1.在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移
的机制或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态。
如图所示溶液中荧光物质分子M和猝灭剂Q相碰撞而引起荧光熄灭：
2.荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物,或者激发态的荧光分子形成有效的猝
灭球状模型，这种现象称为静态猝灭。如图所示：
1我报告的题目是基于碌酸化多肽降解受阻的石墨稀/多肽复合焚光探针用于蛋白激酶活性及抑制作用分析 2蛋白激酶催化作用下的蛋白质憐酸化是生物体内翻译后修饰的重要方式之一。蛋白质的憐酸化和去磷酸化这一可逆过程几调节着细胞的发育、增殖、分化、信号转导、神经活动、肌肉收缩、细胞凋亡及肿瘤发生等过程在内的大部分生命活动。非正常的磷酸化会导致人体产生各种疾病,例如癌症或老年痴呆症等。因此,准确灵敏地检测过度磷酸化、分析蛋白激酶活性和高通量蹄选高效抑制剂对于人类一些重大疾病的早期诊断和治疗极为重要。 传统用于蛋白激酶活性分析的方法依赖于放射性元素标记伽马-32P-ATP法,由于放射性物质对环境及其人体的危害而随之被取代,基于憐酸特异性识别抗体的免疫技术[146]、突光分析方法表面等离子共振技术[184,185]以及质谱等都能有效用于蛋白激酶的活性分析。 石墨稀(Graphene),是从石墨材料中剥离出来的由碳原子组成的二维晶体, 是目前己知世界上强度最高的材料。石墨稀具有独特的电子、机械、热力学特性 在化学、质量、压力等传感应用中独具优势,。与碳纳米管相似,石墨烯对有机 荧光分子表现了有效的突光淬灭效果,这一过程中同时发生了激发态突光分子与 石墨烯表面之间的能量转移和电子转移。2010年诺贝尔物理学奖 氧化石墨烯薄片是石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物，氧化石墨烯是单一的原子层，仍然具有淬灭荧光的效果 3本文首次提出了一种基于多肽/石墨烯突光浮灭机制和接肽酶降解作用的激 酶活性分析方法。酪蛋白激酶CKII是一种重要的丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶, 能磷酸化160种不同的蛋白质,我们以CKII为蛋白激酶模型。FITC 标记的CKII底物多 肽,FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD),能与GO发生有效的突光浮灭。幾肽酶CPY是一类 肽链端解酶,作用于任何一个C-末端残基,从肽链的C端开始逐个降解,释放出 游离氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作用下释放出游离的FITC分子,在 高离子强度环境下,游离FITC分子与GO之间的吸附较小而保持相当强的焚光。 而当FITC-peptide在CKII/ATP催化发生磷酸化,有效地阻碍CPY在憐酸化丝氨 酸位点的降解,使得FITC-多肽更容易与GO结合导致焚光淬灭。 1羧肽酶CPY 作用于任何一个C-末端残基逐个降解释放游离氨基酸，并释放出游离的FITC分子，在高离子强度环境下(猜想，故而加了氯化镁和钾)，与GO之间吸附较小保持相当强的荧光 4. 梭肽酶(carboxypeptidase Y, CPY)、Staurosporine、弗斯可林(Fskorlin)和3-异丁基-1-甲基黄嘿呤(IBMX) 购买于西格玛公司(中国上海)。cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA,催化亚基)购买 于Promega公司,酷蛋白激酶II (CKII)购买于New England Biolabs公司(美国)。 突光素标记底物多肽:FITC-RRRADDSDDDDD ( FITC-pep )、 FITC-RRRADDpSDDDDD (FITC-Ppep)和FITC-LRRASLG (FITC-kemptide) ATP、蛋白酶抑制剂和改良型Bradford蛋白总浓度检测试剂盒 牛血清蛋白(BSA)、三轻甲基氨基甲焼(Tris)、甘油、DTT、 EDTASynergy Mx酶标仪(BioTek仪器有限公司)进行突光光谱分析,所有样 品用480 nm作为激发波长,从500 nm到700 nm (25 °C)扫描焚光发射谱图。 5氧化石墨稀与多肽FITC-pep之间的劳光淬灭（氧化石墨烯对荧光强度的影响）FlTC-peptide+ TBS+ Tris-HCl+ MgCb+ KCl+氧化石墨稀 在96孔酶标板中加入60 nL浓度为的多肽(FlTC-peptide)溶液(溶 于TBS,即20 mM Tris-HCl,10 mM MgCb, 50 mM KCl, pH 7.5),每孔中加入
