作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(12): 2306?2311
https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,
本研究由国家自然科学基金项目(31101098), 湖南省教育厅科学研究优秀人才项目(10B051), 国家科技支撑计划项目(2012BAD20B05-04), 湖南省科技计划重点项目(2010TP4004-1)和作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地开放课题(10KFXW09)资助。
?
通讯作者(Corresponding author): 邢虎成, E-mail: xhcsoldier@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,
第一作者联系方式: E-mail: jinghua06101@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,
Received(收稿日期): 2012-04-27; Accepted(接受日期): 2012-08-15; Published online(网络出版日期): 2012-10-08. URL: https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,/kcms/detail/11.1809.S.20121008.1301.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02306
苎麻ACC 合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析
周精华1 余伟林1 邢虎成1,2,? 揭雨成1,2 钟英丽1,3 敬礼恒1
1
湖南农业大学苎麻研究所, 湖南长沙 410128; 2 湖南省种质资源创新与资源利用重点实验室, 湖南长沙 410128; 3 湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128
摘 要: 根据苎麻转录组测序中的ACS 基因片段, 利用RT-PCR 结合RACE 技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA 序列, 命名为BnACS1, 在GenBank 中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA 序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD 和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS 基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR 分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根系和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR 分析表明, BnACS1受ABA 和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。 关键词: 苎麻; 乙烯; ACC 合成酶; ACS; 克隆表达
Cloning and Characterization of ACC Synthase Gene (BnACS1) from Ramie (Boehmeria nivea )
ZHOU Jing-Hua 1, YU Wei-Lin 1, XING Hu-Cheng 1,2,?, JIE Yu-Cheng 1,2, ZHONG Ying-Li 1,3, and JING Li-Heng 1
1
Institute of Ramie, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Hunan Provincial Key Laboratory of Corp Germplasm Innovation and Utilization, Changsha 410128, China; 3 College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: According to the ACS gene sequence from ramie transcriptome, we designed primers and cloned a full-length sequence of ACS gene cDNA from Xiangzhu 3 by RT-PCR and RACE methods, named as BnACS1, with the accession number of JQ970520 in GenBank. The full length sequence and the ORF of the BnACS1 gene were 1 674 bp and 1 470 bp, respectively, which encoded 489 amino acids. The molecule weight was 54.55 kD and the pI was 6.37. The similarity comparison revealed that the gene nucleotide sequence shared 74%, 74%, 72%, 71%, 70%, and 70% of homology with the Malus × domestica (AB034993), Eriobotrya japonica (GQ370520), Momordica charantia (AF248734), Paeonia suffruticosa (DQ337250), Nicotiana attenuate (AY426755), and Populus euphratica (AB033502) ACS gene, and the similarity of the amino acid sequences with that of those species was 75%, 74%, 71%, 71%, 70%, and 74%, respectively. The results of semi-quantitative RT-PCR showed that the BnACS1 expressed in root, stem, shoot tip, blade, female flower and male flower, with the higher expression level in root and male flower, while the lowest expression level in stem. The results of real-time PCR showed that the BnACS1 was induced by dehydration and ABA, but not by high salt.
