蛋白质定量分析的研究进展
刘雅超1刘旭1白鸿源1房泽海2
(1.黑龙江中医药大学附属一院妇产科,黑龙江,哈尔滨,150040;2.山东省淄博科技职业学院药学系,山东,淄博,255314)
关键词 蛋白质;定量分析;研究
中图分类号 R 文献标识码 A 文章编号 1007-8517(2009)08-0049-02
1蛋白质定量检测的生物化学方法
1.1凯氏定氮(K je l dah l sM e t hod)及分光光度法利用蛋
白质含氮量进行检测的经典方法,优点是定量准确,但操作烦
琐,仅用于标定蛋白质标准品和校正其他测定方法。凯氏定
氮法有半微量法、微量法及全量法。样品与H
2SO
4
一同加热
消化,分析有机物,释放出的NH
3
与结合,碱化蒸馏使氨游离,
硼酸吸收,HC I或H
2S O
4
标准溶液滴定,从而计算蛋白质的含
量。该方法是以H antzsch反应为原理所建立的一种测试蛋白质含量的新的分光光度法。适用于各类食品中蛋白质的测定,且不需要特殊的凯氏定氮装置。取样且少,消化时间短,精密度高准确度好,适用于大批样品同时测定,亦适用于微量蛋白质分析,是一种蛋白质快速、准确测定的新途径。
1.2双缩脲法(B i uret A ssay)双缩脲法简便易行,但检测灵敏度相对较低,最低测定值100 g。必须在测定前先使蛋白完全沉淀,除去干扰物质,才能得到较准确的结果。除三氯乙酸作沉淀剂外.还可用钨酸、磷钨酸和T such i y a试剂,双缩脲法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近、干扰物质少,不受温度的影响。但灵敏度低,0.01吸光度相当于l66.7 g蛋白,且操作复杂,很难用于自动化仪器分析。
1.3Low ry法(Low ry A ssay)结合双缩脲法中铜盐反应与
F o li n-c i o ca lteau试剂反应的特点,通过芳香族氨基酸残基T yr和T ry的迅速反应与肽链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应.而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色、在波长750n m 处测定Am ax。
1.4BCA法(B icichoninic A cid A ssay)BCA法的灵敏度为0.5~10 g/m,l其最低测定值与反应温度有关。有37 和60 (增强法)2种反应温度:在37 时,一般适用于浓度较高的样品(>50 g/m l),但是色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化(37 时该方法检测的蛋白质浓度范围为20~2000 g/m l);在60 (增强法)时,一般适用于浓度较低的样品(<50 g/m l),色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化,因此能大大提高检测灵敏度(60 时该方法检测的蛋白质浓度最低可达5 g/m l)。
1.5丹宁酸法丹宁酸用来沉淀蛋白质,但沉淀结构松散。
2.4急性胰腺炎吕银祥等观察了血必净对严重创伤患者及重症急性胰腺炎患者凝血功能的影响,发现血必净能显著改善患者凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间的延长和纤维蛋白原、血小板数量减少,对凝血功能具有保护作用。张万祥等观察了42例血必净治疗重症急性胰腺炎疗效,发现血常规白细胞、血尿淀粉酶改善明显优于对照组,症状、体征消失时间与对照组比较有差异,认为血必净对于重症急性胰腺炎具有良好的治疗作用。研究结果表明,在生长抑素、抗生素治疗基础上加用血必净注射液,7d临床痊愈率显著高于单用生长抑素组,且能显著缩短重症急性胰腺炎患者的腹痛消失和腹胀缓解时间,纠正高血血尿淀粉酶和CRP水平。
2.5急性肺损伤与急性呼吸窘迫综合征(AL I/ARDS)动物研究表明,血必净可减轻黄磷及其化合物吸入中毒致大鼠肺组织A L I/ARD S病理改变。同时对肺微血管内皮细胞(rP M VECs)的损伤起到保护作用。韩芳等观察了血必净对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者的疗效,发现血必净组患者的细胞因子水平、机械通气时间及病死率均较常规组明显降低,血必净可通过减轻炎症反应而显著降低ARD S的病死率,是安全、有效的治疗方法。研究还表明,血必净注射液具有对抗LPS及发病有关的多种炎症介质的作用,可能减轻了肺组织的炎症反应程度、肺的缺血/再灌注损伤,减轻了肺充血和渗出程度,肺的顺应性改善,在临床上表现为RR减慢和过度
通气的改善。血气分析证实,P a O
2/F i O
2
、P a O
2
明显上升,X
线胸片证实肺部病变吸收好转。在预后方面,治疗后治疗组
ARDS发生率及病死率较对照组明显降低,说明血必净不仅
能改善AL l患者呼吸功能,而且还能改善AL l患者的预后。
2.6肺心病加重期盖慧荣等观察了血必净治疗慢性肺心
病心功能不全临床疗效,发现血必净能明显改善动脉血氧分
压、二氧化碳分压、血液流变学、心输出量、心脏指数、射血分
数,对于慢性肺心病心功能不全具有良好的治疗作用。孙元
莹等观察了血必净配合生脉注射液治疗慢性肺心病急性加重
期的临床疗效,发现血必净合生脉注射液治疗组总有效率明
显优于对照组,治疗组血氧分压、二氧化碳分压改善明显优于
对照组,血液流变学各项指标治疗后较治疗前明显改善,说明
血必净配合生脉注射液对于慢性肺心病急性加重期具有良好
的治疗作用。
