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分子生物学教材修改

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分子生物学实验技术

第一章重组质粒构建实验

实验目的:构建重组质粒

实验试剂:

Trizol

无RNA酶灭菌水。

75%乙醇(DEPC水配置)

异丙醇

氯仿

ddH2O

RT试剂

PCR试剂

SOB肉汤

SOB平板

SOB平板(50 g/ml氨苄青霉素)

Ampicillin

溶液Ⅰ: 50mmol/L 葡萄糖

25mmlol/L Tris·Cl(PH8.0)

10mmol/L EDTA(PH8.0)

在10 lbf/in2(6.895×104pa)高压下蒸汽灭菌15分钟,贮存于4℃。

溶液Ⅱ:

0.4mol/L NaOH

2% SDS

临用前配制,1:1混合

溶液Ⅲ:

5mol/L乙酸钾 60ml

冰乙酸 11.5ml

水 28.5ml

酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

无水乙醇、70%乙醇

BamHI 1套

HindIII 1套

1%琼脂糖凝胶(含EB)

凝胶回收试剂盒 1套

T4 DNA Ligase 1套

1Kb DNA 分子量标准

实验步骤:

一、目的基因的获得

RNA提取

将组织在液氮中磨成粉末后,再以每50~lOOmg组织加入1毫升Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

研磨液室温放置5分钟,然后以每1毫升Trizol液加入O.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。

室温放置15分钟,4℃下l2000g离心10分钟。

取上层水相于一新的离心管,按每毫升Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,l2000g离心10分钟。

弃去上清液,按每毫升Trizol液加入至少1m1的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下75OOg离心5分钟。

小心弃去上清液,然后室温干燥5~10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存在-70℃中。

RT

在冰上操作,依次加入下列试剂

总RNA 0.5μg(1μl)

Oligo(dT) 1μl

混匀,70℃,5min,立刻置于冰上

5Xbuffer 4μl

dNTP混合物2μl(10mM)

RNase抑制剂1μl (1.0U/μl)

混匀,37℃,5min,

逆转录酶1μl (200.0U/μl)

ddH2O up to 20μl

42℃水浴1小时

70℃水浴10分钟终止反应。

cDNA可于-70℃冰箱保存几个月,或-20℃冰箱保存1周。

PCR

ddH2O 34.1μL

10 ×Buffer 5μL

dNTP mixture(2.5mM) 4μL

引物上(20pmol/μL) 1μL

引物下(20pmol/μL) 1μL

MgCl2(25mM) 4μL

模板(102-105拷贝) 0.5μL

DNA Polymerase 0.4μL

总体积50μL

例:如引物的GC含量50%左右,待扩增基因500bp-1kb,参数可设置为:95℃变性处理3min后进入循环,94℃30S、56℃30S、72℃1min,30个循环后72℃延伸7min。同时设立对照组(1)有模板,无引物;(2)有引物,无模板。反应结束后电泳检测。

退火温度和延伸时间是各参数中的关键,其中退火温度主要根据引物的GC含量确定;而延伸时间主要根据扩增的目的基因的长度确定,一般每1kb增加1min。此外,反应体系中Mg2+的浓度也很重要。

提取克隆载体:

挑取1个菌落接种于3mL SOB肉汤(100 g/ml氨苄青霉素)中,37℃, 300rpm振荡培养过夜;取1.5mL-3.0mL菌液13000rpm,4℃离心1min,弃上清,使细菌沉淀尽可能干燥。沉淀加入冰预冷的悬浮液(溶液I)100μL,剧烈震荡混匀;加入新配置的裂解液(溶液II)200μL,倒转几次至液体变清为止;加入冰预冷的中和液(溶液III)150μL,室温下轻轻混匀,置于冰上3-5min, 13000rpm,4℃离心5min;取上清液于

另一只管中,用饱和酚:氯仿:异戊醇进行抽提,13000rpm,4℃离心2min,取上清液加入2倍体积的无水乙醇,震荡混合,室温放置5min,13000rpm,4℃离心5min,弃上清,自然干燥,用30-50μL含无DNA酶的RNase(20μg /mL)的TE溶解,37℃作用30min后,50μL PCR反应体系取0.5-1μL 为模板,后-20℃保存备用。

二、双酶切载体和目的片段

双酶切载体

如酶切位点合适,可提取克隆载体,双酶切出目的片段。

例:克隆载体5μL(1μg)

10×buffer(E) 4μL

10×BSA 4μL

BamHI 1 μL

HindIII 1 μL

ddH2O 25 μL

37℃作用1h,取5μL进行电泳检测,其余的进行凝胶回收后直接用于连接。

双酶切目的片段

如酶切位点合适,可提取克隆载体,双酶切出目的片段。

例:目的片段5μL(1μg)

10×buffer(E) 4μL

10×BSA 4μL

BamHI 1 μL

HindIII 1 μL

ddH2O 25 μL

37℃作用1h,取5μL进行电泳检测,其余的进行凝胶回收后直接用于连接。

凝胶回收采用凝胶回收试剂盒,使用说明如下:

从凝胶上尽量小的切下目的片段,放在一个干净的EP管中,称取凝胶的重量,并加入3倍体积的Buffer S1 (即100mg胶加300μL Buffer S1);盛胶EP管于50℃水浴10min,每2-3min摇动一次,至胶彻底融化;溶液加入到吸附柱内,13000rpm离心1min,弃去收集管中的液体;加入0. 5mL的Buffer W1洗涤DNA,13000rpm离心15sec;弃去收集管中的液体,再加入0.5mL的W1 Buffer,静置1min,13000rpm离心15sec;弃去收集管中的液体,13000rpm离心1min;把吸附柱放在一个干净的EP管内,在柱子膜中央加入30μL Buffer T1, 室温放置1min,13000rpm 离心1min。

凝胶回收后的载体和目的基因,各取5μL电泳检测,并测定浓度以确定连接体系(此步必做)。

三、连接反应

反应体系组成:

5×T4 DNA ligase buffer 4μL

外源DNA 0.3pmol

载体DNA 0.03pmol

T4 DNA Ligase 1μL

ddH2O up to 20μL

可多做几个连接梯度,同时设立对照,如载体的双酶切自连以检测是否酶切完全,载体的单酶切产物连接以检测连接体系和连接酶。23-26℃连接1h。外源DNA与载体DNA的摩尔比为3-10,连接效果较好。

四、转化

于1.5mL离心管中加入100μL感受态细胞,取10μL重组质粒缓慢加入并且边加边搅拌,置冰浴30min、42℃90Sec、迅速冰浴3~5min,加入0.5mL SOB培养基,振荡培养1h。每个抗性平板中加入200-300μL 转化菌,摇动淌匀,自然表面干燥后,37℃培养12-16h。同时将连接对照组也转化细胞,再设立对照:(1)质粒+感受态细胞;(2)无菌水+感受态细胞。培养完毕后,从实验组中筛选出阳性菌落。

