PCR假阴性的原因分析
PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。
造成PCR假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：
1.PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率下降(假阴性）等问题.
2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。
离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的，转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。
3.试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。
PCR扩增方面的技术解答
1、PCR括增的基本原理
PCR (Polymerase Chain Reaction) 是体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板，特异性引物，高温聚合酶，脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性（Denaturation），引物与模板低温退火（Annealing）,引物在高温聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的条件下，退火和延伸可以合二为一。
2、高温聚合酶分类
高温DNA聚合酶主要用于DNA片段的高温快速扩增（合成），它以单链DNA或RNA 为模板，在dNTP和Mg离子存在时，在特定的引物引导下按5’-3’的方向合成DNA。目前，用于高温DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三类：
第一类酶具有5’-3’方向的DNA合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。
第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。如Tth DNA聚合酶。
第三类酶具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。如Pfu DNA聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu能够纠正DNA扩增过程出现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA延伸能力不及其它两类。目前人们试图用各种手段来提高第三类酶的延伸性能，它在现代分子生物学实验中越来越收到重视。
3、如何选酶?
根据扩增产品的用途确定。第一类酶如Taq DNA聚合酶的主要用于检测基因或特定DNA片段是否存在，制备DNA探针，T/A克隆时在DNA片段末端添加单个碱基，和Pfu一道用于较长DNA片段的扩增。这类DNA扩增，DNA片段中可能存在的突变不影响实验结果。
第一类酶大多数使用场合，第二类酶都可以用。需要注意的是Tth的长链PCR 扩增的能力不及Taq酶。人们更多注意的是Tth的逆转录功能，用它来实现基因单管单个酶的RT/PCR扩增检测。和传统的AMV和MMLV 逆转录酶相比，Tth的RT是在
高温下进行的，能有效的解除RNA中的二级结构，是扩增出的基因更为完整。不足之处：Tth的RT能力不及AMV和MMLV 逆转录酶。第三类酶以Pfu DNA聚合酶为代表。
Pfu是已知DNA聚合酶中，保真性最高的聚合酶。它扩增出的DNA产物，随机突变少，保证性能为Taq DNA聚合酶的10倍以上。Pfu主要用于克隆表达基因片段的合成，用于DNA突变实验。如果要求扩增DNA片段中的错误特别少，减少下游分子操作不必要的回复突变工作。高保真DNA扩增，使用Pfu DNA聚合酶是唯一的选择。需要指出的是：用Pfu的DNA扩增，突变少，但不是无突变无错误扩增。Pfu的不足之处是扩增能力较差，2kb以上的基因扩增需要优化反应条件。
将第一类或第二类与第三类酶按特定比例混合，能部分提高PCR扩增的长度和产物的保真性。我们提供的Taq Plus和SuperTaq属于这类产品。这类产品的保真性一般为Taq酶的2倍左右。S公司声称Taq Plus的保真性达到Pfu的水平是没有科学根据的,是极其不负责任的。
4、如何选择酶的供应商?
用可靠可信的酶。国外品牌公司的酶质量是有保证的。理论上生产Taq的工艺不复杂，但是从非专业性生产商出来的产品往往不做严格的产品控制，他们的价格虽然低，但是给您研究带来的潜在的威胁很大。很多公司没有生产能力，为追求最高利润，经常更换供应商。产品的稳定性受到影响。一般情况下他们不做质量控制。您买酶前最好问问他的酶是谁生产的，如果您仅仅被告知是国产和进口的，而不能告知明确的生产商，最好不要购买。
5、遇到问题怎么办?