1.把各种能量转换为光能的过程主要有两种: 其一是热辐射，其二是发光。 2. 按照激发能的不同可以把发光分类为光致发光（紫外波段发光或真空紫外波段发光激发）、阴极射线发光（电子束流激发）、电离辐射发光（Ｘ射线、γ射线及高能离子激发）、电致发光（直流或交流电场激发）、化学发光（由化学反应能激发）、生物发光（由生物能激发）、摩擦发光（由机械应力激发）等。 3. 发光材料是由作为材料主体的化合物（基质）和选定掺入的少量以至微量的杂质离子（激活剂）所组成，有时还掺入另一种杂质离子作为敏化剂。 4. 荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。 5. 荧光淬灭（fluorescence quenching）又称荧光熄灭或萃灭：是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象。 6.荧光熄灭剂:引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。如，卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
7.荧光淬灭的原因很多，机理也很复杂，主要包括：①因荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的的配位化合物；③溶解氧的存在，使得荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子生在荧光物质分子与猝灭剂分子之间 8.静态猝灭：当基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光猝灭的现象称为静态猝灭。 动态猝灭：如果激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。 动态猝灭：温度增高，猝灭增强； 静态猝灭：温度增高，猝灭降低。转变至三重态；④当荧光物质浓度过大时,会产生自淬灭现象。 9. 量子效率也称量子收率, 是指荧光物体分子发射的光量子数与吸收的光量子数之比。其大小是由分子结构决定的, 而与激发光源的能量无关。 10.拉曼散射光谱是指分子对入射光所产生使其频率发生较大改变的一种光散射现象。激光拉曼光谱主要的一些特点: (l)每种物质(分子)都有自己完全独立的特征谱线，因此每种物质的特征谱线可以表征这一物质。(2)拉曼谱线的线宽大多数较窄，并且往往都是成对出现的，也就是具有完全相同大小的正负频差。这两条谱线在短波一边的叫做反斯托克斯谱线，在长波一边的叫做斯托
卤代烃对 唑化合物荧光猝灭机理* 张文勤** 霍明亮 齐翠娥 (化学系) 摘要 测试了1×10-5mo l /L 5,5’-二苯基-2,2’-联唑(POO P )、反-1,2-双[2-(5-苯基唑 基)]乙烯(PO EO P )、4,4’-双[2-(5-苯基 唑基)]-1,1’-联苯(POBO P )在含不同浓度卤代烃的1, 4-二氧六环溶液中的荧光量子产率,讨论了荧光猝灭机理,计算出CH 3I 、Ph I 、PhBr 对PO EO P 、PO O P 、PO BO P 的荧光猝灭速率常数.研究发现,卤代烃分子越小,卤原子核电荷数越高,其猝灭荧光能力越强.关键词:荧光量子产率,唑化合物,荧光猝灭,重原子效应 分类号:O 644.1 STUDY ON THE MECHANISM OF FLUORESCENCE QUENCHI NG OF HALOHYDROCARBONS ON OXAZOLES Zhang Wenqin Huo Mingliang Qi C uie (Dept.of Chemist ry Tianjin U niv er sity ) Abstract The fluo resce nce quantum yields o f 5,5’-diphenyl-2,2’-biso x azo le (PO O P),tra ns -1,2-bis [2-(5-phenylox azolyl )]e th ene (PO EO P )a nd 4,4’-bis [2-(5-phenylox azolyl )]-1,1’-bipheny l (PO BO P)w er e dete rmined in 1,4-dio xa ne co ntaining halohy droca rbons.The fluo res-cence quenching mechanism w as discussed.T he fluo rescence quenching ra te co nsta nts o f these ha loh ydro ca rbons w