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球形红细菌生物转化槲寄生中总三萜类化合物的测定

球形红细菌生物转化槲寄生中总三萜类化合物的测定
球形红细菌生物转化槲寄生中总三萜类化合物的测定

球形红细菌生物转化槲寄生中总三萜类化合物的测定

[摘要]目的:建立槲寄生及球形红细菌转化槲寄生培养液中总三萜类化合物的含量测定方法,并对各个样品的含量进行比较研究。方法:采用紫外分光光度法,以齐墩果酸为对照品,5%的香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸为显色系统,535 nm波长处测定总三萜类化合物的含量。结果:齐墩果酸在2~12 μg/ml 的范围内线性关系良好,标准曲线回归方程为A=21.988C-0.072,r=0.989 5。 75%的乙醇提取、半量常规培养基、游离球形红细菌培养,所得培养液(样品 3)总三萜含量和槲寄生75%的乙醇提取液(样品 1)相比增加 141%。结论:经过球形红细菌转化可以增加槲寄生提取液中总三萜类化合物的含量。

[关键词]槲寄生;光合细菌;球形红细菌;三萜类化合物;含量测定

Determination of the total triterpenes in mistletoe transformed by rhodobac-

ter sphaeroides

[Abstract] Objective: To establish methods for the determination of total triterpenes in mistletoe and its transformation

products by rhodobacter sphaeroides, and to compare the contents of each sample. Methods: Oleanolic acid was taken as

the standard, the content of total triterpenes was measured by spectrophotometry with 5% vanillin-glacial acetic acid solu -

tion and perchloric acid as color-developing agent and the detection wavelength was at 535 nm. Results: The linear corre-

lation of oleanolic acid calibration curve was good in the range of 2-12 μg/ml, and the calibration curve regression equa-

tion was A=21.988C-0.072, r=0.989 5. Compared with 75% ethanol extract of mistletoe (sample 1), the content of total

triterpenes in 75% ethanol mistletoe extract cultured with half amount of conventional medium and rhodobacter sphaeroides

(sample 3) increased by 141%. Conclusion: The content of total triterpenes in mistletoe extract can be enhanced after bio-

transformed by rhodobacter sphaeroides.

[Key words] Mistletoe; Photosynthetic bacteria; Rhodobacter sphaeroides; Triterpenes; Content determination

槲寄生为桑寄生科槲寄生属植物

V. coloratum (Komar.)

Nakai

的干燥带叶茎枝,具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎

作用

[1]

。其中含有黄酮类、生物碱类、三萜类、多肽等化合物。

球形红细菌为光合细菌中的一种,为一种有益菌,可以转化

中药中的部分成分

[2-3]

。本课题组通过一定工艺制得球形红

细菌转化槲寄生培养液(PSBT),提高了槲寄生的抗肿瘤活性,降低了其毒性。通过系统分离、细胞毒活性筛选表明,三萜类化合物为其中细胞毒活性的有效部位之一

[4]

。本文建立

槲寄生及球形红细菌转化槲寄生培养液中总三萜类化合物

的含量测定方法,并对槲寄生及 PSBT 中各含量进行比较研

为球形红细菌转化槲寄生化学成分和转化机制研究奠

定基础

1

仪器与试剂

1.1

药材

由亳州市中药饮片厂加工,东北产地,并经山西医科大

学药学院中药学教研室高建平教授鉴定为桑寄生科槲寄生

属植物槲寄生

[V. coloratum (Kom.) Nakai]。

药材标本保存于

山西医科大学药学院中药学教研室。

1.2

培养基

[5]

乙酸钠

1 640 mg,CaCl

2

·2H

2

O 75 mg,MgSO

4

·7H

2

O 200 mg,

EDTA 20 mg,

酵母膏

1 000 mg, K

2

HPO

900 mg,(NH

4

2

SO

4

1 320 mg,KH

2

PO

4

600 mg,FeSO

4

·7H

2

O 1 118 mg,

微量元素

1 ml ,

去离子水

1 000 ml(pH 6.8~7.2)。

1.3

菌种

紫色非硫菌群红细菌属的球形红细菌(rhodobacter

sphaeroides),

由山西大学光合细菌研究室分离鉴定保藏

液含菌数

8.0×10

8

/ml。

1.4

主要仪器及试剂

UV 2802

型紫外可见分光光度计

美国尤尼柯

);

齐墩果

酸对照品

中国药品生物制品检定所

批号

:110709 -

200304),

其他试剂均为分析纯

槲寄生各提取物及各转化液

样品

见表

1。

1 槲寄生各提取物及各转化液样品表

2

方法与结果

2.1

固定化球形红细菌的制备

将已培养好的球形红细菌培养液在

5 000 r/min

下离心

30 min,

菌体用生理盐水洗涤

2

次,收集湿菌体。将终浓度为

10%(g/g)

的聚乙烯醇(PVA)加水加热溶解,冷却到35℃,加

入终浓度为

30%(g/g)

的湿菌体,搅匀,注射器滴入 pH 值为

6.5(

NaOH

调节)的饱和硼酸水溶液中形成直径为 3 mm

左右的固定化球形红细菌细胞,将形成的小球放入4℃冰箱中固定化

18 h,

蒸馏水洗涤

3

次,培养液中活化 24 h,待用

[4]

2.2

三萜类化合物的测定及对比研究

[5-9]

2.2.1 对照品溶液的配制精密称取齐墩果酸对照品 20 mg,

置于

100 ml

容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即

得浓度为

0.2 mg/ml

的齐墩果酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制取 10 ml 待测样品溶液,减压蒸干,加乙醚适量回流提取至提取液无色,挥干溶剂,加甲醇稀

释至刻度,摇匀。因样品中总三萜含量相差很大,如果不在线

性范围内,做适当稀释后测定。

2.2.3 最大吸收波长的确定分别取经显色后的对照品及供

试品溶液,在 200~800 nm 范围内扫描。结果表明,样品、对照品均在

535 nm

处有最大吸收

故选择

535 nm

作为测定波

2.2.4 专属性试验取经显色后的常规光合细菌培养基(即阴

性对照

,按“1.2” 项下方法配制),在 200~700 nm 范围内扫

结果在

535 nm

处没有吸收

说明选择

535 nm

作为测定

波长

,阴性对照无干扰。

2.2.5 标准曲线及线性范围的考察精密吸取上述对照品溶

0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml,

分别置具塞的试管中

,挥去溶

剂,准确加入 5%的香草醛-冰醋酸溶液和 1.00 ml 高氯酸,

混匀

60℃

恒温水浴中加热

15 min,

冰水浴中冷却至室

加入

5.00 ml

的冰乙酸

转移至

10 ml

量瓶中

加乙酸乙

酯稀释至刻度

摇匀

浓度用

C

表示

),

535 nm

处测定吸光

度(A)。线性方程为 A=21.988C-0.072,相关系数 r=0.989 5,线性范围为

2~12 μg。

2.2.6 精密度试验取对照品溶液 0.4 ml,按“2.2.5”项下方法显色

,连续测定 5 次,测得含量的 RSD=1.13% ,表明分析方

法精密度良好

2.2.7 重现性试验取同一批样品 5 份,按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液

,按“2.2.5”项下方法测定,测得含量的 RSD=

3.12 %,

表明分析方法重现性良好

2.2.8 稳定性试验取经显色后的供试品溶液,在 1 h 内每隔

10 min

测吸光度

,30 min

内测得含量的

RSD=3.65 %,

后吸光度相差很大

,故测定应该在显色后 30 min 内测定。

2.2.9 加样回收率试验取已知总三萜含量的培养液 5 ml,分

别加入对照品溶液

3、5、7 ml。

“2.2.2”