影响DNA扩增的因数很多，酶的质量是个重要因素。本公司提供的各类酶质量都经过严格的质量控制。使用本公司提供的各种DNA聚合酶一般可以排除产品本身的质量问题。影响DNA扩增效率的几个重要因数：模板性质和用量、Mg离子的浓度、退火温度等。实际上 PCR扩增没有什么特殊的规律，做多了，您就成为专家了。如果您还不能得到满意的答案，请直接向申能博彩咨询。
6、如果您不能扩增出产物，表明您使用的试剂或过程有问题吗？
不一定。有些扩增，您的引物，PCR扩增使用的酶，dNTP可能都没有问题，只是可能您没有使用最合适的条件。有些基因表达量就是低，常规的PCR可能就没有办法扩增出来。如果所有的基因都是那么容易扩增出来，那有那么多形式的PCR技术如槽式PCR,Hot Start PCR, LA PCR。如果有时引物设计不合理，靠扩增技术的改进也不一定能弥补。
7、RT-PCR技术难吗？
不难。但是您的心态要对。您不要指望您的基因如扩Actin那么容易，也不要指望3k的cDNA一下子就能扩增出来。我们注意到，降解现象非常严重的样品中，扩增beta Actin也是轻而易举的事情。实际上能扩增出Actin，只能说明PCR扩增系统没有问题，不能说明您的 RNA就一定完好。RT-PCR的关键是RNA的质量，如果您的RT没有问题，PCR跟不会有问题。
8、基因表达水平检测需要注意什么问题？
研究人员常常需要检测特定基因的表达水平，检测的手段很多，主要有Northern, 半定量RT-PCR, 荧光定量PCR(real time PCR),基因芯片的手段。很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点。
Northern方式比较直观，但是难以批量进行，劳动量较大；半定量RT-PCR,被一些学员所推崇，因为很多实验室都可以做，但是半定量RT-PCR的关键要保证所有样品的可比性非常困难，内参需要与待检测基因同管扩增，但是由于内参基因表达水平太高，常常抑制检测基因的扩增，常常是分开扩，都可以扩增出来，混在一起就没有了，所以有时不能反映基因表达的实际情况。目的基因和内参基因分开扩增的所谓半定量RT-PCR，没有什么学术意义。荧光定量PCR，在学术界和临床诊断都被广泛采用，该技术能比较真实反映基因的表达水平，实时监控PCR扩增，数据处理自动化和数字化。荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增，合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针。要准雀体现表达水平，半定量RT-PCR, 荧光定量PCR扩增的循环数比常规少，扩增产物一般都要求处在线性区，如果扩增过程已到达平台区，扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低。基因芯片的基本原理和Northern 基本相同，类似于点杂交，都是采用杂交原理，差别是基因芯片一般采用荧光探针，可以同时比较很多样品，可以批量处理和自动化。不足之处是检测设备费用高，假阳性的比较高，需要其他方式予以验证。
9、PCR扩增过程中若干影响因素？
引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染，引物一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果重合后，还没有改善，请查其他原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下OD，将所有引物的浓度调整到一致，对实验有一定帮助。
高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。当然，便宜又好最好，哪里有？我们这里啊！
dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使dNTP发生降解。dNTP 是由dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成，但是他们的稳定性不同，发生降解的程度不同，导致4种dNTP的浓度不一致，即使不发生降解，4种 dNTP如果浓度不等，PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。
缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂，目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。
Mg2+:是TAQ活性所必须的，浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低（<1mM），合成效率会下降，过高（>3mM），非特异性会加大。很多因素会使Mg2+的实际浓度受到影响，如TE中的EDTA, 反应用的dNTP等都会螯和Mg.