ere calculated .It was found that the halohydr ocar bo n mo lecule with small v ol-ume a nd la rg e ha lo -ato mic num ber has a high fluor escence quenching ability. Key words :fluo rescence quantum yield,ox azo les,fluo rescence quenching ,heavy -a tom effect 高核电荷数原子(重原子)无论作为荧光分子的取代基还是溶剂分子的取代基,都可通过其自旋-轨道耦合作用显著增加荧光分子单重态—→三重态的系间窜跃速率,使荧光减弱或消失.对于重原子溶剂,当处于激发态的荧光分子和溶剂分子发生碰撞时,重原子的P 轨道通过自旋-轨道耦合作用对荧光分子的π轨道产生微扰,打破了不同多重态间跃迁禁阻的 1996年7月Jul.1996 天 津 大 学 学 报JOURNAL OF TIANJIN UNIVERSITY 第29卷 第4期 V o l.29 N o.4 本文1994年8月16日收到.1995年5月16日收到修改稿. * 天津大学青年人才启动基金资助项目. ** 1964年生,男,博士,副教授.Born in 1964,m ale ,Dr .,as sociate prof .
如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般 5纳米是界限，距离短被淬灭 荧光淬灭有以下几种说法: 1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用) 2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物) 3. 转入三重态淬灭 4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭) 首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在 制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水 溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝 灭是不怎么明显的。可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者 相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。 荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨， 而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光 物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。 Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。 荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分 子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物 对大分子构型或构象的影响。 荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相 当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、 产生或恢复。漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白 常会发生。 磁性纳米粒子猝灭量子点的荧光很早就有人研究过。 具体原因： 处于导带的电子在回到价带的过程中，由于磁性纳米粒子的存在，发生了电子转移，量子点导带的电子转移到磁性纳米粒子上，结果荧光发生猝灭。因此，通常制备的磁性-荧光双功能纳 米材料都会在量子点表面修饰一层无机壳、聚合物等材料，降低这种电子转移。
1光致电子转移(PET) 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。具体PET过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图) 由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论来进一步说明(见图1.5)。 2002年Nolan 小组合成了手性的二氮杂环-9-冠-3 衍生物化合物1，它是第一个用来检测Li+的PET 荧光探针[56]。在乙腈溶液中，相较于其它碱金属和碱土金属，能够高选择性的识别锂离子。用280 nm 光激发，不断向溶液中加入
