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基因定点突变简介

基因定点突变

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛

选阳性克隆，再测序确定就行了。

三、引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则：

（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp 才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。

（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。

（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。

（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位臵。

（5）最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。

四、引物设计实例

以G CG→A CG为例：

5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’

（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位臵。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。

（3）重新调整引物长度。

Primer #1:

5’-CCT CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG-3’

Primer #2:

5’-CC GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG AGG-3’在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L 值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952

（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及Buffer

引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTAR TM HS DNA polymerase。

六、如何去掉PCR产物

最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

七、如何拿到质粒

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。

八、图示

九、定点突变操作步骤

[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct?酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。

1. 设计点突变引物。

[注]参考引物设计指导

2. 准备模板质粒DN A

[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）

10×Reaction Buffer5μl

pUC18 control plasmid（10ng/μl，

2μl

total 20ng）

Control primer mix（20pmol/μl）2μl

dNTP mixture（each 2.5mM）2μl

O 38μl

Muta-direct? Enzyme1μl

4. 样品反应体系（50μl反应体系）

10×Reaction Buffer5μl

Sample plasmid（10ng/μl，2μl

total 20ng）

Sample primer (F)

1μl

（10pmol/μl）

Sample primer (R)

1μl

（10pmol/μl）

dNTP mixture（each 2.5mM）2μl

O 38μl

Muta-direct? Enzyme1μl

5. PCR反应条件

[注]按如下参数设臵PCR扩增条件。

6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后臵于室温（避免反复冻融）。[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。

[B] 突变质粒选择

PCR反应结束后使用Mutazyme?酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。

1. 准备PCR反应产物

2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme?酶37℃温育1小时。

[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme?酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme?酶用量。

[C]转化

反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。

1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放臵在冰上30分钟。

2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。

序列分析

通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。

为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。

本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：

第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因

好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。

大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位臵更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。

对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位臵是不是重要的位臵，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI 上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR 循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。

对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。

接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都

不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

大家马上就会想到几个问题了：

第一：引物怎么设计呢？

第二：模板怎么去掉呢？

第三：怎么拿到质粒呢？

对于第一个问题：怎么设计引物？

我只能讲一些原则，并举一些例子。

引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：

不过这种突变引物要加上一个原则：

一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为

11-12base pair。

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：

X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAG AGGAATTCCAG 960

现有序列TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAG

AGGAATTCCAG 924

*********************************************** ************

|----deletion

X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTT GAGAGTGTAGGAGAT 1020

现有序列AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTT GAGAGTGTAGGAGAT 984（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）

我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。

故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG 并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG

其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。

引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。

这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物

对于第二个问题：

怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR 产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。

关于第三个问题：

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。

下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：

1、根据现有基因设计引物；

2、合成引物并准备好模板；

3、PCR，

4、DpnI处理酶切产物；

5、转化酶切产物；

6、筛选阳性克隆；

7、送测序并测全长。

最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。

那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型

什么QuikChange? Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange? XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。实验板长出来的菌有两种可能

一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体）

不过这两种菌长得一模一样^_^，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的，

做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），

实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。

如果两者都拿去DNPI处理

就能够证明模板已经被去除干净。

若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。

如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，

如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候就得靠运气了^_^

大家有什么问题我们可以继续讨论。

另外，如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其它办法进行定点突变，只是麻烦一点，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。

不过，如果你有钱的话，那就去买那个试剂盒吧，其中QuikChange?

Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikCh ange? XL

Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）的原理我上面已经说了，只是补充了一些我认为的注意事项。如果你更有钱的话，那么你可以叫其它公司帮你做定点突变服务，大约是改一个点1000元左右。如果有需要我可以提供公司的联系方式。

下面我以一个例子为例来讲100个bp以下的碱基插入缺失或者改变实验方案。其实这种方案并不是那么好的，只不过考虑到大家一般都没有TYPEII限制性内切酶或者UDG and NTHIII（另外两种方法），所以才打算先介绍这种方法。

首先先说明一点，这种方法在原理上存在一定成功机率，也就是说有运气成分。

而定点突变则一般都是百分之百成功的，而这种100bp以下的插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好的克隆，大家如果要用请慎重考虑。同样的，我只变那几十个碱基，并没有改变载体及其它地方，所以我还是依赖于DPNI酶。

举例：

Homo sapiens FzE3 是一个人类基因，其含有32个氨基酸的信号肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDI AYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLD QAIPPC RSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGG PGGGPTAYP TAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPC EPGRAN GLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYF MVA VAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIW WVILSLT WFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCY VGLSSVDA LRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTV PATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYL

MTMIV GITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信号肽和成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个Leucine。即在信号肽和成熟肽之间插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十个bp）、

实验设计：

信号肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCT GTGCCCTGGTGCTG GCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG

成熟肽：

CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGC ATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCT GTGCACGGACATC GCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAAC CAAGAGGACGCGGGC CTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCC CGAACTCCGCTTT TTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCC ATCCCGCCGTGT CGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATG AACAAGTTCGGCTTC

CAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGT GCGGGCGAGATCTGC GTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCG GGCCCACTGCCTACCCT ACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCG GGGGCCTCAGATGGC AAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGT GCCCCCGTACCTG GGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAAC CGGGCCGTGCCAAC GGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCT GGGTGGGCGTGTGG TCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGG TGGACATGCGG CGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTA CTTCATGGTGGCC GTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCG TGGAGCGCTTCTCG GACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGG GCTGCACCATCCTCTTC ATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCT GTCTCTCACT

TGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAG GCCAACTCGCAGTAC TTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTA TCCTGGCCATGGGC CAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTC CAGTGTGGACGCG CTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCA CGTCCTTCTTG CTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACAC GACGGCACCAAG ACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCG TGCTCTACACAGTG CCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCG CGAGCACTGGGAG CGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCC CGCCCGGCCACTTC CCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGAT GACCATGATCGTC GGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTC GTGGCGCCGCTTC TACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA

插入序列

TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG

通过引物3端大于或等于18个碱基的匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5端的序列来补上那三十个碱基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来，上游和下游引物就刚好把那三十个碱基给补上了，再参照引物的设计原则做一些润色，细心的朋友可以具体分析一下这两条引物。扩出来后再用DPNI酶把模板质粒去掉，再用连接酶把PCR产物的两端连接起来（虽然是平端连接，可是由于是同一条PCR产物的两端连接，效率会很高），转化后，测序验证，OK。

设计引物

forward

primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGA GAGAAG

88.5

reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT

86.9

但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一个碱基的效率最多也是百分之九十九点几而不是百分之一百，所以我们拿到手的引物其实是一个混合物，比如说我们合成一条长二十个碱基的引物，实际上拿到手的是一个混合物，里面即含有二十个碱基的引物，也含有一定比率的十九个、十八个、十七个……碱基的引物。

所以我们用这种方法做PCR时，如果连上的是足额长度的引物，那么实验也就成功了，如果连上的是少一两个碱基的引物，那么实验就失败了，不过引物当中主要的仍是足额长度的引物，所以成功机率还是蛮高的。不过送测序时就要做好准备，可能要测三五个才能拿到一个好的。

如果觉得这样不好的话，我稍后会附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它们是通过互补粘端来连接，就不存在这个问题。

下面附上详细实验过程：

第一步：设计引物；其实只要符合一般引物设计原理就行了，顺便说一下，引物一般的话，越长其质量就…………

第二步：引物PNK处理，一般合成的引物其三端是没有磷酸化的，所以我们要自己进行磷酸化，一般可以让其磷酸化过夜，不磷酸化的话最后一步连接就连不上哦。

第三步：PCR，跟基因定点突变一样，要用好的扩增酶和BUFFER，因为要把整个环高保真的圹增出来嘛；

第四步：DPNI处理，跟基因定点突变一样，要把模板去除干净。

第五步：连接，加上连接BUFFER和连接酶连接，

第六步：转化。

定点诱变(DpnI法)

时间:2010-02-22 13:31:19 来源: 作者: 点击: 89次

1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp,设计的突变位点需位于引物中部。

2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶;循环次数少，一般为12个循环。

反应体系：

10x pyrobest Buffer 5 ul

dNTP Mixture(10mM) 1ul

模板DNA(5~50ng) 1ul

primer 1 (125ng) 1ul

primer 2 (125ng) 1ul

pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul

加无菌蒸馏水至50ul

3、产物沉淀纯化：加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀臵冰上（或-20゜C冰箱）5min,离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用DpnI酶切）

4、DpnI酶切：Buffer 2ul

BSA（100╳）0.2ul

DNA x ul

DpnI 0.5ul

加无菌去离子水至20ul

30゜C酶切1~4 h ；65゜C 水浴15min 终止反应。

5、将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

6、测序验证

笔记(高二生物-基因突变和其他变异)

本文档为精品文档，如对你有帮助请下载支持，如有问题请及时沟通，谢谢支持！ 1 高二生物—基因突变及其他变异 1. 下列变异中，属于基因突变的是 A ．某个染色体上丢失了三个基因 B ．某个基因中的三个碱基对缺失 C ．果蝇第Ⅱ号染色体上某片段移接到第Ⅲ号染色体上 D ．联会时同源染色体的非姐妹染色单体之间互换一段 2. 下列与三倍体无子西瓜有关的叙述中，正确的是 A. 无子西瓜与无子番茄的培育原理相同 B . 收获三倍体种子的西瓜植株一定不会是三倍体 C. 无子西瓜之所以没有种子是因为三倍体西瓜的精子和卵细胞存在生殖隔离 D. 无子西瓜不能产生种子是因为它是单倍体 3. 先天性唇裂是严重威胁青少年健康的一种遗传病。为研究其发病率和遗传方式，应采取的正确方法是 ①在患者家系中调查并计算发病率 ②在人群中随机抽样调查并计算发病率 ③在患者家系中调查研究遗传方式 ④在人群中随机抽样调查研究遗传方式 A. ①③ B ．①④ C ．②③ D ．②④ 4. 21三体综合征患儿的发病率与母亲年龄的关系，预防该遗传病的主要措施是 ①适龄生育 ②基因诊断③染色体分析 ④B 超检查 A ．①③ B ．①② C ．③④ D ．②③ 5. 劳拉、卡佳和安娜为亲姐弟，大姐劳拉和弟弟卡佳为红绿色盲患者,小妹安娜色觉正常,则 A .他们的父母再生一个色觉正常男孩的概率为1/4 B.他们的父母再生一个男孩，他色觉正常的概率为1/4 C.劳拉与比尔（色觉正常）结婚后应选择生男孩，男孩不会患色盲 D.安娜是色盲基因携带者的概率为1/2 6. 如果一个基因的中部缺失了1个核苷酸对，不可能出现的后果是 A ．没有蛋白质产物 B ．翻译为蛋白质时在缺失位置终止 C ．所控制合成的蛋白质减少多个氨基酸 D.翻译的蛋白质中,缺失部位以后的氨基酸序列发生变化 7. 对于一个染色体组成为XXY 的色觉正常的男孩，其双亲可能有如下几种情况：①色盲的母亲和正常的父亲 ②色盲的父亲和正常的母亲(不携带色盲基因)则以上两种情况中，染色体畸变分别发生于什么之中 A ．精子，精子 B ．精子，卵细胞 C ．卵细胞，卵细胞 D ．精子，精子或卵细胞 10. 控制不同性状的基因之间进行重新组合，称为基因重组。下列各选项中能够体现基因重组的是 A ．利用人工诱导的方法获得青霉素高产菌株 B ．利用基因工程手段培育生产干扰素的大肠杆菌 C ．在海棠枝条上嫁接苹果的芽，海棠与苹果之间实现基因重组 D ．用一定浓度的生长素溶液涂抹授粉的雌蕊柱头，以获得无子番茄 11. 肥厚性心肌病是一种显性常染色体遗传病，从理论上分析，如果双亲中一方患病，其子女患病的可能性是 A.25 %或30 % B .50 %或100 % C.75 %或100 % D.25 %或75 % 13. 以下关于生物变异的叙述，正确的是 A ．基因突变都会遗传给后代 B ．染色体变异产生的后代都是不育的 C ．基因碱基序列发生改变，不一定导致性状改变 D ．基因重组只发生在生殖细胞形成过程中