项下方法配制供试品

溶液

,按“2.2.5”项下方法测定,计算回收率。见表 2。

2 回收率测定结果(n=3)

2.2.10 样品含量测定及比较取样品溶液分别制备供试品溶

,在 535 nm 处测定吸光度,如超出线性范围,稀释至适当

倍数测定,表 1 中 1~9 号样品总三萜类含量(n=3)分别为

1.80、0.22、4.34、4.44、

2.10、0.22、0.18、0.24、0.01 mg/ml。3

讨论

本研究结果显示,槲寄生水提取液(样品 2)及槲寄生水

提取液的球形红细菌转化液(样品 6、7、8),其总三萜含量都

很低,说明水不能将槲寄生药材中的三萜类提取完全;75%

的乙醇提取、半量常规培养基、游离球形红细菌细胞培养,所

得培养液(样品 3)总三萜含量和槲寄生 75%的乙醇提取液

(样品 1)相比增加 141%,说明经过球形红细菌转化可以增

加槲寄生提取液中的总三萜的含量;样品 4 和样品 3 相比,

总三萜含量稍有增加,说明固定化球形红细菌在一定条件下

有利于样品中总三萜类化合物的转化,但球形红细菌固定化

后不适合药用,需要进一步考虑;另外,样品 4 和样品 5 中总

三萜含量相比增加

111%,

说明培养液中不添加常规培养基,

适合固定化球形红细菌对槲寄生药材中三萜类化合物的转

,使总三萜的含量增加。由此可见,在不同的条件下,对各

种类型化合物的最佳转化条件是不同的

也体现了中药全成

分生物转化的复杂性

。本文建立槲寄生及球形红细菌转化槲

寄生培养液中总三萜类化合物的含量测定方法

并对槲寄生

PSBT

中各含量进行比较研究

为球形红细菌转化槲寄生

化学成分和转化机制研究奠定基础

[

参考文献

]

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010: 350.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

样品序号培养方式

75%的乙醇提取物制剂,以槲寄生原药材计浓度为 0.2 g/ml

水提取物制剂,以槲寄生原药材计浓度为 0.2 g/ml

75%的乙醇提取,以槲寄生原药材计浓度为 0.2 g/ml,半量常

规培养基

游离球形红细菌细胞培养

75%的乙醇提取,以槲寄生原药材计浓度为 0.2 g/ml,无常规

培养基,固定化球形红细菌细胞培养

75%的乙醇提取,以槲寄生原药材计浓度为 0.2 g/ml,半量常

规培养基,固定化球形红细菌细胞培养

水提取

以槲寄生原药材计浓度为

0.2 g/ml,半量常规培养基,

游离球形红细菌细胞培养

水提取,以槲寄生原药材计浓度为 0.2 g/ml,无常规培养基,

固定化球形红细菌细胞培养

以槲寄生原药材计浓度为

0.2 g/ml,半量常规培养基,

固定化球形红细菌细胞培养

纯球形红细菌培养液

1.10

1.10

1.10

培养液中总

三萜的量(mg)

加入齐墩

果酸的量(mg)

0.60

1.00

1.40

测得量

(mg)

1.72

2.07

2.54

回收率

(%)

103.33

97.00

103.86

RSD

(%)

1.98

2.51

2.98

302011 年 12 月第 8 卷第 35 期

·实验研究·

CHINA MEDICAL HERALD 中国医药导报

[2] 秦娟,李利华,杨官娥,等.光合细菌转化复方决明子口服液中蒽醌类成

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山西大学

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[J].实用医技杂志,2005,12(11):3326.

(收稿日期:2011-07-14)

热原检查实质上就是内毒素的限量检查。鲎试剂法对内

毒素检查具有专一

、灵敏、快速简便的特点,但目前药典规定

的品种尚有限

,因此,扩大应用成了广大药检人员普遍重视

的问题

[1]

。本文根据《中国药典》2010 年版二部附录XI E“细

菌内毒素检查法”

[2]

中所述的药品细菌内毒素的检查方法及

其干扰试验的基本原理,对注射用法莫替丁的细菌内毒素检

查可否限值提高进行了探索性研究

,文中提供了分别来自同

一厂家的

3

批供试品在两个厂家鲎试剂下的干扰试验数据,

证实了本品种细菌内毒素检查限值提高的可行性。同时,运

用相同的方法检查了不同厂家的

17

批供试品,检查结果均

合格。现将研究过程报道如下:

1

仪器与试药

1.1

实验材料及药品

细菌内毒素检查用鲎试剂(购于广东湛江安度斯生物有

限公司,批号:1008202,灵敏度:0.125 EU/ml,规格:0.1 ml/支),细菌内毒素检查用水(BET 水,购于广东湛江安度斯生物有

限公司,批号:1003080,规格:5.0 ml/支);细菌内毒素检查用鲎试剂

(购于广东湛江博康海洋生物有限公司,批号:

1009030,

灵敏度:0.125 EU/ml,规格:0.1 ml/支)。细菌内毒素

标准品(购自中国药品生物制品检定所,批号:150601-200968,效价:150 EU/支)。注射用法莫替丁(哈药集团三精加滨药业有限公司生产,批号:20100111、20100303、20100312)。

1.2

仪器

旋涡振荡器(IKA-MS-1);恒温水浴箱(德国 Julabo 19A)。

2

方法与结果

2.1

鲎试剂灵敏度(λ)的复核

上述两个批号鲎试剂经由细菌内毒素标准品标定,结果

均在

0.5λ

b

~2.0λ

b

(λ

b

为标准灵敏度)之间,符合相关规定,可

用于实验

2.2

样品细菌内毒素限值(L)的确定

参考《中国药典》2010 年版二部附录XI E“细菌内毒素

检查法”

[2]

,参考注射用法莫替丁的临床实际应用情况,本品

成人临床日常用量为每天

40 mg/60 kg,

根据公式

L=K/M,

K

为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以

注射用法莫替丁细菌内毒素检查法研究

陈琪

广东省药品检验所药理室

广东广州

510180

[

摘要

]

目的

:建立注射用法莫替丁细菌内毒素检测法。方法:参照《中国药典》2010 版细菌内毒素检查法进行干扰实

验。结果:注射用法莫替丁稀释至 0.06 mg/ml 后对细菌内毒素检查无干扰作用。结论:细菌内毒素检查法用于注射用

法莫替丁热源检查可靠适用

[

关键词

]

注射用法莫替丁

;细菌内毒素;干扰实验

[

中图分类号

] R927.12 [

文献标识码

] A [

文章编号

] 1673-7210(2011)12(b)-031-03

Study on bacterial endotoxins test for Famotidine for injection

CHEN Qi

Department of Pharmacology, Guangdong Institute for Drug Control, Guangdong Province, Guangzhou 510180, China

[Abstract] Objective: To establish a detecting method for the bacterial endotoxin in the Famotidine for injection. Meth-

ods: The interference test was conducted with reference to Chinese Pharmacopia (2010 Edition) on BET. Results: There was

no interfere effect in the detection for bacterial endotoxin in the Famotidine for injection which was diluted to 0.06 mg/ml.