温度：变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高（一般在90-94C），时间过长（一般45-60秒足够），酶的活性会受到影响，同时影响产率。对于退火温度，过低非特异性扩增增加，过高产率会下降。需要根据引物的长度，用途，组成确定退火温度和时间。
模板：PCR 的关键之一，模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓度。纯度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的试剂存在。模板的pH值接近中性为合适，否则会影响扩增体系的pH值。
10、PCR产物的克隆常用方法？
PCR扩增如采用Pfu DNA Polymerase产物末端为平端; 如用Taq DNA Polymerase 扩增，PCR产物的3’末端通常为单个碱基A。 PCR产物克隆常用的方法有3：
l：平端克隆，但效率低，对于Taq扩增的产物需要除去３’末端通常为单个碱基A。Pfu扩增的可以直接用平端连接。
２：在引物两端设计合适的酶切位点，PCR扩增后，酶切克隆。但PCR产物直接酶切效率低，克隆成功率不高。
３：最为有效的是T/A克隆，因为它不需要知道扩增基因的DNA序列和酶切图谱。虽然用Pfu DNA Polymerase扩增的产物需要用K291-292试剂盒在DNA末端添上单个碱基A,但是添A实验非常简单，克隆的成功率非常高。
荧光定量PCR技术及其应用
荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光
标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。
1 特点
FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而FQ-PCR 只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。该仪器具有以下特点：①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。③工作效率高：内臵9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。
2 原理和方法
FQ-PCR的工作原理[1～4]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm 处），探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来（见图）。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型 PCR扩增仪，也可用其它PCR仪。如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结束后，通过电脑分析，可直接给出定量结果。如果用其他PCR仪，则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件[2]：①探针长度应在20～40个碱基左右，以保证结合的特异性。
②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的
Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。
图.TaqMan PCR反应模式（A）聚合反应；（B）链臵换；（C）裂解；（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）
图.TaqMan PCR反应模式（A）聚合反应；（B）链臵换；（C）裂解；（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）
3 应用
由于FQ-PCR具有高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。
3.1 病原体测定
由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE 公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。 Morris 等[3]用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组。与巢式PCR比较显示，FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性。另外，还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种检测方法均为阳性，10例均为阴性；另有6例用两种方法测定的结果不一致。该6例样品又让第三个实验室用巢式PCR 方法重新测定，其结果与FQ-PCR测定的结果一致率为100%。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。
与宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒（HPV）有多种类型，以HPV-16、18、31、33、35等类型危险性最高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技术对子宫阴道灌洗标本进行了研究。
他们发现，由于荧光探针的应用，对各型HPV的检测变得十分方便和准确。由于HPV-16的特异引物可以和HPV-66的模板DNA发生错配，用一般PCR方法扩增时，如有HPV-66存在，即可扩增出HPV-66片段而发生误诊，但是HPV-16特异探针的应用使HPV-66在TaqMan系统中不能扩增。因此，FQ-PCR对不同亚型的病毒检测具有高度特异性。同时也发现FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法检测不到的HPV模板浓度在TaqMan系统中却可检测到。对于HPV-16、18、31、33、35类型敏感高达到每100～1000个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组，平均每300个细胞中含有一
个拷贝的HPV基因组。
以前常规检测大肠杆菌的方法，都是采用多种选择性培养基培养分离法，对产志贺氏毒素的大肠杆菌（SLTEC）缺乏特异性，因此这种菌株的检测又费时又困难。后来又有应用抗体的免疫学方法和核酸序列测定的生化方法及以DNA扩增为基础的PCR 方法等，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等[5]1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位臵、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于TaqMan 系统可以一次测量96管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电沪及EB 染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR 技术用于食品中沙门氏杆菌的检测研究。
在抗痨治疗开始后，结核病人痰中可持续存在有结核杆菌，为了研究结核病人痰标本DNA定量结果是否与有活力的结核杆菌数量相符合并监测治疗反应，1998年美国Desardin等[7]用FQ-PCR和竞争性PCR两种方法定量检测治疗期间连续收集的结核病人痰标本，结果显示两种方法有较好的重复性和准确性。痰中结核杆菌DNA定量结果与抗酸染色显微镜下计数的结果一致。
3.2肿瘤研究
意大利Gelmini等[2]用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率，他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。
1998年法国Bieche等[8]用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1。同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性。
3.3基因表达研究
由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等[9]用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPO mRNA水平，又用ELISA 方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPO mRNA水平明显
升高，而ET病人的TPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其 mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA 表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO 的作用提供了依据。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技术对鼠成肌细胞系C2C12中肌肉调节因子的表达水平及动态变化进行了研究。
3.4免疫组份分析
对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行[11，12]。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等[13，14]，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。
3.5基因突变及多态性的研究
美国Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。
3.6其他方面
日本Isono[17]利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等[18]还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。
4 结语
综上所述，FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。
什么是反向PCR（inverse PCR）?