五、筛选

挑取数个白色菌落接种于SOB肉汤中,37℃, 300rpm振荡培养3hrs,按上述方法提取质粒。

1.酶切鉴定

提取重组质粒,一部分进行单酶切,一部分进行双酶切,提取原空载体进行单酶切以做对照。点样电泳,并设立marker DNA。

鉴定用酶切均以20μL体系为佳。

例1:双酶切

重组质粒质粒7μL

10×buffer 2μL

BamHI 1 μL

HindIII 1 μL

ddH2O up to 20 μL

37℃作用1h。电泳检测。

例2:单酶切

重组质粒质粒/空载体7μL

10×buffer 2μL

BamHI 1 μL

ddH2O up to 20 μL

37℃作用1h。电泳检测。

2.PCR鉴定

采用Taq聚合酶进行,反应体系为:

ddH2O 38μL

10 ×Buffer 5μL

dNTP mixture(2.5mM) 4μL

引物上(20pmol/μL) 1μL

引物下(20pmol/μL) 1μL

模板(102-105拷贝) 0.5μL

Taq Polymerase 0.5μL

总体积50μL

3.测序

经鉴定为阳性的重组质粒送公司测序。

六、实验结果要求

做出的每个克隆都要求拍出它的酶切鉴定或者是PCR鉴定图谱以存档。

例1:重组质粒的酶切和PCR电泳图谱

例2:重组质粒的PCR 电泳图谱

注:因不同的公司,其产品的剂量和使用有所不同,故以后具体操作时仍需详细阅读产品说明书。

第二章 表达的重组蛋白鉴定实验

实验目的:鉴定表达的重组蛋白的相对分子量和免疫反应性

实验试剂:

1.IPTG 1mol/L

2.SDS-PAGE 试剂

2.1.0.1mol/L 磷酸钠缓冲液(PBS ):1mol/L Na 2HpO 4 68.4ml 1mol/L NaH 2PO 4 31.6ml 。

2.2.2 ×loading buffer :0.1M Tris-HCl pH6.8,4% SDS ,20% Glycerol ,0.2 M DTT ,0.2% Bromophenol Blue 。

2.3.Tris-甘氨酸缓冲液:25mmol/L Tris, 250mmol/L 甘氨酸,0.1%SDS 。

2.4.聚丙烯酰胺(丙烯酰胺,Acrylamide ;N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(Bisacrylamide);十二烷基硫酸钠;N,N,N',N'-四甲基乙烯酰胺(TEMED ;过硫酸胺;考马斯亮蓝R250,

3.Western Blot 试剂

3.1.转移缓冲液: 39mmol/L 甘氨酸,48mmol/L Tris 碱, 0.037% SDS (电泳级),20% 甲醇。

3.2.二抗封闭液:5%(W/V )脱脂奶粉,150mmol/L NaCl ,50mmol/L Tris ·Cl(pH7.5)。

3.3.封闭液:5%(W/V)脱脂奶粉,0.02%叠氮钠,溶于磷酸缓冲盐溶液。

3.4.一抗:兔抗;二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG ,配套显影液。

3.5.无磷酸盐洗涤液:150mmol/L NaCl ,50mmol/L Tris ·Cl(pH7.5)。

实验步骤:

一、诱导表达:

1.重组质粒转化:重组质粒各1μl,加入到100μl感受态大肠杆菌中,设空质粒为阳性对照和感受态大肠杆菌为阴性对照。37℃,培养16h。

2.细菌扩增:用无菌接种环从平板上挑取5个克隆,分别接种到3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,并设阴性对照,300r/min振摇3hrs以上。

3.诱导表达:当振摇至OD值=0.4。每管菌液各取出1ml加入IPTG至终浓度为1mmol/L,另吸出1ml不加IPTG作对照。37℃,300r/min,培养4h。4℃,12000r/min离心1min,弃上清。每管加1ml PBS,混匀,同法离心。弃上清,每管加入50μl PBS、50μl 2×loading buffer,重悬沉淀,100℃煮沸5min,置-20℃备用。

二、SDS-PAGE测定融合蛋白分子量

1.洗净玻璃板,按说明书安装电泳装置。

O 2.3ml,30% Acrylamide 1.3ml,1.5mol/L Tris (pH 8.8)1.3ml,10% 2.配胶:8%分离胶组分为:ddH

2

SDS 0.05ml,10% 过硫酸氨 0.05ml,TEMED 0.004ml。混合后,注入已安装玻璃板的间隙中,上覆纯水

O 3.4ml,30% Acrylamide 0.83ml,1.0mol/L Tris (pH6.8) 0.63ml,隔离空气。5%积层胶5ml组份为:ddH

2

10% SDS 0.05ml,10%APS 0.05ml,TEMED 0.005ml。混合后,加入已凝聚的分离胶上,插入电泳梳子。

3.凝胶电泳:分别将各样品10μl加入凝胶梳孔中,留取一孔加入蛋白Marker10μl,空孔加入10 μl 1 ×loading buffer置于垂直电泳槽内,向上下槽分别加入电泳缓冲液,56V稳压电泳至溴酚蓝指示剂泳动至积层胶与分离胶结合处(约20min左右),调整电压至105V,电泳至指示剂泳动至分离胶下端边缘(约50min 左右)停止电泳。

4.染色:将5倍体积染色液考马斯亮蓝R250加入染色缸中,摇床轻摇1h,至凝胶全部着色。

5.脱色:反复更换脱色液至本底透明,成像仪摄片。

三、W estern blot 鉴定融合蛋白的免疫反应性

1.戴上手套,取下电泳好的凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下,立即放在3张转膜缓冲液浸湿的Whatman 3MM滤纸上,盖上1张经去离子水浸泡的硝酸纤维素滤膜,排除气泡后,盖上另3张同样处理的滤纸,排除气泡。用刀片切除多余的滤纸和滤膜,使其大小均与凝胶完全吻合,用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置。

加满新鲜配制的转膜缓冲液,转好电极位置,使凝胶位于负极,硝酸纤维素滤膜位于正极。400mA恒流电泳75min。

2.封闭:电泳结束后,取下硝酸纤维素滤膜用PBS淋洗后,放入封闭液中,置4℃摇床轻摇1h。

3.一抗反应:取出滤膜放入含1: 1000浓度的第一抗体的封闭液,置4℃摇床轻摇2h。

4.洗涤:废弃封闭液和抗体,用250ml PBS漂洗滤膜3次,每次10min;再用无磷酸盐洗涤液洗涤1次10min。

5.二抗反应:硝酸纤维素滤膜放入含1:700浓度的第二抗体封闭液中,置4℃摇床轻摇1h。

6.洗涤:无磷酸盐洗涤液洗涤3次,每次10min。

显色:显色液临用时配制,取250μl DAB加入10ml无磷酸盐洗涤液、10μl30% H2O2混匀;洗净后的硝酸纤维素滤膜放入显色液中反应3min,用水终止反应,成像仪摄片。

第三章斑点杂交实验

实验目的:

实验器材:

杂交炉,PCR 仪,Bio-Rad 紫外分光光度仪,镊子等。

实验试剂:

1. 尼龙膜,带阳性电荷,Roche公司产品。

2.Herring sperm DNA

3.甲酰胺

4. Denhardt

5.Blocking reagent

6.Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (from sheep): Roche公司产品

NBT/BCIP

7.Buffer 1:50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl。

8. Buffer 2:90%Buffer 1、10% 封闭液。

9. Buffer 3:100mM Tris-HCl(pH9.5)、100mM NaCl、50 mM MgCl。

10. 显色液:25μl NBT(100mg/ml)、19μl BCIP(50mg/ml),加5ml Buffer 3。

11. 终止液:10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA。

12.杂交buffer: 50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液、25μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA。The hybridization buffer can be stored frozen at -20℃.