Conclusion: It is reliable and applied for bacterial endotoxin test on pyrogen in Famotidine for injection.

[Key words] Famotidine for injection; Bacterial endotoxin; Interference test

[作者简介] 陈琪(1979-),女,药理学硕士,副主任科员,主管药师,从事

药品检验研究工作。

31

DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理

DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理 实质是基因重组 R型活肺炎双球菌(受体菌)在对数期后期(生长后期)约40分钟内处于“感受态”,吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时,R 型活肺炎双球菌(受体菌)细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白,它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分,从而使细胞表面的DNA受体显露出来(也可能是一种自溶酶,可特异性地结合双链DNA)。被加热杀死的S型肺炎双球菌(供体菌)自溶,释放出自身的DNA片段(已经失活,但双链结构尚存在,分子量小于1×107,约含15个基因),称为“转化因子”。当“转化因 子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌(受体菌)时,就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌(受体菌)细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合,在位点上进一步发生酶促分解,形成平均分子量为4-5×106的DNA片段,然后双链拆开,其中一条降解,另一条单链逐步进入细胞,与受体菌染色体组上的同源区段配对,并使受体染色体组的相应单链片段被切除,从而将其替换,于是形成一个杂种DNA区段(它们间不一定互补,故可呈杂合状态)。随着受体菌染色体组进行复制,杂合区段分离成两个,其中之一类似供体菌,另一类似受体菌。当细胞分裂后,此染色体发生分离,于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化,其实质是基因重组。 转化之所以会发生: 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对,形成杂合细菌,通过分裂生殖形成R型和S型两种后代,不象许多人认为的(R型直接变成S 型); 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态,保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生:S型有荚膜,无感受态,不能作为受体菌,若人为除去荚膜,培养出无荚膜的后代,它就同时丧失了毒性,变成R型,当然就会有了感受态。

第二十一章 萜类和甾族化合物

第二十一章萜类和甾族化合物 1.找出下列化合物的手性碳原子,并计算一下在理论上有多少对映异构体? (1)α-蒎烯(2)2-α-氯菠 (3)苧(4)薄荷醇 (5)松香酸(6)可的松 (7)胆酸 答案: 解:

2.找出下列化合物的碳干怎样分割成异戊二烯单位:(1)香茅醛 (2)樟脑 (3)蕃茄色素 (4)甘草次酸

(5)α-山道年 答案: 解: 3.指出用哪些简单的化学方法能区分下列各组化合物? (1)角鲨烯、金合欢醇、柠檬醛和樟脑; (2)胆甾醇、胆酸、雌二醇、睾丸甾酮和孕甾酮 答案: 解: ①首先水解,各加钼酸铵,黄色沉淀为金合欢醇,其余三者加 Tollen试剂,析出Ag的为柠檬醛,其余二者加溴水,褪色者为角鲨烯,最后为樟脑。

4.萜类β-环柠檬醛具有分子式C10H16O,在235nm处(ε=12500)有一吸收峰。还原则得C10H20,与拖伦试剂反应生成酸(C10H16O2);把这一羧酸脱氢得间二甲苯、甲烷和二氧化碳。把C10H20脱氢得1,2,3-三甲苯。指出它的结构式。提示:参考松香酸的脱氢反应。 答案:略 5.β-蛇床烯的分子式为C15H24,脱氢得1-甲基-7-异丙基萘。臭氧化得两分子甲醛和C13H20O2。C13H20O2与碘和氢氧化钠液反应时生成碘仿和羧酸C12H18O。指出β-蛇床烯的结构式。 答案: 解: 故此化合物含氢化萘的骨架,臭氧化得两分子甲醛,必须具有两,所以此化合物的可能结构式为:

6.在薄荷油中除薄荷脑外,还含有它的氧化产物薄荷酮C10H18O。薄荷酮的结构最初是用下列合成方法来确定的: β-甲基庚二酸二乙酯加乙醇钠,然后加H2O得到B,分子式为C10H16O3。B加乙醇钠,然后加异丙基碘得C,分子式为C13H22O3。C加OH-,加热;然后加H+,再加热得薄荷酮。 (1)写出上列合成法的反应式; (2)根据异戊二烯规则,哪一个结构式更与薄荷油中的薄荷酮符合? 答案: 解: 7.溴对胆甾醇的反式加成能所生成的两种非对映体产物是什么?事实上其中一种占很大优势(85%)。试说明之。 答案: 解:

萜类化合物解析

一、萜类化合物概述 萜类化合物(Terpenoids)是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称[4]。萜类化合物中的烃类常单独称为萜烯。萜类化合物除以萜烯的形式存在外,还以各种含氧衍生物的形式存在,包括醇、醛、羧酸、酮、酯类以及甙等。萜类化合物在自然界中分布广泛,种类繁多,估计有1万种以上,是天然物质中最多的一类。 萜类化合物的分子结构是以异戊二烯为基本单位的,因此其分类依据主要是以异戊二烯单位数目的不同为标准来进行。开链萜烯的分子组成符合通式(C5H8)n(n≥2),含有两个异戊二烯单位的称为单萜,含有三个异戊二烯单位的称为倍半萜,含有四个异戊二烯单位的则称为二萜(图1),以此类推[4]。倍半萜约有7 000多种,是萜类化合物中最大的一类[5]。二萜类以上的也称“高萜类化合物”,一般不具挥发性[6]。此外,有的萜类化合物分子中具有不同的碳环数,因此又进一步区分为链萜、单环萜、双环萜、三环萜等。其中,单萜和倍半萜及其简单含氧衍生物是挥发油的主要成分,而二萜是形成树脂的主要成分,三萜则以皂甙的形式广泛存在。 萜类化合物在植物界中普遍存在[4]。常见含萜类化合物的植物类群有:蔷薇科(Rosaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、天南星科(Araceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、萝科(Asclepi-adaceae)、莎草科(Cyperaceae)、禾本科(Gramineae)、柏科(Cu-pressaceae)、杜鹃科(Ericaceae)、木犀科(Oleaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、樟科(Lauraceae)、胡椒科(Piperaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、马兜铃科(Aristolochiaceae)、芸香科(Ru-taceae)、唇形科(Labiatae)、菊科(Compositae)、松科(Pinaceae)、伞形科(Umbelliferae)、桃金娘科(Myrtaceae)等[7]。 1陈晓亚,叶和春.植物次生代谢及其调控.见:李承森主编.植物学进展(第一卷).北京:高等教育出版社,1998.293~304 2杜近义,胡国赋,秦际威.植物次生代谢产物的生态学意义.生学杂志,1999,16(5):9~10 3陈晓亚,刘培.植物次生代谢的分子生物学及基因工程.生命学,1996,8(2): 8~9 4肖崇厚主编.中药化学.上海:上海科学技术出版社,1991.323~37 5Bohlmann J, Gilbert MG, Rodney C. Plant terpenoid synthases: Molecular biology and phylogenetic analysis. Proc Nati Acad Sci,1998,95(8):4126~4133 6Langenheim J H. Plant resins. Am Sci,1990(78):16~24 7 谷文祥,段舜山,骆世明.萜类化合物的生态特性及其植物的化作用.华南农业大学学 报,1998,19(4):108~110 二、萜类化合物的分类

大肠杆菌电转化感受态细胞制备.

