尿碘，简单、实用。具体操作步骤见试剂盒使用说明书。本方法与以往仪器分析方法进行比较，具有明显的优势，见下表。 表试剂盒与行标法技术性能指标的比较 实验室设备60份样人员灵敏度批间相对检测范围投入需时μg/L 变异误差μg/L 行标法专用25-30 6-7h 检验专业10 <10% <10% 5-300 实验室万元至少2人 需空调需培训 试剂盒实验室 2 1h一般人员10 <10% <10% 5-800 或现场千元1人 六．用户所需器材（自备） 1．15×（120－150）mm试管若干及试管架； 2．秒表一块，精度0.01秒； 3．加样器200μl、500μl各一支，配套吸头若干。（本公司有芬兰产品提供） 4．Casio3600以上型或其他有统计、回归功能的函数计算器一部。 七．尿样的收集及保存 1.尿样以晨尿为优，随意一次尿样也可。 2．取排尿过程中的中段尿样至少10ml，取其2ml分装到血清离心管中便于保存，用于测定。测定时仅需尿样0.2ml。 3．尿样常温保存为7天，2-8℃下为1个月，不提倡冷冻保存。 八．技术咨询和人员培训
肝素钠效价方法 2. 1 羊血浆的制备 取冷冻贮藏的绵羊血浆,置于不超过37 ℃的水浴融化,以脱脂棉过滤至清洁干燥的玻瓶中备用。 取血浆1 mL 置试管内,加入0. 25 %氯化钙溶液0. 8mL ,混匀,在(37 ±1) ℃水浴中保温,若在5 min 内凝结,则血浆可用于实验。 2. 2 标准品溶液的制备 取肝素钠标准品(204 u/ mL) 适量,用煮沸放冷的纯化水稀释至100 u/ mL ,置4 ℃冷藏备用。临用前用生理盐水精确稀释至7 u/ mL 。 2. 3 供试品溶液的制备 称取肝素钠原料或量取肝素钠注射液适量,按估计效价用生理盐水稀释至与标准溶液相当的效价浓度。 2. 4 血浆半凝固度剂量(V1/ 2) 的测定 取具塞试管3 支,分别于各试管中加入梯度剂量(170 ,200 ,230μL) 的标准溶液,再按顺序准确加入血浆1. 0 mL ,0. 25 %氯化钙溶液0. 8 mL ,立即加塞,倒置混合3 次,置(37 ±0. 5) ℃恒温水浴中保温,准确记录1 min ,判断每管凝结程度,结果判定V1/ 2在200μL 左右。以此为中点,左右各以10μL 为一级,同法操作,测定V1/ 2为190μL 。
2. 5 肝素钠及其制剂的效价测定 取具塞试管若干支,分别于各试管中加入梯度剂量的标准溶液和供试品溶液,以190μL 为中点,每隔10μL 为一级,同2. 3 项下方法操作,记录每管凝结程度,按式(1) 计算。 供试品的效价单位= V std ×C std ×V V sam ×W sam (1) 式中:V std. 标准品1/ 2 凝固度的肝素加入体积(μL) ;C std. 标准品溶液的浓度(u/ mL) ; V sam. 供试品1/ 2 凝固度时的加入体积(μL) ;W sam. 供试品称取的重量(mg) ; V. 测定样 品的总体积(mL)
肝素钠检验项目附细则 一、效价测定 操作步骤： 1. 标准品制备：精密称量肝素钠标 准品数量(mg)×197u/mg=总单位 数×0.93=美国羊血浆法总单位 数（uspu ）÷8 uspu/ml=需要实际 加入的蒸馏水毫升数。精确加入 蒸馏水。分装封口备用。 2. 效价测定： 2.1 样品的制备：精确称量待测 肝素粗品40~50mg 放入容量瓶中，再向其中加入1mg:1ml 比例的生理盐水，至样品全部溶解。吸取0.5ml 上述溶液至西林瓶中，再按照公式：估效价÷16-0.5计算出生理盐水量，加入西林瓶中。 2.2 样品的测定：依据估计血浆标准凝固点±10ul 、±20ul 分别向试管中加入标准品和待测样品，再向各试管中加入1ml 血浆和0.8ml 的氯化钙生理盐水。充分混匀后置37℃水 浴锅中孵育1小时。结果按照公式计算：实际效价=凝固点样品2 1V 凝固点21V 标准品 ×估效价 结果要求： 所需主要仪器及价格：电子天平 单价：1000（物理）~2000（电子）rmb 水浴锅 单价：800rmb 二、比旋度测定 当平面偏振光通过含有某些光学活性物质（如具有不对 称碳原子的化合物）的液体或溶液时，能引起旋光现象，使 偏振光的振动平面向左或向右旋转。偏振光旋转的度数称为 旋光度。旋光度有右旋、左旋之分，偏振光向右旋转（顺时 针方向）称为“右旋”，用符号“+”表示；偏振光向左旋转（逆 时针方向）称为“左旋”，用符号“-”表示。偏振光透过长1dm ， 且每1ml 中含有旋光性物质1g 的溶液，在一定波长与温度 下，测得的旋光度称为比旋度。比旋度是旋光物质的重要物理常数，可以用来区别药物或检查药物的纯杂程度，也可用来测定含量。 物质的旋光度不仅与其化学结构有关，而且还和测定时溶液的浓度、光路长度以及测定时的温度和偏振光的波长有关。 旋光度测定法的测定方法主要包括以下几个方面：