LiClO4，化合物 1（Φ = 0.022）对Li+的滴定表现出 5 倍荧光信号增强效应，表明从胺的冠醚到荧光团的电子转移，荧光量子效率升高（Φ = 0.11），形成 1 : 1 的配合物，结合常数 log β = 5.4。 Gunnlaugsson, Bichell, Nolan, A Novel Fluorescent Photoinduced Electron Transfer (PET) Sensor for Lithium [J]. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 4989-4992. NH H 3C O HN CH 3 O N O N ×× PET PET Li + Bozdemir, Altan Sozmen, Fazli Buyukcakir, et al. Reaction-Based Sensing of Fluoride Ions Using Built-in Triggers for Intramolecular Charge Transfer and Photoinduced Electron Transfer[J]. Organic Letters, 2010, 12(7) : 1400-1403. 2010年Akkaya 等[18]通过在BODIPY 的中位引入一个含三异丙基硅烷的酚盐基团,已知酚盐是强的给电子基团,当被硅烧保护后,酚盐的强给电子能力被抑制,即PET 现象被抑制,所以探针2在与F 离子作用之前发出很强的荧光,当探针与F-离子作用之后,硅浣保护基团被去除,酚盐的强给电子能力恢复,发生PET 现象,荧光被淬灭。在F-离子的浓度达到0.5mM 时,探针的荧光被完全淬灭。
第22卷第1期海南大学学报自然科学版V ol.22N o.1 2004年3月NATURA L SCIENCE JOURNA L OF H AINAN UNIVERSIT Y M ar.2004 文章编号:1004-1729(2004)01-0057-04 荧光素-GOD-HRP荧光淬灭法测定 植物果实组织中的葡萄糖含量 占达东1,王周平2,吕家根3 (1.琼州大学化学系,海南五指山572200;2.西南师范大学化学系,重庆400715; 3.陕西师范大学化学系,西安710062) 摘 要:植物组织中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生的过氧化氢可在辣根过氧化物酶的 催化作用下使荧光素褪色并使荧光淬灭,基于这一现象,笔者建立了一种选择性测定植物果实 组织中葡萄糖含量的荧光分析方法,同时利用这种方法对苹果、鸭梨和酥梨组织液中的葡萄糖含 量进行了测定,并与分光光度法检测的结果及文献值进行了比较,结果表明:该方法具有安全、 方便、准确的优点,适合检测复杂样品尤其是植物中的葡萄糖含量. 关键词:G OD;HRP;植物果实组织;荧光素;荧光淬灭法;葡萄糖 中图分类号:Q554 文献标识码:A 葡萄糖在生物体内具有极其重要的生理意义,有关各种动植物体内的葡萄糖含量的测定已有大量的报道[1～8].由于检测的对象多为血液、组织液和细胞液,这些分析对象的组成往往十分复杂,尤其是植物组织液中的果糖和其他还原性物质常常对葡萄糖的分析产生严重的干扰,因此大多数的检测方法都是基于酶反应的高度选择性来消除各种共存物的干扰的.植物组织液中葡萄糖检测的经典方法是利用G OD催化氧化葡萄糖,使其生成过氧化氢,进而利用HRP催化过氧化氢氧化邻连茴香胺或高香草酸,使其生成有色产物,然后再以分光光度法或荧光法进行检测[8].该方法的主要缺点是邻连茴香胺和高香草酸不仅价格较高,而且都是致癌物质,这不仅会危害操作者的身体健康,同时也会对环境造成污染.本文所介绍的方法是在保留经典方法的高度选择性的同时,用廉价、安全的荧光素取代了连苯胺类物质,使过氧化氢在HRP的作用下氧化荧光素并使其褪色,因此以荧光法来检测剩余荧光素的含量便可间接地测定出葡萄糖的含量.由于荧光素在490nm处有很强的吸收,并在514nm处产生很强的荧光,因而对提高分析方法的灵敏度十分有利.为了使这一方法得到广泛的应用,笔者采用该方法分别测定了苹果、鸭梨和酥梨组织中的葡萄糖含量,并与分光光度法[9]的分析结果和文献报道的数值进行了比较,认为三者之间显示了较好的一致性. 1 实 验 1.1 试剂、材料及仪器 配制0、5、20、50、100、200、300、400mg?L-1的葡萄糖(分析纯)标准溶 收稿日期:2003-04-07 作者简介:占达东(1963-),男,海南琼山人,琼州大学化学系副教授.
