表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建
及其免疫保护性研究
乔传玲1,2,于康震1,2,姜永萍1,2,张建林1,2,邓国华1,2,
孟庆文1,2,田国斌2,唐秀英2
(1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室;2农业部动物流感研究中心,哈尔滨 150001)
摘要:从含有禽流感病毒A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1)核蛋白(NP )基因的质粒pUC NP 中切下NP 基因片段,将其亚克隆到pSY 538质粒,再将带有痘苗病毒启动子P11的Lac Z 基因也平端克隆到pSY 538质粒,然后切下同时含有NP 及Lac Z 基因的片段,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY 681,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY (NP +Lac Z )。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S 2FPV 2017的鸡胚成纤维细胞,在X 2gal 存在的条件下,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR 、Western 2blot 鉴定,结果证明,获得了能高效表达
AI V NP 蛋白的重组禽痘病毒rFPV 2NP 。SPF 鸡体内的免疫保护试验结果表明,它能够诱导机体产生较高水平的NP
特异性抗体,并对H5N1和H7N1这2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。
关键词:禽流感病毒;重组禽痘病毒;核蛋白基因;免疫保护性
Protection and Construction of Recombinant Fowlpox Virus Expre ssing
Nucleoprotein Gene of Avian Influenza Virus
QI AO Chuan 2ling 1,2,Y U K ang 2zhen 1,2,J I ANG Y ong 2ping 1,2,ZH ANGJian 2lin 1,2,DE NG G uo 2hua 1,2,
ME NG Qing 2wen 1,2,TI AN G uo 2bin 2,T ANG X iu 2ying 2
(1National K ey Laboratory o f Veterinary Biotechnology/Harbin Veterinary Research Institute ,Chinese Academy o f
Agricultural Sciences ;2Research Certer o f Animal Influenza ,Ministry o f Agriculture ,Harbin 150001)
Abstract :T o construct trans fer vector ,NP gene of A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1),which derived from recom 2binant plasmid pUC NP ,was subcloned into EcoRI site of pSY 538,and Lac Z gene prom oted by p11was cloned into SmaI site of this plasmid.Both NP and Lac Z gene were cloned into NotI site of FPV vector pSY 681.Then it was trans ferred onto CEF cells in fected with S 2FPV 2017.F owlpox virus recombinants were selected by blue plaque screening with X 2gal following several cycles purification.The results of identification by PCR and Western 2blot indicated that recombinant FPV could efficiently express NP gene of AI V in vitro.The results of immunization in SPF chickens indicated that this re 2combinant virus could induce high titer NP specific antibodies and protect chickens against the lethal challenge with H5N1and H7N1HPAI V.
K ey words :Avian In fluenza ;Recombinant fowlpox virus ;NP gene ;Protection
收稿日期:2001211227
作者简介:乔传玲(19732),女,河南宁陵人,博士,主要从事动物病毒分子生物学研究。于康震为通讯作者,现在农业部畜牧兽医局工作。T el :
010*********;E 2mail :yutian @mail.agri.g https://www.doczj.com/doc/7516972968.html,
禽流感(AI )是由正粘病毒科、A 型流感病毒引起的一种禽类感染和/或疾病综合征,该病于1878
年在意大利鸡群中首次暴发,目前已遍布于世界上许多国家和地区,被国际兽疫局列为A 类烈性传染
病。近几年来,在我国的一些地区也相继分离到了不同亚型的禽流感病毒,禽流感使养禽业遭受很大的经济损失[1]。特别是1997年香港禽流感感染人的事件更加引起了世人的震惊,它预示着该病不仅
中国农业科学 2003,36(6):704-708Scientia Agricultura S inica
对养禽业、并随时有可能对人类构成威胁,显示了AI更为突出的公共卫生学意义。因此,如何研制高效的AI疫苗,为防制AI提供物质储备,日益成为国内外学者研究的重点。
就AI V而言,具有免疫保护性的几种蛋白主要是H A、NA及NP,其中H A、NA可诱导机体产生中和抗体,为体液免疫的主要靶抗原,它们是亚型特异性的。NP可诱导机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CT L)反应,为细胞免疫的靶抗原,在不同亚型之间可产生交叉保护性[2]。据报道,基于H A基因的活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗均可对同一H A亚型病毒的攻击产生近100%的保护,而对其它亚型病毒攻击的保护性较差[3～7]。近几年来,禽痘病毒作为重组病毒载体疫苗株之一以其独到的优越性,已成功用于多种病原基因的表达[8～10],本研究的目的是将AI V主要保护性抗原NP基因插入禽痘病毒(FPV)转移载体中,然后再转染由亲本禽痘病毒S2FPV2017所感染的CEF细胞,获得表达禽流感病毒NP基因的重组禽痘病毒(rFPV2NP),并进一步探讨其对SPF鸡的免疫保护性。
1 材料与方法
1.1 质粒
pUC NP是含有H5亚型禽流感病毒A/G oose/ G uangdong/1/96(H5N1)株NP基因完整cDNA的重组质粒,基因两端引入了EcoRI位点,由本实验室保存。pSY538含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2, pSY681含有禽痘病毒同源臂,pSC11含有痘苗病毒启动子P11启动的Lac Z基因,它们均由美国加利福尼亚大学Y ilma教授惠赠。
1.2 病毒