高中生物基因突变

基因突变导入：表现型是基因型与环境条件相互作用的结果，不论是基因型还是环境条件的改变，都可能引起表现型改变，这就是生物的变异。问题情境：投影显示资料资料一：在北京培育出的优质甘蓝品种，叶球最大的有3．5千克，当引种到拉萨后，由于昼夜温差大、日照时间长、光照强，叶球可重达7千克左右。但再引回北京后，叶球又只有3．5千克。资料二：用抗病易倒的小麦和易病抗倒的小麦杂交，通过基因重组培育出了既抗病又抗倒的高产小麦品种。提出问题： 1．变异的类型有哪几种？ 2．不同变异类型分别由何种原因引起？结果如何？学生思考得出结论，教师进一步归纳总结。（－）基因突变 1．基因突变的概念血红蛋白是由四条多肽链，共含有574个氨基酸中，病者与正常人大部分是相同的。所不同的，只是在第6位的一个谷氨酸被缬氨酸替代，因而引起血红蛋白结构异常。异常的血红蛋白在氧气分压较低的情况下呈棒状或卷绳样晶体结构，会使红细胞由正常圆饼状变成镰刀状。镰刀型红细胞膜易受损伤而被网状内皮细胞破坏，出现溶血性贫血症状。讨论问题：产生蛋白质结构变异的根本原因是什么？演示软件：该软件开始可从上→下顺次演示，比较符合学生由表及里、由浅入深的认知规律。当学生已有一定的感性认识后，再次演示可变为从下→上次序播放。而此种安排则有助于学生明确因果关系，进一步加深知识理解。学生认真观察、思考、得出结论：控制血红蛋白分子合成的DNA 碱基序列中有一对发生了改变（变成）遗传信息改变，mRNA上相应密码子改变，多肽链上相应的氨基酸改变，血红蛋白异常红细胞异常（镰刀型）教师点拨：除了碱基替换外，控制合成血红蛋白分子的DNA碱基序列有时也会发生碱基的增添或缺失，导致血红蛋白病的产生，引导学生最终得出基因突变的概念。 2．基因突变 3．基因突变的特点指导学生阅读：书P49。

高中生物《基因突变》优质课教案、教学设计

《基因突变》教学设计 1.教材依据：青岛版普通高中课程标准试验教科书生物《必修2》第四章第1 节。 2.设计思想教学活动围绕着对基因突变的实例展开，理解基因突变的内涵，把握基因突变的外延、特点以及与生物变异和进化的关系；强化核心概念的教学，注重知识与生活、实践应用的联系。 3.目标聚焦 1.阐明基因突变的机理、特点和应用 2.关爱生命，选择健康的生活方式 4. 学法指导从实例分析入手，按照认知的规律从现象到概念，从宏观（镰刀型贫血症）到微观（镰刀型贫血症的发病机理）来归纳总结出基因突变的概念和特点；利用图示、加强知识的前后联系等方法引导学生不断地探究、思考、分析和讨论，帮助学生理解基因突变概念、结果以及与性状的关系。最后将所学内容进行整合。 5教学过程导入：（通过PPT 上的两个实例，引出可遗传变异和不可遗传变异的两种类型）学生活动：学生观察PPT 并分析讨论。提问：实例一：在北京培育的优质甘蓝品种，叶球最大的有3.5KG，当引种到拉萨后，由于昼夜温差大、日照时间长、光照强，叶球可重达7KG 左右。但再引回北京后，叶球又只有3.5KG。实例二：太空椒（普通青椒种子遨游过太空后培育而成）与普通青椒对比，果实明显增大，将太空椒的种子种植下去，仍然是肥大果实。实例一、二描述的变异类型是否属于同一种变异？若不是，二者不同的原因是什么？（学生思考）――不是，前者不可以遗传，后者可以遗传。教师总结并展示PPT：变异分为不可遗传的变异（仅由环境因素引起的性状改变）和可遗传的变异，包括基因突变、基因重组和染色体变异。这节课我们来探讨学习可遗传变异中的基因突变。板书：第四章生物的变异第1 节基因突变教师通过PPT 展示教材P69 基因突变的意义：新基因产生的途径、生物变异的根本来源、为生物进化提供了原始材料，提高同学们学习《基因突变》的兴趣。

高一生物基因突变及其他变异测试题

第5章基因突变及其他变异 A卷一．选择题 1．下列有关基因突变的说法，不正确的是（） A．自然条件下的突变率很低 B．基因突变对生物自身都是有害的 C．基因突变能够产生新的基因 D．基因突变是广泛存在的 2．基因突变按其发生的部位可以分为①体细胞突变和②生殖细胞突变两种，以下相关叙述中正确的是（） A．均发生在有丝分裂的间期 B．①发生在有丝分裂间期，②发生在减数第一次分裂的间期 C．均发生在减数第一次分裂的间期 D. ①发生在有丝分裂间期，②发生在减数第一次或第二次分裂的间期 3．使人患镰刀型细胞贫血症的根本原因是（） A．正常血红蛋白变成了异常血红蛋白 B．血红蛋白中的谷氨酸变成了缬氨酸 C．信使RNA中的GAA变成了GUA D．DNA中的一个碱基对发生了替换 4．人的基因突变不包括DNA分子双链中（） A．碱基对G—C变成T—A B．因某种原因增加了一对碱基G—C C．因某种原因缺失了一对碱基G—C D．因某种原因缺失了大量的基因 5．一种果蝇的突变个体在21℃的气温下，生活能力很差，但是当气温上升到25.5℃时，其生活能力则大大提高了，这说明（） A．生物的突变常常是有利的 B．环境条件的变化对突变体是有利的 C．突变后使个体的体质增强 D．突变的有利或有害与环境环境条件有关 6. Bu（5—溴尿嘧啶）是胸腺嘧啶的类似物，在含有Bu的培养基上培养大肠杆菌，得到少数突变型大肠杆菌，与原大肠杆菌相比，突变型大肠杆菌中的碱基数目不变，但（A+T）/（C+G）的碱基比例略小于原大肠杆菌，这表明Bu诱发基因突变的机制是（）A．阻止碱基正常配对 B．断裂DNA链中糖与磷酸之间的化学键 C．诱发DNA发生碱基种类替换D．诱发DNA链发生碱基序列变化 7.下列各细胞中，只含有1个染色体组的是（） A. 果蝇的体细胞 B. 人的卵细胞 C. 单倍体普通小麦的体细胞 D. 普通小麦的体细胞 8. 已知某物种的一条染色体上依次排列着A、B、C、D、E五个基因，下面列出的几种改变情况中，未发生染色体结构改变的是（） 9.下列有关单倍体的叙述中正确的是（）