大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养 2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用 3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时 8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天 9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12.离心,弃上清液

13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散 15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。

(完整版)第十七章萜类和甾体化合物

第十七章 萜类和甾体化合物 萜类化合物(Terpenoids )和甾体化合物(Steroids )广泛存在于自然界中,有的能直接用来治疗疾病,有的是合成药物的原料,因此它们与药物的关系非常密切。 第一节 萜类化合物 萜类化合物多是从植物提取得到的香精油(挥发油)的主要成分。如:柠檬油、松节油、薄荷油等。它们多是不溶于水,易挥发,具有香味的油状物质,有一定的生理及药理活性,如祛痰、止咳、驱风、发汗和镇痛等作用。广泛用于香料和医药等。 一、结构与分类 (一)结构及异戊二烯规律 萜类化合物是由异戊二烯(Isoprene )作为基本骨架单元,可以看成是由两个或两个以上异戊二烯单位以头尾相连或互相聚合而成,这种结构特征称为“异戊二烯规律”。因此,萜类化合物是异戊二烯的低聚合物以及它们的氢化物和含氧衍生物的总称。 C CH 2 CH CH 3 CH 2 1 23 4 头 尾头 尾 头 尾 头 尾 头 尾 头 尾 异戊二烯 月桂烯 柠檬烯 月桂烯是两分子异戊二烯头尾相连;而柠檬烯是两分子异戊二烯之间的1,2和1,4加成。(一分子异戊二烯用3,4位双键与另一分子异戊二烯进行1,4加成)。所以,异戊二烯规律在萜类成分的结构测定中具有很大应用价值。 (二)分类 萜类化合物根据分子中所含异戊二烯骨架的多少可分为单萜、倍半萜、二萜等。见表19-1。

表19-1 萜类化合物的分类 异戊二烯单元数碳原子数类别 2 10 单萜类 3 15 倍半萜 4 20 二萜类 6 30 三萜类 8 40 四萜类 >8 >40 多萜类 二、单萜类化合物 单萜类化合物是有两个异戊二烯单元构成。根据两个异戊二烯单元的连接方式不同,单萜有可以分成为链状单萜、单环单萜和双环单萜。 (一)链状单萜化合物 链状单萜类化合物具有如下的碳架结构: 这是两个异戊二烯头尾相连而成。很多链状单萜都是香精的主要成分,例如:月桂油中的月桂烯、玫瑰油中的香叶醇、橙花油中的橙花醇、柠檬油中的柠檬醛(α-柠檬醛和β-柠檬醛)、玫瑰油及香茅油中的香茅醇等。它们很多是含有多个双键或氧原子的化合物,其结构如下: H CH2OH CH2OH H H CHO CHO H CH2OH 月桂烯香叶醇橙花醇α-柠檬醛β-柠檬醛香茅醇(Myrcene)(Geraniol)(Nerol)(Geranial)(Neral)(Citronellol)这些链状单萜都可以用来制备香料,其中柠檬醛还是合成维生素A的重要原料。 (二)单环单萜类化合物

R型细菌如何转化成S型细菌

R型细菌如何转化成S型细菌 R型活肺炎双球菌(受体菌)在对数期后期(生长后期)约40分钟内处于“感受态”,吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时,R型活肺炎双球菌(受体菌)细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白,它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分,从而使细胞表面的DNA受体显露出来(也可能是一种自溶酶,可特异性地结合双链DNA)。被加热杀死的S型肺炎双球菌(供体菌)自溶,释放出自身的DNA片段(已经失活,但双链结构尚存在,分子量小于1×107,约含15个基因),称为“转化因子”。当“转化因子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌(受体菌)时,就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌(受体菌)细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合,在位点上进一步发生酶促分解,形成平均分子量为4-5×106的DNA片段,然后双链拆开,其中一条降解,另一条单链逐步进入细胞,与受体菌DNA的同源区段配对,并使受体DNA的相应单链片段被切除,从而将其替换,于是形成一个杂种DNA区段(它们间不一定互补,故可呈杂合状态)。随着受体菌DNA进行复制,杂合区段分离成两个,其中之一类似供体菌,另一类似受体菌。当细胞分裂后,此DNA发生分离,于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化,其实质是基因重组。 转化之所以会发生: 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对,形成杂合细菌,通过分裂生殖形成R型和S型两种后代,不象许多人认为的(R型直接变成S型); 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态,保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生:S型有荚膜,无感受态,不能作为受体菌,若人为除去荚膜,培养出无荚膜的后代,它就同时丧失了毒性,变成R型,当然就会有了感受态。 三、真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同,不会发生转化(转化本身只发生在同种菌株间或近缘菌株间)。我们可以放心去吃想吃的东西,包括被加热杀死的S型肺炎双球菌。 四、S型可以变成R型吗?当然可以!产荚膜细菌由于有黏液物质,菌落表面湿润、有光泽、黏液状,称光滑型—S型(smooth);无荚膜细菌由于无黏液物质,菌落表面干燥、粗糙,称粗糙型—R型(rough)。自然状态下通过基因突变来完成,不是转化。人工方法是诱变,物理、化学方法都行,变过来的还能再变回。

遗传性球形红细胞增多症

遗传性球形红细胞增多症临床路径 (2017年版) 一、遗传性球形红细胞增多症临床路径标准住院流程 (一)适用对象。 第一诊断为遗传性球形红细胞增多症 (二)诊断依据。 根据《血液病诊断及疗效标准》(第三版,科学出版社) 1 病史 应仔细询问病史,注意发病时年龄及家族调查,75%的病例有阳性家族史。 2临床表现 2.1 贫血轻重不等,于再生障碍危象或溶血危象时加重,多表现为小细胞高色素性贫血。 2.2 黄疸或轻或重,呈间歇性;详细询问病史,多自幼即反复发作。 2.3 脾脏可轻至重度肿大,多同时有肝肿大,常有胆囊结石。 2.4 约75%的病例有阳性家族史,多呈常染色体显性遗传。 3 实验室检查 3.1 具备溶血性贫血的实验室检查特点,红细胞MCHC增高。 3.2 外周血涂片可见胞体小、染色深,中心淡染区消失的小球形红细胞,多在10%以上(正常人<5%),多可达70%,也有约20%的患者缺乏典型的球形红细胞。

3.3 红细胞渗透脆性试验(OF):正常人开始溶血0.42%~0.46%,完全溶血 0.28%~0.32%。本症多于0.50%~0.75%开始溶血,0.4%完全溶血。 3.4自溶试验(48小时):溶血>5%,温育前先加入葡萄糖或ATP可明显减少溶血。 3.5酸化甘油溶血试验(AGLT50):阳性(150秒以内)。 3.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行红细胞膜蛋白分析:部分患者可见收缩蛋白等膜骨架蛋白缺少。 3.7 伊红-5’-马来酰亚胺(EMA)流式检测 (三)进入路径标准。 1. 第一诊断符合遗传性球形红细胞增多症编码(ICD-10: D58.002) 2. 当患者同时具有其他疾病诊断,但在住院期间不需要特殊处理,也不影响第一诊断的临床路径流程实施时,可以进入路径。 (四)标准住院日10天内。 (五)住院期间的检查项目。 1.必需的检查项目 1.1常规:血常规(含网织红细胞计数及白细胞分类)、外周血涂片瑞氏染色(观察成熟红细胞形态)、尿常规+尿Rous、大便常规+潜血、血型、输血相关检查(肝炎病毒全套、HIV 病毒、梅毒)。