禽痘病毒S2FPV2017由美国加利福尼亚大学Y ilma教授惠赠。攻毒用高致病力禽流感病毒(HPAI V)A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1)和K P株H7N1病毒由动物流感研究中心保存。
1.3 实验动物
8周龄SPF鸡由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供,试验期间饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中。
1.4 含NP基因重组禽痘病毒转移载体的构建
首先用限制性内切酶EcoRI将NP基因从pUC2 NP上切下,直接克隆到pSY538的EcoRI位点,筛选正向插入的重组质粒;用PstI及XbaI消化质粒pSC11,回收大小约为3.2kb的片段,T4DNA聚合酶末端补平后克隆到pSY538的SmaI位点;然后再将同时含有NP及Lac Z基因的片段切下克隆到质粒pSY681的NotI位点,从而构建出以大肠杆菌Lac Z 基因作为报告基因的禽流感病毒NP基因重组禽痘病毒转移载体。
1.5 转染与筛选
按常规方法制备鸡胚成纤维(CEF)细胞,待其长成单层后接种禽痘病毒S2FPV2017,37℃作用2h,用不含抗生素的Hanks液洗2次,按照Lipofec2 tamineT M P LUS试剂盒使用说明书将重组质粒转染细胞,作用2h后,更换含2倍血清的培养基,待80%以上的细胞出现病变时收获,留作种毒备用。筛选重组病毒时将种毒作10倍倍比稀释后接种于CEF细胞,感作2h后在其表面铺制第一层琼脂糖凝胶,出现细胞病变后,再铺制含有X2gal(200μg?ml-1)的低熔点琼脂糖凝胶。
1.6 重组病毒的鉴定
1.6.1 PCR鉴定 采用S DS2蛋白酶K法分离和纯化重组病毒的DNA,通过PCR来验证AI V NP基因是否在其重组病毒的基因组中。
1.6.2 Western blot检测 用重组禽痘病毒rFPV2 NP、禽痘病毒亲本株S2FPV2017感染的CEF细胞及正常CEF细胞和AI V裂解后制备的样品进行S DS2 PAGE电泳,之后转移到NC膜上用AI V特异性多克隆血清进行Western blot检测重组禽痘病毒所表达的AI V NP蛋白。
1.7 免疫保护试验
1.7.1 免疫 将8周龄SPF鸡随机分为3组,每组20只。第1组为空白对照,不作任何处理。第2组为禽痘病毒免疫组,经翅膀刺种途径接种FPV细胞培养液,病毒含量为
2.5×105pfu[6]。第3组为重组禽痘病毒免疫组,翅下刺种5×105pfu的rFPV2NP细胞培养液。
1.7.2 攻毒 免疫后4周将各组免疫鸡一分为二,分别用10倍鸡体半数致死量(10LD50)的A/G oose/ G uangdong/1/96(H5N1)和K P株H7N12个HPAI V 毒株进行攻击。
1.7.3 抗体检测 免疫和攻毒后每周采血分离血清,用杆状病毒表达的NP抗原纯化后作为E LIS A 抗原,间接法检测NP特异性抗体。
1.7.4 病毒分离 于攻毒后第4天采集泄殖腔拭子,经抗生素处理,尿囊腔接种于9～11日龄的SPF 鸡胚,1个样品接种3枚鸡胚,每枚0.2ml,收集接种24h后死亡鸡胚的尿囊液,微量血凝试验检测病毒
507
6期 乔传玲等:表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究
的存在。第1次检测结果为阴性的样品,要进行3
次盲传后方可判定结果。
1.7.5 统计发病率和死亡率 攻毒后两周内每天
观察试验鸡的生长状况,并详细记录发病和死亡情况。临床发病的判定标准为:鸡群中个别鸡表现呆立、对外界刺激反应不灵敏,头下垂、眼睛呈全闭或半闭状态、羽毛杂乱等;眼观病变有流鼻涕和眼泪、无毛部位皮肤发绀、出血、水肿,鸡冠肉髯坏死。
2 结果与分析
2.1 表达AI V NP 基因重组禽痘病毒的构建2.1.1 转移载体的构建 所构建的重组转移载体
同时插入了NP 和Lac Z 基因,其大小约为10.5kb ,当限制性内切酶HindIII 消化可切出5.2kb 和5.3kb 大小的2个带(line 3、4、5),而用XhoI 则切出3.3kb 和7.2kb 2条带(line 2),酶切鉴定的结果表明这2个基因的表达方向相同(图1)
。
1:λDNA/EcoRI +H indIII 2:pSY (NP +Lac Z )/XhoI 3、4、5:pSY (NP +Lac Z )/H indIII
图1 p SY (NP +LacZ )转移载体酶切鉴定
Fig.1 Restriction enzyme analysis of trans fer vector pSY (NP +
Lac Z )
2.1.2 重组禽痘病毒的筛选与纯化 经2次铺胶
后,筛选到的第一代重组病毒在CEF 细胞上形成蓝
斑。进一步克隆纯化后重组病毒在CEF 细胞上所形成的蚀斑100%为蓝斑。
2.1.3 重组病毒的鉴定 PCR 提取其病毒DNA ,PCR 扩增出一条长短约为1.5kb 的条带(图2),
证
1:NP PCR product 2:Negative control 3:D L2000DNA M arker
图2 rFPV 2NP 重组病毒PCR 鉴定
Fig.2 Identification of the recombinant rFPV 2NP by PCR
明NP 基因已重组到禽痘病毒基因组中。
NP 蛋白在重组禽痘病毒中的表达,用禽流感病毒的特异性血清进行Western blot 分析,结果检测到NP 蛋白大小为56ku ,具有与AI V 蛋白一样的生物学活性(图3)。2.2 重组病毒rFPV 2NP 的免疫保护性2.2.1 抗体 E LIS A 抗体检测结果为重组禽痘病
毒免疫组的抗体水平远远高于禽痘病毒免疫组和空
1:低分子量蛋白标准Low m olecular weight protein M arker 2、3:rFPV 2NP 感染的CEF 细胞CEF cells in fected with rFPV 2NP 4:S 2FPV 2107感染的CEF 细胞CEF cells in fected with S 2FPV 21075:AIV 对照AIV control
图3 重组病毒NP 基因表达产物We stern 2blot 检测
Fig.3 Western 2blot analysis of NP protein expressedby recombi 2
nant virus
6
07 中 国 农 业 科 学 36卷
白对照组,并且免疫鸡在攻毒后1周抗体水平显著升高(图4)
。
图4 试验鸡在免疫和攻毒后NP 2E LISA 抗体的变化
Fig.4 E LIS A antibody to NP of chickens after immunization and
challenge
2.2.2 病毒分离 NP 重组禽痘病毒免疫组在用H5N1和H7N1病毒攻击后第4天,存活的免疫鸡泄
殖腔中病毒的检出率为分别为3/10(30%)和2/6(33.3%),而亲本禽痘病毒S 2FPV 2017免疫组和非免疫对照组所采样品检测结果均为阳性(表)。2.2.3 发病和死亡情况 NP 重组禽痘病毒免疫组当用H5N1毒株进行攻击时,有7只发病,6只死亡;而当用异源毒株H7N1攻击时,有8只发病,7只死亡。禽痘病毒免疫组和空白对照组则全部发病和死亡(表)。
3 讨论与结论
随着DNA 重组技术的发展和应用,目前疫苗研究已逐步从常规疫苗向基因工程疫苗过渡。在美国已经研制出了表达H5亚型AI V H A 基因的重组禽痘病毒,可以对同一H A 亚型病毒的侵染产生100%
表 SPF 鸡用致死剂量的HPAI V H 5N 1和H 7N 1攻毒保护结果1)
T able Protection of immunized chickens against lethal challenge with HPAI V H5N1and H7N1组别
G roups
攻毒后天数
Days post 2challenge (d )
12345678鸡总数
T otal N o.阳性检出/样品总数
N o.positive/N o.tested
