玄参中多酚类化合物的抗氧化活性研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：刘质净，李丽，王晶，闫静，刘春明
【摘要】目的采用超声法分别以不同提取时间、不同浓度乙醇水溶液和不同极性提取溶剂对玄参中多酚类化合物进行提取。方法采用Folin-Ciocalteu方法测定玄参不同提取物的总多酚含量，并通过DPPH抗氧化活性体外评价体系测定玄参不同提取物的抗氧化活性、清除自由基的能力。结果40%乙醇提取物的总多酚含量最高，而20%乙醇提取物具有最好的清除DPPH自由基的能力。结论玄参中多酚类化合物具有较好的体外抗氧化活性。
【关键词】玄参; 抗氧化活性; 总多酚; DPPH
Abstract：ObjectiveTo study the antioxidant activities of polyphenolics in Scrophularia ningpoensis Hemsl. MethodsFolin-Ciocaileu method was developed for evaluation of the total phenolic content (TPCs) of different extracts, and the free radical 2,2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH˙) assay was used to measure the antioxidant activity of different extracts. ResultsThe
TPCs of 40% ethanol extract showed the highest TPCs, and the 20% ethanol extract had the strongest activity of scavenging free radicals. ConclusionThe polyphenol extracts of Scrophulariae have good antioxidant activity.
Key words：Scrophulariae; Antioxidant activity; Total phenolic ; DPPH
玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，别名元参、黑参、浙玄参、乌元参等。玄参中含有丰富的多酚类化合物[17]。多酚类化合物的主要功能性质是作为许多酶体系的抑制剂或激活剂、金属螯合剂以及自由基清除剂[8，9]。多酚类化合物通过酚羟基的离解和自由基途径产生抗氧化作用[10，11]，是医药、食品、化妆品中很有前景的一类天然抗氧化剂和自由基清除剂。本实验对玄参药材中多酚类化合物的抗氧化活性进行了系统的分析研究，采用Folin-ciocalteu法测定不同提取样品中总多酚的含量，并通过DPPH抗氧化体外评价方法比较不同提取样品清除DPPH自由基的能力，为玄参作为天然抗氧化剂的研究开发提供基础。
1 材料与仪器
玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl药材购于北京同仁堂长春药店;Folin-Ciocalteu 试剂，没食子酸标准品，2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH˙) 等购自Sigma Chemical Co.公司(St. Louis, Mo);实验所用试剂均为分析纯试剂购于北京北化精细化学品有限责任公司;水为超纯水18.2 ΩPa。
Beckman公司DU800型紫外可见分光光度计;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);BS-124S电子天平(Sartorius AG, Sartorius);加样枪(Germany);HS-Z11-Ⅱ电热蒸馏水器(上海跃进医疗器械厂);旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)。
2 方法与结果
2.1 样品提取分离
2.1.1 常温下不同超声时间提取精密称取干燥至恒重的同一批药材粉末5份，分别称取1.997 7，2.001 6，1.996 4，2.009 2，2.000 9 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入80%乙醇50 ml，常温下超声提取30，60，90，120，150 min，静置，放冷，过滤，残渣用提取溶剂洗涤1次，合并滤液，置旋转蒸发仪减压回收溶剂至干，用50%乙醇3 ml溶解，得样品。
2.1.2 常温下不同浓度乙醇提取精密称取干燥至恒重的同一批药材粉末5份，分别取1.996 2，2.007 2，2.001 5，1.997 7，2.001 0 g，置具塞锥形瓶中，分别加入20%，40%，60%，80%，100%乙醇水溶液50 ml，常温下超声提取30 min，静置，放冷，过滤，残渣用提取溶剂洗涤1次，合并滤液，置旋转蒸发仪减压回收溶剂至干，用50%乙醇3 ml溶解，得样品。
2.1.3 常温下不同溶剂提取精密称取干燥至恒重的同一批药材粉末3份，分别取1.997 7，2.000 2，2.000 9 g，置具塞锥形瓶中，分别加入80%乙醇、正丁醇、丙酮50 ml，常温下超声提取30 min，静置，放冷，过滤，残渣用提取溶剂洗涤1次，合并滤液，置旋转蒸
发仪减压回收溶剂至干，用50%乙醇3 ml溶解，得样品。
2.2 抗氧化活性体外分析实验