遗传性球形红细胞增多症(专业知识值得参考借鉴)

本文极具参考价值,如若有用请打赏支持我们!不胜感激! 遗传性球形红细胞增多症(专业知识值得参考借鉴) 一概述遗传性球形红细胞增多症(HS)是一种红细胞膜蛋白基因异常所致的溶血性疾病,是一种家族遗传性疾病。HS是先天性红细胞膜异常疾病中最常见的一种,此病于一百多年前就已经报道。HS临床特征为程度不一的的溶血性贫血、间歇性黄疸和脾肿大;血液学特征为外周血细胞涂片可见到较多的小球形红细胞;实验室检查为红细胞渗透脆性试验增高。HS见于世界各地,男女皆可发病。国内目前无确切的发病率统计。在北方地区,HS居遗传性溶血性贫血的首位。 二病因及发病机制HS大多数患者家族中有同样病例,呈常染色体显性遗传。目前发现在第8号染色体短臂缺失。HS约1/4的患者缺乏明确的家族史,可能与基因突变有关。少数患者常染色体隐性遗传往往是合并发生新的突变而发病。 基本的发病机制是组成红细胞膜的蛋白基因异常,主要涉及的是膜收缩蛋白、锚蛋白、区带4.2 蛋白和区带3蛋白。这些红细胞膜上蛋白基因的异常最终使红细胞膜脂质失去膜骨架的支持,稳定性减退,结果使红细胞表面积减少,是形成小球形红细胞的基础。 脾脏是小球形红细胞的主要破坏器官。脾脏破坏球形红细胞的基本因素是:①红细胞内在缺陷而形成球形;②脾脏结构的完整。 三临床表现贫血、黄疸、脾脏肿大是HS最常见的临床表现。三者可同时存在,也可单独发生。临床根据不同的表现将HS分为:典型HS、轻型HS、无症状携带者和重型HS。 1.贫血 贫血轻重程度不一,从无症状至危及生命的贫血。常在一些诱因时贫血加重,如各种感染、重体力活动、妊娠等。 2.黄疸 黄疸在新生儿期是最常见的临床表现,发生率在50%,严重者甚至需要换血。 3.脾脏肿大 脾脏肿大程度不一,一般为中度肿大。大多数患者在查体时可触及到脾脏。 四检查1.血常规 血红蛋白和红细胞正常或轻度降低。网织红细胞计数增高,一般多在5~20%。但当发生溶血危象时,网织红细胞计数会降低。

21 萜类和甾族化合物

·237· 第二十一章 萜类和甾族化合物 学习要求: 1.理解萜的涵义;掌握异戊二烯规律和萜的分类。 2.熟悉各类萜的典型化合物的特性及重要用途。 3.熟悉甾族化合物的基本结构和立体结构,了解重要甾族化合物的类型和用途。 萜类和甾族化合物是广泛存在于植物、昆虫及微生物等生物体中的一大类有机化合物。在生物体内有着重要的生理作用。萜类和甾族化合物虽是两类不同的化合物,但有着生源合成方面的密切关系,因而放在一章内进行讨论。 §21-1 萜 类 一、萜的涵义和异戊二烯规律 分子中含C 10以上,且组成为5的倍数的烃类化合物称为萜类。 因分子中含有双键,所以,萜类化合物又称为萜烯类化合物。 萜类化合物是广泛存在于植物和动物体内的天然有机化合物。如从植物中提取的香精油——薄荷油、松节油等,植物及动物体中的某些色素——胡箩卜素、虾红素等等。 研究发现,萜类分子在结构上的共同点是分子中的碳原子数都是5的整倍数。例如: 月桂烯 对薄荷烯 (存在于柠檬,橘子中) 姜烯(存在于姜油中) (存在于月桂子油等中) 松节油( 蒎烯)异樟烯 (存在于松节油等中) (存在于姜油,冷杉等中) α

·238· 上述化合物的碳干骨骼可以看成是由若干个异戊二烯单位主要以头尾相接而成的。 这种结构特点叫做萜类化合物的异戊二烯规律。异戊二烯规则是从对大量萜类分子构造的测定中归纳出来的,所以能反过来知道测定萜类的分子构造。 二、萜的分类、命名 萜类化合物中异戊二烯单位可相连成链状化合物,也可连成环状化合物。 1.分类 根据组成分子的异戊二烯单位的数目可将萜分成以下几类: 1)单萜: 含有两个异戊二烯单位。它包含开链单萜,单环萜,二环单萜三种。 2)倍半萜:含有三个异戊二烯单位的萜。 3)双萜: 含有四个异戊二烯单位的萜。 4)三萜: 含有六个异戊二烯单位的萜。 5)四萜: 含有八个异戊二烯单位的萜。 这些萜类和单萜一样,也有开链和成环之分。 2.命名 IUPAC 规定的系统命名法,较生辟,多接触才能熟练。 我国一律按英文俗名意译,在接上“烷”、“烯”、‘醇“等类名而成。 习惯常用用俗名如樟脑,薄荷醇等。见P 621。 三、萜类化合物 1.单萜 1)开链单萜 C C C C C CH 2C CH 3 CH CH 2 异戊二烯 头尾 异戊二烯单位