保护率
Protection rate
(%)
非免疫对照
H5N1
0/00/06/05/34/32/20/20/0107/70Unvaccinated control H7N10/07/32/50/20/010-2)0S 2FPV 2017免疫
H5N10/00/05/06/25/33/20/30/0108/80S 2FPV 2017immunized H7N10/06/25/31/40/10/0101/13)0rFPV 2NP 免疫
H5N10/00/00/05/04/23/20/10/0103/1040rFPV 2NP immunized
H7N1
0/0
4/0
4/2
4/2
2/2
1/1
0/0
0/0
10
2/6
30
1)
斜线‘/’上方为发病鸡数,下方为死亡鸡数;2)该组鸡在攻毒的第四天已全部死亡;3)仅有1只鸡存活1) ‘/’upper is N o.of sick chicken ,downer is N o.of dead chicken ;2)The chickens were all died 4days post 2challenge ;3)Only one chicken is surviving
的免疫保护。1998年,重组禽痘病毒疫苗已获得美国农业部的批准可在紧急情况下使用,并于同年在墨西哥的商品肉鸡群中应用,从而有效地控制了H5N2的流行[11]。鉴于禽流感病毒是变异最快、亚型最多的一种病原,仅其表面的2种抗原H A 和NA 的变异就会导致病毒得以逃避宿主免疫系统的监视,所以说一种理想的禽流感疫苗必须能够对更多亚型禽流感病毒的攻击提供保护。尽管针对病毒H A 蛋白已经研制了各种类型的疫苗,但它们的保护效力也仅仅限于同一H A 亚型之间的病毒攻击,而对另一不同亚型病毒的攻击则没有保护作用。NP 蛋白作为病毒最为保守的蛋白,它能否提供更好的免疫保护性,一直是人们研究的热点[12～14]。
本试验将已进行测序的禽流感病毒A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1)的NP 基因亚克隆到禽痘病毒转移载体中,构建转移质粒、继而转染由禽痘病毒
亲本株感染的CEF 细胞,筛选到的重组病毒经体内
外试验进一步鉴定证实能够高效表达具有AI V 蛋白相同生物学活性的NP 蛋白,表达产物约为56ku ,与杆状病毒表达的NP 蛋白具有相同的分子量[15]。为了进一步检测所表达的NP 蛋白在机体内能否诱导保护性免疫反应的产生,将它接种于8周龄SPF 鸡后,用H5N1和H7N12种亚型的HPAI V 进行致死性攻击,结果其保护率分别为40%和30%,进一步证实单个的NP 蛋白在体内所诱导的免疫原性还不足以对致死性攻击提供强有力的保护,这一结果与有关的文献报道相符[5]。
在本动物试验的各组免疫鸡中都放入了2只空白对照鸡,当用致死剂量的HPAI V 对免疫鸡进行攻击后,尽管从部分重组病毒免疫鸡的泄殖腔中分离到了病毒,其中的对照鸡并没有感染和发病;与此相反,亲本禽痘病毒免疫组中的对照鸡全部感染、发病
7
076期 乔传玲等:表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究
并死亡。这表明重组病毒的免疫尽管没能够提供完全的保护,但可以阻止和减少病毒的排放量,从而减少对周围环境的威胁,对控制疾病进一步地流行与扩散具有一定的免疫效力。
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(责任编辑 林鉴非)
807 中 国 农 业 科 学 36卷
《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2017版）》等6种重点知识考试参考答案 1.患者体温基本正常、临床症状好转时，病原学检测间隔（c ），连续两次阴性，可根据相应规定解除隔离措施。 A.1-2 天 B.3-4天 C.2-4天 D.4-5天 2.以下关于人感染H7N9禽流感的实验室检查正确的是：d A.血生化中有肌酸激酶升高 B.对患者呼吸道标本采用PCR检测到H7N9禽流感病毒核酸 C.从患者呼吸道标本中检测出H7N9禽流感病毒 D.以上均对 3.重症病例病毒核酸阳性可持续（A ）周以上 A.3 B.6 C.9 D.12 4.下列哪项不是寨卡的临床特征D A.发热 B.皮疹 C.关节痛 D.角膜炎 5.人感染H7N9禽流感易发展为重症的危险因素不包括（A ） A.年龄≥45岁 B.合并严重基础病或特殊临床情况 C.发病后持续高热（T≥39度） D.淋巴细胞计数持续降低 6.以下不属于人感染H7N9禽流感重症病例次要标准的是（D ） A.呼吸频率≥30次/分 B.氧合指数≥250mmHg C.多肺叶浸润 D.血尿素氮≥7.14mmol/L 7.以下不能对寨卡病毒灭活的是（ C） A.70%乙醇 B.1%次氯酸钠 C.红外线照射 D.过氧乙酸 8.以下关于埃博拉出血热错误的是（C ） A.病毒分离应采集发病一周内患者血清标本，用Vero细胞进行病毒分离
B.发病前21天内，在没有恰当个人防护的情况下，接触过埃博拉患者的血液、体液、分泌物、排泄物或尸体等符合其流行病学史 C.疑似病例应及时采集标本，并送至所在医院检验科进行病原学检测 D.尚无特异性治疗措施，主要是对症和支持治疗 9.埃博拉出血热患者诊疗过程中，医务人员应当戴（D ） A.一次性口罩 B.纱布口罩 C.特效抗病毒口罩 D.医用防护口罩 10.埃博拉病毒60℃灭活病毒需要（D ） A.5分钟 B.15分钟 C.30分钟 D.1小时 11.医疗机构应当重视并落实消毒、隔离和防护工作，为医务人员提供充足的防护用品，确保诊疗区域的工作环境达到（D ）的需求 A.消灭一切可能性传染源 B.切断传播途径 C.保护医务人员安全救治患者 D.切断传播途径、保护医务人员安全救治患者 12.根据WHO通报的MERS疫情，结合文献报道，对（A ）进行修订。 A.《中东呼吸综合征医院感染预防与控制技术指南（2014版）》 B.《医疗机构消毒技术规范》 C.《医院隔离技术规范》 D.《医院空气净化管理规范》 13.人感染H7N9禽流感患者在使用抗病毒药物之前应：A A.留取呼吸道标本 B.做药物过敏实验 C.查验血型 D.量体温 14.截至2016年1月，至少在非洲、亚洲、美洲的45个国家有（A ）传播的证据 A.寨卡病毒 B.鼠疫 C.霍乱 D.疟疾 15.人感染H7N9禽流感的主要临床表现为（A ） A.肺炎 B.腹泻 C.出血 D.呕吐
禽流感检测方法研究进展 郑胜男本硕21 摘要:禽流感是一种可以感染多种禽类和人的烈性传染病,其病毒亚型众多,宿主范围广，容易发生变异和重组，由于各亚型之间无交叉反应性,使得禽流感病毒的检测工作较为困难。目前，该病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，同时,人们也正致力于用一些新兴检测方法来检测禽流感病毒。现就禽流感病毒的检测方法做一综述。关键词:禽流感病毒;检测方法;AIV；血清;诊断；分子生物； 禽流感是由正黏病毒科、A型流感病毒属中的不同亚型引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。目前已知禽流感病毒的血凝素包括16种亚型，[1]神经氨酸酶包括9种亚型。其中H5和H7亚型常为高致病性的禽流感病毒。 1.病原学检测方法 1 .1病毒分离与鉴定 病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，以细胞发生病变，鸡胚死亡或培养物尿囊液具有凝集红细胞特性作为判定依据作初步鉴定，也可用针对NP的单抗,用免疫荧光染色作病毒的初步鉴定。[2]确诊还需其它辅助检测手段。其检测结果准确可靠，灵敏，极少量病毒也可检出。但其操作程序繁