2.2.1 样品总多酚含量测定样品总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu方法[12], 结果表示为每克样品中含有相当没食子酸的毫克数。吸取0.2 ml一定浓度( 使吸光度值落在标准曲线上) 的样品溶液，加入1 ml 0.5 mol/L的Folin-Ciocalteu试剂, 再加入0.8 ml 7.5% 的碳酸钠溶液充分混合，室温下放置0.5 h, 然后在765 nm下测吸光度。用没食子酸溶液(质量浓度范围为0.020.2 mg/ml)制作标准曲线, Y=9.562 3X-0.133 2(R2=0.999 9)，如图1所示。所有实验重复两次。
2.2.2 DPPH方法测定样品的抗氧化活性DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基，2-2-diphenyl-1-picry-hydrazyl radical)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在波长515nm 处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在波长515nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强、吸光度越小[13，14]。
准确称取DPPH自由基，配置浓度为0.040 76 mg/ml的[DPPH·]乙醇溶液，得到[DPPH·]标准曲线为：Y=18.032X-0.001 6,R2=0.999 3。样品浓度范围为0.000 815-0.040 76 mg/ml，如图2所示。
图1 没食子酸标准曲线
以乙醇为溶剂，配置不同浓度的玄参样品溶液，分别取0.1 ml 样液，加入3.9 ml质量浓度为2.5 mg/100 ml [DPPH·]标准液(现用现配)，以乙醇替代样液为空白。将混合溶液摇匀，用比色皿，在515nm 波长处，测定其在不同时间的吸光度值，根据标准曲线可以换算成[DPPH·]的质量浓度，从而计算出[DPPH·]残留率。根据[DPPH·]残留率和相应的玄参样品添加量，可以绘制样品清除[DPPH·]自由基的曲线。根据[DPPH·]的质量浓度与吸光度的关系曲线，可以将添加自由基清除剂后侧的的吸光度换算为[DPPH·]的质量浓度，从而计算出添加自由基清除剂后的[DPPH·]残留率，其计算公式如下:
[DPPH·]REM=[DPPH·]T/[DPPH·]T=0×100%
其中[DPPH·]T为自由基清除过程中某一时刻[DPPH·]的质量体积分数，[DPPH·]T=0 为[DPPH·]的原始质量体积分数。
根据[DPPH·]残留率与相应玄参提取物的添加量，制作二者的关系曲线，通过线性回归分析可以得到回归方程，而根据回归方程式可以计算出[DPPH·]残留率为50%时玄参样品的添加量即半抑制量(EC50), EC50越小其清除自由基能力越强，引用一个新的参数——自由基清除能力AE(Antiradical efficiency),AE=1/EC50。根据AE的大小判断抗氧化剂清除自由基的能力的大小，AE越大其清除自由基能力越强。
图2 DPPH标准曲线(C：0.000 8150.040 76 mg·ml-1)
3 结果
3.1 Folin-ciocalteu法测定玄参不同提取物中总多酚含量的结
果
3.1.1 玄参不同提取时间样品中总多酚含量的测定从表1可以看出，不同提取时间样品的总多酚含量:30 min 150 min120 min60 min90 min乙醇超声提取物;30 min乙醇超声提取物中总多酚含量最高，达到0.504 1 mg/g，且明显比其他超声时间提取物要高;150 min 和120 min其次;60 min和90 min超声提取物中的总多酚含量较少。表1 不同提取时间样品的总酚含量及清除DPPH自由基的能力α：每克样品中含有相当没食子酸的毫克数;β：[DPPH·]的原始质量体积分数减少至50 %时样品的添加量
3.1.2 玄参不同浓度乙醇水溶液提取样品中总多酚含量的测定由表2可知，玄参不同浓度乙醇超声提取物中的总多酚含量在0.251 31.618 7 mg/g之间，其中40%乙醇超声提取物的总多酚含量最高，100%乙醇提取物中的总多酚含量最低，基本趋势是随着乙醇浓度的升高，其提取物中总多酚的含量降低。分析原因可能是因为多酚类化合物极性较强，易溶于水，所以其提取物中总多酚的含量随着乙醇浓度的升高而减少。表2 不同浓度乙醇提取样品的总多酚含量及清除DPPH自由基的能力
3.1.3 玄参不同极性溶剂提取样品中总多酚含量的测定玄参不同溶剂提取样品中的总多酚含量如表3所示, 正丁醇提取物的总多酚含量最高，为0.511 8 mg/g;其次是80%乙醇提取物，为0.504 1 mg/g;丙酮提取物的总多酚含量最少，为0.155 6 mg/g。得出玄参中多酚类化合物易溶于乙醇和正丁醇，而较难溶于丙酮。表3 不同溶剂提取
样品的总多酚含量及清除DPPH自由基的能力
3.2 玄参中多酚类化合物清除DPPH自由基的测定结果
3.2.1 玄参不同提取物中的多酚类化合物清除DPPH 自由基的能力玄参不同提取物中多酚类化合物清除DPPH自由基的能力如表13。如80%乙醇提取物清除DPPH自由基的曲线(见图1)，在加入不同浓度玄参提取物以后，[DPPH·]自由基残留率随时间的变化而逐渐变小，随着样品添加量的增加，[DPPH·]自由基残留率迅速降低, 在50 min内[DPPH·]自由基残留率下降很快，一般在100300 min该体系的[DPPH·]自由基残留率不再下降，达到平衡。
图3 80%乙醇提取物清除DPPH的曲线