参考文献
[1]付素珍.血必净治疗腹腔间隔室综合征合并多器官功能障碍30
例疗效观察[J].中国全科医学,2009,12(4):329-330
[2]曹书华,高红梅,王永强,等.血必净对多器官功能障碍综合征
大鼠细胞因子的影响[J].中华急诊医学,2003,12(2):94-96.
[3]常文秀,高红梅,曹书华.血必净对多器官功能障碍综合征内皮
细胞的保护作用[J].天津医药,2005,33(11):685-687
[4]张畔,曹书华,崔克亮,等.血必净对多脏器功能障碍综合征
单核细胞H LA DR表达影响的研究[J].中国中西医结合急救
杂志,2002,9(1):21-23
(收稿日期:2009.02.12)
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临床研究 中国民族民间医药
C li n i cal research Ch i n ese Jou rnal of E t hno m ed ici ne and E thnophar m acy
可用Ca iil ne取代蛋白,蛋白游离出后用免疫法或空氮法测定,但此法操作麻烦、加F eC l
3
与丹宁酸蛋白沉淀反应显色, 5m i n后在510nm比色,0.1m o l的丹宁酸可结合0.333 g白蛋白、灵敏度达5m l L-1,线性范围为0.05~1.8g L-1。
1.6浊度法(比浊法)利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白浓度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂。30g L-1磺基水杨酸作为沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白。50g L-1三氯乙酸蛋白作沉淀剂,可沉淀白蛋白和球蛋白。
1.7染料结合法(Dye Comb i nati on A ssay)是利用蛋白质与染料结合的性质进行检测的方法。常用的染料有:考马斯亮蓝(coo m ass i e br il1iant blue,CBB)G-250或R-250、丽春红S(ponceau S)、氨基黑(am ido black)、溴甲酚绿(brom creso1
g reen,BCG)和溴甲酚紫(bro m creso1purple,BCP)等。
1.8紫外分光光度法(ultrav i o1et Spectropho to m etry)是利用蛋白质在紫外280n m处有最大吸收峰的现象,进行检测的方法,具有简便、快速且可回收样品的优点。紫外分光光度法检测蛋白质的最低测定值为10Pg。
1.9荧光法这是近几年兴起的一种新的定量测定蛋白质的方法,观已报道的络天青S、次氯酸盐 硫胺素及白蛋白蓝670法测定蛋白质的方法,其灵敏度较低。
1.10金属离子-染料结合法借用金属离子-染料和蛋白质在适宜条件下反应进而检测蛋白的方法发展很快,钛-4,5-二溴基荧光酮(DBPF)-Tw een-80与蛋白质的显色反应用来测定微量尿蛋白。在p H
2.9,血清蛋白能与钛-DBPF -Tw een-80形成蓝色络合物. m ax=605n m,加入少量乙醇能提高方法的灵敏度及稳定性。
2蛋白质定量检测的免疫法
2.1免疫扩散法所谓抗原是指引起机体产生抗体的物质,而抗体是指在抗原的刺激下机体产生的物质。抗原与抗体结合生成沉淀以达到机体免疫的目的,抗原与抗体属于蛋白质化合物。
2.1.1环状免疫单扩展法将一定量的抗体(一般常用单价抗血清)与含缓冲液的琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度的凝胶板,再把抗原滴进凝胶板的小孔个,在合适的浓度和湿度环境中、经过一定的时间,抗原由小孔向四周扩散(呈辐射状),与已沉匀在琼脂糖凝胶中的抗体相互作用。
2.1.2双向扩展法一定浓度的琼脂糖(或琼脂)凝胶是多孔的网状结构,大分子物质可自由通过,这种分子的扩散作用可使分别在两处的抗原和相应抗体相遇.形成抗原-抗体复合物.比例合适时出现沉淀,沉淀的特征与位置取决于抗原分子量的大小、分子结构、扩散系数和浓度。如果抗体存在于多种有机大分子中出现多条沉淀线,即可定性抗原,诊断疾病。此法操作简单且灵敏度高,是最常用的免疫法。
2.2琼脂糖免疫电泳法免疫化学与琼脂电泳相结合形成了免疫电泳技术,这是一种灵敏度很高的蛋白质分离及鉴定技术,可用于定性、定量测定抗原或抗体。此技术是1953年由G rabar及w ililli m s提出,后来由Scheigg er改进形成的一种微量蛋白质测定法。可分为以下几种常用免疫电泳法:
2.2.1微量免疫电泳法在有离子的琼脂糖的玻璃中心各挖一长槽,槽的两侧各挖一个小圆孔,孔内加入待测样品,电泳时,由于样品中各蛋白质的等电点不同,其带电性不同,因而被分离成几个区带。电泳后在长槽中加入相应的抗血清37 时扩散,分离的蛋白质就与相应的抗体形成大小不同、深浅各异的沉淀弧。一般情况下每一沉淀弧代表蛋白质混合物中一种成分,以此进行定性、定量。
2.2.2对流免疫电泳将抗原和抗体分别加入琼脂板样品孔内同时进行电泳,抗原由阴极向阳极移动,抗体向阴极倒退,两成分相遇,特效抗原与抗体结合,形成可见的白色沉淀物,即对流免疫电泳.这种方法是抗原与抗体在电场作用下定向移动,限制了抗原与抗体的自由式扩散,可提高灵敏度16倍。