杂，费用高，实验室要求高，耗时费力，周期长，检测时间需1～3 周，大面积应用推广受到较大限制。 1 .2电镜检测技术 用电镜技术或免疫电镜技术诊断禽流感病毒，可以在电子显微镜下清楚观察到粒子形态，确定病毒的有无。[3]、[4]电镜技术快速、准确，但检验结果与样品制备技术、取病材料的部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。 2.免疫学检测 2 .1血凝(HA )和血凝抑制(HI)试验 HA 和HI 简单、快速、特异性好，但是操作繁琐费时，不能用已知HA亚型的抗血清检出禽流感新的HA亚型。HI试验是WHO进行全球流感监测所采用的普及方法。[5]一般先将可疑病料接种适龄鸡胚或细胞进行病毒分离，然后用HA试验检测出培养物是否具血凝素活性，再用已知阳性血清进行HI试验来验证。[6] 2 .2琼脂扩散试验(AGP) AGP试验是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，适用于鉴定所有A型流感病毒。AGP试验操作简单，既可以定性又可以定量。但敏感性差，易有有假阳性。现已在AIV快速定型双扩散法[7]基础上建立了AGP诊断试剂盒。AGP试验可以用敏感性、准确性良好的尿素- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为补充或辅助诊断手段。 [8] 2 . 3乳胶凝集试验(LAT)
目前，用于禽流感强制免疫的疫苗主要有三种：禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rl-H5)、重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1，Re-5+Re-4株)、禽流感H5-H9二价灭活疫苗。不论是活疫苗还是灭活苗，影响禽流感免疫效果的因素很多，实践中应对疫苗种类的选择、防疫程序的制订、接种途径、操作方法给予充分的重视，才能尽量减少免疫失败或不良反应。 1、禽流感疫苗使用前的准备工作 1.1制定合理的免疫程序一般在制订禽流感免疫程序时应考虑以下几方面的因素：①当地禽流感疫病的流行情况；②雏鸡的母源抗体水平；③免疫间隔时间；④鸡的免疫应答能力；疫苗的种类；免疫接种的方法；⑤免疫对鸡健康及生产性能的影响等。 鸡禽流感疫苗首免日龄在12~15d，如果日龄太小，鸡免疫系统尚未完全建立，会造成免疫系统损伤，影响免疫效果。另一方面，母源抗体高滴度时，免疫不仅不能刺激机体产生应有的免疫应答，抗体反而会被中和，结果免疫失败。最好通过实验室检测禽流感母源抗体水平来确定首免日龄。说明书中禽流感油乳剂灭活苗免疫保护期为4个月，这是在实验室条件下采用SPF鸡检测得出的数据，而实际生产中影响禽流感疫苗免疫效果的因素很多，如饲养管理、营养水平、日龄大小、健康状况等，导致疫苗的保护期长短不一。所以，不能机械地照搬说明书中的保护期来推测免疫时间，有条件的，应根据HI抗体检测结果来指导何时免疫。 1.2了解禽流感疫苗要选择合适的疫苗对鸡群免疫接种，由于禽流感病毒血清型众多，不同亚型之间不能完全保护。在生产实践中应针对当前和本地流行的疫情来选择血清型、病毒株相同的疫苗。如果疫苗毒株的抗原性与感染病原的差异较大，很难取得良好的防疫效果。疫苗要妥善保存，禽流感疫苗是生物制品，对温度要求很严格，切忌随便存放，否则对疫苗有直接影响。灭活疫苗要保存在低温、干燥、阴暗的地方，适宜温度为2~8℃，活疫苗为冻干苗，则在冰箱冷冻室-15℃以下保存，切忌反复冻融。 有些养殖户将禽流感疫苗随意丢放，甚至被太阳暴晒，这样会使疫苗效价下降，有的还可能失效。 疫苗使用前例行检查，仔细核对禽流感疫苗抗原亚型、毒株、生产厂家、生产日期、失效期，有出现包装破损、活疫苗瓶非真空、油苗破乳分层、颜色改变等现象的疫苗，严禁使用。疫苗的用量不能随便降低或超剂量使用，剂量太低，机体不能产生足够的抗体；剂量过大，可能产生免疫麻痹或副反应。稀释液的选择与用量要掌握好，注射、点眼、滴鼻免疫接种时，可选用蒸馏水、生理盐水。饮水免疫时，最好用凉开水，其次是干净新鲜的深井水，不能用含消毒药物的水。稀释的浓度要根据实际情况配制，浓度不准确，免疫效果也会大打折扣。灭活苗使用前应预温在25℃左右，预温可使油乳剂苗粘度降低、稀薄、易注射、吸收好，否则注射的局部易出现游离肿块。 1.3其他参加免疫操作的人员必须经验丰富，能熟练掌握疫苗的配制、免疫操作方法，确保每只鸡有 足够的疫苗用量，同时疫苗较快地用完。禽流感疫苗注射前，应核对连续注射器刻度容量和实际容量之间的误差，以免与实际注射量偏差太大，对注射器可能出现的故障能及时维修。注射活疫苗用的针头为7号，油苗用9号针头，针头太细，注射时费力，注射器也容易损坏；针头太粗，注射后疫苗会从针孔溢出。同一鸡舍的鸡群，每注射1000羽至少换针头一枚，针头使用前严格消毒，防止疫情传播。鸡群健康是禽流感免疫的基础，只有健康的鸡群才能产生良好的免疫应答，鸡群不健康时接种会造成免疫失败。 2、免疫操作 2.1滴入免疫法滴入免疫法是指滴鼻、点眼、经上呼吸道或眼结膜进行免疫的一种方法。500头份的疫苗用25ml稀释液稀释，把鸡头颈提起，呈水平位置，用手堵住一侧鼻孔，然后将疫苗滴入眼、鼻各一滴，待疫苗吸入和在眼内扩散后才可将鸡轻轻放回，谨防漏滴、重
文献综述 禽流感病毒致病机制的研究进展 摘要：禽流感对畜禽养殖业造成巨大经济损失，并对人类健康造成威胁，已成为各国公共卫生关注的人畜共患病。本文从禽流感病毒（Avian Influenza Virus.AIV）的分子学特性，跨越种属的传播机制以及各基因组份与致病性的作用等方面进行简述。 关键词：禽流感病毒；传播机制；致病机制 １前言 禽流感（Avian Influenza.AI）是由正粘病毒科A型流感病毒（Avian Influenza Virus. AIV）引起的禽类急性传染病，被世界动物卫生组织和我国《家畜家禽防疫条例》列为A类烈性传染病。禽流感病毒根据其核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）抗原性及其基因特性的不同可划分为A、B、C型。其中A型流感病毒感染范围最广、危害最大，常以流行性的形式出现，并能引起世界性人流感的大流行。A型流感病毒也可以从各种动物体中分离到，例如人、猪、马、海洋哺乳动物、猫、狗和鸟类等[1]。根据对鸡致病性的不同，AIV可以分为高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza.HPAI）和低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza.LPAI）。高致病性AIV由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率达100%，其感染禽类达88种，主要是鸡、鸭、鹅，除此之外，还可感染猪、猫、狗、老虎等哺乳动物和人类，是一种人畜共患病，对各国的公共卫生构成严重的危害[2]。近年来不断增加的H5N1亚型禽流感病毒（AIV）直接感染人、致人死亡的事件不断增加。本文对禽流感病毒致病机制的研究进展综述如下，以期提高人们对公共卫生学意义上禽流感防控紧迫性的认识。 ２AIV生物学特征 流感病毒属正黏病毒科，是一种呈球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒，其基因组分为8个节段，编码血凝素（hemagglutinin, HA)），神经酰胺酶（neuraminidase, NA），基质蛋白（matrix protein,M）M1和离子通道M2，非结构（nonstructrual,NS）蛋白NS1和NS2，核蛋白（nucleo protein,NP）以及三个聚合酶PB1、PB2（polymerase basic1, 2）和PA（polymerase acidic）以及新发现的与有道细胞凋亡有关的PB1-F2蛋白[3]等10种蛋白。根据核蛋白和基质蛋白的抗原性不同，流感病毒被分为甲型、乙型和丙型，AIV 属于甲型流感病毒。甲型和乙型流感病毒的主要抗原表位位于跨膜糖蛋白HA和NA，根据这些糖蛋白抗原性的差异，甲型流感病毒可分为16个H亚型（H1- H16）和9个N
