[文章编号] 16712587Ⅹ(2009)0120073205
[收稿日期] 2008205229
[基金项目] 吉林省科技厅科研基金资助课题(200705121)
[作者简介] 李 静(1971-),女,辽宁省锦州市人,副教授,医学博士,硕士研究生导师,主要从事消化系肿瘤基因
诊断与基因治疗研究。
[通讯作者] 李 静(Tel :0416********,E 2mail :jz7203@yahoo 1com 1cn )
RNA 干涉下调survivin 基因对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡作用
李 静1,2,蒋 政3,陈 丽1,孙海波1
(11辽宁医学院附属第一医院消化科,辽宁锦州121000;21吉林大学第一医院消化内科,吉林长春130021;
31辽宁省锦州市第二医院骨科,辽宁锦州121003)
[摘 要] 目的:探讨RNA 干涉技术下调survivin 基因表达对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡的作用,为肝
癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法:构建pSU62si 2survivin 重组质粒,转染人肝癌细胞株Bel7402,设空白组、阴性组和治疗组,采用M T T 法检测肝癌细胞的增殖活性,R T 2PCR 检测survivin 基因mRNA 水平,
Western blotting 及免疫组化法检测survivin 蛋白表达,流式细胞技术(FCM )及AO/EB 染色观察细胞凋亡。
结果:M T T 法检测,治疗组24、48和72h 细胞生长抑制率(%)分别为21143±1167、39107±3180和59172±
7105,与阴性组比较差异有显著性(P <0101)。R T 2PCR 及Western blotting 检测,治疗组细胞survivin 基因在mRNA 及蛋白水平上表达均下降,上述产物量与β2actin 的比值与空白组和阴性组比较差异均有显著性(P <0101)。FCM 检测治疗组细胞阻滞于G 0/G 1期,凋亡率为(20165±1128)%,与空白组及阴性组比较差异有显
著性(P <0101)。AO/EB 双染色治疗组细胞呈早中期凋亡。结论:重组质粒pSU62si 2survivin 可抑制survivin 基因在人肝癌细胞中的表达,抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡;survivin 基因可作为肝癌基因治疗的重要靶点。
[关键词] 肝肿瘤;RNA 干涉;细胞凋亡;survivin 基因[中图分类号] R73715;R392111 [文献标识码] A
E ffect of dow n 2regulating survivin expression by RNAi
on grow th suppression and promotion on apoptosis of
hum an hepatocellular carcinom a cells
L I Jing 1,2,J IAN G Zheng 3,CH EN Li 1,SUN Hai 2bo 1
(11Department of G astroenterology ,First Affiliated Hospital ,Liaoning Medical University ,Jinzhou
121000,China ;21First Hospital ,Jilin University ,Changchun 130021,China ;31Department of Orthopaedics ,Second Hospital of Jinzhou City ,Jinzhou 121003,China )
Abstract :Objective To explore the effect of down 2regulating survivin expression by RNAi on growth suppression and promotion on apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells ,in order to supply an effective target and technique for liver cancer gene therapy.Methods The recombinant plasmid of p SU62si 2survivin was constructed ,which was transfected into Bel7402cells.Mock group ,negative group and treated group were set https://www.doczj.com/doc/7a12831581.html,ing M T T assay the proliferation of transfected cells was investigated ,the survivin protein expression level was determined by Western blotting and immunohistochemical staining.Transcription of survivin was detected by semi 2quantitative R T 2PCR.Flow cytometry (FCM )and AO/EB double dyeing were used to examine apoptosis in transfected cells 1Results M T T assay demonstrated that the cell growth inhibition rates (%)of transfected cells in treated group at 3
7第35卷 第1期2009年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)Journal of Jilin University (Medicine Edition )Vol.35No.1 Jan.2009
24,48and72h were21143±1167,39107±3180,and59172±7105,there were significant differences compared with negative group(P<0101).The results of R T2PCR and Western blotting showed that the mRNA and protein levels of survivin declined markedly in transfected cells,the ratio of expression product toβ2actin in treated group had significant differences compared with negative group and mock group(P<0101).The results of FCM indicated that the cells in treated group were inhibited in G0/G1stage,the apoptotic rate was20165%±1128%, there were significant differences compared with mock group and negative group(P<0101).AO/EB double dyeing showed that the most cells in treated group were in early or middle stage apoptosis.Conclusion The recombinant plasmid of pSU62si2survivin can significantly inhibit the expression of survivin gene in Bel7402cells,and suppress cell growth and induce apoptosis,so survivin may act as an important target to treat human hepatocellular carcinoma.