2.2.3火箭电泳法取一定量单价血清,与一定量琼脂凝胶混匀,然后铺板,板上挖几个小孔,每孔中加不同浓度的相应抗原,将此板放在p H8.6的电泳槽中进行电泳,在电场作用下抗原向正极泳动,在泳动中与凝胶中的抗体反应,逐渐形成类似火箭的沉淀峰.其峰的高度与抗原的浓度成正比,以此可定量抗原。国外有人用此法测定了全血清中的C-活性蛋白质。如果被测抗原等电点与单价血清(抗体)的等电点相同,不仅需要用琼脂糖,而且需对抗原进行化学处理,使负电荷相对增加,这样处理后才能出现火箭峰。处理时,一般用氰酸钾或甲醛。
2.2.4双向定量免疫电泳法双向定量免疫电泳法又称交叉电泳。先将抗原进行电泳分离蛋白质的各组分;放在抗体琼脂板上,使各组分在垂直方向再电泳一次,根据各组分和沉淀峰便可定性、定量抗原。
2.2.5放射免疫电泳法R I A法是将放射性同位素测定法和免疫反应相互结合的一种技术,优点是特效、敏感、精确、简单。一般不需要复杂的提纯步骤。目前该法已用于细菌和病毒抗原的分析、抗体的测定,各种免疫球蛋白和血清蛋白的定量测定及肿瘤有关的抗原测定等。
2.3毛细管电泳免疫法在用琼脂糖免疫法定量分析抗原和抗体蛋白质时,抗原和抗体的纯化是非常麻烦的问题。近年来发展较快的是毛细管免疫电泳,它的分离速度快、分辨率高且不受染色时间、温度、染色剂浓度、显色时间等因素影响。诸多优点使其广泛地应用于包括球蛋白在内的各种临床指标的检测。
蛋白质定量检测技术发展至今已经建立了许多成熟的方法,且衍生出了众多试剂盒。但在实际工作中,无论是使用自配试剂还是商品试剂盒来进行蛋白定量,往往忽视了需根据待测定蛋白质的特性选择合适的方法和标准品,造成蛋白定量结果的不可靠。随着蛋白质定量检测的日趋频繁和检测要求的日益提高,正确选择、应用蛋白质定量方法和标准品,应该引起有关人员的高度重视。
参考文献
[1]赵峰.脂蛋白(a)检测在临床诊断中的价值[J].职业与健康,
2002,18
[2]康建.一种简单快速的聚丙烯酰胺凝胶电泳染色法一铜染色
法[J].生物化学与生物物理进展,1990,17
[3]张滨.人体血液蛋白的毛细管电泳分析进展[J].分析化学,
1997,25(8):973-977
(收稿日期:2009.01.26)
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中国民族民间医药 临床研究 Ch i nes e J ournal of E t hnom edici ne and E t hnophar m acy C li n i cal research
《生物化学》课程论文 姓名：曹SS 学号：11310300SS 专业：SS教育 成绩： SS学院生命科学学院 2015年 1 月 1 日
文献综述 蛋白质结构与功能的研究进展 学生：曹SS 指导老师：杜SS 【摘要】人类基因组计划即将完成。虽然基因组的序列作为信息库拥有大量的、重要的生物信息资源，但并不是基因本身,而是基因组所编码的蛋白质才能够直接参与和指导绝大多数的生物学过程。毫无疑问，只有阐明蛋白质的作用机理，才能够真正理解基因的功能。蛋白质结构与功能关系的揭示将有助于人类对于如生殖、发育、疾病等生命活动的基本机理的了解。同时，将对于人类疾病的防治和药物的发明具有重要的指导意义。 【关键词】蛋白质；结构；功能 1.引言 在人类进人21世纪新纪元之际,生命科学也迎来一个崭新的时代,即“后基因组时代(Post一genome era)”。在这一时代中,生命科学的中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能,并在此基础上阐明遗传、发育、进化、功能调控等基本生物学问题,以及进一步解决与医学、环境保护、农业密切相关的问题。由于基因的功能最终总是通过其表达产物—蛋白质来实现的,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质分子上来。现已知道,以蛋白质为主体的生物大分子的功能主要决定于它们的三维结构,所以也有人认为当代生物学研究已经进人了“结构基因组时代(structural genomics era)”。目前,我们还不可能只用基因组DNA的一维序列去确定生命活动的机理(mechanism)和途径(path-way),也难以仅用基因的信息去解释疾病发生与发展的分子机理。显然,在人类基因组之后的时代,在有关生命活动整合知识的指导下,以蛋白质及其复合物、组装体为主体的生物大分子的精细三维结构及其在分子、亚细胞、细胞和整体水平上的生物学功能的研究是生命科学的重大前沿课题,也是当前生物学领域中最具有挑战性的任务之一,在后基因组时代生物学发展中处于战略性的关键地位。因此,在从现在到今后的5到15年中,我国在重点基础研究发展的战略性规划中,不失时机地组织精干的结构生物学研究队伍,开展对重要功能基因表达产物—蛋白质及其复合物、组装体的结构与功能的研究具有重要的科学意义,是推动我国生物学研究在21世纪生物学领域占据一席之地的必要措施[1]。 另外，以蛋白质为主体的生物大分子及其复合物和组装体三维结构与功能关系研究是生
细胞内蛋白质的合成与运输 摘要：蛋白质是一切生命的物质基础，这不仅是因为蛋白质是构成机体组织器官的基本成分，更重要的是蛋白质本身不断地进行合成与分解。这种合成、分解的对立统一过程，推动生命活动，调节机体正常生理功能，保证机体的生长、发育、繁殖、遗传及修补损伤的组织。根据现代的生物学观点，蛋白质和核酸是生命的主要物质基础。 关键字：多肽链、蛋白质、翻译、核糖体、运输途径、运输方式，研究前景 前言：国家重大科学研究计划对中国的四项重要科学研究所涉及的领域分别作了详细说明，四个项目分别是蛋白质研究，量子调控研究，纳米研究，发育与生殖研究。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控，翻译水平调控，翻译后水平调控。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。 一、蛋白质生物合成过程