在DPPH实验中，根据EC50的大小可以判断抗氧化剂清除自由基的能力的大小，EC50越小其清除自由基能力越强，AE越大，其清除自由基能力越强。
3.2.2 玄参不同提取时间样品中多酚类化合物清除DPPH自由基的能力玄参不同提取时间样品清除DPPH自由基的能力如表1，其强弱顺序为超声150 min乙醇提取物清除DPPH自由基的能力最强,其次为30，120 min乙醇提取物，60，90 min乙醇提取物清除DPPH 自由基的能力较弱。分析原因可能是随着超声时间的延长，多酚类化合物有所分解，其清除DPPH自由基的能力随之减弱，在90 min时其清除DPPH自由基的能力最弱，达到平衡后结合型多酚又游离出来，其清除DPPH自由基的能力又随着时间的延长而逐渐增强。
3.2.3 玄参不同浓度乙醇提取样品清除DPPH自由基的能力由
表2可知，玄参不同浓度乙醇超声提取物清除DPPH自由基的能力是20%乙醇提取物40%乙醇提取物80%乙醇提取物60%乙醇提取物100%乙醇提取物，大致趋势是随着乙醇浓度的增高，其提取物清除DPPH自由基的能力降低。玄参不同浓度乙醇提取物清除DPPH自由基的能力基本上与其所含多酚类化合物的含量呈正比。3.2.4 玄参不同极性溶剂提取样品清除DPPH自由基的能力由表3可以看出，玄参不同溶剂提取样品清除DPPH自由基能力的强弱顺序为80%乙醇提取物，正丁醇提取物，丙酮提取物，其EC50依次为79，89，646 mg/ml。由此可看出，玄参丙酮提取物清除DPPH自由基的能力远远低于正丁醇和80%乙醇提取物。
4 讨论
本论文采用Folin- Ciocalteu 方法测定玄参不同提取物中的总多酚含量，并采用DPPH抗氧化活性体外评价体系，对玄参不同提取物的抗氧化活性进行了系统研究。由于多酚类化合物酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自由基有较强的捕捉能力，使多酚类化合物具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力。而研究结果表明，玄参不同提取物中均含有一定量的多酚类化合物且具有较好的清除DPPH自由基的能力，说明玄参具有较好的体外抗氧化活性，可开发为天然抗氧化剂。其中40%乙醇提取物中的总多酚含量最高，丙酮提取物中的总多酚含量最低;而通过DPPH抗氧化活性体外评价体系，得出20%乙醇提取物清除DPPH自由基的能力最强，100%乙醇提取物清除DPPH自由基的能力最差。玄参不同提取物中总多酚
含量与其中多酚类化合物清除DPPH自由基的能力基本一致，但不完全相同。
【参考文献】
[1] Kitagawa1. On the iridoid constituent isolated from the roots of scrophularia buergerana Miq[J]. Chem Ararm Bull,1967,15(8):1254.
[2] 李医明，蒋山好，朱大元.玄参属植物化学成分与药理活性研究进展[J]. 中草药, 1999, 30 (4) : 307.
[3] 李医明,蒋山好,高文运,等.玄参中的苯丙素苷成分[J]. 中草药，1999,30(7):487.
[4] 李医明,蒋山好,高文运,等.玄参的脂溶性化学成分[J]. 药学学报，1999,34(6):448.
[5] 张建春,朱健美.玄参的化学成分与药理作用研究进展[J]. 山东医药工业，2003,22(1):25.
[6] 张雯洁,刘玉青，李兴从，等.中药玄参的化学成分[J]. 云南植物研究,1994,16(4):407.
[7] 邹臣亭,杨秀伟.玄参中一个新的环烯醚萜苷化合物[J]. 中草药，2000,31(4):241.
[8] Subramani Sellappan, Casimir C Akoh Gerard Krewer. Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity of Georgia-Grown Blueberries and Blackberries[J]. J. Agric. Food Chem., 2002, 50(8): 2432.
[9] Sanchez-Moreno C,Larrauri J A Saura-Calixto F. Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxi-dation of wines, grape juices and related polyphenolic con-stituents[J]. Food Res. Int.,1999,32:407.
[10] 石碧,狄莹.植物多酚[M]. 北京:科学出版社,2000:124.
[11] 陈欣欣,许时婴.黑莓渣提取物中多酚类化合物抗氧化活性的研究[J]. 食品工业,2007，3:3.
[12] C S Ough M A Amerine. Methods for analysis of musts and wines (second edition) [M]. New York : J.Wiley and Sons,1988:203.
[13] Brand-Williams W, Cuvelier M E, Berset C. Use of a freee radical method to evaluate antioxidant activity[J]. Lebensm Wiss Technol, 1995, 28(1):25.
[14] 李春阳,许时婴,王璋.DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基的能力[J]. 食品与生物技术学报,2006,25(2):102.