《解谜禽流感》初中说明文阅读题及答案 《解谜禽流感》初中说明文阅读题及答案 《解谜禽流感》初中说明文阅读题及答案 ①2016年在墨西哥暴发的H7N3型禽流感，是北美有记载以来在禽类中暴发的最大疫情，共有2000万只鸟禽被扑杀。此次暴发还导致两人感染，但他们并未发生发热和肺部症状，仅出现了结膜炎症。 ②自2002年起，科学家陆续发现人感染H7型禽流感病毒的病例。在过去10年里，人感染H7型禽流感病毒共有100多例确诊或疑似感染病例。感染人数最多的一次发生在荷兰，共有80多人感染H7N7型禽流感病毒，1人死亡，同时还导致3000多万只鸟禽死亡。 ③禽流感病毒究竟是什么？ ④禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素和神经氨酸酶蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型和9个N亚型。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次人感染的禽流感病毒是H7N9。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。 ⑤禽流感主要是指禽中流行的由流感病毒引起的感染性疾病。禽流感病毒可分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和无致病性禽流感病毒。高致病性禽流感病毒目前只发现H5和H7两种亚型。由于种属屏障，禽流感病毒只在偶然的情况可以感染人，既往确认感染人的禽流感病毒有H5N1、H9N2、H7N2、H7N3、H7N7、H5N2、H10N7，症状表现各不相同，可以表现为呼吸道症状、结膜炎、甚至死亡。人感染高致病性H5N1禽流感病毒后常表现为高热等呼吸道症状，往往很快发展成肺炎，甚至急性呼吸窘迫综合症和全身器官衰竭，甚至死亡。 ⑥H7N9是禽流感的一种亚型。流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素（即H），一型为神经氨酸酶（即N），H 又分15个亚型，N分9个亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。依据流感病毒
第16卷第4期黑龙江八一农垦大学学报16（4）：65～70 文章编号：1002-2090(2004)04-0065-06 禽流感的研究进展 李冬野，余丽芸 （黑龙江八一农垦大学， 大庆 163319） 摘 要：禽流感是由A型流感病毒引起的禽类（家禽和野禽）的一种急性传染病，给全世界造成巨大的经济损失，同时对人类的公共卫生也造成了相当大的危害。本文综述了禽流感在病原、致病机理、临床症状、诊断以及防治方面的研究进展情况。 关键词：禽流感；研究进展 中图分类号：S855.3 文献标识码：A Minireview of Avian Influenza Research LI Dong-ye，YU Li-yun Abstract：Avian influenza caused by type A influenza virus is an acute highly contagious disease of birds (poultry and wildfowl). This disease leads to important economic losses worldwide, at the same time it does a great harm to the public health. The subject of this review included brief characterizations of the pathogeny，pathogenesis, lesions, diagnose and prevention and control. Key words：avian influenza；minireview 0 前言 禽流行性感冒(Avian influenza，AI) 简称禽流感，又名真鸡瘟（Fowl plague）、真性鸡瘟、鸡疫、欧洲鸡瘟等，是由A型流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度接触性、急性传染病。鸡、火鸡、鸭等家禽及野鸟均可感染。亚洲、美洲、欧洲的许多国家和地区都曾发生过此病，给养禽业造成了巨大的损失。同时，其对人类的公共卫生也造成了相当大的危害。禽流感病毒是人流感病毒株形成的最庞大基因库，禽流感可直接感染人，陆续有人感染禽流感病毒死亡的病例报道。高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI) 已被国际兽医局动物流行病组织(OIE) 列为甲类传染病， 并被列入国际生物武器公约动物传染病名单，1992年2月禽流感被我国农业部《家禽家畜防疫条例》列为甲类监测传染病[1]。 1 禽流感病毒概述 1.1 分类 1.1.1 型的分类 禽流感是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae) 流感病毒属的A型流感病毒所引起的。正粘病毒分两属，即A 型、B 型流感病毒属和C 型流感病毒属。型的分类可根据核蛋白（NP）和膜蛋白（MP）的不同来划分，也就是说NP和MP具有型特异性。AIV属A型流感病毒，在正粘病毒属中A型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型[2]。 1.1.2 亚型的分类 禽流感病毒（AIV）可按病毒粒子表面的血凝素(hemagglutnin，HA )和神经氨酸酶(neuram inidase，NA )的糖蛋白进行分类[3]，前者对红细胞有凝集性，后者能将吸附在细胞表面的病毒子解脱下来，分为15个H亚型和9个N亚型。根据HA与NA的不同又可将禽流感分为很多亚型，因此可以组成 收稿日期：2004-08-22 作者简介：李冬野（1976-），女，研究实习员，黑龙江八一农垦大学毕业，现从事动物疾病的研究工作。
中国兽医杂志一2019年(第55卷)第2期Chinese Journal of Veterinary Medicine 重组禽流感病毒(H 5+H 7)二价灭活疫苗对鸡和鸭的免疫效果观察 冯肖肖1,吴赟竑1,吴雪军1,华炯钢2,张一存2,张一璐1,何一杰1,徐一辉1(1.浙江省动物疫病预防控制中心,浙江杭州311199;2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州311199)一一摘要:H7N9流感变异毒株的出现给我国家禽养殖业造成了严重的疫情风险三为了解和评估新型重组禽流感H5+H7二价灭活疫苗(H5N1Re-8株+H7N9H7-Re1株)的免疫效果和抗体消长规律,我们开展了鸡二鸭现场免疫试验三监测结果表明,该疫苗对蛋鸡和蛋鸭都具有良好的免疫效果,H5和H7亚型免疫抗体水平在免疫后2周均能达到100%的免疫合格率三对雏鸡也具有较好的免疫效果,免疫一次时H5和H7亚型抗体合格率分别在一免后3周和2周达到70%以上,并维持到一免后13周;进行二次免疫后,H5和H7亚型抗体合格率在二免后1周都达到100%三对雏鸭的免疫效果相对较差,一次免疫的H5亚型抗体水平不能达到70%的免疫合格标准,二免后1周H5和H7亚型抗体合格率均能达到80%以上,必须加强免疫一次才能达到满意的免疫效果三 关键词:H7N9流感病毒;重组禽流感H5+H7二价灭活苗;免疫效果 中图分类号:S852.4一一一一一文献标志码:A一一一一一文章编号:05296005(2019)02000807一一Immune Effects of the Inactivated H5and H7Subtype Avian Influenza Virus Vaccine (H5N1Re-8and H7N9Re-1)Applied in Chickens and Ducks FENG Xiao-xiao 1,WU Yun-hong 1,WU Xue-jun 1,HUA Jiong-gang 2,ZHANG Cun 2,ZHANG Lu 1,HE Jie 1,XU Hui 1 (1.Zhejiang Center of Animal Disease Control,Hangzhou 311199,China ;2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Hangzhou 311199,China)Abstract :The new mutants of H7N9avian influenza viruses have caused devastating poultry diseases and severe economic dam-age scince 2017.Here,we evaluated the immune effect of the inactivated H5and H7subtype avian influenza vaccine (H5N1Re-8and H7N9Re-1)in chickens and ducks.According to the immune procedure made by Ministry of Agriculture of the People s Repub-lic of China,chickens and ducks were immunized with H5N1Re-8and H7N9Re-1vaccine and the hemagglutinin-inhibition (HI)antibody was detected on a weekly basis.Our results indicated that H5N1Re-8and H7N9Re-1vaccine induced strong immune re-sponse in egg-laying poultry,and 100%of participants in groups had high protective antibody levels in two weeks post one-time vac-cination.For the first immunization in chickls,the H5and H7antibodies could reached 70%protective threshold in three and two weeks post one-time vaccination,respectively.Then,chicks inoculated for the second immunization had the 100%of H5and H7 protective antibody levels in one week post two-time immunization.The H5antibody level of ducklings vaccinated one time was bel-low the 70%protective threshold,while the H5and H7antibody level of ducklings was above 80%in one week post two-time vacci-nation.Thus ducklings need two-time vaccination to get good immune response. Key words :H7N9avian influenza virus ;inactivated H5and H7subtype avian influenza virus vaccine ;Immune effects.Corresponding author :XU hui 收稿日期:20180223基金项目:浙江省 三农六方 科技协作项目(CTZB-F16-0728AWZ-SNY1-39)作者简介:冯肖肖(1984),女,兽医师,博士,从事动物监测工作,E-mail:fengxiaoxiao5713@https://www.doczj.com/doc/7516972968.html, 通讯作者:徐辉,E-mail:xuhui888@https://www.doczj.com/doc/7516972968.html, 一一2013年2月开始我国上海二安徽二浙江等省市相继出现了人感染H7N9流感的病例,并迅速传播 至其他省份,流行呈散发趋势[1-5]三截止到2017年12月,我国已有人感染H7N9确诊病例1457例,死亡571例,死亡率为39.19%三H7N9亚型流感病毒 属于正粘病毒科甲型流感病毒属,其基因组为8个 节段的负链单股RNA 病毒,在病毒增殖中极易发生 变异[3-4]三2013年以来发现的H7N9流感病毒对禽类表现为低致病性,感染禽类后并无明显临床症8
禽流感病毒的传播途径 至今由禽鸟传人的禽流感有三种：甲型H5N1、甲型H7N7及甲型H9N2。禽流感主要通过横向传播，即通过易感禽类与感染禽类的直接接触或与病毒污染物的间接接触而传播，如被污染的饮水、飞沫、饲料及其他被污染的蛋筐、蛋盘、运输工具等。被病毒污染的羽毛和粪便是重要的传染物，因为病毒含量高而且存活时间长，应特别注意。该病能否垂直传播，目前尚无足够的证据，但从自然感染禽流感病毒的鸡蛋蛋黄、蛋清及蛋壳中均能分离到病毒，所以感染鸡群的蛋不能用作孵化，不经消毒处理的不能运至非疫区。人感染禽流感的主要传播 主要经呼吸道传播，通过密切接触感染的禽类及其分泌物、排泄物，受病毒污染的水等，以及直接接触病毒毒株被感染。在感染水禽的粪便中含有高浓度的病毒，并通过污染的水源泉由粪便-口途径传播流感病毒。目前还没有发现人感染的隐性带毒者，尚无人与人之间传播的确切证据。 人类对禽流感的研究和防治工作已有100多年的历史。目前研究结果表明，禽流感病毒中缺乏人流感病毒的基因片段，除非禽流感病毒与人流感病毒发生基因重组，否则它很难侵犯人类，导致人与人间传播。人禽流感的发生，目前只可能是因接触的病禽而感染。人感染病毒的几率很小。
一般认为任何年龄均具有易感性，但12岁以下儿童发病率较高，病情较重。与不明原因病死家禽或感染、疑似感染禽流感家禽密切接触人员为高危人群。 单纯型流感 仅有上呼吸道卡他性炎症变化，黏膜可见充血、水肿及淋巴细胞浸润。纤维上皮细胞变性、坏死、脱落。 肺炎型流感 肺脏是暗红样水肿。气管、支气管内有血性分泌物、黏膜充血，其纤毛上皮细胞坏死脱落，黏膜下层灶性出血、水肿和白细胞浸润，肺泡中有纤维蛋白渗出液，含中性粒细胞及淋巴细胞。肺中叶肺泡有出血，肺泡内可有透明膜，肺组织易分离出流感病毒。 严重并发症型流感 主要病理改变为肺实变。由于肺间质水肿、间质负压减小，增加小气道陷闭倾向，导致肺不张；肺泡膜表面活性物质减少，肺泡亦陷隐闭；加之肺充血，使肺容量减小和肺顺应性下降，导致急性呼吸急迫综合征等严重并发症。
禽流感的研究进展 谭飞虎，刁小龙，朱玉娟，张尚弟，张连团，祁越，刘卫军，吴頔 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070） E-mail：tanfeihu521@https://www.doczj.com/doc/7516972968.html, 摘要：禽流感（Avian Influenza,AI），1878年首次发现与意大利，目前在美洲、非洲、亚洲、欧洲一些国家广泛发生。禽流感（AI）是由是由A型禽流感病毒(av ian in fluenza virus,AIV) 引起的禽类烈性传染病，主要在禽类中传播。AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。它可通过多种途径传播，且临床症状多样。本文主要从AIV的结构特征，致病机理，防治措施等方面论述了AIV 的研究进展 关键词：禽流感，结构特征，致病机理 引言 禽流感（Avian Influenza，AI）又名真性鸡瘟、欧洲鸡瘟，1878年首次发现于意大利。禽流感是由正粘病毒科甲型流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染和疾病综合症。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）亚型众多，变异频繁，根据病毒的血凝素（Hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的差异，将A型流感病毒分为不同的血清型，目前已发现16种HA亚型和9种NA亚型。