遗传密码表在mRNA的开放式阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸或其他信息，这种三联体形势称为密码子（codon）。如图，通常的开放式阅读框架区包含500个以上的密码子。 遗传密码的特点 一方向性：密码子及组成密码子的各碱基在mRNA序列中的排列具有方向性（direction），翻译时的阅读方向只能是5ˊ→3ˊ。 二连续性：mRNA序列上的各个密码子及密码子的各碱基是连续排列的，密码子及密码子的各个碱基之间没有间隔，每个碱基只读一次，不重叠阅读。 三简并性：一种氨基酸可具有两个或两个以上的密码子为其编码。遗传密码表中显示，每个氨基酸都有2,3,4或6个密码子为其编码（除甲硫氨酸只有一个外），但每种密码子只对应一个氨基酸，或对应终止信息。 四通用性：生物界的所有生物，几乎都通用这一套密码子表 五摆动性：tRNA的最后一位，和mRNA的对应不完全，导致了简并性 氨基酸活化 在进行合成多肽链之前，必须先经过活化，然后再与其特异的tRNA合，带到mRNA 相应的位置上，这个过程靠tRNA合成酶催化，此酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA 相结合，生成各种氨基酰tRNA.每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用A TP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的氨基酸臂（即3'-末端CCA-OH）上（图1）。原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰蛋氨酸tRNA，由N10甲酰四氢叶酸提供甲酰基。而真核细胞没有此过程。前面讲过运载同一种氨基酸的一组不同tRNA称为同功tRNA。一组同功tRNA由同一种氨酰基tRNA合成酶催化。氨基酰tRNA合成酶对tRNA和氨基酸两者具有专一性，它对氨基酸的识别特异性很高，而对tRNA识别的特异性较低。氨基酰tRNA合成酶是如何选择正确的氨基酸和tRNA 呢？按照一般原理，酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的，只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点，才能合成正确的氨酰基tRNA。现在已经知道合成酶与L形tRNA的内侧面结合，结合点包括接近臂，DHU臂和反密码子臂（图2）。氨基酰－tRNA合成酶与tRNA的相互作用，可见氨酸接受柄、乍看起来，反密码子似乎应该与氨基酸的正确负载有关，对于某些tRNA也确实如此，然而对于大多数tRNA来说，情况并非如此，人们早就知道，当某些tRNA上的反密码子突变后，但它们所携带的氨工酸却没有改变。1988年，候稚明和Schimmel的实验证明丙氨酸tRNA酸分子的氨基酸臂上G3：U70这两个碱基发生突变时则影响到丙氨酰tRNA合成酶的正确识别，说明G3：U70是丙氨酸tRNA分子决定其本质的主要因素。tRNA分子上决定其携带氨基酸的区域叫做副密码子。一种氨基酰tRNA合成酶可以识别以一组同功tRNA，这说明它们具有共同特征。例如三种丙氨酸tRNA
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于
Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ） Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐
蛋白质结构及性质论文 ——动科一班黄细旺（1207010127）&冯志（1207010126） 摘要：蛋白质结构及其理化性质 关键词：蛋白质、结构、理化性质 前言： 蛋白质分子是由许多氨基酸通过肽键相连形成的生物大分子。人体内具有生理功能的蛋白质都是有序结构，每种蛋白质都有其一定的氨基酸百分组成及氨基酸排列顺序，以及肽链空间的特定排布位置。因此由氨基酸排列顺序及肽链的空间排布等所构成的蛋白质分子结构，才真正体现蛋白质的个性，是每种蛋白质具有独特生理功能的结构基础。 蛋白质结构 蛋白质分子结构分成一级、二级、三级、四级结构四个层次，后三者统称为高级结构或空间构象。并非所有的蛋白质都有四级结构，由一条肽链形成的蛋白质只有一级、二级和三级结构，由二条或二条以上多肽链形成的蛋白质才可能有四级结构。 1．蛋白质的一级结构 蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。一级结构的主要化学键是肽键，有些蛋白质还包含二硫键，它是由两个半胱氨酸巯基脱氢氧化而成。 2．蛋白质的二级结构 蛋白质的二级是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肪酸主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链构象。 （一）肽单元20世纪30年代末L.Panling和R.B.Cory应用X线衍射技术研究氨基酸和寡肽的晶体结构其目的是要获得一组标准键长和键角以推导肽的构象最终提出了肽单元概念。