K ey w ords:hepatocellular carcinoma;RNA inter;apoptosis;survivin
siRNA(small interfering RNA)是一种短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA 为靶目标降解特定的mRNA,导致其相应的基因沉默,这种现象被称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)[1]。RNAi已成为可以通过siRNA来人为改变基因表达的强有力的工具[2],广泛应用于基因功能组学、细胞信号传导通路的途径、抗病毒、抗肿瘤等方面的研究。survivin是可同时调节细胞周期和凋亡的基因,在多数人类肿瘤中过表达,被认为与肿瘤的发生发展密切相关。国
、胃癌、宫颈癌、卵巢癌等多种肿瘤中应用RNAi技术靶向survivin基因的抗癌研究的报道[326],筛选高效特异的siRNA以获得最好的抗癌治疗效果成为研究的热点。目前在肝癌中的相关研究尚不多见,仅国内闫歌等[7]报道RNAi 技术对肝癌细胞内源survivin基因的表达有抑制作用。本研究应用RNAi技术沉默survivin基因在人肝癌细胞中的表达,观察其对肝癌细胞的增殖及凋亡的影响,以期为肝癌的基因治疗提供有效靶点和技术支持。
1 材料与方法
111 主要试剂和细胞培养 Anti2survivin、β2actin兔抗人多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司,转染试剂Lipofectamine2000购于Invit rogen公司,B型超纯质粒小样快速提取试剂盒(去内毒素)购于北京博大泰克公司,其他试剂由吉林大学前列腺疾病防治研究中心提供。p SU62si2survivin由吉林大学前列腺疾病防治研究中心构建并惠赠。survivin2siR2 NA的序列为:5′2GA TCCC GGACCACC GCA TC2 TC TACA T TCAA GA GA T GTA GA GA T GC GGT2 GGTCCT T T T T GGA T23′(sense st rand),5′2A2GCTA TCCAAAAA GGACCACC GCA TCTC TA2 CA TC TCT T GAA T GTA GA GA T GC GGT GGTCC GG23′(antisense strand)。将与人的任何基因序列均无同源关系的DNA序列(scrambled)构建重组质粒(p SU62si2scramble)作为阴性对照。质粒提取按说明书进行,经λDNA定量>015g?L-1者待用。人肝癌细胞Bel7402由吉林大学基础医学院病理生理学教研室保存,用含10%新生牛血清的IMDM培养液在37℃、5%CO2孵箱内培养。
112 M T T法检测细胞生长抑制率 取对数生长期细胞,0125%胰酶消化,调细胞浓度为每孔8×103,接种于96孔平底培养板,将其分为3组:空白组(mock)、阴性组(p SU62si2scramble)和重组质粒治疗组(p SU62si2survivin),每组分24、48和72h3个时间段,每时间段4复孔。待细胞生长至80%～90%融合时进行转染,按说明书操作,每孔质粒终浓度为012g?L-1,培养至68h,在相差显微镜下观察拍照后,各孔加入浓度为5g?L-1M T T(用PBS新鲜配制)20μL,温箱孵育4h,吸去上清,每孔加入分析纯DMSO 100μL,酶标仪检测各孔的吸光度值(A570),共重复3次。计算生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。113 细胞转染 取生长对数期细胞按1×106个接种于100mL培养瓶中。细胞分组同前。待细胞生长至90%～95%融合时,分组进行转染,质粒终浓度为012g?L-1,转染后72h,相差显微镜观察细胞生长情况,收集细胞备用。
114 R T2PCR 收获的细胞按试剂说明书完成RNA的提取,取总RNA10μg逆转录为cDNA, PCR条件:94℃、5min,94℃、30s,56℃、30s,72℃、45s,72℃、7min,30个循环, 25μL体系。以β2actin为内参。PCR产物以
47吉林大学学报(医学版) 第35卷 第1期 2009年1月
20g?L-1琼脂糖凝胶电泳,EB染色,应用天能G is凝胶成像系统分析,PCR产物量以光密度/面积表示,以survivin/β2actin产物量的比值为最终结果。实验共重复3次。引物序列为survivin: sense,5′2GCA GA TC T T GC T TC GC GA T GTACG2 GGCC23′;antisense,5′2CGTC GCGA GGGCTA T2 GAACTAA T GACCC23′,412bp。β2actin:sense, 5′2AA GTAC TCCGT GT GGA TCGG23′;antisense, 5′2A T GC TA TCACC TCCCCT GT G23′,520bp。引物均由上海生工公司合成。