其分子机制涉及点突变引起的抗原漂移（Antiyentil drife）和不同亚型毒株同源性产生新亚型所引起的抗原转变(Antiyentic shift)。该病在临床上所表现的症状变化从亚临床感染，重轻度的呼吸系统疾病，产蛋下降到严重的致死性疾病，其严重程度取于病毒的毒株以及被感染禽的种类，日龄和有无并发症等因素。禽流感病毒仅有H5和H7了两个血清型可引起高致病力禽流感（High Pathogentic Avian Influenza，HPAIV），以突然死亡和高死率为特征，在火鸡和鸡种引起的危害最为严重，常可导致感染鸡群的全军覆没，造成严重的经济损失，所以被国际兽医局列为A类烈性传染病。 1 流感病毒的分类 由于禽流感造成的损失巨大，引起国际社会的广泛关注，并对其分类进行了更为详尽的研究。根据国际病毒分类学（ICTV）第六次分类报告（1995年）规定，正粘病毒科分 3个病毒属：A，B型病毒属（Influenza Virus），A,B,C型流感病毒属（Influenza Virus C），类托高土病毒属（Thogotoline Virus），各属的代表中分别为A型流感病毒，C型流感病毒，托高土病毒，但是习惯上仍将A,B,C型流感病毒都归属亚流感病毒属的3个型[1]。这3个型的流感病毒没有共同的抗原，在内部核蛋白和基质蛋白的抗原性上有很大差异，在致病性和基因结构上也有所不同，其中的A型流感病毒感染的范围最大，危害最大，它可以感染人，猪，马，海洋哺乳动物，禽类等，是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。而B，C型流感病毒却只能感染人，所以禽流感可感染人类，引起以呼吸系统症状为主的急性传染病，部分患者可发展为全身多脏器功能衰竭而死亡。2005年1月新英格兰医学杂志上确认了第一例在人与人之间传播的禽流感病例，由于猪既有人类病毒的受体，又具有禽类病素的受体，所以猪可以同时感染两种病毒，并发生重配进而感染人类，这是禽流感病毒传染的最可能途径[ 2 ]。 -1-
Brain Nuclear Extracts (2/97, AG; modified from David Frank) Lysis Procedure 1. Place small piece of frozen ctx (approx one hemisphere of E18 Ctx) in 1 ml PBS lysis buffer. 2. Homogenize with dounce homogenizer (5 strokes with A, 5 strokes with B). 3. Transfer homogenate to eppendorff tube. Spin at 4 C for 5 mins. 4. Discard supernatant, resuspend pellet (nuclei) in 1 ml Extraction Lysis Buffer. 5. Sonicate nuclei with two 15 sec bursts. 6. Spin at 4 C for 15 mins. 7. Recover supernatant and transfer to new tube. 8. Quantify protein concentration by Bradford Assay. Label tubes and freeze at -70 C. 9. To run lysate in gel, suspend required amount in 2X SDS sample buffer (50 μl) with b-mercapto-ethanol, boil, cool on ice, and load. Note: To make whole brain lysate, go directly to step 4 and start by placing tissue in 1 ml extraction buffer.
魏官庄小学 如何预防H7N9禽流感病毒知识讲座禽流感病毒普遍对热敏感，对低温抵抗力较强，65℃加热30分钟或煮沸(100℃)2分钟以上可灭活。病毒在较低温度粪便中可存活1周，在4℃水中可存活1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0的条件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上。 一、流行病学 (一)传染源。目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。 (二)传播途径。经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。 (三)易感人群。目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。 (四)高危人群。现阶段主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前1周内接触过禽类者。 二、临床表现 根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。 三、H7N9的症状和预防
1. 病情表现为典型的病毒性肺炎，起病急，病程早期有高热(38度以上可给予物理降温，如冰敷，乙醇擦浴，降温毯等。儿童禁用水杨酸类解热镇痛药)，咳嗽等呼吸道感染症状。起病5-7天出现呼吸困难。 2. 对鸡肉等彻底煮熟，不要吃半生不熟鸡蛋。 3.尽量不接触活禽鸟和猪等。 4. 病毒在100℃中一分钟可被消灭。 5. 加强身体锻炼，增强自身的身体的免疫力 6. 要勤开窗，不要因为害怕pm2.5而把窗户紧闭，导致空气不流通。 7. 避免去人多的地方，现在病毒虽还没有变异到人传人，但年老体弱和幼儿抵抗力差，还是要注意的好。 8. 在家的时候，采用熏醋的方法在家庭中用于预防不耐酸的流感病毒、副流感病毒、呼吸道病毒等所引起的感冒有一定效果。 9. 春夏转换季节，一定要注意保暖，千万不要觉得，天气变暖了，就可以少穿衣服，不要着凉了。 10. 早睡早起，生活要规律，不要再暴饮暴食，多吃蔬果，不抽烟，少喝酒，养成一个好的生活习惯。
汉坦病毒
Hantavirus
汉坦病毒属病原学
布尼亚病毒科汉坦病毒属，-ssRNA分3个节段 L RNA M RNA
包膜
S RNA
G2包膜糖蛋白
血凝
核衣壳蛋白 RNA聚合酶
G1包膜糖蛋白
受体吸附、中和抗原
细胞培养：金黄地鼠肾细胞、Vero细胞、 恒河猴肾细胞等多种细胞中缓慢增殖， 可形成包涵体
易感动物：黑线姬鼠、乳小白鼠等
黑
线
姬
小白鼠
鼠
汉坦病毒型别、动物宿主、致病性及分布
病毒型别
动物宿主
汉滩病毒
黑线姬鼠
（hantaan
virus，HTNV）
首尔病毒
褐家鼠
（Seoul virus，
SEOV）
辛诺柏病毒
草原
（Sin Nombre 鹿鼠
virus，SNV ）
所致疾病
分布地区
肾综合征出血热
（hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）
朝鲜，中国 和远东地区
HFRS
中国，朝鲜
（高热、出血、肾损 和日本等
害）
汉坦病毒肺综合征
南、北美洲
（hantavirus
pulmonary syndrome，
HPS） （急性肺水肿，成
人呼吸窘迫征，青壮年多见）
HFRS的特点
9人群普遍易感，隐性感染少
9临床特征：
高热、出血、肾损害
三痛＝头痛、眼眶痛、腰痛
三红＝面部、颈部、胸部潮红
95期临床表现：
发热期、低血压休克期、少尿期、
多尿期、恢复期 9病死率：~15% 9免疫性：持久
病毒性出血热病的“3H”：
hyperpyrexia
hemorrhage
hypotention
5