尿碘快速定量试剂盒检测与国标法的对比 雷航琪杨志琼朱万明万衍罗燕冯鑫 （乐山市疾控预防控制中心乐山614000） 碘是人体必须的微量元素，当摄入不足时人体会出现一系列的问题，导致所谓的“碘缺乏病”，特别是孕妇和儿童缺碘后会引起严重的后果。尿碘是反应人体碘营养水平的重要指标，要想知道人体的碘营养状况，检测尿碘是较为直接的方法。尿碘检测目前实验室所采用的方法是砷铈催化分光光度法（WS/T107-2006）。该法是目前测定尿碘的国标方法，该方法的灵敏度高、准确度高，但由于尿碘含量很低且测定受多种因素干扰影响，外界环境的温度、湿度以及检测人员的操作都直接影响检测结果的准确性。国标方法规定的操作较为复杂，时间控制严格，需多人配合完成。现市场上有原理大致相同、操作更为简洁的试剂盒出现。现采用试剂盒法和国标法对相同样品、相同质控样同时进行测定，统计测定结果。对两种方法的灵敏度、准确度、精密度方面进行比较。 1实验部分 1.1 样品井研县、金口河县、犍为县各140份尿样，包含儿童和孕妇。共420份。 1.2 试剂国标法：按照国标方法的要求进行配制。 试剂盒：尿碘快速定量试剂盒AR型（武汉众生）。 1.3 标准物质：冻干人尿中碘成分标准物质GBW(E)09108i、GBW(E)09109g、GBW(E)09110n 以及试剂盒中自带的质控样品。 1.4测定方法国标法：取各尿样及标准使用液系列0.25mL置于试管中，加入1.0mL过硫酸 铵溶液（1.0mol/L），置于100℃烘箱中消化60min，冷却后加入2.5mL亚砷酸（0.10mol/L），混匀后放置15min，间隔30s加入0.3mL硫酸铈铵（0.076mol/L）反应，上分光光度计间隔30s比色。 试剂盒：取各尿样及标准使用液系列0.20mL置于试管中，加入0.5mL消解夜，置于100℃烘箱中消化60min；冷却后加入0.5mL还原剂，混匀。再加入0.5mL指示剂摇匀。
肝素钠的检测方法 德晟肝素钠检测方法如下： 一．效价F：（标准≥150IU/mg），环境温度要求20~30℃。 F=标品微升数*预估效价/样品微升数 1.1试剂： 1羊血浆（冷冻保存，使用时室温解冻，过滤） 28IU/mg肝素钠标准品 30.9%生理羊水：9g氯化钠（精确至0.01g）溶解于100ml去离子水中，并定容至1000ml，待用。 40.25%氯化钙溶液：用0.9%生理盐水配制，取1.25gCaCl2（精确至0.0001g）溶于100ml生理盐水中，溶解并定容至500ml，待用。 58%柠檬酸钠溶液：用0.9%生理盐水配制，取20g柠檬酸钠（精确至0.0001g）溶于100ml生理盐水中，溶解并定容至250ml，待用。 1.2测定8%柠檬酸钠溶液用量： 取3支试管分1、2、3，分别加入标准品溶液110ul，再依次加入8%柠檬酸钠溶液10ul、20ul、30ul，→分别加入0.25%氯化钙溶液0.8ml，加入过滤好的羊血浆1ml，摇匀，置于37℃水浴中10min，观察凝固情况，取半凝固管的柠檬酸钠量xul作为后续的加量标准。
2.1待测品配制： M=20/样品预估效价（g） 称取Mg待测样品（精确至0.0001g），溶解于生理盐水中，并定容至100ml，取溶液2ml溶液溶解定容至50ml，取5ml样品溶液于试管中剩余样液冷藏保存。 2.2测定： 标准管：取10支试管分别加标品溶液100ul、110ul、120ul、……190ul，加入8%柠檬酸钠溶液xul，0.25%氯化钙溶液0.8ml，过滤好的羊血浆1ml，37°C水浴1h，记录半凝固点。 待测管：取10支试管分别加样品溶液100ul、110ul、120ul、……190ul，加入8%柠檬酸钠溶液xul，0.25%氯化钙溶液0.8ml，过滤好的羊血浆1ml，37°C水浴1h，记录半凝固点。 二．PH值 精确称取0.4g样品（精确至0.01g）溶于40ml去离子水中，测定其PH值，记录室温，湿度。 三．吸光度 精确称取0.2g样品(精确至0.01g)溶于50ml去离子水中，分别测定在260nm和280nm 的吸光度。 四．澄清度 称取1.00g样品溶于25ml去离子水中，测定640nm的吸光度。 五．比旋度 称取1.00g样品溶于25ml去离子水中，旋光仪测定其比旋度，取其三次均值。 注意：检测前所有试验仪器均用生理盐水清洗二至三遍