遗传性球形红细胞讲稿最终版本

前段时间,我们科室接待了一位面容苍白的患者,因为是我的一个朋友,所以我就留心了一下,结果发现她的血涂片居然是这个样子,大家看,这张血涂片上面的红细胞有什么不一样的地方吗?难道仅仅是颜色深一点吗? 情况要比我们想象的要复杂一些,这些颜色深一点的是球形红细胞,也就是我们这节课的主角。 接下来,我们将从遗传性球形红细胞增多症的概述,发病机理,临床表现,诊断,治疗等方面去了解他。 遗传性球形红细胞增多症(hereditaryspherocytosis)是红细胞先天性膜缺陷引起的溶血性贫血中最常见的一种类型。因外周血中出现球形红细胞而得名, 1、发病率,世界范围内大概是十万分之二十到三十,目前我国没有确切的统计数据; 2、发病年龄段,一般来说,遗传性疾病可以自幼就开始发病,但是他的临床表现的时间,差异很大,任何一个年龄段都会发病,但大概三分之二的患者是在成年以后发病; 3、地域差异,白种人发病率高达两千分之一,没有其他集中发病的区域。 究竟是什么原因让一个圆润饱满,凹凸有致的红细胞变成了一个人人都不喜欢的球状体型,难道是因为减肥不成功吗? 问题出在基因上 遗传性球形红细胞增多症的发病原因是由于基因的缺陷引起红细胞膜的骨架蛋白异常而导致的溶血性贫血目前了解的比较多的主要是8号染色体的异常,红细胞膜蛋白的缺陷涉及到一组膜蛋白,主要有锚蛋白、血影蛋白、带3蛋白、带4.2蛋白等等,这些不同的蛋白对应不同的基因和染色体,目前研究的比较清楚的是锚蛋白,它对应的是ANK1基因的突变,而这个突变,会造成8号染色体短臂的缺失,有40%到65%的几率引起发病,其他致病基因的缺陷尚不明确。 当机体出现异常的球形红细胞,会出现怎样的临床表现呢? 我们大家都知道,脾脏在我们免疫系统中发挥重要的作用,它有一个很重要的功能是清除衰老,变形等异常的红细胞,由于球形红细胞通过能力的减弱,被大量的破坏在脾脏,而这种破坏超过骨髓代偿能力的时候,往往会出现贫血,而红细胞被破坏的产物胆红素超过肝脏处理能力的时候,就会出现黄疸,脾脏也由于红细胞在此破坏、刺激增生而越来越大。 所以,遗传性球形红细胞增多症的临床表现主要是贫血、黄疸和脾脏肿大,但是,他的临床表现差异很大,有的表现的很轻微,往往在体检的时候才发现胆红素轻微升高,完全没有任何临床表现,但也有的人则表现出严重的临床症状,所以他的临床表现差异很大,根据严重程度不同可分为三种类型,轻型、中间型和重型:,轻型多在儿童时期发病,由于儿童骨髓的代偿能力很强,不会出现贫血,这种类型大概占到25%左右;中间型在成年人时期发病,有轻到中度的贫血或者是脾脏的肿大这种类型大概占到三分之二左右;有极少数的病人表现为重型,会有很严重的贫血,还可出现贫血的溶血危象、再生障碍危象,会造成生命危险。 并发症,它主要是长期贫血带来的危害,长期的贫血可以使我们的组织器官处于一个缺氧的状态,可能会导致像心功能不全这些临床表现。再一个就是可能会出现溶血危象,再生障碍危象,严重的甚至会危及生命。 另外一个重要的并发症是容易形成胆石症,由于大量红细胞被破坏,导致胆红素过度的排泄,沉积在胆道里,可以造成胆石的形成。 所以,HS患者的临床表现总结起来就是:贫血,黄疸,脾脏肿大和胆石症等等,但是,这些症状在临床上不具备特异性,因为很多的疾病都可以导致这些症状,那么,我们该怎样去确认它,去诊断它? 所以,重点来了 遗传性球形红细胞增多症的诊断:1、诊断时可以根据它的临床表现进行,它主要是三大症状,贫血、黄疸和脾脏肿大; 2、血常规的检查 HS患者外周血红细胞平均体积(MCV)下降,<80fl 参考值:80-94 fl 红细胞平均血红蛋白浓度MCHC浓度>354g/L 参考值:320-360 g/L 红细胞分布宽度>RDW14% 参考值:0-14% 灵敏度63% 特异度90% 3、外周血细胞涂片,球形红细胞的显著增高,大于20%;这也是这个疾病比较显著的特征, 4、红细胞渗透脆性试验,(Osmotic Fragility test OFT) 他是筛查红细胞膜缺陷的常规试验,本试验测定红细胞对各种浓度低渗溶液的抵抗力。在低渗盐水中,水分透过细胞膜,使红细胞逐渐胀大破坏。红细胞的渗透性主要取决于红细胞的表面积与体积之比。表面积大而体积小者对渗盐溶液的抵抗力较大,反之则抵抗力较小(脆性增加)。球形红细胞表面积/体积比值减少,对低渗溶液特别敏感,脆性显著增加。

有机化学(第四版)第二十一章 萜类和甾族化合物

有机化学(第四版)第二十一章萜类和甾族化合物1.找出下列化合物的手性碳原子,并计算一下在理论上有多少对 映异构体? (1)α-蒎烯(2)2-α-氯菠 (3)苧(4)薄荷醇 (5)松香酸(6)可的松 (7)胆酸 答案: 解:

2.找出下列化合物的碳干怎样分割成异戊二烯单位:(1)香茅醛 (2)樟脑 (3)蕃茄色素 (4)甘草次酸

(5)α-山道年 答案: 解: 3.指出用哪些简单的化学方法能区分下列各组化合物? (1)角鲨烯、金合欢醇、柠檬醛和樟脑; (2)胆甾醇、胆酸、雌二醇、睾丸甾酮和孕甾酮 答案: 解: ①首先水解,各加钼酸铵,黄色沉淀为金合欢醇,其余三者加 Tollen试剂,析出Ag的为柠檬醛,其余二者加溴水,褪色者为角鲨烯,最后为樟脑。

4.萜类β-环柠檬醛具有分子式C10H16O,在235nm处(ε=12500)有一吸收峰。还原则得C10H20,与拖伦试剂反应生成酸(C10H16O2);把这一羧酸脱氢得间二甲苯、甲烷和二氧化碳。把C10H20脱氢得1,2,3-三甲苯。指出它的结构式。提示:参考松香酸的脱氢反应。 答案:略 5.β-蛇床烯的分子式为C15H24,脱氢得1-甲基-7-异丙基萘。臭氧化得两分子甲醛和C13H20O2。C13H20O2与碘和氢氧化钠液反应时生成碘仿和羧酸C12H18O。指出β-蛇床烯的结构式。 答案: 解: 故此化合物含氢化萘的骨架,臭氧化得两分子甲醛,必须具有两,所以此化合物的可能结构式为:

6.在薄荷油中除薄荷脑外,还含有它的氧化产物薄荷酮C10H18O。薄荷酮的结构最初是用下列合成方法来确定的: β-甲基庚二酸二乙酯加乙醇钠,然后加H2O得到B,分子式为C10H16O3。B加乙醇钠,然后加异丙基碘得C,分子式为C13H22O3。C加OH-,加热;然后加H+,再加热得薄荷酮。 (1)写出上列合成法的反应式; (2)根据异戊二烯规则,哪一个结构式更与薄荷油中的薄荷酮符合? 答案: 解: 7.溴对胆甾醇的反式加成能所生成的两种非对映体产物是什么?事实上其中一种占很大优势(85%)。试说明之。 答案: 解:

红细胞形态改变.

红细胞形态改变 1、正常形态与大小 正常红细胞为淡红色双凹圆盘形,大小较一致,直径6~9μm,中央淡染区的大小相当于细胞直径的1/3~2/5左右。 2、形态异常 (1)球形红细胞增多:涂片中此种细胞超过20%才有诊断价值,见于遗传性球形细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血。 (2)椭圆性红细胞增多:一般高于25 %~50%才有诊断价值,主要见于遗传性椭圆性细胞增多症。 (3)口形红细胞:中央淡染区呈扁平裂缝状,状如微张口的嘴形或鱼口状,超过10%有诊断价值,常见于遗传性口形红细胞增多症,少量可见于弥漫性血管内凝血及酒精中毒。 (4)靶形红细胞:中央淡染区扩大,但中心部位又有部分色素存留而深染,形似射击的靶标,见于珠蛋白生成障碍性贫血、异常血红蛋白病、缺铁性贫血等。 (5)镰形红细胞:状似镰刀,见于镰形红细胞性贫血。 (6)泪滴形红细胞:呈泪滴状,见于骨髓纤维化、珠蛋白生成障碍性贫血、溶血性贫血等。 (7)棘细胞及刺细胞:棘细胞外周呈钝锯齿状突起,刺细胞外周呈不匀称、不规则的棘刺状突起,主要见于棘形细胞增多症(先天性无β脂蛋白血症)。