反向PCR是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环
上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板（依赖于引物）的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点（例如，互补突头连接与钝头连接）。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。
用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PCR 大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4 DNA聚合酶修理（钝化）。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。
聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰
应用PCR技术诊断单基因疾病
自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的诊断。目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对诊断方法的选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR 技术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长时间，而 1987年10月以后，应用PCR只需2-4天。在1987年以前，几乎所有的β－地中海贫血症的产前诊断都是通过检测在β－珠蛋白簇中连锁DNA的多态间接完成的，一般需要2-4 周。1987年10月以后，用PCR扩增β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成β－地中海贫血症的产前诊断。这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需一周时间。该项改进技术的作用:
（1）如果我们不能确定在父母双方中β－地中海贫血的突变位臵，我们还可以在1、
2天之内研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多态性；
（2）通过比较母亲与胎儿DNA序列差别来判断母亲传染的程度。这只是说明PCR对基因诊断意味着什么的几个例子。
以下我们举几个特例具体说明PCR技术的应用：
（1）通过扩增产物的打点杂交或限制性内切酶酶解方法确定已知的点突变；
（2）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变；
产前基因诊断基础知识
产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。1978年Kan和Dozy提出应用与β－蛋白基因连锁的DNA多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。此种诊断需要进行家族性研究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基因型是用正常β－珠蛋白基因及镰状红胞β－珠蛋白基因探知的。家族被调查成员包括夫妇俩的孩子，如没有孩子，则调查夫妇双方的父母。到1982年，通过利用MstⅡ限制性内切酶方法可以直接产前诊断是否有镰状红细胞贫血，因为内切酶MstⅡ及其同功酶Cv 嗷蛳xnNⅠ不能在突变位点降解镰状β－珠蛋白基因而可在此位点降解正常βA－珠蛋白基因。这种改进不需家族调查，就可更准确地进行镰状贫血病的产前诊断。正是这种改进法，使直接而简便地确定致病突变成为可能，这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。
单基因缺陷的诊断是通过对连锁DNA多态性研究及家族研究而确定的。到1988年底，我们利用这种方法诊断了一些患Duchenne肌营养不良症病人、大多数甲型和乙型血友病人、所有囊性纤维变性病人及Huntington氏病、神经性纤维瘤和成人多囊肾病人。应用这种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β－地中海贫血、α地中海贫血有大多数Duchenne肌营不良症、部分甲型血友病和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。几乎所有这些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR 技术在产前诊断、症发前诊断及携带者发现等方面具有非常重要的价值。
应用PCR技术直接发现点突变
在点突变诊断中，继PCR技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及直接测序。John Hopkins大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血：（1）将人绒毛膜样品（CVS）或羊水中得到的胚细胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）应用 PCR技术在β珠蛋白基因5末端扩增一个725bp区，用30个循环，72℃链延伸120。（3）用CvnI酶消化725bp扩增产物。（4）降解的产物进行电泳。（5）EB染色。（6）紫外灯下观察DNA片段，并拍照。
在反应中选择使扩增产物含有两固定CvnI位点的引物。因此，酶解产物至少应可见三条带。每个镰状红细胞的β珠蛋白基因含有一个381bp带，而正常βA珠蛋白基因经酶结果已积累了大量信息，所以我们倾向选用限制性内切酶法消化经PCR 扩增的产物，而不是利用特异寡核苷酸探针经打点杂交来诊断βS突变位臵的β突变位臵。然而，这种方法的的局限性（也是Southern杂交的局限性）是不能显示