定点突变技术——从单点突变到多点突变

定点突变技术——从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli 中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过 8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质

定点诱变技术解析

第三章DNA突变技术

?基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。 ?根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变定点突变 2.随机突变表型筛选

?随机突变易错PCR法(Error-prone PCR) ?降低一种dNTP的量（降至5％-10％）?加入dITP来代替被减少的dNTP ?缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shuffling ?外显子、单基因和基因家族的重组装?随机引物延伸法 ?交错延伸法 ?定点突变点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube ?Random fragmentation of a pool of related genes; ?Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); ? PCR amplification with primers of reassembled products How DNA shuffling works

Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences 一、单基因和基因家族的重组装

高中生物必修二基因突变及其他变异测试题及答案

第5章基因突变及其他变异一、选择题 1．人类发生镰刀型贫血症情况的根本原因在于基因突变，突变的方式是基因内（）A．碱基发生替换B．增添或缺失某个碱基对 C．增添一小段DNA D．缺少一小段DNA 2．若一对夫妇所生的子女中，性状上差异甚多，这种差异主要来自于（） A．基因突变B．基因重组 C．环境影响D．染色体变异 3．现有三种玉米籽粒，第一种是红的，第二种是白的，第三种也是白的，但如果在成熟时期暴露于阳光下籽粒变成红的。第三种玉米的颜色是由哪种因素决定的（）A．基因B．环境 C．基因和环境D．既不是基因也不是环境 4．下列不属于多倍体特点的是（） A．茎秆、叶、果实、种子都较大B．发育迟缓 C．营养物质含量增多D．高度不育 5．人工诱导多倍体最常用的有效方法是（） A．杂交实验B．射线或激光照射萌发的种子或幼苗C．秋水仙素处理萌发的种子或幼苗D．花药离体培养 6．遗传病是指（） A．具有家族史的疾病 B．生下来就呈现的疾病 C．由于遗传物质发生了变化而引起的疾病 D．由于环境因素影响而引起的疾病 7．21三体综合征属于（） A．基因病中的显性遗传病B．单基因病中的隐性遗传病 C．常染色体遗传病D．性染色体遗传病 8．无子西瓜之所以无子，是因为三倍体植株在减数分裂过程中染色体的（） A．数目增加，因而不能形成正常的卵细胞 B．数目减少，因而不能形成正常的卵细胞 C．联会紊乱，因而不能形成正常的卵细胞

D．结构改变，因而不能形成正常的卵细胞 9．人类基因组是指人类DNA分子所携带的全部遗传信息。人类基因组计划就是分析测定人类基因组的核苷酸序列。其主要内容包括绘制人类基因的遗传图、物理图、序列图和转录图。科学家应对多少条染色体进行分析（） A．46条B．23条C．24条D．22条 10．下列关于基因突变的叙述中，正确的是（） ①基因突变包括自发突变和诱发突变 ②基因突变发生在DNA复制时，碱基排列发生差错，从而改变了遗传信息，产生基因突变 ③生物所发生的基因突变，一般都是有害的，但也有有利的 A．①②B．②③C．①③D．①②③ 11．下列变异属于基因突变的是（） A．外祖父色盲，母亲正常，儿子色盲B．杂种红果番茄的后代出现黄果番茄 C．纯种红眼果蝇的后代出现白眼性状D．用花粉直接培育的玉米植株变得弱小12．减数分裂和受精作用会导致生物发生遗传物质的重组，在下列叙述中与遗传物质重组无关的是（） A．联会的同源染色体发生局部的互换 B．卵原细胞形成初级卵母细胞时DNA复制 C．形成配子时，非同源染色体在配子中自由组合 D．受精作用时，雌雄配子的遗传物质相互融合 13．如果将一个镰刀型细胞贫血病的患者血液，输给一个血型相同的正常人，将使正常人（） A．基因产生突变，使此人患病B．无基因突变，性状不遗传给此人 C．基因重组，将病遗传给此人D．无基因重组，此人无病，其后代患病14．下列属于染色体结构变异的是（） A．染色体中DNA的一个碱基发生了改变 B．染色体增加了某一段 C．染色体中DNA增加了碱基对 D．染色体中DNA缺少了一个碱基 15．用基因型DdTt的个体产生的花粉粒，分别进行离体培育成幼苗，再用一定浓度的

高中生物练习-基因突变可能引起性状改变(2)(学生版)