(8)裂细胞:指红细胞发生各种明显的形态学改变,可呈梨形、新月形、逗点型、三角形、盔形等,见于弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、心血管创伤性溶血性贫血。 3、大小异常 红细胞大小异常包括:①小红细胞,直径<6 μm,见于小细胞低色素性贫血,如缺铁性贫血;②大红细胞,直径>10μm,见于溶血性贫血、急性失血性贫血等;③巨红细胞,直径>15μm,常见于巨幼细胞贫血;④红细胞大小不均,直径相差可达一倍以上,见于缺铁性贫血、溶血性贫血、失血性贫血及巨幼细胞贫血等,其中以巨幼细胞贫血最为明显。

萜类和甾族化合物

第二十一章萜类和甾族化合物 一、教学目的和要求 (1)掌握萜类化合物的结构特征及重要萜类化合物(樟脑、冰片、薄荷醇、法尼醇)。 (2)掌握甾族化合物的结构特征及重要甾族化合物(胆甾醇、可的松、胆甾酸)。 二、教学重点与难点 萜类及甾族化合物的结构特征 三、教学方法和教学学时 1、教学方法:以课堂讲授为主,结合必要的课堂讨论。教学手段以板书和多媒体相结合。 2、教学学时:10学时 四、教学内容 第一节萜类 一、萜的涵义和异戊二烯规律 二、萜的分类,命名 三、单萜 四、倍半萜 五、双萜 六、三萜类 七、四萜类 第二节甾体化合物 一、甾的基本结构和命名 二、甾体化合物的立体结构:甾体化合物碳架的构型,甾体化合物碳架的构象 三、甾醇类 四、胆酸 五、甾型激素 五、课后作业、思考题 习题:2、6。

萜类和甾族化合物是广泛存在于植物、昆虫及微生物等生物体中的一大类有机化合物。在生物体内有着重要的生理作用。萜类和甾族化合物虽是两类不同的化合物,但有着生源合成方面的密切关系,因而放在一章内进行讨论。 §21~1 萜 类 一、萜的涵义和异戊二烯规律 分子中含C 10以上,且组成为5的倍数的烃类化合物称为萜类。 因分子中含有双键,所以,萜类化合物又称为萜烯类化合物。 萜类化合物是广泛存在于植物和动物体内的天然有机化合物。如从植物中提取的香精油——薄荷油、松节油等,植物及动物体中的某些色素——胡箩卜素、虾红素等等。 研究发现,萜类分子在结构上的共同点是分子中的碳原子数都是5的整倍数。例如: 上述化合物的碳干骨骼可以看成是由若干个异戊二烯单位主要以头尾相接而 成的。 这种结构特点叫做萜类化合物的异戊二烯规律。异戊二烯规则是从对大量萜类 分子构造的测定中归纳出来的,所以能反过来知道测定萜类的分子构造。 月桂烯 对薄荷烯 (存在于柠檬,橘子中) 姜烯(存在于姜油中) (存在于月桂子油等中) 松节油( 蒎烯)异樟烯 (存在于松节油等中) (存在于姜油,冷杉等中) αC C C C CH 2CH 3 CH CH 2 异戊二烯 头尾异戊二烯单位

转化摇菌提质粒

转化摇菌提质粒 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

一、感受态细胞XL-1转化实验 (1)5ng DNA+100μl感受态细胞XL-1于离心管中,混匀,冰浴30min。 (2)42o C, 45s。 (3)冰浴2min。 (4)涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。 (5)放入37 o C恒温孵育箱,待液体吸收完全后,倒置孵育16-18h。 (6)保鲜袋密封后,倒置放于4o C冰箱保存。 二、菌液的培养与质粒的提取 1.每个样本挑取5个细菌,进行摇菌,提取质粒。(一个细菌一支管) 在50ml离心管里加入5ml液体LB和5μl 50mg/ml氨苄青霉素,用200μl枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆,枪头打入离心管中,置于37o C摇床,250r/min培养16~18h,质粒提取。(老师,这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌,还是直接挑取5个菌落直接摇菌) 质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取,步骤如下): (1)吸附柱中加入500μl平衡液BL,13000rpm离心1min。倒掉收集管中废液,吸附柱放回收集管,备用。 (2)收集5ml菌液,13000rpm/min, 离心10min,收集沉淀。 (3)加入500μl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 (4)加入500μl溶液P2, 温和地上下翻转6~8次,使菌体充分裂解。(5)加入700μl溶液P3, 立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色沉淀。 (6) 13000rpm/min离心10min,收集上清分次加入过滤柱中(800μl/次)。(7) 13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800μl)。 (8) 13000rpm离心1min,弃掉滤液。 (9)加入500μl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。

细菌转化,单克隆挑选及摇菌

细菌转化,单克隆挑选及摇菌 1.接种50~100ul菌液于5 ml LB试管中,37℃250转/分震荡约3小时,至OD600≈时停止振荡(透过管能看到手指要挑选细菌活力强时) 2、取离心管与菌液放冰浴冷却15min 3.将细菌转移至的离心管中,4℃,4000转/分离心15min(防止菌体破裂),弃上清液 4.以1ml (倍菌液体积)预冷的CaCl2重悬细菌沉淀,冰浴30min,4℃,4000转/分离心15min,弃上清液 5.用250μl(倍菌液体积)预冷的CaCl2重悬细菌沉淀 质粒DNA加入到感受态细菌中,轻轻旋转几次以混匀内容物,冰上放置30分钟 7.将离心管放入42℃的循环水浴中,90秒 8.将离心管置于冰上,10分钟 9.加入200ulsoc 培养基(加入了葡萄糖等物质,比LB培养基更营养,更利于热激后细菌恢复),200转37℃45min,同时将培养平板放入孵箱 10.用一无菌玻璃推板轻轻将转化的细菌均匀地涂于培养基上。(玻璃推板充分火焰消毒,待充分冷却后再进行涂板,可将推板贴在平板盖内侧,再用手隔板盖感觉温度) 11. 37℃培养箱中正置平板,待液体完全干后再倒置平板,培养16小时,将平板取出4℃放置约2小时后观察。挑选单个肉眼能见菌落,

坐上在平板上做上标记(菌落不易太大,否则有杂菌混入,培养箱中培养不超过16个小时) 12、在超净台内,将细菌挑入LB培养基,一个菌落一支管,180~200转/分钟过夜(12~16个小时,以菌体浑浊为佳)。抽取质粒(抽取质粒时每支LB管也应对应相应的EP管) 备注 LB培养基制备 蛋白胨1%(g/ml) NaCl 1% 酵母粉% 到此配方为LB培养基(液体) 若配制平板则加琼脂粉% 氨苄青霉素的储存浓度是50~100ug/ul,使用时稀释1000倍, 以下步骤在超净台进行, 培养液高压灭菌后,待容器不烫手时加入氨苄,轻摇混匀,倒入平板,每板大约20ml

转化,摇菌,提质粒.