13. 10% SDS (w/v)

14. 20×SSC: 3M NaCI, 0.3 M Na-citrate, pH7.0 (20℃)

15. 2×SSC; 0.1% SDS (w/v), sterile.

16. 0.1×SSC; 0.1% SDS (w/v), sterile.

17. Buffer 4: 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH8.0 (20℃)

实验步骤:

1.膜预处理: 将膜分为若干个点样区域,两个点样区域间相距0.5cm,每个点约3mm直径(光滑平整的吸管的直径大小)。先将膜在水中浸湿,然后浸在20×SSC中,约15min。取出膜,将膜上的溶液滴尽后平放于两层滤纸中间,于室温晾干10min,直至膜微干,不滴水。同时将probe置于沸水浴中10min,冰上骤冷2.点样:带正电荷的尼龙膜,每个探针点样约2μl,在80℃烘烤2h。

3.预杂交:42℃,2hrs.

将膜放置于封口袋或者盒子中,按每平方厘米尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。将杂交袋放入预先加热到42℃的杂交炉或者水浴中。预杂交液:50%甲酰胺、5×SSC、2×Denhardt溶液、25μg/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA。轻轻摇晃。预杂交与杂交之间不要使膜干燥。

4.杂交:

PCR扩增产物纯化后然后定量,煮沸5分钟,置冰浴(热变性)。

弃预杂交液,换新的杂交液,加入探针,使其浓度在40-100ng/ml, 混匀,继续于42℃杂交16hrs。5.100 ml 的buffer 1洗膜15min,洗2次,洗去未结合的抗体。

6.加抗体:用Buffer1 稀释anti-Dig-AP反应液(1:3000-5000),反应1hr。弃液后,用buffer 1洗膜15min,洗2次。

7.20ml 的buffer 3平衡5min。

8.显色:加入显色液5ml,显色,避光反应30min-1hr或过夜。显色过程中不要振荡混匀。

9.50ml 的buffer 4洗膜5min,终止反应。

杂交膜可以保存在封有buffer 4的袋子中。

第四章重组质粒构建的策略

第一节连接反应的策略

可以采用几种策略来进行外源DNA片段和质粒载体的连接。对此,可依据外源DNA片段末端的性质,以及质粒载体与外源DNA上限制酶切位点的性质来作出选择。

第二节定向克隆

用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段,也就是最容易克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。

以下是一个典型的用DNA快速连接酶将双酶切后的目的片段与相应双酶切后载体连接、转化、鉴定的操作过程:

一、酶切反应:

1.第一步酶切:

1)PCR产物10μl,纯水24μl,10×Buffer 4μl,第一个内切酶 2μl;

2)质粒10μl,纯水24μl,10×Buffer 4μl,第一个内切酶2μl;

混匀,37℃反应1h。

2.第一步酶切产物纯化

各取每管酶切产物加入等量酚:氯仿:异戊醇振荡混匀,4℃12000g 离心2min。取上清,加入含1/10体积3mol/L NaAc(pH7.0)的2.5倍无水乙醇沉淀,-20℃放置过夜,4℃12000g 离心15 min,70%乙醇洗涤1次,4℃12000g离心8 min,离心,弃上清,干燥。最后加15μl纯水溶解,10μl用于第二步酶切反应,5μl 用于电泳观察结果。

3.第二步酶切反应

1) PCR第一步酶切产物10μl,纯水24μl,10×Buffer 4μl,第二个内切酶 2μl;

2) 质粒第一步酶切产物10μl,纯水24μl,10×Buffer 4μl,第二个内切酶2μl;

4. 酶切产物纯化(珠子纯化法)

4.1.酶切产物用1%电泳分离各条带,同时以PCR产物以及第一次酶切产物作为对照。100V电压,电泳30min后在弱紫外光下用刀片切取目的片段的琼脂糖凝胶。

4.2.把切下的琼脂糖凝胶块放置在1.5ml eppendorf管中,加入琼脂糖溶解液400μl,DNA吸附珠子10μl,置55℃水浴10min,每2min混匀一次。

4.3.12000g离心1min,弃上清。加入无水乙醇1ml,12000g离心1min,弃上清,重复一次。4.4.沉淀内加入20μl洗脱液,混匀,置室温10min,12000g离心1min。

4.5.吸取上清,加入含1/10体积3mol/L NaAc(pH7.0)的2.5倍无水乙醇沉淀,-20℃放置过夜,4℃12000g 离心15 min,75%乙醇洗涤1次,4℃12000g 离心8 min,弃上清,沉淀干燥。最后加15μl 1×连接dilution Buffer溶解,取5μl用于紫外定量。

二、连接反应:

在eppendorf 管中加入双酶切载体5μl,双酶切目的片段5μl, 2×连接Buffer 10μl,T4 DNA快速连接酶1μl,混匀后置于20℃水浴中反应30min。

三、重组质粒转化大肠杆菌

1.将上述10μl的连接反应物与100μl感受态大肠杆菌混匀,并以未酶切的质粒转化感受态大肠杆菌作阳性对照,感受态大肠杆菌作阴性对照,冰水浴30min,42℃水浴90S,再冰水浴5min,加450μl LB培养基,125r/min 37℃振摇1h。

2.抗性筛选:取上述转化后的菌液200μl均匀地涂于含合适浓度、相应抗生素的固体培养基平板表面,置于37℃孵箱内18h后观察结果;同时取未转化质粒的感受态菌涂布于不含抗生素的固体培养基平板表面作阴性对照。

四、PCR筛选阳性克隆

1.用无菌接种环从含抗生素的固体培养基平板上挑取5个较大的、边缘整齐、表面光滑的克隆,分别接种到5ml含抗生素的LB培养基中,振摇过夜,同时以转化空载体质粒的大肠杆菌作PCR作阴性对照。2.模板处理:菌液直接变性,无菌取上述菌液各100μl,装于eppendorf 管中,100℃煮沸5min,同时设阳性对照。

3.PCR反应。

4.结果观察:取5μl PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min后,在紫外检测仪上观察结果。