115 Western blotting 收获的细胞加入超声裂解缓冲液(50mmol?L-1Na H2PO4,100mmol?L-1 T ris2HCl,250mmol?L-1NaCl,100mg?L-1 Triton X2100,1mg?L-1PMSF,2mg?L-1 Ap rotitin,p H810),200～300W超声裂解,每次10s,间隔10s,共5次,12000g4℃离心40min,上清即为总蛋白粗提液。取总蛋白40μg 加等体积2×上样缓冲液煮沸变性5min,蛋白分离电泳采用120g?L-1十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶,电泳后采用半干法转膜至PVDF膜, anti2survivin及β2actin兔抗人多克隆抗体浓度为1∶200,1ν2000,应用化学发光法显影,曝光时间10s～1min。应用Bandscan系统分析,蛋白量以吸光度/面积表示,以survivin/β2actin蛋白量的比值为最终结果。实验共重复3次。
116 细胞免疫组化法检测survivin蛋白表达 取处于对数生长期的细胞按每孔1×105接种于铺有载玻片的24孔板,细胞生长至80%～90%融合时,分组同前进行转染,于48h后取出盖玻片,荧光显微镜下观察拍照后按免疫组织化学染色说明书操作。阳性结果为细胞质或胞核棕黄着色,随机选取5个高倍镜视野计数,阳性细胞占全部细胞15%以上即为阳性。
117 流式细胞术检测细胞凋亡 分别收集转染48h后细胞1×106个,离心,用冷PBS悬浮细胞, 1000r?min-1离心10min,弃上清,将细胞用1mL注射器快速推入冷乙醇(体积分数70%)中, 4℃固定12h以上,调整细胞密度为1×109?L-1, RNase消化后,加50mg?L-1PI115mL进行DNA染色,流式细胞仪做单参数分析,实验数据用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。实验共重复3次。
118 AO/EB双染色 分别收集转染48h细胞,制备单细胞悬液,调细胞密度为1×1010?L-1,取细胞悬液25μL,加100mg?L-1AO染液2μL及100mg?L-1EB染液2μL,滴于载玻片,盖片封片后荧光显微镜观察,于20min内计数500个细胞。正常细胞显绿色/黄绿色荧光,早期凋亡细胞显黄色荧光,晚期凋亡细胞显红色荧光,细胞坏死呈不均匀的橙红色荧光。
119 统计学方法 应用SPSS1210软件,计量资料以x±s表示,细胞生长抑制率、细胞凋亡率均数两两比较采用双样本t检验。
2 结 果
211 M T T检测Bel7402细胞增殖活性 治疗组细胞增殖活性明显低于空白组及阴性组;细胞生长抑制率(%)治疗组细胞在48和72h明显增高,与阴性组比较差异有显著性(P<0101。见表1。
表1 不同处理组Bel7402细胞生长抑制率
Tab11 Growth inhibition rates in Bel7402cells in various groups(x±s,η/%)
Group
Growt h inhibition rate
(t/h)244872 pSU62si2scramble 4.75±1.287.01±0.849.30±2.97 pSU62si2survivin21.43±1.6739.07±3.80359.72±7.053 3P<0.01vs pSU62si2scramble group
212 Bel7402细胞survivin基因的表达 R T2PCR 结果显示,survivin的mRNA表达在治疗组明显降低(图1),survivin/β2actin产物量的比值在空白组、阴性组和治疗组分别为0196±0101、0195±0101和0145±0102,治疗组与空白组和阴性组比较差异均有显著性(P<0101)。Western blotting结果显示,survivin蛋白表达在治疗组明显减弱(图2),survivin/β2actin蛋白量的比值在空白组、阴性组和治疗组分别为0191±0111、0185±0115和0132±0121,治疗组与空白组和阴性组比较差异均有显著性(P<0101)。细胞免疫组化结果显示,空白组及阴性组可见大量细胞呈强阳性,而治疗组仅见部分细胞呈弱阳性,见图3(插页一)。
213 Bel7402细胞凋亡 FCM结果显示,重组质粒治疗组细胞出现明显的细胞凋亡峰,凋亡率达(20165±1128)%,与空白组及阴性组比较差异有显著性(P<0101);细胞周期分析显示,治疗组细胞出现G0/G1期阻滞,治疗组S期及G0/G1期
57
李 静,等1 RNA干涉下调survivin基因对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡作用
细胞比例与空白组及阴性组比较差异有显著性
(P <0101),见表2;AO/EB 双染色结果,空白组及阴性组细胞呈绿色或黄绿色荧光,实验组细胞可见较多黄色荧光,偶见红色荧光,提示细胞较多呈早中期凋亡(图4,见插页一)
。
图1 Bel7402细胞survivin 基因mRNA 表达
Fig 11 Expression of survivin mRNA in Bel7402cells
Lane
1:
Mock
group ;
Lane
2:pSU62si 2scramble
group ;
Lane 3:pSU62si 2survivin group ;Lane 4:DL2000marker
图2 Bel7402细胞survivin 蛋白Western blotting 分析