包括第六密码子即βS突变位臵的β珠蛋白基因的缺失。因此，一个杂合子个体（含一个βS珠蛋白基因，及一个基因缺失）与患镰刀状红细胞贫血病人（含两个βs 珠蛋白基因）酶切片段的条带图形是一样的。所以，在诊断这类病人时，会遇到一些困难，最后只有调查其双亲才能确诊。如果双亲都是βaβs基因型，这个人可确诊为镰状红细胞贫血症。如果双亲中一个一是βa型，另一个是βaβs基因型，此人诊断为βs杂合子基因型且βs珠蛋白基因含一个缺失。由于突变引起的疾病具有一定特征，所以，理论上直接确诊β地中海贫血是可能的。发生地中海贫血症的高危人群为地中海人、中东人、亚州印度人、中国人和黑人。到1988年底，已知引起地中海贫血的突变有60多种，引起地中海贫血的99％等位基因特征是已知的，其余的等位基因很少或存在于易患者很少的种族中。因为每种人群有自己的β地中海贫血突变谱，一般情况下，4-6对等位基因在任一特定种族的β地中海贫血基因中占99％以上，因此，使确定易患β地中海贫血的夫妇二人的致病突变简单化。
如何提高PCR反应的特异性
引物
引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量；引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 ---生物秀实验频道
Mg2+
较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM 到3mM，以0.5mM递增，进行最适Mg2+浓度测定
退火温度
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。退火温度一般设定为比引物的Tm低5℃的温度。合理的退火温度为55-70℃。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合 ---生物秀实验频道https://www.doczj.com/doc/7012592334.html,
巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少，巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度
递减PCR
通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩增，并在随后的循环中继续扩增占据优势
热启动PCR
通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。最常用的是热启动DNA 聚合酶，常温时该酶活性被抑制，94-95℃加热数分钟后回复正常活力开始反应，这样可以避免起始循环温度下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的灵敏度及特异性。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一
PCR增强剂
包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 ---生物秀实验频道
建立PCR实验室的基本条件
临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断，由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR技术要求高、影响因素多（特别是RNA标本），实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是PCR技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。二、PCR 实验室验收准备工作
（一）硬件准备——实验室基本建设
1.根据文件要求，临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。
2.各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
3.进入各工作区域必须严格按照单一流向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。
4.不同的工作区域使用不同的工作服（不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
5.工作区域仪器设备配臵标准
（1）试剂贮存和准备区 2～8℃和-15℃冰箱：混匀器；微量加样器（覆盖1～1000μl）；移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
（2）标本制备区 2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速台式冷冻离心机；混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器（覆盖1～1000μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；超净工作台，消耗品；一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
（3）扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪；微量加样器（覆盖1～1000μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
（4）扩增产物分析区视检测方法不同而定。基本仪器设备如下：微量加样器（覆盖1～200μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
（二）软件建设——质量手册编写与实施、人才资源（上岗证培训与相关知识学习）1.临床基因扩增检验实验室的质量手册编写质量手册是阐明临床基因扩增检验实验室的质量方针，并描述过其质量体系的文件。质量手册规定了质量体系的基本结构，是实施和保持质量体系应长期遵循的文件。临床基因扩增检验实验室质量手册编写应依照卫生部下发两个文件，并结合本实验室实际情况编写适合本实验室的切实可行的质量手册。质量手册的提纲应包括三部分：质量方针和宗旨；工作制度；标准操作文件（SOP）
（1）质量方针和宗旨制定临床基因扩增检验实验室的质量管理目标和质量保证体系的结构体系和总方针。