一、感受态细胞XL-1转化实验 (1)5ng DNA+100μl感受态细胞XL-1于1.5ml离心管中,混匀,冰浴30min。 (2)42o C, 45s。 (3)冰浴2min。 (4)涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。 (5)放入37 o C恒温孵育箱,待液体吸收完全后,倒置孵育16-18h。(6)保鲜袋密封后,倒置放于4o C冰箱保存。 二、菌液的培养与质粒的提取 1.每个样本挑取5个细菌,进行摇菌,提取质粒。(一个细菌一支管) 在50ml离心管里加入5ml液体LB和5μl 50mg/ml氨苄青霉素,用200μl枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆,枪头打入离心管中,置于37o C摇床,250r/min培养16~18h,质粒提取。(老师,这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌,还是直接挑取5个菌落直接摇菌) 质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取,步骤如下): (1)吸附柱中加入500μl平衡液BL,13000rpm离心1min。倒掉收集管中废液,吸附柱放回收集管,备用。 (2)收集5ml菌液,13000rpm/min, 离心10min,收集沉淀。 (3)加入500μl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 (4)加入500μl溶液P2, 温和地上下翻转6~8次,使菌体充分裂解。 (5)加入700μl溶液P3, 立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色沉淀。 (6)13000rpm/min离心10min,收集上清分次加入过滤柱中 (800μl/次)。

(7)13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800μl)。 (8)13000rpm离心1min,弃掉滤液。 (9)加入500μl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。(10)加入600μl漂洗液PW, 静置5min, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。 (11)重复步骤10。 (12)13000rpm/min离心2min,彻底去除柱子中残留废液。 (13)将DNA吸附柱放入新的离心管,悬空滴加100μl无菌双蒸水,静置5min。13000rpm/min离心1min,所得到的液体即为高纯度的DNA 溶液,置于-20o C保存。 七.定点突变的鉴定 质粒提取后用限制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.1.6亚克隆 对成功突变的突变体和质粒载体进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳,按照胶回收试剂盒步骤回收载体和目的片段,用T4连接酶进行目的片段和表达载体的连接,产物转化细菌感受态细胞,挑取阳性克隆,按照质粒试剂盒说明书提取质粒,用限制性内切酶进行酶切鉴定,送质粒进行测序鉴定。

八年级上册生物细菌教案

八年级上册生物细菌教案 教学目标: 知识与技能: 1、描述出细菌的形态结构特点。 2、通过与动植物细胞的比较,推测细菌的营养方式 3、结合生活实际,推测细菌的生殖方式。 过程与方法: 通过观察细菌的结构和动植物细胞结构图并进行比较,培养学生的观察能力,分析问题的能力。培养学生应用所学知识解释生活中实际问题的能力。 情感态度与价值观: 通过了解细菌被发现的过程和巴斯德的实验,使学生认识到科学发展离不开实验技术的进步,更要依靠科学家孜孜不倦的追求和严谨求实的科研作风。通过对细菌繁殖方式的学习研究,认识到细菌繁殖速度很快,生活习惯不卫生很容易被细菌感染,从而培养学生良好的卫生习惯。 教学重点:细菌形态结构的特点及细菌的营养方式和生殖方式。 教学难点: 细菌的结构及其与动植物细胞的比较。细菌的营养方式和生殖方式的推测。 教学课时:1课时 教学过程:

一、情境导入 通过复习细菌的分布情况。从生活实例出发,提出一系列问题, 哪里有细菌,你的手上有细菌吗?你的课桌上、书上、钢笔上有细菌吗?我们用肉眼能看到细菌吗? 二、探究新知 (一)细菌的发现 1、质疑过渡:为什么我们时时刻刻在与细菌打交道,却又不了 解细菌呢? (细菌微小,肉眼看不见) 2、学生阅读书本P71的相关内容,从中可以获取以下的重要信息。 ①细菌的发现:17世纪后叶列文虎克 ②微生物学之父——巴斯德(证明细菌的由来并提出巴氏消毒法)。 3、小结:通过阅读,你对于科学的发现有什么新的认识? (二)细菌的形态: 1、质疑过渡:细菌很小,所以我们虽然时时刻刻在接触它们, 却看不到,那么,它们的形态、到底是怎样的呢? 2、屏幕展示细菌形态图片,使学生对细菌的三种形态有一个理 性的认识,然后介绍一些与学生身体健康有关的细菌,如肺炎球菌、大肠杆菌等。 (三)细菌的结构: 1、质疑过渡:细菌的形态不同,但基本结构相同,细菌的结构 怎样呢? 2、展示细菌结构图片。学生就细菌结构进行讨论,总结细菌的 结构的特点。

细菌的转化与平板筛选

实验概要 本实验介绍了细菌的转化与平板筛选的原理及操作步骤。 实验原理 感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp r等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。 重组质粒转化宿主细胞后,还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列,此结构称为lac Z'基因。lac Z'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。任何携带着lac Z'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后,便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶,在IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导后,在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落(半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝)。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z'中的多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽,而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶,也就不能分解Xgal而显蓝色,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。 主要试剂 1. 0.1mol/L CaCl2溶液 2. LB液体培养基及LB固体培养基 3. 氨苄青霉素(Amp):用无菌水配制成100mg/mL溶液,置-20℃冰箱保存。 4. Xgal:将Xgal溶于二甲基甲酰胺,配成20mg/mL,不需过滤灭菌,分装小包装,避光贮存于-20℃。 5. IPTG:取2g IPTG溶于8mL双蒸水中,再用双蒸水补至10mL,用0.22um滤膜过滤除菌,每份1mL,贮存于-20℃。 主要设备 1. 超净工作台

细菌转化实验原理和操作步骤

细菌转化实验原理和操作步骤 转化( transformation )是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程,是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。 关键词:细菌转化细菌转化 一.实验目的 1 .以 pGLO 质粒转化大肠杆菌为例,学习转化的基本原理及方法。 2 .验证 DNA 是遗传物质,加深对中心法则的理解。 二.实验原理 转化( transformation )是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程,是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有 CaCl 2 法 ( 化学转化法 ) 和电转化法。本实验是用 pGLO 细菌转化试剂盒中提供的 pGLO 质粒来转化大肠杆菌,所用方法为 CaCl 2 转化法。 pGLO 质粒: pGLO 质粒上主要含有两个基因,一个为编码绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因,一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外,该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系,转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光,这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。

三.实验材料 受体菌:K12 HB101 质粒: pGLO plasmid 转化液( CaCl2 ) 氨苄青霉素( amp ) 阿拉伯糖( ara ) 培养基:固体 LB 、液体 LB 接种环、移液器等 四.实验步骤 1. 准备平板:每组: 1 块 LB 平板, 2 块 LB/amp 平板, 1 块 LB/amp/ara 平板 2. 准备感受态细胞:用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉,此即感受态细胞。 3. 活化受体细胞:挑取 1 环K12 HB101 菌液,于 LB 培养基上 37 ℃活化16-24h 。 4. 转化: 1)在两只无菌离心管 上分别标 记 +DNA, -DNA 。 2)在上述两管中分别 加入 250 μ l 转化液。 3) 迅速置于冰上。 4)各挑取活化好的受 体菌的一 个单菌落,悬浮于两管 转化液中。 5)在标有 +DNA 的管 中加入一 环质粒 DNA ,而标有 -DNA 的管中不加。 6)将上述两管于冰上 放置 10min 。

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