荧光淬灭法测定Ni(II) 摘要： 目的运用荧光淬灭法检测工业废水①中的Ni(II)是否达标。 方法镍对邻二氮菲的荧光具有淬灭的特性，本文采取标准曲线法，首先测定一系列邻二氮菲的标准溶液的荧光强度，得到以荧光强度（F）与邻二氮菲浓度（c）的曲线，再测定用过量的邻二氮菲处理的Ni(II)试样的荧光强度，最后间接计算出Ni(II)试样的浓度。 通过标准曲线法课以有效地扣除背景，减小误差，结果相对准确，标准曲线的r2约为0.99925②，通过与环境监测部门给出的数据对比，相对误差较小，结果值得信赖。 关键词：镍邻二氮菲荧光淬灭法 Abstract: Purpose use the fluorescence quenching method to detect Ni (II) in the natural lake. Method this method is based on the quenching of fluorescence of phenanthroline due to the formation of complex Ni (II)-phen. Firstly, determine the fluorescence intensity of a series of o-phenanthroline standard solution, so we obtain a standard curve about fluorescence intensity(F) and o-phenanthroline concentration (c) . Then determine the fluorescence intensity of Ni (II) sample with excess o-phenanthroline treatment, and finally indirectly calculate the Ni (II) sample concentration. Through the standard curve method we can effectively deduct the background, reduce errors, the result is relatively accurate, the standard curve r2 is about 0.99925, and by the comparison of the data given by the environmental monitoring department, the relative error is small, the results reliable. Key words: nickel phenanthroline fluorescence quenching 引言：镍是人体必需的微量元素之一, 对体内某些酶有激活作用及刺激造血机能和促进红细胞再生的作用。但过量亦会中毒③。环境中镍的主要污染来源为：镍矿的开采和冶炼；合金钢的生产和加工过程；煤、石油燃烧时排放烟尘中；电镀、镀镍的生产过程④。测定镍的方法有原子吸收法和ICP-AES法、丁二酮肟分光光度法、极谱催化波等⑤。本文基于镍对邻菲罗啉自身荧光淬灭的作用，进行了痕量镍的测定。该方法具有操作简便，测定快速，重现性好，灵敏度高等特点。应用该方法测定了工业废水中的痕量镍，得到了满意的结果。 ①以某冶金厂的废水为测定样本； ②本文中的测定数据均属由在实验中的分子荧光法测定奎宁含量的实际数据类比之后虚拟而得； ③孙成均. 生物材料检验[M] . 北京: 人民卫生出版社, 2006. 49； ④镍有何毒性与危害?南宁环保局网络课堂2005-06-10； ⑤《PAN- Rh6G 能量转移荧光猝灭法测定痕量镍》，宁玲, 吕昌银, 陈云生, 范翔, 贺元文，2008.05
荧光猝灭一般有静态猝灭和动态猝灭。可以通过测定猝灭常数与温度的关系来区分。静态猝灭是由于猝灭剂与荧光基团发生了结合生成不发荧光的物质，因而当温度升高的时候，体系紊流程度增加，导致猝灭常数减小；而动态猝灭是由于猝灭剂与荧光基团发生碰撞导致荧光强度减少，因而当温度升高，进而体系紊流增大是碰撞加剧，从而猝灭常数增大。你可以查找相关文献比如Y.-Q. Wang, H.-M. Zhang, G.-C. Zhang, W.-H. Tao, S.-H. Tang, Interaction of the flavonoid hesperidin with bovine serum albumin: A fluorescence quenching study, Journal of Luminescence, 126 (2007) 211-218. 无论是动态猝灭还是静态猝灭，F0/F与之间均存在着线性关系，单独通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据而没有提供其他信息的情况下，是很难判断所发生的猝灭现象究竟属于动态猝灭还是静态猝灭。通常需要提供猝灭现象与寿命、温度和粘度的关系及吸收光谱的变化情况等信息。 (1) 变温实验动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下降，同时分子的运动加速，其结果将使分子的扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的程度。根据Stern-V olmer方程作图，如果高温的斜率大于低温的斜率，则为动态猝灭；反之，则为静态猝灭。 (2) 测量吸收光谱动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质的吸收光谱；而在静态猝灭中，基态配合物的生成往往