他们发现参与肽健的6个原子位于同一平面Cα1和Cα2在平面上所处的位置为反构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元其中肽键（C-N）的键长为0132nm．介于C－N的单健长（0149nm）和双键长（0127nm）之问，所以有一定程度双键性能，不能自由旋转。而Cα分别与N和羰基碳相连的键都是典型的单键可以自由旋转。 （二）α-螺旋Paulαing和Core根据实验数据提出了两种肽链局部主链原子空间构象的分子模型，称为α-螺旋和β-折叠，它们是蛋白质二级结构的主要形式，在α-螺旋结构中多肽键的主链围绕中心轴是有规律的螺旋式上升，螺旋的走向为顺时钟方向即右手螺旋，其氨基酸恻键伸向螺旋外侧。每36个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm。a一螺旋的每个肽键N－H和第四个的羧基氧形成氨键，氢键的方向与螺旋长轴基本平行。肽链中的全部肽键都可形成氢键以稳固α-螺旋结构。肌红蛋白和血红蛋白分子中有许多肽链段落呈a一螺旋结构，毛发的角蛋白、肌肉的肌球蛋白以及血凝块中的纤维蛋白它们的多肽链几乎全长
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
蛋白质组学关键技术研究进展 摘要：蛋白质组学是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，是在90年代初期，由Marc Wikins 和学者们首先提出的新名词。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。本文综述了蛋白质组学的一些关键技术的应用研究进展。 关键词：蛋白质组学；蛋白质组技术；研究方法 蛋白质组学的概念[1]最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。近年来，高通量蛋白质分离与鉴定技术，如双向电泳、生物质谱、蛋白质芯片、酵母双杂交系统、生物信息学等相继建立并日趋完善，加速了蛋白质组学的发展。 1蛋白质组学概述 随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，蛋白质结构与功能研究越来越重要，蛋白质组学、生物信息学等相关学科已逐渐成为生命科学的前沿。 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。 目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA、mRNA、蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control)，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control)。从mRNA 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤] 1．标准曲线的绘制： 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量
蛋白质工程的主要研究方法和进展 李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐 (福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108) 摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化 中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02 Advances in The Techni q ues of P rotein Engineering L i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na) Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w ed K ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on 20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1 理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。 2 非理性进化 非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。 易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3!-5!校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。 D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase?酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重 47 安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5) 作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。*通讯作者 收稿日期:2009-01-15
分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