五、双酶切鉴定阳性克隆

1.取上述PCR阳性的克隆,留存菌种。

2.余下的菌液取1.5ml按第一章方法抽提质粒,沉淀溶于20μl去离子水中。

3.电泳观察抽提结果:各取1μl质粒,在含0.5μg/ml EB的1.0%琼脂糖凝中电泳,100V电压电泳30min 后,在紫外检测仪上观察结果。

4.阳性克隆的酶切反应:取上述抽提后的质粒各4μl,置于eppendorf管中,分两步进行酶切反应,酶切体系同上,空载体作为对照。

5.电泳观察结果:取上述酶切产物各10μl,以酶切后空载体及原位PCR产物作对照,在含1.0%琼脂糖凝胶中电泳,100V电压电泳30min后,在紫外检测仪上观察结果。

第三节制备大肠杆菌感受态细胞

一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

下面的简单方案是Cohen等(1972)的所用方法的变通方案,常用于成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性好,该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃,但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。

1)从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm),转到一个含有100ml LB或LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约3小时(旋转摇床,300转/分)。为得到有效转化,活细胞

值来监测培养物的生长情况。

数不应超过108细胞/ml,可每隔20-30分钟测量OD

600

值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大,因此有必要通过测量确定大肠杆在菌株与菌株之间,OD

600

菌菌株的生长培养物在生长周期的不同时相的OD

值,并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂平皿

600

以计算每一时相的活细胞数,从而使分光光度读数得到标化。

2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌,一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管(Falcon 2070)中,在冰上放置10分种,使培养物冷却至0℃。

切记:下述所有步骤均需无菌操作。

3)于4℃用Sorvall GS3转头(或与其相当的转头)以4000转/分离心10分钟,以回收细胞。

4)倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。

重悬每份沉淀,放置于冰浴上。

5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl

2

6)于4℃用Sorvall GS3转头(或与其相当的转头)以4000转/分离心10分钟,以回收细胞。

7)倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。

8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl

,重悬每份细胞沉淀。

2

此时,可将细胞分装成小份,放于-70℃冻存。在这些条件下,尽管长期保存后转化效率会稍有下降,

但细胞仍可保持处于感受态。

溶液中保存24-48小时,在贮存的最初12-24小时Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于4℃在CaCl

2

内,转化效率增加3-5倍,然后降低到初始水平。

9)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量心管中,每管加DNA(体积<10μl,DNA<50ng ,轻轻旋转混匀内容物,在冰中放置30分钟。

试验中一定要包括下面的对照。

A:加入已知量的标准超螺旋质粒DNA制品的感受态细胞。

B:完全不加质粒DNA的感受态细菌。

10)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上,恰恰放置90秒,不要摇动试管。

11)快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1-2分钟。

12)每管加800μl LB培养基。用水浴培养基加温至37℃,然后将管移到37℃摇床上,温育45分钟使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率,在复苏期中,应温和地摇动细胞(转速不超过225转/分)。

13)将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移至含相应抗生素的LB琼脂培养基上。如培养物体积太小(<10μl)。可再加肉汤培养基,用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。

如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞,应离心浓缩细胞,然后用适量LB轻轻重悬细胞。

如用四环素抗性作为选择标记,全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上(或铺在软琼脂中),然而如选用氨苄青霉素抗性,则只能将一部分培养物(根据实验决定)铺在单独的平皿上,氨苄青霉素抗性菌落数的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系,这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长抑制物质的缘故。

14)将平板置于室温直至液体被吸收

15)倒置平皿,于37℃培养,12-16小时后可出现菌落。

如检查氨苄青霉素抗性,用转化细胞铺平板时密度应较低(每个90mm平板不超过104菌落),于37℃培养平板时不应超过20小时,氨苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中,迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样,培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素,以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml,可使情况有所改善,但不能彻底根除之。

二、高效感受态细胞的制备:

1)接种环或无菌牙签从含有相应抗生素的LB固体平板中挑取单一菌落,置于含有相应抗生素的LB液体培养基37℃、300rpmin培养过夜。

注:培养基中抗生素原浓度各稀释1000倍,氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL,卡那霉素50μg/mL。

2)从培养液中取2%~5%的接种量置于含有相应抗生素的LB液体培养基37℃、300rpmin培养3个小时左右,即杆菌处于对数期阶段。

3)于4℃将细菌移置离心管(冰上操作)。

4) 4℃、4000rpm离心5min,弃上清。

5) 加预冷的TFB1,每50mL细菌加15mL,冰上放置90min。

6) 4℃、4000rpm离心5min,弃上清。

7) 加预冷的TFB2,每50mL细菌加2mL,混匀。

8) 以每管100-200μL的量分装于eppendorf管,储存于液氮或-70℃中。

TFB1:15%甘油TFB2:10mM MOPS

100mM RbCl 10mM RbCl

50mM MnCl275mM CaCl2

30mM 乙酸钾15%甘油

10mM CaCl2 用KOH调pH至6.8,过滤除菌

pH 5.8,过滤除菌

第四节含重组质粒的细菌菌落的鉴定

常用5种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落;

1)小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析。

2)а互补。

3) 插入失活。

4)杂交筛选。

5)PCR筛选

第五节 PCR产物直接克隆

人们总希望可以将PCR产物进行克隆,从而可用于杂交分析。高质量的DNA测序或从复杂的PCR反应体系中分离出某一单一产物。克隆一般操作较复杂,需经酶切,纯化等一系列步骤,近年来发展起来的PCR 产物直接克隆,通过改变PCR产物的末端结构可快速获得高效的克隆。原理是根据Taq DNA聚合酶的一个非模板依赖的聚合酶作用,通常在PCR反应结束后Taq DNA 聚合酶在DNA双链的3’末端自动加上一个核苷,dNTP混合物的dATP首选。因此PCR产物通常是3’末端多带有一个dATP。当酶切后的平端载体和dTTP 及Taq DNA聚合酶在合适的条件下反应时,则可得到3’末端仅多出一个dTTP的载体,此载体称为T载体。T载体与PCR产物在连接酶的作用下,T-A互补配对,其连接效率大大超过单纯平端连接,此法可以方便地将PCR产物直接进行克隆。

一、材料

5μg载体DNA (如pUC19或M13mp18等)

TE缓冲液,pH8.0

5?扩增缓冲液(含适量的Mg++浓度)

5mM dNTP

5U/μl Taq DNA聚合酶

模板DNA

PCR扩增仪

二、方法

1、用产生平端的酶消化5μg载体DNA,取50ng电泳以检测酶切是否完全,剩余的酶切产物用酚/氯仿抽提一次,乙醇沉淀回收,最终溶于25μl TE缓冲液(pH8.0)

2、加T末端反应

5μg平端DNA载体

20μl 5?扩增缓冲液

20μl 5mM dTTP

1μl(5U) Taq DNA聚合酶

加水至总体积100μl

75℃孵育2小时

此时应注意Mg2+应是2~5mM。如此产生的T载体足够用于多次克隆。

3、将靶DNA在适当的条件下进行扩增,最后在70℃~75℃延伸5~15分钟以确保所有产物3’端均带上

A尾巴。

4、连接反应

8μl 模板DNA(0.1~5μg)