Keywords: Ramie; Ethylene; ACC Synthase; ACS ; Cloning and expression
乙烯是一种重要的植物气体激素, 参与调控植物的生根及根毛的生长发育[1]、花的发育[2]、性别决定[3]、果实的成熟[4-5]、机械损伤[6-8]、生物与非生物胁迫[9-11]等生长发育过程。近年来, 关于乙烯调控的生物合成、分子调控机制以及作用机理取得了很大的研究进展。乙烯能够改善植物的抗逆能力, 如在拟南芥上施加外源乙烯利后不仅能够缓解盐胁迫对幼苗根系伸长生长的抑制作用, 而
且能够缓解盐胁迫对幼苗根系增重生长的抑制作用[12], 而乙烯利浸种甘蔗的出苗速率和分蘖率均明显比对照好, 并改善了甘蔗的农艺性状和品质[13]; 乙烯在植物性别决定方面也起着非常重要的调控作用, 如乙烯利可以引起小麦雄性不育[14-15], 施用外源乙烯利可使黄瓜雌花的比例增加, 且全雌性黄瓜雌蕊中乙烯的含量比雌雄性同株黄瓜中雌蕊乙烯的含量高[16]。我们在前期研究中发现, 喷
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施乙烯作用抑制剂硝酸银和合成抑制剂AVG(氨基乙氧基乙烯基苷氨酸)对苎麻性别有影响, AVG和AgNO3都可以增加苎麻雄花的比例; 而喷施乙烯利则可增加苎麻雌花的比例。由此可见, 乙烯在调控苎麻性别分化过程中也起着重要的调控作用。
在乙烯生物合成过程中, 由S-腺苷蛋氨酸(S-adenos-ylmethionine)形成ACC (1-aminocy-clopropane-1-carboxylate)是限速步骤, ACC合酶(ACC synthase, ACS)是乙烯生物合成的限速酶[17], 因此克隆ACC合酶基因对于研究乙烯的生物合成和调控机制具非常重要的作用。目前已经在许多植物中克隆到该关键酶基因并进行了功能分析, 如将反义ACS基因片段导入番茄, 明显减缓番茄果实的成熟衰老速度, 且果实硬度变大、耐失水等[18], 将康乃馨的反义ACS基因通过农杆菌介导转入烟草, 会明显增强转基因烟草对非生物胁迫的耐受能力[19], 而西瓜中的CitACS3只在雄花和雌雄同株的雄花中表达, 不在雌花中表达[20]; 以上研究表明, ACC合酶基因在应对逆境胁迫方面和植物性别决定方面具重要调控作用。乙烯在苎麻的性别分化中也具非常重要的调控作用, 但是对于苎麻, 目前还没有关于乙烯生物合成途径中相关基因克隆的研究报道, 苎麻体内ACC合酶基因的克隆和功能分析, 将为进一步阐明乙烯与苎麻性别分化的关系及苎麻抗旱的分子机制奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料及其处理
湘苎3号由湖南农业大学耘园实验基地提供。在湘苎3号营养生长期剪取根、茎、茎尖和叶片, 在生殖生长期, 剪取1~3 mm长的雌花和雄花, 用于基因组织表达特异性分析; 选用株高10 cm左右、茎粗和叶片数基本一致的大田幼苗, 在培养室用自来水培养10 d, 长出幼嫩的须根后分别用20% PEG6000、250 mmol L–1的NaCl、200 μmol L–1的ABA进行干旱、高盐和非生物胁迫信号物质胁迫处理, 分别在处理0、2、4、6和8 h取样, 剪取根、茎和叶片用液氮速冻, –80℃保存以备提取总RNA, 用于基因胁迫表达特征分析。
1.2 生化试剂
RLM-RACE试剂盒购自ABI; Trizol购自Invitrogen 公司; DNA Marker、Taq DNA聚合酶、Transfer-T1感受态细胞购自TransGen Biotech; 反转录试剂盒、2×SYBR Green Master Mix、First strand cDNA Synthesis kit购自Fermentas; pMD 19-T载体购自TaKaRa公司; 其余试剂均为国产分析纯或者化学纯。
1.3 总RNA的提取与cDNA的合成
按Trizol试剂说明书操作流程提取苎麻不同组织和不同处理时间点根、茎尖和叶片的总RNA, 按照First strand cDNA Synthesis试剂盒说明书合成第1链cDNA。
1.4 BnACS1基因5′端的克隆
根据苎麻转录组测序中得到的ACS基因片段序列, 利用软件Primer 5.0设计5′RACE引物(ACS-R1: 5′-CCT CTTCCAAGGCTTGTCGC-3′, ACS-R2: 5′-GTTCGCCAT CGCAAATCG-3′); 参照ABI公司的RLM-RACE试剂盒说明书, 以根和茎尖混合总RNA模板反转录合成5′RACE首链cDNA, 以1 μL反转录产物为模板进行第1次PCR, 反应体系含首链cDNA 1 μL、10 μmol L–1上下游引物各1 μL、10×buffer 2.5 μL、dNTPs 1 μL、Taq酶0.2 μL, 加ddH2O至25 μL, 反应程序为94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 1 min, 32个循环, 72℃ 7 min反应终止于4℃。第2次PCR取第1次PCR产物1 μL为模板, 反应程序和体系同第1次PCR, PCR结束之后, 取10 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收纯化PCR产物并连接到pMD19-T载体上, 转化Trans-T1, 经M13引物和槽式引物验证阳性克隆, 送华大基因测序。
1.5 BnACS1基因表达分析
根据BnACS1的全长cDNA序列设计表达分析PCR 引物(ACS-F: 5'-GGTGGTGCCCAACAAGAAGA-3', ACS- R: 5′-CGAGTGCGGCGACATCA-3′)。以苎麻肌动蛋白基因为内参(Actin-F: 5′-GCTCCGTTGAACCCTAAG-3′, Actin- R: 5′-GCTCCGATTGTGATGATTT-3′)。用半定量RT-PCR 分析BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中的组织表达特异性, 反应体系含第1链cDNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、dNTP 1 μL、10 μmol L–1上下游引物各
1 μL, Taq酶0.