（2）工作制度一般应包括以下文件：实验室的设臵、布局及组织结构；实验室内务管理制度；实验室的人员配臵及管理制度；生物的防护与安全制度；实验室废弃物处理制度；实验室清洁消毒制度；仪器设备的管理制度；仪器、试剂、耗材购臵程序及管理制度；临床标本的管理制度；实验室记录的管理制度；质量控制工作管理制度；结果报告管理制度；抱怨的内部处理制度；负责人及质检员职责；岗位设臵和责任制等……
（3）标准操作程序（SOP）一般包括：消毒液配制标准操作程序：消毒标准操作程序；超净工作台使用标准操作程序；超净工作台维护和保养标准操作文件；PCR仪使用标准操作程序；PCR仪维护和保养标准操作程序；高速低温离心机使用标准操作程序；移液器使用标准操作程序；冰箱维护和保养标准操作程序；电热恒温水浴箱操作程序；电子天平使用和校正操作程序；可移动紫外消毒车使用操作程序；加样器校准标准操作程序；离心机维护保养操作程序；温度计校准程序；试剂的质检操作程序；标本唯一标识编号编制规则；临床标本的采集及处理操作程序；临床标本的保存程序；乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；丙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测标准操作程序；沙眼衣原体核酸扩增荧光检测标准操作程序等……
（4）引用图表：PCR扩增可接受标本记录表；PCR扩增拒收标本记录表；室内质控结果记录表；室间质控记录表；消耗性材料验收记录表；试剂验收记录表；故障处理表；台阶式高速离心机使用记录表；台式高速冷冻离心机使用记录表；扩增仪维护保养记录表；人员培训计划及培训记录表；实验室工作人员一览表；主要设备一览表；实验室清洁消毒记录表；工作区温度、湿度记录表；抱怨记录表；标本超低
温保存记录表；应急处理记录表；垃圾处理记录表；冰箱温度记录表；水浴箱温度记录表；移动紫外消毒车记录表；设备校正记录表；检测结果报告流程；报告单样张；临床送检标本流程图；实验室组织结构图。
定量PCR常见问题解答
1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？
按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？
定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：
3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？
当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位臵，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：
〃在Windows桌面上，选择开始(start),我的电脑(My computer)。
〃在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
〃在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
〃单击碎片整理(Defragment)。
〃当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
〃在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
〃为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
免疫-PCR技术进展
免疫-PCR技术结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性，是一种极为敏感的抗原检测技术，并适合于各种微量抗原的检测。
荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度。但在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏度。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1ng/ml，但在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。1992年，Sano[1]等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR（Immuno-PCR）。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。
众所周知，PCR技自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。而免疫-PCR技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。
1 免疫-PCR的基本原理
免疫-PCR主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应。第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。免疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫-PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力，只要存在着极微量的抗原抗体反应，PCR 都能大量扩增抗体所连接的DNA分子，再用电泳来表明实验结果。免疫-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。最初Sano等人建立的免疫-PCR实验流程如下：（1）再包被缓冲液稀释抗原BSSA，并固定在微滴定板上。（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体，并洗去未结合的抗体分子。（3）加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体（蛋白A能与抗体结合，而链亲和素可与生物素化PUC19中的生物素结合），并洗去未结合的嵌合蛋白-Puc19复合物。（4）PCR扩增抗体所连接的Puc19。（5）琼脂糖凝胶电泳，EB显色检测Puc19.