第4章生物的变异第1节基因突变可能引起性状改变 1.下图为基因的作用与性状的表现流程示意图.正确的选项是 A．①过程是转录,它以DNA的两条链为模板、四种核苷酸为原料合成mRNA B．②过程中只需要mRNA、氨基酸、核糖体、酶、ATP即可完成 C．人的镰刀型细胞贫血症是基因通过控制蛋白质的结构而直接控制性状 D．某段DNA上发生了基因突变,则形成的mRNA、蛋白质一定会改变 2.下列关于基因突变的叙述,正确的是 A．基因突变必然引起基因数量发生改变 B．高等生物的基因突变只发生在生殖细胞中 C．基因位置改变引起的生物性状改变属于基因突变 D．若编码某多肽的基因缺失了单个碱基对,则该基因编码的肽链可能变长 3.一些食物较长时间存放于湿热环境中易导致黄曲霉菌大量繁殖,其次生代谢产物黄曲霉毒素可使人体肝细胞中p53基因与RNA聚合酶结合的部位发生改变,导致基因无法表达,最终引发肝癌等疾病.下列分析错．误．的是 A．p53基因的功能可能是抑制细胞的不正常增殖 B．肝癌细胞膜表面的糖分子较正常细胞有所减少 C．肝癌细胞的这种变异属于基因突变 D．用DNA合成抑制剂阻断癌细胞的细胞周期,则多数细胞将停留在S与G2的临界期 4.高等动植物大约每105到108个配子中才有一个发生基因突变,说明基因突变具有 A．普遍性B．稀有性 C．多方向性D．可逆性 5.菜植物的花色由一对等位基因（C/c）控制,C控制红色素合成,若只含1个C基因,红色素表现不足为粉红色.经X射线照射红花品系,其后代中出现了几株开粉红花的植株和几株开白花的植株.下列叙述错误的是 A．基因突变或染色体畸变都可能引起该植物的花色变异 B．各种类型的白花植株经X射线照射均有可能产生红花植株 C．后代粉红花植株体细胞中可能只含有C基因,不含有c基因 D．未经X射线照射的粉红花品系也可能产生红花后代 6.人镰刀型细胞贫血症是基因突变造成的,血红蛋白β链第6个氨基酸的密码子由GAG变为GUG,导致编码的谷氨酸被置换为缬氨酸.下列相关叙述错误的是

(人教版)高中生物必修二：5.1《基因突变和基因重组》同步练习(含答案)培训资料

(人教版)高中生物必修二：5.1《基因突变和基因重组》同步练习(含答案)

一、选择题 1．下列有关基因突变的叙述中，不正确的是( ) A．基因突变是指基因结构中碱基对的增添、缺失或替换 B．基因突变是由于基因中脱氧核苷酸的种类、数量和排列顺序的改变而发生的 C．基因突变可以在一定的外界环境条件或者生物内部因素的作用下引起 D．基因突变的频率是很低的，并且都是有害的解析：A项说明了基因突变的本质，B项阐明了基因突变的原因，C项说明了引起基因突变的因素。基因突变的频率很低，而且一般都是有害的，但不全是有害的，有一些基因突变是中性的，还有少数突变是有利的，且突变的有利、有害是相对于生物所处的环境而言的。答案： D 2．下列变化属于基因突变的是( ) A．玉米籽粒播于肥沃土壤，植株穗大粒饱；播于贫瘠土壤，植株穗小粒瘪 B．黄色饱满粒与白色凹陷粒玉米杂交，F2中出现黄色凹陷粒与白色饱满粒 C．在野外的棕色猕猴种群中偶尔出现了白色猕猴 D．小麦经减数分裂产生花粉解析：选项A是由环境条件改变引起的不可遗传的变异；选项B属于基因重组；选项D是减数分裂；选项C是基因突变。答案： C 3．基因A，它可以突变为a1，也可以突变为a2，a3……一系列等位基因，如图不能说明的是( ) A．基因突变是不定向的 B．等位基因的出现是基因突变的结果 C．正常基因的出现是基因突变的结果 D．这些基因的转化遵循基因的自由组合定律解析：图中表示基因突变是不定向的，基因突变的结果是产生新的基因(或等位基因)，此等位基因对生物体有可能是有害的，也有可能是有利的；这些基因的转化既不符合分离定律，也不符合自由组合定律。答案： D 4．有性生殖生物的后代性状差异，主要来自于基因重组，下列过程中哪些过程可以发生基因重组( )

高中生物基因突变知识点总结

高中生物基因突变知识点总结下面由为大家提供关于高中生物基因突变知识点总结，希望对大家有帮助!高中生物基因突变第一节一、生物变异的类型1、不可遗传的变异(仅由环境变化引起)2、可遗传的变异(由遗传物质的变化引起)，包括：基因突变;基因重组;染色体变异二、可遗传的变异(一)基因突变1、概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，叫做基因突变。 2、原因：物理因素：X射线、紫外线、r射线等;化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等;生物因素：病毒、细菌等。 3、特点：(1)普遍性(2)随机性(基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期;基因突变可以发生在细胞内的不同的DNA分子上或同一DNA分子的不同部位上)(3)低频性(4)多数有害性(5)不定向性【注】体细胞的突变不能直接传给后代，生殖细胞的则可能 4、意义：它是新基因产生的途径;是生物变异的根本来源;是生物进化的原始材料。 (二)基因重组1、概念：是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。 2、类型：(1)非同源染色体上的非等位基因自由组合(2)四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换高中生物基因突变第二节一、染色体结构变异：实例：猫叫综合征(5号染色体部分缺失)类型：缺失、重复、倒位、易位(看书并理解)二、染色体数目的变异 (3)染色体组数的判断：① 染色体组数= 细胞中形态相同的染色