10μl 2?连接缓冲液

1μl 10mM ATP

1μl T载体

20~500U T4连接酶

15℃反应过夜

5、取1~10μl连接产物至感受态大肠杆菌,铺平板过夜,筛选阳性重组克隆。

第五章蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷,由于在多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下,每克多肽约可结合1.4g去污剂。借助已知分子量的标准参照物,则可测算出多肽链的分子量。然而,对多肽主链所进行的修饰,例如N-糖基化或O-糖基化,将显著影响其表观分子量。因此,糖基化蛋白的表观分子量不能正确反映其多肽链的实际分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行,其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。当两电极间接通电流后,凝胶中形成移动界面,并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后,复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力,故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。

最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964)和Davis(1964)设计的,样品和积层胶中含Tris·Cl(pH6.8),上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分离胶中含 Tris·Cl (pH8.8)。系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)。样品和积层胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域,它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高,有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。

聚丙烯酰胺凝胶由通过N,N′一亚甲双丙烯酰胺一类双功能试剂进行交联的丙烯酰胺聚合链组成。SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无实用价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成SDS多肽复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随双丙烯酰胺:丙烯酰胺比例的增加而变小,比率接近1:20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按双丙烯酰胺:丙烯酰胺为1:29配制,试验表明它能分离大小相差只有3%的多肽。

凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。下表给出了用5-15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺a浓度(%)线性分离范围(kD)

15 12-43

10 16-68

7.5 36-94

5.0 57-212

a双丙烯酰胺:丙烯酰胺摩尔比为1:29

第一节 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制

一、试剂

(一)丙烯酰胺和N,N′一亚甲双丙烯酰胺

有多个厂家出售的电泳级丙烯酰胺不含金属离子。应以温热(以利于溶解双丙烯酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N,N'-亚甲双丙烯酰胺的贮存液,丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸,这一脱氨基反应是光催化或碱催化的,故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液应置棕色瓶中贮存于室温,每隔几个月须重新配制。

小心:丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤,其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。

(二)十二烷基硫酸钠(SDS)

有多个厂家出售特级SDS,其纯度可满足电泳的要求。尽管其中任何一种SDS均能获得可重复的结果,但都不能互相替换。当以某一厂家的SDS替代另一厂家的产品时,多肽的迁移图谱变化甚大。故建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用。SDS可用去离子水配成10%(w/v)贮存液保存于室温。

(三)用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液

制备这些缓冲液必须使用Tris碱。使Tris碱完全溶于去离子水后,按附录B的方法用HCl调节溶液的pH 值。如用Tris·C1(或称Trizma)来配制缓冲液,则盐浓度太高而使多肽在凝胶中发生不规则迁移,导致蛋白带极度扩散。

(四)TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。有多个厂家可提供电泳级TEMED。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用,因此pH值较低时聚合反应受到抑制。

(五)过硫酸铵

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解,故应隔周新鲜配制。

(六) Tris一甘氨酸电泳缓冲液

这一缓冲液含25mmol/LTris碱、250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)、0.1% SDS,可配成5×贮存液备用。在900m1去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸,然后加入50m1 10%(w/v)的电泳级SDS贮存液,用去离子水补至1000m1量则成5×贮存液。

二、装置

使用不连续缓冲系统要求在垂直板凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺电泳。虽然自Studier(1973)引入此系统后,电泳槽和电极板的基本设计模式没有多大改变。但目前许多厂商出售的装置都各有许多小的改进。选购哪一套系统可各有所好,见仁见智,但同一实验室只使用同一型别的装置乃明智之举。这种标准化有利于比较不同操作者所得到的结果,并可望破损的装置能够利废更新。

第二节 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制

(一)根据厂家说明书安装玻璃板。

(二)确定所需凝胶溶液体积(这些数据一般由厂家提供),按下表给出的数值在一三角锥瓶中按需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分,一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

这里推荐使用的过硫酸铵浓度比有些工作者所用的浓度高,这可省却通过脱气排除丙烯酰胺溶液中的溶解氧(它可延缓聚合过程)的操作。

配制Tris—甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液

不同体积(m1)凝胶液中各成分所需体积(m1)

溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50

6%

水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5

30%丙烯酰胺溶液 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.00

1.5mo1/L Tris 1.3

2.5

3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5

(pH8.8)

10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04

8%

水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2

30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.3

1.5mol/l Tris 1.3

2.5

3.8 5.0 6.3 7.5 10.00 12.5

(pH8.8)

10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03

10%

水 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8

30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7

1.5mo1/L Tris 1.3

2.5

3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5

(pH8.8)

10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

12%

水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5

30%丙烯酰胺溶液 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0

1.5mo1/L Tris 1.3

2.5

3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5

(pH8.8)

10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

15%

水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5

30%丙烯酰胺溶液 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.0

1.5mo1/l Tris 1.3

2.5

3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5

(pH8.8)

10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5

TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

(三)迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注积层胶所需空间(梳子的齿长再加1cm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层0.1%SDS(当丙烯酰胺浓度≤8%时)或异丁醇(当丙烯酰胺浓度≥10%)。将凝胶垂直放置于室温下。覆盖层可防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。

(四)分离胶聚合完全后(30分钟),倾出覆盖层液体,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰

胺。尽可能排去凝胶上的液体,再用纸巾的边缘吸净残留液体。

(五)按下法制备积层胶:按下表给出的数据在一个一次性使用的塑料试管中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液,依次混合各成分。一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下一步操作。

配制Tris-甘氨SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液

不同体积(m1)凝胶液中各成分所需体积(ml)

溶液成分 1 2 3 4 5 6 8 10

水 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8

30%丙烯酰胺溶液 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7

1.0mol/L Tris(pH 6.8)0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25

10%SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1

10%过硫酸铵 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1

TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01

(六)在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶,立即在积层胶溶液中插入干净的Teflon梳子。小心避免混入气泡,再加入积层胶溶液以充满梳子之间的空隙,将凝胶垂直放置于室温下。

Teflon梳子应用水洗干净,临用前用乙醇擦试,挥发至干。

(七)当积层胶发生聚合时,可把样品置于1×SDS凝胶加样缓冲液中,在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。 1×SDS凝胶加样缓冲液

50mmol/L Tris·C1(pH 6.8)

100mmo1/L二硫苏糖醇(DTT)

2% SDS(电泳级)

0.1%溴酚蓝

10%甘油

不含二硫苏糖醇(DTT)的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,临用前必须从1mol/L二硫苏糖醇贮存液(见附录B)中现用现加于上述缓夜中。

必须将分子量已知的标准参照蛋白样品同时变性。适当大小的各种多肽的混合物已经商品化.