2 μL, 加ddH2O至25 μL。反应程序为94℃
2 min; 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s, 28个循环; 72℃ 7 min反应终止于4℃, 反应完成之后, 取7 μL产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析基因的相对表达量。利用ABI 7300实时定量PCR仪对各胁迫处理取样点的cDNA为模板进行Real-time PCR分析, 反应体系含2×SYBR Green Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、10 μmol L–1上下游引物各0.5 μL, 补水至总体积20 μL; 反应程序为50℃ 2 min, 95℃ 10 min; 95℃ 15 s; 60℃ 60 s, 40个循环, 采用ABI 7300荧光定量PCR仪进行, 实验设3个重复, 利用2–ΔΔCT 法计算目的基因的相对表达量。
1.6 生物信息学分析
将RACE测序结果和已知的序列用SEQUENCHER 软件拼接得到的全长cDNA序列, 然后利用在线分析网站(https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,/gorf/gorf.html)预测ACS基因的开放读码框, 并通过美国国立生物技术信息中心网站(NCBI)对ACS基因核苷酸序列进行Blastn比对, 对其推测的氨基酸序列进行Blastp比对和保守性功能域预测, 最后利用(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)网站分析ACS基因编码蛋白质的等电点和分子量, 并利用DNAstar软件生成BnACS1基因氨基酸序列的进化树, 分析该基因的进化关系。
2结果与分析
2.1 苎麻不同组织总RNA的提取
采用Trizol试剂提取湘苎3号苎麻根、茎、茎尖、
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作 物 学 报 第38卷
叶片、雌花和雄花(图1)以及不同胁迫处理时间点根、茎、叶片的总RNA, 以1.0%普通琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的完整性。从电泳图谱上可见3条28S 、18S 和5S 的清晰条带, 且28S 条带的亮度是18S 的2倍(图1), 表明RNA 基本无降解且没有蛋白质的污染。
图1 苎麻不同组织总RNA 的提取
Fig. 1 Extraction of total RNA in different organs from ramie
1: 根; 2: 茎; 3: 茎尖; 4: 叶片; 5: 雌花; 6: 雄花。
1: root; 2: stem; 3: shoot tip; 4: leaf blade; 5: female flower;
6: male flower.
2.2 BnACS1基因5′端的克隆
根据转录组测序中得到的ACS 基因片段设计5′RACE 引物, 进行5′RACE PCR 扩增, 获得了长度为650 bp 的条带(图2)。将测序结果与已知序列比对分析, 该片段序列为ACS 基因的5′序列, 拼接获得了该基因的全长cDNA 序列
, 在GenBank 中的登录号为JQ970520。
图2 5′RACE 的PCR 扩增电泳图
Fig. 2 Electrophoretogram of 5′RACE amplification
1: marker; 2: BnACS1基因5′RACE 扩增。
1: marker; 2: 5′RACE PCR of BnACS1 gene.