体有几条，则含几个染色体组例：以下各图中，各有几个染色体组?② 染色体组数= 基因型中控制同一性状的基因个数例：以下基因型，所代表的生物染色体组数分别是多少?(1)Aa ______(2)AaBb _______(3)AAa _______(4)AaaBbb _______(5)AAAaBBbb _______(6)ABCD ______答案：2 2 3 3 4 13、单倍体、二倍体和多倍体单倍体：由配子发育成的个体。几倍体：由受精卵发育成的个体，体细胞中含几个染色体组就叫几倍体，如含两个染色体组就叫二倍体，含三个染色体组就叫三倍体，以此类推。体细胞中含三个或三个以上染色体组的个体叫多倍体。三、染色体变异在育种上的应用1、多倍体育种：方法：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。 (能够抑制纺锤体的形成,导致染色体不分离,从而引起细胞内染色体数目加倍)原理：染色体变异实例：三倍体无子西瓜的培育优缺点：培育出的植物器官大，产量高，营养丰富，但结实率低，成熟迟。现有纯合矮杆不抗病水稻ddrr和纯合高杆抗病水稻DDRR两个品种,要想得到能够稳定遗传的矮杆抗病水稻ddRR ，应该怎么做?优缺点：后代都是纯合子，明显缩短育种年限，但技术较复杂。【附】育种方法小结诱变育种杂交育种多倍体育种单倍体育种方法用射线、激光、化学药品等处理生物杂交用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗花药(粉)离体培养原理基因突变基因重组染色体变异染色体

基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC 含量应大于40%）。（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

高中生物基因突变及其他变异(知识点-习题)

第五章基因突变及其他变异第一节基因突变和基因重组一、基因突变的实例 1、镰刀型细胞贫血症 ⑴症状 ⑵病因基因中的碱基替换直接原因：血红蛋白分子结构的改变根本原因：控制血红蛋白分子合成的基因结构的改变 2、基因突变概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变二、基因突变的原因和特点 1、基因突变的原因有内因和外因物理因素：如紫外线、X射线 ⑴诱发突变（外因）化学因素：如亚硝酸、碱基类似物生物因素：如某些病毒 ⑵自然突变（内因） 2、基因突变的特点 ⑴普遍性 ⑵随机性 ⑶不定向性 ⑷低频性 ⑸多害少利性 3、基因突变的时间有丝分裂或减数第一次分裂间期 4.基因突变的意义：是新基因产生的途径；生物变异的根本来源；是进化的原始材料三、基因重组 1、基因重组的概念随机重组（减数第一次分裂后期） 2、基因重组的类型交换重组（四分体时期） 3.时间：减数第一次分裂过程中（减数第一次分裂后期和四分体时期）４．基因重组的意义四、基因突变与基因重组的区别

第二节染色体变异一、染色体结构的变异（猫叫综合征） 1、概念缺失 2、变异类型重复倒位易位二、染色体数目的变异 1.染色体组的概念及特点 2.常见的一些关于单倍体与多倍体的问题 ⑴一倍体一定是单倍体吗？单倍体一定是一倍体吗？（一倍体一定是单倍体；单倍体不一定是一倍体。） ⑵二倍体物种所形成的单倍体中，其体细胞中只含有一个染色体组，这种说法对吗？为什么？（答：对，因为在体细胞进行减数分裂形成配子时，同源染色体分开，导致染色体数目减半。） ⑶如果是四倍体、六倍体物种形成的单倍体，其体细胞中就

StarMut超长基因定点突变试剂盒

StarMut XL Site-directed Mutagenesis Kit StarMut 超长基因定点突变试剂盒【货号和规格】T113-01，10 rxn 【产品概述】本试剂盒采用反向PCR (Inverse PCR) 技术，对含有目标基因的双链环状质粒进行扩增，直接导入突变序列，从而实现单个或多个邻近碱基的突变(mutation)、缺失(deletion)、或插入(insertion)。该技术的原理如右图所示。首先以甲基化的质粒DNA 为模板，使用人工合成含有目的突变碱基的引物进行扩增反应，然后用DpnI 限制性内切酶消化不含突变的质粒模板，再进行转化和筛选。本试剂盒采用保真性能和扩增效率俱佳的StarMut XL Enzyme ，能够快速扩增15 kb 以下的质粒DNA (15~30 sec/1 kb)，最大限度地保持扩增质粒的保真性，大大缩短反应时间，是StarMut Site-directed Mutagenesis Kit (货号T111-01)的升级产品。该方法操作简单快捷，突变阳性率高，对引物设计的要求相对宽松、灵活。严格按说明书操作，6个以下连续碱基的突变率可达90%以上，最多可实现21个连续碱基的插入或删除。对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的质粒)，可通过转化dam ＋的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR 反应模板。本试剂盒提供一个 4.5 kb 、含有突变的lacZ 基因的对照质粒(Control Plasmid)。质粒转化大肠杆菌后在含Amp 、IPTG 和X-gal 的琼脂平板上呈白色菌落；采用试剂盒提供的Control Primers 成功进行突变反应后，菌落呈现蓝色，可据此检测突变效率。【产品组分】 * 使用前请先短暂离心；? 使用前请完全解冻并充分混匀【保存条件】 ?20℃保存，有效期一年。【操作步骤】 1．引物设计原则： (1) 正、反向突变引物各一条，长度约25~45个碱基，分别包含带有突变点的互补区和3' 端延伸区(见下图)； (2) 突变点分别位于正、反向引物的互补区，互补区应包含至少15个碱基； (3) 引物突变点的3' 端应包含10~15个与质粒模板互补的碱基； (4) 引物的3'端应包含至少一个G 或C 碱基，尽量避免三个以上的重复碱基，以免错配； (5) 尽量将引物的GC 含量控制在40~60％； (6) 请使用经过PAGE 或HPLC 纯化的引物，否则会降低突变阳性率。引物设计举例：互补区延伸区互补区延伸区 Forward Primer ： 5'-GATTACGCCAAGCT T CTAAATTAACCG-3' 5'-CCAAGCT T CTAAATTAACCGTG-3' Reverse Primer ： 3'-GATACTGGTACTAATGCGGTTCGA A G-5' 3'-CTAATGCGGTTCGA A GATTTAATTG-5' 延伸区互补区延伸区互补区 StarMut XL Enzyme * 8 μl 5 x StarMut XL Reaction Buffer ? 100 μl High-GC Additive * 30 μl dNTPs * 25 μl Dpn I (10 U/μl)* 12 μl Control Plasmid (5 ng/μl)* 10 μl Control Primers (10 μM of each)* 10 μl ddH 2O 1 ml 图1. StarMut 超长基因定点突变试剂盒原理和操作流程示意图或 PCR 合成突变链 Dpn I 消化掉含有甲基化的DNA 质粒模板转化至高效感受态细胞中 CH 3 CH 3 3CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3