生物化学论文 —蛋白质 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新 蛋白质是由α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。、 蛋白质是荷兰科学家格利特·马尔德在1838年发现的。他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存 。 蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。人体中估计有10万种以上的蛋白质。生命是物质运动的高级形式，这种运动方式是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质有极其重要的生物学意义。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。生命运动需要蛋白质，也离不开蛋白质。 人体内的一些生理活性物质如胺类、神经递质、多肽类激素、抗体、酶、核蛋白以及细胞膜上、血液中起“载体”作用的蛋白都离不开蛋白质，它对调节生理功能，维持新陈代谢起着极其重要的作用。人体运动系统中肌肉的成分以及肌肉在收缩、作功、完成动作过程中的代谢无不与蛋白质有关，离开了蛋白质，体育锻炼就无从谈起。
《蛋白质结构解析研究进展》 一、蛋白质结构分类 人类对于进化的认识及蛋白质结构相似性比较的研究使蛋白质结构分类成为可能，而且近年来取得的研究进展表明，大部分蛋白质可以成功的分入到适当数目的家族中。目前国际上流行的蛋白质结构分类数据库基本上采取两种不同的思路，一种是数据库中储存所有结构两两比较的结果；第二种思路是致力于构建非常正式的分类体系。由于所有分类方法反映了各研究小组在探究这个重要领域的不同角度，所以这些方法是同等有效的。目前，被广泛应用的四种分类标准是：手工构造的层次分类数据库SCOP，全自动分类的MMDB和FSSP，和半手工半自动的CATH。 蛋白质结构自动分类问题可以被纳入机器学习的范畴，通过提取分析蛋白质结构的关键特征，构造算法来学习蕴含于大量已知结构和分类的数据中的专家经验知识，来实现对未知蛋白质结构的分类预测。目前，对蛋白质结构的不同层次分类，结果比较好的机器学习方法是：神经网络多层感知器、支持向量机和隐马尔可夫模型。支持向量机应用于分类问题最终归结于求解一个最优化问题。上世纪90 年代中期，隐马尔可夫模型与其他机器学习技术结合，高效地用于多重比对、数据挖掘和分类、结构分析和模式发现。多层感知器即误差反向传播神经网络，它是在各种人工神经网络模型中，在机器学习中应用最多且最成功的采用BP学习算法的分类器。 二、蛋白质结构的确定 蛋白质三维空间结构测定方法主要包括X射线晶体学分析、核磁共振波谱学技术和三维电镜重构，这三种方法都可以完整独立地在原子分辨水平上测定出蛋白质的三维空间结构。蛋白质数据库PDB中80%的蛋白质结构是由X射线衍射分析得到的，约15%的蛋白质结构是由核磁共振波谱学这种新的结构测定方法得到。 1、X射线晶体学
1．蛋白质的常规检测方法 凯氏（Kjeldahl ）定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化, 含氮有机物分解产生氨, 氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收, 再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲（NHCONHCONH是3分子的脲经180C左右加热，放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。 测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg） 优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 Folin- 酚试剂法 原理：Folin- 酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Folin- 酚试剂中的磷钼酸- 磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下, 蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
测定范围：20~250ug 优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效 缺点：①费时，要精确控制操作时间； ②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨 酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和脲素均会干扰反应。 紫外吸收法 原理：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm 处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比）。此外，蛋白质溶液在280nm的吸光度值与肽键含量成正比，利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较 大的干扰。 定氮法、双缩脲法、Filon- 酚试剂法和紫外吸收法为常用的 4 种古老的经典方法。 1.5 考马斯亮蓝法 原理：染料考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）及芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度呈正比。 优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。 缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同有较大的偏 ，因此用于不同蛋白质测定时 差。