运用这种方法，Sano等人可检测到600个BSA抗原分子。与用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA方法相比，免疫-PCR的敏感度比ELISA高106。在这免疫-PCR系统中，链亲和素-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。它的两个独立结合位
点蛋白A和链亲和素分别与IgG的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系，通过PCR扩增，将抗原抗体反应的特异性高度放大。因此，免疫-PCR结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高度敏感性，成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术。
2 免疫-PCR的改进
虽然Sano等+人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。Ruzicka[2]等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。
此外，Sano的免疫-PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou[3]等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液（modified antigen dilution buffer, MADB）代替Sano免疫-PCR 中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2M，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETSI，检测浓度可达到9.6×10-15M，是常规ELISA 的105倍。与Sano的免疫-PCR系统相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用[4]。但直接包被待检抗原不适用于临床标本和难以吸附固相抗原的检测。随后在一系列实验中建立了各种夹心免疫-PCR[5～10]，扩大了检测范围。然而亲和素（链亲和素）作为一个连接分子对生物素的结合具有4价特性，亲和素与生物素化DNA 结合可得到5种不同产物，即游离亲和素、结合饱和亲和素和部分饱和亲和素才能在检测过程中发挥作用，游离亲和素与固相中生物素化抗体结合会降低方法的敏感性[11]。
3 多分析物免疫-PCR
在以上的免疫-PCR实验中，生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂（链亲和素、亲和素）连接到生物素化的抗体上。这样，DNA标记和抗体就被组装在同一位点上，因此可能产生可变的化学计量。另外它需要额外的步骤加入生物素试剂和连接试剂，并需要众多的洗涤步骤去除过量的试剂和非特异性连接试剂的实验组分，作为一个免疫-PCR实验就相当复杂且需要相当多的操作时间。Hendrickson[12]等人用异双功能化学交联剂预先连接好抗体和ssDNA标记，形成标记DNA-抗体偶联物。特别是，他将不同的抗体标上特异的DNA序列，形成一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR，并可同时检测多种抗原，避免了免疫实验敏感性的限制和在一个实验中检测抗原的种类。而且，免疫-PCR夹心模式可以用常规的免疫实验完成。这样就大大降低了原先免疫-PCR实验的复杂性，并减少了大量的操作时间。这种免疫-PCR系统的关键改进就是用异双功能化学关联剂制备标记DNA-抗体偶联物。制备过
程如下。（1）氨基修饰寡核苷酸与SATA反应，形成乙酰硫代乙酰修饰DNA。（2）Sulfo-SMCC与抗体反应，形成马来酰亚胺修饰抗体。（3）混合马来酰亚胺修饰抗体和乙酰硫代乙酰修饰DNA，并加入羟胺盐酸，在黑暗条件下反应，使抗体和标记DNA 偶联。（4）反应混合物用HPLC凝胶过滤纯化偶联物，收集的偶联物在4℃下保存。
在这偶联物中，ssDNA是连在抗体的Fc段上，因此并不影响抗体的活性。Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核苷酸（分别为55、85、95个碱基）分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG、β-Gal的特异性抗体上，每一个寡核苷酸标记物含有相同的引物序列。这样，一对引物就可以促成三种DNA的共同扩增，Hendrickson用预先制备好的三种抗体-RNA偶联物同时检测hTSH、hCG、β-Gal实验使用双抗夹心模式。实验结果表明，分析物检测的敏感度超过普通ELISA约三个数量级。
由于化学合成寡核苷酸标记物序列长度不能超过100个碱基。因此，在多分析物免疫-PCR实验中，ssDNA标记物和引物的设计就受到了限制。Joerger[13]等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bp的dsDNA可以通过生物学和生物化学方法制备。Joerger通过PCR和单向缺失在以Puc18为基础的重组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA，选择适合长度的dsDNA作为特异性抗体的标记物。另外，在免疫-PCR实验中，dsDNA比ssDNA具有更多的优越性。DsDNA中的一条链跟抗体的Fc段连接，另一条链在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中，使链复制没有空间位阻。而且dsDNA比ssDNA具有更高的稳定性。此外，长链DNA分子更容易用荧光标记和光吸收检测，并且可以引入更多的非同位素标记，序列长度的提高可以促进杂合检测。
4 免疫-PCR扩增产物的ELISA检测
pCR扩增产物一般是通过凝胶电泳、EB染色来检测并定量的。也有的是在凝胶电泳后用Southern杂交来检测PCR产物[8,9,14]。1997年，Niemeyer[15]提出所谓的免疫-PCR和PCR-ELISA检测，即用ELISA方法来检测并定量PcR产物。它主要是用一对分别标记了生物素和捕获抗体固定扩增产物，用标记上碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA。Niemeyer分别检测了鼠IgG、兔IgG和重组HbsAg，证实与凝胶电泳、EB显色相比，ELISA方法检测定量PCR扩增产物结果具有更高的稳定性和可重复性。凝胶电泳、EB显色的变异系数（CV）达到38％，而ELISA的变异系数只有10％。而且，以荧光染料AttoPhos作为显色底物的ELISA检测灵敏度比凝胶电泳、EB显色高10倍。另外，荧光强度和抗原检测量的相关系数也高达99％。这种PCR-ELISA更节省时间，且易于自动化操作和便于临床检测。
5 展望
免疫-PCR作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性、适合于各种微量抗原的检测[16]，并且可以直接检测细胞上抗原[14]。预先将抗体和标记DNA偶联，简化了实验操作，并可以同时检测多种抗原。而标记物和引物被设计为带有亲和配体，则可以用常规ELISA方法进行检测。随着免疫-PCR技
术的进一步发展完善，免疫-PCR的功能将得到更充分的发展，新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范围，简化实验的复杂性。具有侧链DNA标记物的偶联物能够承担的标记物的检测，产生更准确的结果。相信不久就会有商品化的免疫-PCR试剂盒问世。
PCR技术的拓展知识
1.逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。
2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。