高一生物基因突变及其它变异练习

Ⅰ豌豆雄蕊←────────→豌豆雌蕊Ⅰ↓│↓ Ⅱ精原细胞合子Ⅳ卵原细胞Ⅱ↓↓↓ Ⅲ精子────────────卵细胞Ⅲ①有丝分裂发生在Ⅰ→ⅡⅣ→Ⅰ ②基因分离发生在Ⅱ→Ⅲ ③基因重组发生在Ⅲ→Ⅳ ④Ⅳ为个体发育的起点第5章基因突变及其它变异单元练习 1. 番茄果实红色（H）对黄色（h）为显性。某隐性纯合黄色植株（hh）自交，结出了半边红半边黄的变异果，这种变化原因可能是（） A.环境改变 B.基因重组 C.基因突变 D.染色体变异 2.科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用的方式进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体中，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程，属（）A．基因突变B．基因重组C．基因互换D．染色体变异 3.下列为豌豆的生活史，对此图的叙述正确的是（） A ①②③ B ①②④ C ①②③④ D ②③④ 4.马（2N=62）和驴（2N=62）杂交形成的骡是高度不育的，其原因是（） A.骡不能进行正常的减数分裂 B.骡的体细胞只含有一个染色体组 C.骡的染色体结构发生了变异 D.马和驴的染色体相互排斥 5.如图是某二倍体植物的一个正在分裂的细胞，下列叙述正确的是（） ①植物的基因型是AaBB ②若该植株由花粉发育而来，则其亲本是一个四倍体 ③该植株不可能产生Ab型配子④该细胞发生过基因突变 A．①③ B．②④ C．①④ D．②③ 6. 减数分裂的哪一异常变化将可能出现先天愚型的后代（）A．第5对染色体部分缺失B．第21号染色体着丝点分开但不分离C．第3号染色体的着丝点不分开D．第21号染色体部分颠倒 7．某种群中发现一突变性状，连续培养三代才选出能稳定遗传的纯合突变类型，该突变为（）A．显性突变（d→D）B．隐性突变(D→d) C．显性突变和隐性突变D．人工诱变 8.几种氨基酸的密码子如下。甘氨酸：GGU、GGC、GGA、GGG; 缬氨酸：GUU、GUC、GUA、GUG；甲硫氨酸：AUG。经研究发现，在编码某蛋白质的基因的某个位点上发生了一个碱基替换，导致对应位置上的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸；接着由于另一个碱基的替换，该位置上的氨基酸又由缬氨酸变为甲硫氨酸，则未突变时的甘氨酸的密码子应该是（）

高一生物《基因突变和基因重组》知识点归纳

高一生物《基因突变和基因重组》知识点归纳名词： 1、基因突变：是指基因结构的改变，包括DNA碱基对的增添、缺失或改变。 2、基因重组：是指控制不同性状的基因的重新组合。 3、自然突变：有些突变是自然发生的，这叫～。 4、诱发突变(人工诱变)：有些突变是在人为条件下产生的，这叫～。是指利用物理的、化学的因素来处理生物，使它发生基因突变。 5、不遗传的变异：环境因素引起的变异,遗传物质没有改变，不能进一步遗传给后代。 6、可遗传的变异：遗传物质所引起的变异。包括：基因突变、基因重组、染色体变异。语句： 1、基因突变 ①类型：包括自然突变和诱发突变 ②特点：普遍性;随机性(基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。突变发生的时期越早，表现突变的部分越多，突变发生的时期越晚，表现突变的部分越少。);突变率低;多数有害;不定向性(一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。)。 ③意义：它是生物变异的根本来源，也为生物进化提供了最初的原材料。 ④原因：在一定的外界条件或者生物内部因素的作用下，使得DNA复制过程出现小小的差错，造成了基因中脱氧核苷酸排列顺序的改变，最终导致原来的基因变为它的等位基因。这种基因中包含的特定遗传信息的改变，就引起了生物性状的改变。

⑤实例：a、人类镰刀型贫血病的形成：控制血红蛋白的DNA上一个碱基对改变，使得该基因脱氧核苷酸的排列顺序—发生了改变，也就是基因结构改变了，最终控制血红蛋白的性状也会发生改变，所以红细胞就由圆饼状变为镰刀状了。b、正常山羊有时生下短腿“安康羊”、白化病、太空椒(利用宇宙空间强烈辐射而发生基因突变培育的新品种。)。 ⑥引起基因突变的因素：a、物理因素：主要是各种射线。b、化学因素：主要是各种能与DNA发生化学反应的化学物质。c、生物因素：主要是某些寄生在细胞内的病毒。 ⑦人工诱变在育种上的应用：a、诱变因素：物理因素---各种射线(辐射诱变)，激光(激光诱变);化学因素—秋水仙素等b、优点：提高突变率，变异性状稳定快，加速育种进程，大幅度地改良某些性状。c、缺点：诱发产生的突变，有利的个体往往不多，需处理大量的材料。d、如青霉素的生产。 2、基因突变是染色体的某一个位点上基因的改变，基因突变使一个基因变成它的等位基因，并且通常会引起一定的表现型变化。 3、基因重组： ①类型：基因自由组合(非同源染色体上的非等位基因)、基因交换(同源染色体上的非等位基因)。 ②意义：非常丰富(父本和母本遗传物质基础不同，自身杂合性越高，二者遗传物质基础相差越大，基因重组产生的差异可能性也就越大。);基因重组的变异必须通过有性生殖过程(减数分裂)实现。丰富多彩的变异形成了生物多样性的重要原因之一。 4、基因突变和基因重组的不同点：基因突变不同于基因重组，基因重组是基因的重新组合，产生了新的基因型，基因突变是基因结构的改变，产生了新的基因，产生出新的遗传物质。因此，基因突变是生物产生变异的根本原因，为进