(八)积层胶聚合完全后(30分钟),小心移出Teflon梳子,使用能喷射水流的瓶子,立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要,使用接于注射器的平头皮下注射针头把积层胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶固定于电泳装置上,上、下槽各加入Tris一甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡,为此最好使用接上注射器的弯形皮下注射针头。

Tris一甘氨酸电泳缓冲液

25mmol/L Tris

250mmol/L 甘氨酸(电泳级)(PH8.3)

0.1% SDS

可配成5×贮存液备用,在900ml去离子水中溶解15.1g Tris碱和94g甘氨酸,然后加入50ml 10%(w/v)的电泳级SDS贮存液,用去离子水补至1000ml则成5X贮存液。

上样前不要预电泳,以免破坏缓冲系统的不连续性。

(九)按预定顺序加样,每样品加15μl,为能把样品加到样品孔底部,最好使用Hamilton微量注射器,每加完一个样品应在下槽缓冲液中洗涤加样注射器。最后在所有不用的样品孔中加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。

(十)将电泳装置与电源相接(正极应接下槽),凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后,把电

压提高到15V/cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约需4小时),然后关闭电源。

(十一)从电泳装置上卸下玻璃板,放在纸巾上,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔(第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

切记:如果凝胶将用于Western印迹反应,则不要切角。

(十二)至此,凝胶可被固定并用考马斯亮蓝或硝酸银染色,进行荧光自显影或放射自显影,或用于Western 印迹反应。

第三节用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色

经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的多肽可用甲醇:冰乙酸固定,并同时用考马斯亮蓝R250染色。考马斯亮蓝R250,是一种三苯甲烷纺织染料,又称酸蓝83。可将凝胶放在这一染料的甲醇-乙酸浓溶液中浸泡数小时,然后经过长时间的脱色而使过量染料从凝胶上扩散出去。

(一)在90ml甲醇:水(1:1,v/v)和10m1冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250,用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。

(二)用至少5倍体积的染液浸泡凝胶,放在平缓摇动的平台上于室温染色4小时以上。

(三)移出并回收染液以备后用,将凝胶浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液[见步骤(一)]中,平缓摇动4-8小时,其间应更换脱色液三四次。

(四)脱色越充分,考马斯亮蓝染色法的蛋白质检出下限就越低,脱色24小时通常能检测到单一条带中含量低至0.1μg的蛋白质。

采用下述方法可加快脱色速度:

a.使用30%甲醇、10%乙酸的混合液脱色。但若脱色时间延长,将会降低蛋白质的染色强度。

b.使用正常的脱色液在较高温度下(45℃)脱色。

c.在正常脱色液中加入数克阴离子交换树脂或放入一块海绵,以吸附从凝胶上洗脱下来的染料。

d.在商品化的装置中进行电泳脱色。

(五)脱色后,可将凝胶浸于水中,长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。但是,将经过固定的凝胶保存于水中会发生溶胀并在贮存中出现变形。为避免这一问题,经固定的凝胶应保存于含有20%甘油的水中,染色后的凝胶不应在脱色液中保存,否则会导致已染色的蛋白带褪色。

(六)为保留永久性记录,可对已染色的凝胶进行拍照,或把染色的凝胶干燥成胶片保存。

第四节 SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥

含有S35标记氨基酸的放射性标记蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶进行放射自显影前必须预先干燥。干燥中遇到的主要问题有:①凝胶的收缩与变形;②凝胶的破裂。先把凝胶贴附在一张Whatman 3MM滤纸之上再进行脱水处理,可以使上述第一个问题减轻到最低限度;但对第二个问题则尚无把握解决。对于聚丙烯酰胺浓度较高而又比较厚的凝胶,这一问题更为突出。凝胶往往在尚未干透却被取下干胶机时发生破裂。因此有必要使干胶机保持良好的工作状态并使用压力较少波动的可靠真空管,也有必要尽可能在符合实验要求的前提下采用最薄的凝胶。

有许多厂商出售干胶机,最好是选购来自所用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳装置的同一制造厂商的产品。这样往往可有更大的余地选择适当规格的凝胶干燥机,以便既与凝胶大小相匹配,也适于同时容纳多块SDS 聚丙烯酰胺凝胶。

(一)从电泳装置上卸下凝胶,于室温以5—10倍体积的冰乙酸:甲醇:水(10:20:70)混合液固定之。酸性固定液扩散进入凝胶后溴酚蓝将变黄,蓝色全部褪尽之后,继续固定5分钟,然后用去离子水将凝胶略洗一下。

如果在干胶过程中凝胶老是发生破裂,可在步骤2)前先把已固定的凝胶在20%甲醇、3%甘油的溶液中浸泡过夜。

(二)把凝胶平置于一张比凝胶稍大的Saran包装膜上,切角处应置于右下方。

(三)在湿胶上放置一张干燥的Whatman 3MM滤纸,滤纸的尺寸应适度,既在凝胶四边多出1—2cm的边缘,

却又恰好放入干胶机中。一旦滤纸与凝胶面贴上,不能再移动。

(四)在干燥机上另外放置一张3MM滤纸,其尺度必须足以覆盖所有需要同时干燥的凝胶。

(五)把放置妥当的3MM滤纸-凝胶-Saran包装膜夹层置于干胶机滤纸上,Saran包装膜应在最上面。

(六)关上干胶机上盖,开始抽气以使上盖把凝胶四周封闭起来。如果干胶机上装配有加热器,可开启低档加热(50--65℃)以加速干燥。

(七)根据制造厂商推荐的数据掌握干胶时间(一般0.75mm标准胶需要2小时)。如果使用加热器,应在停止加热数分钟后方可撤除真空。

(八)从干胶机上取下已粘附于3MM滤纸上的凝胶。

(九)撕下Saran包装膜,进行放射自显影或保存脱水凝胶作为实验记录。

第六章蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体:固定化蛋白质的免疫学测定(Western 印迹法)

第一节蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体

用于Western印迹法的固相支持体己有多种,其中包括重氮苯硫醚纸、重氮苄氧甲基纸、溴化氰活化纸、氰尿酰氯纸以及活化尼龙等。在上述各种情况下,从凝胶上转移的蛋白质均与固相支持体共价结合。虽然这类固相支持体容量最大并能更牢固地结合蛋白质,但一般难于制备,而且在蛋白质转移之前可能还需要把凝胶中的甘氨酸浸泡出来。此外,像尼龙膜这样的带电荷支持体,还可能无法高效地结合带同种电荷的蛋白质。故止,目前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上(Burnette,1981)。

有两种电泳装置可供进行电转移时选用,老式的一种须把凝胶的一面与硝酸纤维素滤膜相接触,然后将凝胶及与之相贴的滤膜夹于Whatman 3MM滤纸、两张多孔垫料以及两块塑料板之间。把整个结合体浸泡于配备有标准铂电极并装有pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液的电泳槽中,使硝酸纤维素滤膜靠近阳极一侧(见图),然后接通电流约12小时。在此期间,蛋白质从凝胶中向阳极迁移而结合于硝酸纤维素滤膜上。为了防止过热并因而导致在夹层中形成气泡,转移过程应在冷室中进行。