禽流感研究进展 发表时间：2016-09-07T12:08:08.280Z 来源：《心理医生》2016年10期作者：刘元金1,2 付小敏2 赵晓会2 [导读] 与其他病毒性疾病类似，禽流感的防治尚无特别有效的方法，接种疫苗是预防禽流感发生与传播的最有效手段。 刘元金1,2 付小敏2 赵晓会2 (1华兰生物河南新乡 453000) (2新乡医学院三全学院河南新乡 453000) 【摘要】禽流感(Bird Flu或Avian Influenza) 具有高致病性和高致死率，它不仅给养殖业造成很大的危害，而且对人类的健康和生命安全也构成了威胁。因此，研究禽流感的特点及其防控技术势在必行。本文主要综述了禽流感概况、病原体结构特征、疫苗的研发及防控手段。 【关键词】禽流感；疫苗；研究进展 【中图分类号】R18 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）10-0002-02 Progress and achievements in the research on avian influenza Liu Yuanjin1; Fu Xiaomin2 Zhao Xiaohui2 1. HuaLan Bio-engineering, Henan Xinxiang 453000,China 2. Sanquan Medical College, Xinxiang Medical University, Henan Xinxiang 453000,China 【Abstract】Avian influenza virus can causes a very high level of morbidity and mortality. It is not only greatly harmful to culturist, but also underlying dangerous to human being. Therefore it should be stressed to establish its molecular character and prevent strategy. In this review, we foucus on the molecular character and prevent strategy of the Avian Inluenza. 【Key words】Avian influenza ; Vaccine; Research progress 1.前言 禽流感是由A型流感病毒引起的禽类传染病，同时也是一种人畜共患病；被列为一类动物传染病。与其他病毒性疾病类似，禽流感的防治尚无特别有效的方法，接种疫苗是预防禽流感发生与传播的最有效手段。随着禽流感病毒多种亚型的发现以及生物技术的发展，目前已研发出了针对禽流感的多种疫苗。 2.禽流感概况 2.1 禽流感的发病历史 禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)又称欧洲鸡瘟，被国际兽疫局定为甲类传染病。最早于1878年发生在意大利。到1955年，科学家证实其病原体为A型流感病毒；至到1981年被正式更名为禽流感。在被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗措施，仅能以消毒、隔离、宰杀禽畜的方式防止其蔓延。 2.2 禽流感的发病特点 禽流感常与传染性支气管炎、传染性气管炎、大肠杆菌病等混合感染；发病率和死亡率与自身毒株、鸡群性别、环境等有关。如禽流感病毒侵入黏膜，有利于大肠杆菌继发感染，进而增强禽流感病毒血凝作用，导致鸡群发病率和死亡率增高；禽流感病毒血清型多，各型间交叉保护弱，同一血清型不同毒株的毒力差异很大；禽流感病毒变易变异，极易发生致病性变异及抗原漂移和转变。 3.禽流感病原体 禽流感病毒(AIV)属正黏病毒科，流感病毒属。呈多形性，直径为80～120nm。其核酸由8段单股负链RNA组成，共编码8种结构蛋白和2种非结构蛋白。病毒包膜上有10～12nm的密集钉状物或纤突覆盖，分别是血凝素HA和神经氨酸酶NA。每个病毒颗粒大约由0.8%～1.1%的RNA，70%～75%的蛋白质，20%～24%的脂质和5%～8%的碳水化合物组成。 4.禽流感病毒的分类及致病性 4.1 禽流感病毒的分类 禽流感病毒（AIV）可按病毒粒子表面的HA和NA进行分类，共分为15个H亚型和9个N亚型。其中最受关注的是H5和H7，它们具有或转变为高致病性的潜力,致使最初的病毒若未受到控制而得以在鸡群中繁殖和传播。 4.2 禽流感的致病性 禽流感病毒可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。其中高致病性禽流感是由H5和H7亚毒株引起，其特点是潜伏期短，传播快，发病急，发病率和死亡率高，但传播范围往往局限。低致病性禽流感特点是潜伏期长，传播慢，病程长，发病率和死亡率低，一旦发病，如不采取积极措施，病毒很难在疫区根除，疫情会逐渐向周边地区扩散，而且病毒毒力还有可能变强。 5.禽流感疫苗的研制策略 5.1 全病毒灭活疫苗 禽流感灭活疫苗一般是用禽流感病毒鸡胚尿囊液经甲醛灭活而成。其工艺简单、免疫效果好、免疫持续时间长等优点，现已在规模化家禽养殖中使用，有效的避免了禽流感的暴发。但此类疫苗的副反应较多。 5.2 减毒活疫苗 减毒活疫苗是指将野毒株感染鸡胚，并在25～26℃下连续传代得到冷适应的减毒毒株，该病毒只能在25℃左右复制，不能在37℃下传代，使用该弱毒株接种使机体产生特异性免疫。多项人体和动物研究证实，该减毒株有很好的稳定性，对表面抗原发生转移的流行株病毒有一定的保护作用；但具有毒力恢复的风险。 5.3 基因工程亚单位疫苗 亚单位疫苗是指提取禽流感的有效成份并经进一步精制而成。这种疫苗的特点是安全性好，但成本相对高。随着基因工程技术的发展,外源表达的基因工程亚单位疫苗可大大降低成本。1994年Kodihalli等研制了火鸡H5N2病毒NP/HA和ISCOM的复合亚单位疫苗并用其免疫火鸡,21d后可产生较高的抗体滴度，对同源和异源(H6N1)亚型病毒的攻击产生保护作用。 5.4 基因重组活载体疫苗 利用遗传工程技术来分离血凝素基因（H5、H7、H9），并把它们插入载体病毒（如痘病毒），构建表达HA的重组病毒。此重组病毒
重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗研究及应用H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)通常可导致感染家禽全部死亡,引起疫情的暴发。2003年以来,在全球60多个国家和地区暴发了H5亚型AI疫情。 同时,H5和H7亚型AIV均能导致人发病和死亡,给人类健康带来严重威胁。疫苗免疫是适合我国国情的AI最有效防控措施之一。 2014年以来,我国家禽中分离的H5亚型AIV主要属于2.3.4.4分支,国家禽流感参考实验室研制的H5N1亚型Re-8株系列灭活疫苗,已在家禽中广泛应用并取得了良好的效果。2017年初,我国人H7N9流感疫情增多,家禽中出现H7N9亚型HPAI疫情,迫切需要能够同时预防H5和H7亚型AI的禽AI疫苗。 本研究首先对H7N9 H7-Re1疫苗株的病毒含量、毒力、免疫原性等生物学特性进行了系统鉴定。结果显示,该疫苗种毒生物安全度高、特异性强、免疫原性好且能在鸡胚中高效稳定增殖,是用于H7亚型HPAI防控的理想疫苗种毒。 其次,以H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1株疫苗种毒为基础,研制出重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)(以下简称H5+H7二价灭活疫苗),进行了安全性和有效性的系统评估。将H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1株鸡胚尿囊液分别2倍浓缩,使用甲醛灭活后,按照本研究确定的1:1.5抗原比例乳化制备成H5+H7二价灭活疫苗。 安全性试验结果表明,大剂量、单剂量和单剂量重复接种的SPF鸡在接种后14日内,无任何不良反应。该疫苗最小免疫剂量为0.1mL,免疫后3w H5和H7亚型HI抗体平均滴度均在6log2以上;肌肉与颈部皮下途径免疫SPF鸡,效力无明显差异,均可产生较高的抗体水平,高峰期(首免后4w)抗体水平即可达