高中生物_必修二_基因突变及其他变异测试题及答案

基因突变及其他变异一、选择题 1．人类发生镰刀型贫血症情况的根本原因在于基因突变，突变的方式是基因内（）A．碱基发生替换 B．增添或缺失某个碱基对 C．增添一小段DNA D．缺少一小段DNA 2．若一对夫妇所生的子女中，性状上差异甚多，这种差异主要来自于（） A．基因突变 B．基因重组 C．环境影响 D．染色体变异 3．现有三种玉米籽粒，第一种是红的，第二种是白的，第三种也是白的，但如果在成熟时期暴露于阳光下籽粒变成红的。第三种玉米的颜色是由哪种因素决定的（）A．基因 B．环境 C．基因和环境 D．既不是基因也不是环境 4．下列不属于多倍体特点的是（） A．茎秆、叶、果实、种子都较大 B．发育迟缓 C．营养物质含量增多 D．高度不育 5．人工诱导多倍体最常用的有效方法是（） A．杂交实验 B．射线或激光照射萌发的种子或幼苗C．秋水仙素处理萌发的种子或幼苗 D．花药离体培养 6．遗传病是指（） A．具有家族史的疾病 B．生下来就呈现的疾病 C．由于遗传物质发生了变化而引起的疾病 D．由于环境因素影响而引起的疾病 7．21三体综合征属于（） A．基因病中的显性遗传病 B．单基因病中的隐性遗传病 C．常染色体遗传病 D．性染色体遗传病 8．无子西瓜之所以无子，是因为三倍体植株在减数分裂过程中染色体的（） A．数目增加，因而不能形成正常的卵细胞 B．数目减少，因而不能形成正常的卵细胞 C．联会紊乱，因而不能形成正常的卵细胞

D．结构改变，因而不能形成正常的卵细胞 9．人类基因组是指人类DNA分子所携带的全部遗传信息。人类基因组计划就是分析测定人类基因组的核苷酸序列。其主要内容包括绘制人类基因的遗传图、物理图、序列图和转录图。科学家应对多少条染色体进行分析（） A．46条 B．23条 C．24条 D．22条 10．下列关于基因突变的叙述中，正确的是（） ①基因突变包括自发突变和诱发突变 ②基因突变发生在DNA复制时，碱基排列发生差错，从而改变了遗传信息，产生基因突变 ③生物所发生的基因突变，一般都是有害的，但也有有利的 A．①② B．②③ C．①③ D．①②③ 11．下列变异属于基因突变的是（） A．外祖父色盲，母亲正常，儿子色盲 B．杂种红果番茄的后代出现黄果番茄 C．纯种红眼果蝇的后代出现白眼性状 D．用花粉直接培育的玉米植株变得弱小 12．减数分裂和受精作用会导致生物发生遗传物质的重组，在下列叙述中与遗传物质重组无关的是（） A．联会的同源染色体发生局部的互换 B．卵原细胞形成初级卵母细胞时DNA复制 C．形成配子时，非同源染色体在配子中自由组合 D．受精作用时，雌雄配子的遗传物质相互融合 13．如果将一个镰刀型细胞贫血病的患者血液，输给一个血型相同的正常人，将使正常人（） A．基因产生突变，使此人患病B．无基因突变，性状不遗传给此人 C．基因重组，将病遗传给此人D．无基因重组，此人无病，其后代患病 14．下列属于染色体结构变异的是（） A．染色体中DNA的一个碱基发生了改变 B．染色体增加了某一段 C．染色体中DNA增加了碱基对 D．染色体中DNA缺少了一个碱基 15．用基因型DdTt的个体产生的花粉粒，分别进行离体培育成幼苗，再用一定浓度的秋水仙素处理，使其成为二倍体。这些幼苗成熟后的自交后代是（）

高中生物必修二第章基因突变及其他变异知识点

第5章基因突变及其他变异 ★第一节基因突变和基因重组一、生物变异的类型 ●不可遗传的变异（仅由环境变化引起） ●可遗传的变异（由遗传物质的变化引起）基因重组二、可遗传的变异（一）基因突变 1、概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，叫做基因突变。类型：自然突变和诱发突变发生时期：主要是细胞分裂间期DNA分子复制时。 2、原因：外因物理因素：X射线、紫外线、r射线等；化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等；生物因素：病毒、细菌等。内因： DNA复制过程中，基因中碱基对的种类、数量和排列顺序发生改变，从而改变了基因的结构。 3、特点：a、普遍性 b、随机性（基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期；基因突变可以发生在细胞内的不同的DNA分子上或同一DNA分子的不同部位上）；c、低频性 d、多数有害性 e、不定向性注：体细胞的突变不能直接传给后代，生殖细胞的则可能 4、意义：它是新基因产生的途径；是生物变异的根本来源；是生物进化的原始材料。（二）基因重组 1、概念：是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。 2、类型：a、非同源染色体上的非等位基因自由组合 b、四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换 c、人为导致基因重组（DNA重组）如目的基因导入质粒 3、意义：形成生物多样性的重要原因之一；为生物变异提供了极其丰富的来源，对生物进化具有重要意义基因重组不能产生新的基因，但能产生新的基因型。基因突变既能产生新的基因，又能产生新的基因型。有性生殖后代性状多样性的主要原因是基因重组。传统意义上的基因重组是在减数分裂过程中实现的，但精子与卵细胞的结合过程不存在基因重组。人工控制下的基因重组（1）分子水平的基因重组，如通过对DNA的剪切、拼接而实施的基因工程。（2）细胞水平的基因重组，如动物细胞融合技术以及植物体细胞杂交技术下的大规模的基因重组。再如肺炎双球菌的转化。第二节染色体变异一、染色体结构变异：实例：猫叫综合征（5号染色体部分缺失））类型：缺失、重复、倒位、易位（看书并理解．．．．．某一片段确实；增加某一片段；非同源染色体；位置颠倒

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