3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的检测。扩增同一模板的几个区域。
4.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。
5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。
6.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行列测定，以了解目的基因的序列。
7.锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。
8.着色互补试验或荧光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。
9.双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。
10.原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,简称IS PCR），它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和
组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。
摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Appl ied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。 1. 2－△△CT方法
产物检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 假阴性，不出现扩增条带： PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。
PCR结果异常分析 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。 PCR反应的关键环节有： ①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量及活性；④PCR 循环条件。 应寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 1．假阴性，不出现扩增条带 （1）模板： ①模板中含有杂蛋白质； ②模板中含有Taq酶抑制剂； ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白； ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚； ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序应固定不宜随意更改。 （2）酶失活： 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 （3）引物： 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： ①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。 ④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 （4）Mg2+浓度： Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 （5）反应体积的改变： 通常进行PCR扩增采用的体积为20l、30l、50l或100l,用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20l 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 （6）物理原因： 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检
P C R产物电泳结果分析Last revision on 21 December 2020
产物检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带： PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： 1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。 一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是 10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意： 1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！ 4. 所有成分加完后，离心去除气泡。 5. 每个样品至少3个平行孔。 参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！） 或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司
用2-△△Ct法分析real-time PCR数据-----联合应用LightCycler Data Analysis软件和MS Excel By netmee，netmee@https://www.doczj.com/doc/7012592334.html, 引用请注明作者。 1、打开存取的数据文件，点击 2、依次点击，，这是适合SYBR green为染料的选项。点击step1：Baseline下的“change graph settings”小图标。取消弹出的Customize Graph 选项卡中的Logarithmis选项，点击“OK”按钮，退出选项卡。 3、点击下的“change graph settings”小图标 ，取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项
，点击“OK”按钮，退出选项卡。 4、在选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。 5、可以在选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。 6、如果确为直线，则左侧的“Crossing Point”值为所需要的Ct值。
7、依次选取下图菜单：将数据导出为文本文件。 8、打开所保存的文本文件，如图选取
“Calculated Concentration”列。
10、将目的基因，本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入beta-actin值右侧一列。分别标记两列数据为“beta-actin”和“iNOS”。 11、设置所有Ct值的单元格格式 12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。
13、将E列（目的基因Ct值右侧一列）输入公式“=D4-C4”，求出目的基因与同管beta-actin Ct值之差，即△Ct。 14、向下拉复制公式，将△Ct列数值计算出。
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量 METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 P CR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT 公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulleti n No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有