Fig 12 Western blotting analysis for survivin protein in Bel7402cells
Lane 1:pSU62si 2survivin group ;Lane 2:pSU62si 2scramble group ;Lane 3:Mock group
3 讨 论
原发性肝癌中绝大部分是肝细胞癌,在全球癌症死亡率中居第3位,在我国为第1位癌症死因[8]。由于缺乏典型的临床表现,并缺乏客观特异的检测指标,往往延至晚期才被发现,目前尚缺乏
表2 Bel7402细胞凋亡率及细胞周期分布
Tab 12 Apoptotic rates and cell cycle analysis in Bel7402cells
(x ±s ,η/%)
Group Apoptotic rate Percentage of cells
S G 0/G 1G 2
Mock
pSU62si 2scramble pSU62si 2survivin
0.57±0.462.90±0.5020.65±1.283
32.70±0.9735.35±2.3318.39±1.823
48.85±0.4552.67±3.1466.25±1.123
18.45±1.3811.98±2.9715.37±1.36
3P <0101compared wit h mock and pSU62si 2scramble groups
特异、高效的治疗方法,5年生存率仅为3%～
6%[9],因此探索有效的生物治疗技术成为肝癌研究的热点。细胞凋亡异常是肿瘤形成的关键,survivin 基因是1997年Miller 实验室首先发现的凋亡抑制蛋白家族的最小成员,全长14700bp ,位于染色体17q25,编码由142个氨基酸组成的相对分子质量约16500的胞浆蛋白,广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织,但在正常成人分化组织中(胸腺、生殖器除外)检测不到[10]。survivin 基因在凋亡和细胞周期的基因调控中发挥重要作用,其高表达既可通过与Caspase3及Caspase7的结合抑制细胞凋亡,又可通过启动多种细胞周期调节因子促进细胞增殖[11]。本室前期研究结果显示,survivin 基因在人正常肝组织中无表达,在癌旁组织中弱表达,在原发性肝癌组织中强表达,表达阳性率为80%,与国内外报道的70%～75%相近[12,13],表明survivin 基因的异常活化在肝癌的发生发展过程中可能起重要作用。由于survivin 基因作用于各个凋亡途径的汇集点,而且具有肿瘤组织
表达特异性,因而survivin 已成为肿瘤基因治疗的理想靶点[14,15]。
RNAi 技术是近年快速发展的基因研究技术,siRNA 成功转入活体内的进展使得人们期待siRNA 药物能应用于人类肿瘤、病毒感染等治
疗[16]。本研究应用针对人的survivin 基因的siRNA 构建表达载体p Siliencer1102U62survivin 2siRNA 2GFP ,转染人肝癌细胞株Bel7402。本研究
结果表明,重组质粒在mRNA 及蛋白水平均可抑制survivin 基因表达,对肝癌细胞的增殖活性有抑制作用,并可诱导肝癌细胞凋亡,使细胞阻滞于G 0/G 1期,与闫歌等[7]研究结果相似。本文作者认为,应用RNAi 技术可抑制survivin 基因在肝癌细胞中的表达,人工合成的survivin 2siRNA 2GFP 可通过抑制肝癌细胞的增殖、促进肝癌细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用,survivin 基因可成为肝癌治疗的重要靶点。
本研究室同时构建了两对siRNA ,均为短发夹结构,siRNA 2survivin 21靶向编码基因71289,
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靶位点中G/C含量38%,siRNA2survivin22靶向编码基因368～386,靶位点中G/C含量是57%。在M T T预实验中两对siRNA作用大致相同,本研究选择siRNA2survivin21进行实验。本实验结果与本研究室应用同样的重组质粒转染其他肿瘤细胞系比较[17],对survivin基因表达抑制的程度有所下降,提示survivin基因在不同的肿瘤中作用可能有所不同,或不同的肿瘤细胞对同种重组质粒的转染效率不同。本文作者在研究中还注意到阴性组的细胞在转染后也会出现一些变化,如部分细胞形态改变,基因表达也有变化,虽然与空白组比较差异无显著性,但提示转染试剂及携有无关序列的表达载体对细胞还是存在一定的毒性作用及未知影响。另外本实验中转染效率约为28134%,而同样条件下转染前列腺癌细胞及白血病细胞,转染效率最高可达80%,考虑可能与肝癌细胞本身特质有关,还可能与细胞密度、培养基条件、抗生素等因素有关。如能寻找更好的转染方法,提高转染效率,降低毒性,将使以siRNA为主的基因重组药物发挥更理想的治疗作用[18,19]。
[致谢:感谢吉林大学前列腺疾病防治研究中心赵雪俭教授、孟艳副教授、潘淑琴老师等悉心指导]
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