在比较新的一种装置中,凝胶及与之相贴的硝酸纤维素滤膜夹于事先用含有Tris、甘氨酸、SDS和甲

醇的转移缓冲液浸泡过的Whatman 3MM滤纸之间,然后把结合体夹在石墨电极板之间,硝酸纤维素滤膜朝阳极一侧。蛋白质转移可于室温进行1.5—2小时便可完成。

上述两种方法都卓有成效,其间的选择见仁见智,主要是各人所好。但由于后者节省时间而且不需要大电流,因此我们更偏向于使用第二种方法。下面将予详细介绍。

(一)当SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳行将结束时,用蒸馏水淋洗石墨板,然后用Kimwipes纸或其他不被吸收的纸巾揩干电极板上粘附的液滴。

(二)戴上手套,切6张Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素滤膜(Millipore HAWP或相应的滤膜),其大小都应与凝胶大小完全吻合。如果滤纸或滤膜面积大于凝胶,滤纸和滤膜伸出的边缘就大有机会相接触,造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。用软铅笔在滤膜一角作好标记。

拿取凝胶、3MM滤纸和硝酸纤维素滤膜时必须戴手套。因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向滤膜转移。

(三)把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的水面上,借毛细作用使之从下往上湿润后,将之浸没于水中,浸泡5分钟以上以驱除留于滤膜上的气泡。

(四)在一浅托盘中加入少量转移缓冲液,把6张3MM滤纸浸泡于其中。

转移缓冲液

39mmol/L 甘氨酸

48mmol/L Tris碱

0.037% SDS(电泳级)

20%甲醇

配制1L转移缓冲液,需称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris碱、0.37g SDS,并加入200ml甲醇,加水至总量为1L。

(五)戴上手套按如下方法安装转移装置:

a.平放底部电极(将为阳极),石墨一边朝上。

b.在这一电极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的3MM滤纸,逐张叠放,精确对齐,然后用一玻璃移液管作滚筒以挤出所有气泡。

c.把硝酸纤维素滤膜放在3MM滤纸堆上,要保证精确对齐,而且在3MM滤纸与硝酸纤维素滤膜之间并不留有气泡。

d.从电泳槽上撤出放置SDS聚丙烯酰胺凝胶的玻璃,把凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下,然后准确平放于硝酸纤维素滤膜上。把凝胶左下角置于硝酸纤维素滤膜的标记角上,戴手套排除所有气泡。

切记:为避免发生短路,不要切去凝胶的左下角。

e.把最后3张3MM滤纸放在凝胶上方,同样须确保各层精确对齐并不留气泡。

(六)将靠上方的电极(阴极)放于夹层物上,石墨一边朝下。连接电源(将阳极导线或红色导线接于底部石墨电极)。根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流,电转移1.5-2小时。

(七)断开电源并拔下槽上插头,从上到下拆卸转移装置,逐一掀去各层把凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘进行染色,以便检查蛋白质转移是否完全。

(八)可做可不做:取出硝酸纤维素滤膜置于一张干净的3MM滤纸上,于室温干燥:30-60分钟。

使硝酸纤维素滤膜干燥,据称可以改善滤膜在随后的处理中保留蛋白质的能力。但是,这也可能导致蛋白质进一步变性并因此改变其免疫反应性.所以干燥滤膜对某些蛋白质/抗体组合来说可能是优点,但对另一些组合则可能是缺点,此一时而彼一时,只能针对具体靶蛋白根据实验来决定。

(九)切去滤膜的左下角,以免铅笔标记[步骤二]被抹去。按用丽春红S(Ponceau S)或印度墨汁(India ink)给滤膜染色。仅当Westen印迹法使用放射性标记抗体或探针检测时才使用印度墨汁。

第二节封闭硝酸纤维素滤膜的免疫球蛋白结合位点

正如从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移出来的蛋白质可以与硝酸纤维素滤膜结合一样,免疫学检测试剂中的

蛋白质同样也能与之结合。Western印迹法的灵敏度取决于封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。现已设计的封闭液有多种,其中脱脂奶粉(Johnson等,1984)最为价廉物美,既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况,也就是当牛奶中可能含有要用Western印迹法检测的蛋白质时,不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。

(一)把硝酸纤维素滤膜放入可以加热封接的塑料袋中(Sears Seal-A-Meal或相应的牌号),根据滤膜面积以0.1m1/cm2的量加入封闭液,尽可能排除里面的气泡,然后密闭袋口,平放在平缓摇动的摇床平台上于室温温育1—2/小时。

封闭液

5%(w/v)脱脂奶粉

0.01%防沫剂A

0.02%叠氮钠,溶于磷酸缓冲盐溶液

小心:叠氮钠有毒,使用时应戴手套谨慎操作,含有叠氮钠的溶液应标记清楚。

如果免疫探针的非特异结合背景仍然太高以致难以接受,可加入Tween 20至终浓度为0.02%。在大多数情况下,加入这种去污剂不至影响抗体与靶抗原的特异性结合。

(二)剪开塑料袋,弃去封闭液,立即加入抗靶蛋白抗体溶液与滤膜一同温育[方法见第三节一]。

第三节第一抗体和靶蛋白的结合

实际上,Western印迹膜的检测分两步进行:首先靶蛋白特异性的非标记抗体在封闭液中先与硝酸纤维素滤膜一同温育。经洗涤后,再将滤膜与二级试剂——放射性标记的或与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白抗体或A蛋白一同温育。进一步洗涤后,通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原—抗体—抗体或抗原—抗体-A蛋白复合物在硝酸纤维素滤膜上的位置。

间接法即两步检测法的主要优点是使用单个二级试剂则可测定多种多样的第一抗体,从而免却了逐一纯化并标记各种第一抗体之累。因为向厂商购置的二级免疫试剂,价格颇为低廉,所以可大大节约时间和金钱。

一、用抗靶蛋白的第一抗体与硝酸纤维素滤膜共温育的方法

(一)在装有用(上页第二节)所述方法处理过的硝酸纤维素滤膜的塑料袋中,按每平方厘米0.1m1的量加入封闭液和适量的第一抗体。

封闭液

5%(w/v)脱脂奶粉

0.01%防沫剂A

0.02%叠氮钠,溶于磷酸缓冲盐溶液PBS

如果免疫探针的非特异结合背景仍然太高以致难以接受,可加入Tween 20至终浓度为0.02%。在大多数情况下,加入这种去污剂不至影响抗体与靶抗原的特异性结合。

应进行预实验并按实际情况确定第一抗体的加量,推荐使用以下稀释度:

a.多克隆抗体:1:100—1:5000。

b.杂交瘤细胞培养上清液:不稀释一1:100。

c.带杂交瘤小鼠的腹水:1:1000—1:10000。

(二)尽可能排除藏匿的气泡后密封袋口,将滤膜平放在平缓摇动的摇床平台上,于4℃温育2小时。

也有报道指出,为了提高靶抗原的检测灵敏度,可延长温育时间(于室温温育长达18小时)。但非特异性结合背景是温育时间和温度的函数,延长时间或提高温度都会引起背景升高。