（一）荧光化合物 为了使用荧光检测器对化合物进行有效的检测，应当了解化合物的结构与发生荧光的关系。 具有对称共轭体系的分子能发射荧光。荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系的分子中，并且随π电子共轭度和分子平面度的增加，荧光效率增大，荧光光谱向长波方向移动。 具有芳香环并带有给电子取代基的化合物，或具有共轭不饱和体系的化合物都能发出荧光。在芳香烃上导入给电子基团，如—OH，—NH2，—OCH3，—NR3等均增强了荧光，主要是由于产生了p-π共轭作用，在不同程度上增强了π电子的共轭。而吸电子基团如—NO2、—COOH 等减弱了荧光。取代基位置对芳香烃荧光的影响通常为：邻位、对位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。 （二）影响荧光强度的因素 pH 值对可离子化的某些荧光化合物的影响很大。例如未解离的苯酚和苯胺分子会产生荧光，但其离子却不产生荧光。苯酚在pH=1 , 的溶液中荧光最强，而在pH=13的溶液中无荧光；苯胺在pH为7-12的溶液中能产生荧光，而在pH<2和pH>13的溶液中都不产生荧光。 溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性，导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强度，随着温度的升高而降低。液相色谱中，荧光检测器通常在室温下操作，可以保证足够的灵敏度。 当样品浓度较高时，荧光物质分子易与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起溶液的荧光强度降低，荧光强度不再与浓度呈线性关系，这种现象称为荧光猝灭效应。其中，样品浓度过大时，荧光在样品池中分布不均匀，以及荧光在未射出样品池之前就被溶液中未被激发的荧光物质吸收的现象又称内滤效应。溶液浓度越大，该效应越显著。 除了荧光物质分子间碰撞及其与溶剂分子碰撞可能引起猝灭外，溶液中其它成分，特别是顺磁性物质的存在，将使猝灭效应加剧。因此，在进行荧光检测时，
5.4 无辐射跃迁和荧光的温度猝灭 5.4.1 无辐射跃迁 绝热近似下局域中心的本征波函数X ψψ=包含两个因子，一个是依赖于原子实位形的电子波函数() ,R r ψ，另一个是描述原子实系统在绝热势中运动的波函数() X R 。一般来说，局域中心系统的总能量与电子-原子实相互作用有关，无法把相互作用能分割为电子的能量和原子实的能量。然而，在绝热近似下，原子实在绝热势中运动，相应的本征能量就很自然的被归之为晶格振动能，而绝热势的极小值，则通常被归之为电子能。在这样的绝热近似下，电子能与晶格振动能不能相互转换。 实际上，我们在作绝热近似时忽略了下面列出的项: 2 212I I I I I X X AX A m ψψψ?? -???+?≡=ψ ?? ?∑ （5.4-1） 其中的算符A 称之为非绝热算符。考虑到这一项的存在，状态X ψψ=不再是严格的定态。两个这种类型的状态，如果能量相同，就可能以一定几率从一个状态跃迁到另一个状态。也就是说，非绝热算符A 把电子和声子的 运动耦合在一起，正是由于这种电子-声子相互作用，会导致中心状态间的跃迁。跃 迁的结果，电子能和声子能都 变了，但跃迁前后二者之和不变。这种过程与辐射场无关，称之为非（无）辐射过程（nonradiative processes ）。 这种非辐射过程大多是由处在较高电子态（因而较低振动态）的中心能级跃迁到较低电子态的能级，两个态的电子能之差0ωp 全部变为晶格振动（声子）能 p ?ω，即 0p p =。 0ω 图5.4-1 无辐射跃迁的位形坐标图
图5.4-1中的箭头示出了一个非辐射跃迁的元过程 Vm Un →。跃迁初态的振动态是上电子态的低振动态，末态是下电子态的高振动态，跃迁前后状态的能量相同，但能量的组成变了，电子能之差变成了振动能 0()p n m p ωωω→-≡ 处在上电子态的中心，可能处在不同的振动态，从这些不同初态都可以通过无辐射跃迁到相应末态。在热平衡条件下，这些无辐射跃迁过程的统计平均就是总 的无辐射跃迁速率。仿照前面关于辐射跃迁的讨论，在热平衡条件下，这种总的无辐射跃迁的速率可表示为： 0002 ,0max(0,) (1),,m p NR p m p A NW N r r u p m v m ∞ =-==-+∑ （5.4-2） 其中，放出的声子数是恒定的， 0p p =，常数N 与跃迁涉及的两个电子 态及相应的电子-声子相互作用有关。通常，N 在1011 s -1到1014 s -1范围内。 或者，利用黄昆的解析表达式(,)p W S m ，该速率可写成： 0000012max(0,) 0120 0()(1)(,)e ()!!()(1)e ()!!p j j S m p NRp j p p j j S m j S m S m A NW S m N p j j S m S m N p j j +∞ -+=-+∞ -+=+==++=+∑∑ （5.4-3） 按照经典弗兰克-康顿原理，电子态间的跃迁最可能发生在上下电子态相应位形坐标曲线的交点所对应的位形。如图5.4-1 所示，上电子态的位形曲线在交点处的振动能量为?E ，在热平衡条件下，处在那样的振动状态的几率正比于玻尔兹曼因子B T e -?E 。因而可以认为无辐射跃迁 几率与之成比例。尽管从式（5.4-2）看这并不一定成立，黄昆讨论了高温强耦合 的情形，得出在这一近似下，无辐射跃迁速率的确满足关系 B k T NR A e -?E 。 （5.4-4）