2.3 BnACS1基因的生物信息学分析
通过拼接比对, 该基因cDNA 序列全长为1 674 bp, 其中开放读码框长为1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD 和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS 基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。选取5个代表性物种进行氨基酸序列多重比对表明(
图3), 苎麻的BnACS1基因与其他
图3 推定的苎麻BnACS1氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列多重比对结果
Fig. 3 Alignment of the deduced amino acid sequence of BnACS1 and those from other species
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物种的ACC合酶基因存在很高的保守性。进化分析表明(图4), BnACS1与胡杨的ACS3基因亲缘关系最近, 与烟草的ACS基因亲缘关系较远。
2.4 BnACS1基因表达分析
图5表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明(图6), 在ABA 胁迫处理下, BnACS1基因仅在叶片中诱导表达上调, 在根和茎尖中均诱导表达下调; 在干旱胁迫处理下, BnACS1基因仅在根中诱导表达上调, 在茎尖和叶片中没有诱导表达变化; 在高盐胁迫处理下, BnACS1基因在根、茎尖和叶片中均不诱导表达; 不同部位、不同条件下BnACS1表达水平的差异表明该基因以不同的方式参与植物应对不同胁迫的反应。
图4苎麻BnACS1基因氨基酸序列与其他物种同源序列的进化树分析Fig. 4 Phylogenetic tree of ramie and other species traced on putative BnACS1
图5 BnACS1在不同器官中的表达情况
Fig. 5 Expression analysis of BnACS1 in various organs from
ramie
1: 根; 2: 茎; 3: 茎尖; 4: 叶片; 5: 雌花; 6: 雄花。
1: root; 2: stem; 3: shoot tip; 4: blade; 5: female flower; 6: male flower.
3讨论
ACS基因是乙烯合成途径中的一个关键限速酶基因, 已经在许多植物中被分离到, 但是在苎麻中至今未见报道。本文通过RT-PCR与RACE技术相结合的方法, 从苎麻中克隆到BnACS1基因的全长cDNA序列; 对推测的BnACS1基因氨基酸序列在NCBI中的Blastp比对发现该基因与其他物种的ACS基因高度同源, 且该基因具备典型的ACS基因家族结构特征, 是ACS家族成员之一。ACS基因是一个大的基因家族, 家族中的不同成员调控不同的生长发育过程和应对不同的环境胁迫, ACS基因在不同组织中有的是组成型表达或特异表达, 而有的则诱导表达[21]; 从番茄中克隆到9个ACS基因, 其中LeACS1A、LeACS2、LeACS4和LeACS6调控果实的成熟, 但是其具有不同的表达模式[22]; 从拟南芥基因组中也鉴定出了9个ACS基因, 这些基因也通过不同的表达模式来调控植物的生长、发育和应对各种环境胁迫, 如ACS6、ACS7和A C S9基因受低氧胁迫的诱导[23],而A C S8基因受
图6 BnACS1基因在逆境处理下的相对表达量
Fig. 6 Relative expression of BnACS1 gene under various stresses
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光照长度和生物钟的调控[24-25]; 王爱勤等[26]在研究环境胁迫和激素诱导甘蔗ACC合酶基因家族3个成员的表达时发现乙烯利诱导Sc2ACS1在叶和茎中、Sc2ACS2在根、茎和叶中、Sc2ACS3主要在根和茎中均上调表达; 我们在苎麻转录组测序结果中发现8个ACS基因, 克隆其中的一个ACS基因的全长cDNA序列, 半定量RT-PCR分析表明, 该基因在苎麻雄花中表达量明显高于雌花, 这暗示该基因可能也是苎麻性别调控相关基因; 荧光定量PCR 分析表明, 在ABA诱导下, 该基因只在叶片中上调表达, 干旱胁迫诱导下, 该基因仅在根中诱导也上调表达, 而高盐胁迫下, 该基因在根、茎和叶片中表达均没有明显变化, 说明该基因可能在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时, 具有独特的表达模式。
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木聚糖酶的基因克隆及表达 木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。 木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。见表2。 3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高
植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html, 收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性① 张 国 李 滨 邹 琦② (山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018) 摘要 Rubisco 活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco 活性的酶, 我们利用PCR 技术, 从小麦(Triticum aestivum )叶片cDNA 文库中克隆得到Rubisco 活化酶基因cDNA 片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot 表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco 活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco 活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco 活化酶, 小麦, 衰老 Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi ② (Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University , Tai’an 271018) Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from wheat (Triticum aestivum ). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence Rubisco 是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP 的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco 的活性, 如:底物RuBP 本身就是Rubisco 的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco 易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco 成为光合速率的限制因子, 因 而也成为提高作物光合效率的研究目标。 Salvucci 等(1985)发现了Rubisco 活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase 活性; 也有人认为RCA 是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco 的活化状态实际是Rubisco 的失活速率和RCA 活化Rubisco 速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/7816743831.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中