肝素钠的提取与检测 摘要 本实验主要是对肝素钠提取工艺的研究。对国内外肝素钠的提取和纯化方法进行研究和分析，建立以牛内脏（肝、肺、心）为原料，采用盐解、离子交换的方式与乙醇沉淀相结合提取肝素钠。利用天青A染色法检测肝素钠的效价，测定波长是505nm，与标准曲线对比可得到样品中肝素钠的效价。利用浓硫酸氧化法，在波长为298nm处的吸光度来确定肝素钠的浓度。利用双缩脲法，在波长为540nm处的吸光度来确定蛋白质的含量。试验测得肝素钠的效价平均值为139.483U/mg，肝素钠的浓度平均值为200.8752mg/kg，去除蛋白质效果良好，均在99%以上。 关键词：肝素钠，盐解，树脂，天青A，纯化，蛋白质 1.1研究背景和意义 1.1.1研究背景 肝素钠又称肝素，是重要的生物药品，作为天然的抗凝血物质而受到世界各国的重视。我国是世界上肝素钠主要出口国之一，但是出口产品以低效价的粗品肝素为主。肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在[1]。这种复合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种活性逐渐表现出来。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、
抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。中国具有丰富的畜产品副产物资源，但我国生产的肝素产品效价低，提取率低的问题很突出，这种情况下，只有提出肝素提取纯化新工艺，才能提高畜产品加工副产物的附加值，拓宽利用领域，增加国民收入，提高中国在国际上的地位。 1.1.2研究意义 肝素主要分布于哺乳动物的肺、肝、小肠粘膜细胞内。目前，国内外制取肝素的原料多以猪小肠粘膜、牛肺、猪肺为主，在提取工艺中都必须经过肝素蛋白质复合物的提取、肝素蛋白质复合物的分解和粗品肝素的精制三个过程。 国内每年猪牛屠宰量极大，副产物产量极高，但是目前利用率却很低。其主要原因是加工技术和装备水平落后，产品提纯方面的产业化技术还没有真正突破。 1.1.3肝素效价显色原理 肝素是一种粘多糖，在多糖链上带有很多阴离子基团，如磺酸基、羧基等。因而肝素具有很强的负电性，能与阳离子或带正电荷的分子结合，生成复合物。天青A染料是一种碱性染料，即正电荷部分能与肝素的阴离子结合，生成肝素天青复合物，并能表现因光异色现象，即产生一种较原来染料颜色不同的反应，这一反应程度与肝素结合量有一定关系。1976年，杰奎斯等在贝克曼DK-2分光光度计上利用天青A作肝素定量测定，发现低浓度肝素在波长505nm，pH=8.6的条件下，肝素浓度与吸光值之间符合朗白---比尔定律。该法可用于测定
尿碘比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 尿碘比色法定量检测试剂是一种旨在通过过硫酸铵热消解预处理后，运用砷铈催化还原方法，测定样品中无色还原产物，即采用比色法测算尿碘含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良桑德尔-科尔索夫（Sandell–Kolthoff）方法、成功实验证明的。适用于各种尿液样品尿碘含量的检测。产品即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。 技术背景 碘在甲状腺生理学方面起着主要作用，碘化合物是正常脊锥动物生长和发育所必需的。尿碘（urinary iodine）检测成为饮食碘摄入监测的最常用的工具，从而评价人群碘缺乏症（iodine deficiency disorders；IDD）的状况。尿碘的检测方法主要运用桑德尔-科尔索夫反应（Sandell–Kolthoff reaction），即首先进行过硫酸铵（ammonium persulfate）热消解预处理后，在亚砷酸（arsenious acid）还原剂的存在下，通过碘催化黄色的硫酸铈铵（ceric ammonium sulfate）还原为无色的三价铈（cerous form）的反应，在分光光度仪（405nm 波长）下出现吸收峰值的降低变化，来定量测定样品中尿碘的含量。 产品内容 消解液（Reagent A）5毫升 还原液（Reagent B）5毫升 显色液（Reagent C）3毫升 标准液（Reagent D）500微升 稀释液（Reagent E）500微升 产品说明书1份 保存方式 保存在—20℃冰箱里；试剂具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器 （微型）台式离心机：用于样品制备 干式恒温仪：用于反应孵育 比色皿或96孔板：用于比色的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