第5章分子发光—荧光、磷光和化学发光法(Molecular Emisssion and Luminescence)（3学时） 教学目的和要求： 1.学会分子发光——荧光、磷光和化学发光原理。 2.了解分子发光——荧光、磷光和化学发光法的特点和应用。 教学要点和所涵盖的知识点： 荧光、磷光和化学发光原理、仪器、分析方法及应用 重点和难点： 荧光的原理、仪器、分析方法及应用。 分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。 第一节荧光分析法 一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001μg/mL之间。可见比UV-Vis 的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。 二、基本原理 1、分子荧光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。
这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s; 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫(VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。 2、去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括： (1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 (2)内转化(Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 (3)荧光发射 处于第一激发单重态中的电子跃迁至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。 三、荧光与有机化合物的结构 1、跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历π→π*，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生π*→π跃迁而得到荧光。π*→π跃迁常能发出较强的荧光(较大的量子产率)。这是由于π→π*跃迁具有较大的摩尔吸光系数(一般比n→π*大100-1000倍)。
荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。 荧光分子本身浓度增大使其荧光猝灭的现象称为浓度猝灭或自猝灭。 由于荧光的再吸收、荧光物质发生化学变化而观察不到荧光的现象一般不称为荧光猝灭。在利用荧光进行定量、液体闪击计数等包含荧光过程的测定方法中，一定要注意溶剂、共存杂质、氧气等猝灭剂的影响。 利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝灭剂的荧光测定方法，即为荧光猝灭法。一般而言，荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性。分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素. 至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物容易产生荧光,稠环化合物也会产生荧光.饱和的或只有一个双键的化合物,不呈现显著的荧光.最简单的杂环化合物,如吡啶,呋喃,噻吩和吡咯等,不产生荧光。 取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响.苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变.通常给电子基团,如-NH2-,-OH,-OCH3,-NHCH3和-N(CH3)2等,使荧光增强;吸电子基团,如-CL,-Br,-I,-NHCOCH3,-NO2和-COOH,使荧光减弱.具有刚性结构的分子容易产生荧光。 大多数无机盐类金属离子不产生荧光,而某些情况下,金属螯合物却能产生很强的荧光. 溶剂的性质,体系的PH值和温度,都会影响荧光的强度. 荧光分子与溶剂或其他分子之间相互作用,使荧光强度减弱的现象称为荧光猝灭.引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂.当荧光物质浓度过大时,会产生自猝灭现象。