蛋白质的改性 摘要：介绍蛋白质的功能特性，以及物理、化学、摘要介绍蛋白质的功能特性，以及物理、化学、酶法等各种改性方法及其对蛋白质功能特性和营养安全性的影响，展望蛋白质改性的应用前景。 0 前言 蛋白质具有营养功能，添加到食品中可以有效地提高产品的营养价值，更重要的是蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性，影响食品的感官特性，而且对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用。因此蛋白质广泛用于食品加工的各个领域。但是，不少天然蛋白质的这些特性尚不突出，不能满足现代食品开发与加工的需要，往往通过特定的方法来提高其功能特性，使其应用领域更广阔。 1 蛋白质的功能特性 蛋白质的功能性质主要分三类: (l)水化性质，包括水吸收及保留、湿润性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肤链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用。 (2)与蛋白质一蛋白质相互作用有关的性质，包括产生沉淀作用、凝胶作用和形成各种其它结构(如蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展，内部的疏水基团暴露出来，通过疏水作用(高温能提高此类作用)、静电作用(通过ca和其它二价离子桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联形成空间网状结构。 (3)表面活性，包括表面张力、乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基又有亲油基，能够吸附在油一水或空气一水界面上，一旦被界面吸附，蛋白质形成一层膜，可阻止小液滴或气泡聚集，有助于稳定乳化液和气泡。这些功能特性在食品中常被应用。 (4)蛋白质的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用。高比例的极性残基影响肤链间相互作用、水化作用、溶解性和表面活性，疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相当重要，它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带电氨基酸能增强静力相互作用，起到稳定球蛋白，结合水分的作用，以及水化作用、溶解度、凝胶作用和表面活性。琉基(SH)能被氧化形成二硫键，硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变性。共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小、形状、表面电荷。所有这些性质又受PH、温度等环境因素及加工处理的影响。 2蛋白质改性 2.1物理改性 所谓蛋白质物理改性是指利用热、机械振荡、电磁场、射线等物理作用形式改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式, 一般不涉及蛋白质的一级结构。如蒸煮、搅打等均属于物理改性技术。
食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。 (一)、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6％，即1份氮素相当于6.25分蛋白质,以此为换算系数6.25，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同.如玉米、高梁、荞麦,肉与肉制品取6.25，大米取5.95、小麦粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取5.17，动物胶5.55。 测定原理： 食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。 (1) 消化反应：有机物(含C、N、H、O、P、S等元素)+H2S04 -→(NH4)2S04+C02↑+S02↑+S03+H3PO4+CO2↑ (2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH-→2NH3↑+2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3BO3-→(NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O-→2NH4CH+4H3BO3 或 (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器： 1、硫酸钾；