(三)剪开塑料袋,废弃封闭液和抗体,用250ml PBS漂洗滤膜3次,每次10分钟。

(四)按下面介绍的方法,立即用二级免疫试剂与滤膜一同温育。

第四节用二级免疫试剂与硝酸纤维素滤膜温育的方法

二级试剂(通常是抗免疫球蛋白抗体或A蛋白)可用125I进行放射性标记,也可与辣根过化物氧酶或

碱性磷酸酶共价偶联。与酶共价偶联的免疫球蛋白和A蛋白均有商品出售。

虽然放射性标记和酶标记的二级试剂都同样十分好用,但有时会由于放射性标记过程过于激烈而导致抗体失活,因此大多数研究者更倾向于使用经厂家试验的酶联试剂。

一、放射性标记第二抗体

(一)经磷酸缓冲盐溶液最后一次洗涤后[本节一、步骤(三)],把硝酸纤维素滤膜转移到一个可以加热封接的塑料袋中(如Sears Seal一A—Meal),其中按滤膜面积含0.1ml/cm2的新鲜封闭液。每平方厘米滤膜面积加入约104计数/分的放射性标记二级试剂。

封闭液

5%(w/v)脱脂奶粉

0.01%防沫剂A

0.02%叠氮钠,溶于PBS

小心:叠氮钠有毒,使用时应戴手套谨慎操作,含叠氮钠的溶液应标记清楚。

如果免疫学探针的非特异结合背景仍然太高以致无法接受,可加Tween 20至终浓度为0.02%。在大多数情况下,加入这种去污剂不致影响抗体与靶抗原的特异性结合。

(二)平放在平缓摇动的摇床平台上,于室温温育1—2小时。

(三)剪开袋口,把滤膜快速转移到250m1的PBS中,把塑料袋和放射性液体丢弃于放射性废物桶中。(四)用PBS漂洗滤膜,每10分钟换液1次。反复漂洗,直至用手提式小型探测仪在滤膜的无蛋白区检测不到放射性为止。

(五)最后从漂洗液中移出滤膜平放于一叠纸巾上,晾10分钟至干。

(六)把滤膜安放于一张Whatman 3MM滤纸上,并在纸上打上放射性标签。

放射性标签可以在粘性标签纸或标签带上点上放射性墨水制成,标签随后将贴于3MM滤纸的面上。在微量离心管内加入印度墨汁,然后加入少量Tran 35S label(ICN Radiochemicals)或32P即可配成放射性墨水。可用带纤维笔尖的笔来打点,这根笔应设为专用并醒目地贴上放射性物质的专用提示标签。

(七)待放射性墨水干后,用Sara包装膜包封3MM滤纸,然后夹上X光片并加上增感屏,置—70℃曝光。

二、酶联二级试剂

(一)经PBS最后一次洗涤后[见本节一、步骤(三)],把硝酸纤维素滤膜转移到装有200m1 150mmol/L NaCl、50mmol/l Tris·Cl(pH7.5)溶液的托盘中,于温室平缓摇动温育10分钟。

切记在加入酶联第二试剂之前须清除滤膜上的叠氮钠和磷酸盐。

(二)把滤膜转移至一个加热封接的塑料袋(如Sears Seal-A-Meal)或一浅托盘中,按滤膜面积加入0.1ml/cm2无磷酸盐、无叠氮钠的封闭液。

无磷酸盐、无叠氮钠的封闭液

5%(w/v) 脱脂奶粉

150 mmol/L NaCl

50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)

(三)根据厂家说明书加入酶联二级试剂,如果使用塑料袋则应予封口。二级试剂的稀释度一般推荐用1:200---1:2000,以使终浓度达到0.5—5.0ug/ml。

(四)于室温平缓摇动,将滤膜与酶联二级试剂一同温育1小时。

(五)把滤膜转移至一浅托盘上,内装200m1的150mmol/L NaCl、50mmol/l Tris·C1(pH7.5)溶液。于室温平缓摇动,温育10分钟。再重复上述步骤3次,每次更换新的NaCl-Tris·C1溶液。

(六)按下文介绍的方法加入合适的生色底物。

(七)

第五节酶联抗体生色底物的使用

一、碱性磷酸酶经免疫反应固定的碱性磷酸酶可催化底物5一溴-4-氯-3-引哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP /NBT)在原位转变为深蓝色化合物。

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现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学:以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象,从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学:偏重于核酸(基因)的分子生物学,主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程,也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列(核苷酸、氨基酸)的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术(基因工程) ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学) ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间:19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一:肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二:噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括: ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑,标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些? ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5~10位获诺贝尔奖的科学家,简要说明其贡献。

建立一个分子生物学实验室所需的仪器

分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术,这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,从而可以深入分析基因结构与功能,并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线: 1) 分离制备目的基因或DNA片段; 2) 目的DNA与载体在体外进行连接; 3) 重组DNA分子转入宿主细胞; 4) 筛选及鉴定阳性重组体; 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器:

二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性,使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选,基因组中特定基因序列的定量定性检测,基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器: 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易,产量高和成本低廉等优点,使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是:表达缺乏翻译后加工,得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物,具有易培养,繁殖快,便于基因操作等优点,渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达

分子生物学实验设计报告-四川大学

分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构,其中65至67位氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)形成发光团,为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变,就可以改变GFP中的氨基酸,得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白(简称EGFP) 传统的PCR产物克隆方法主要有两种:一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点,PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上;另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力,过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法,旨在克服上述缺陷,它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入,而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克隆的重组载体,这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入大肠杆菌体内,通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法,省

时,快捷,但容易出现假阳性。为了避免这种情况,我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理: ~

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数:又称分配系数,是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析:确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志,分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶:指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交:在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭,用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR:是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达:外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除:是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因,从分子水平上设计实验,将该基因从动物的原基因组中去除,或用其它无功能的DNA片断取代,然后从整体观察实验动物表型,推测相应基因的功能。 8.物理图谱:人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”,以碱基对(bp,kb,Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图:不同质荷比的离子经质量分析器分开后,到检测器被检测并记录下来,经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光:激光束照射细胞时,光以90度角散射的讯号,用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析:是以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解:从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移:用电泳技术将凝胶中的蛋白质,DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物,形成印迹。 15.多重PCR:是在一次反应中加入多对引物,同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签(Tag),表达产物为融合蛋白(有分N端或者C端融合表达),方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组:发生在DNA同源序列之间,有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map),它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”,以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子:广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光:激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

分子生物学实验报告

分子生物学实验 院系:生命科学与技术学院 专业:生物科学(基地) 班级: 201101班 学号: 姓名: 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力,生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备;DNA的重组;PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进细胞中去进行繁殖和表达,需要运载工具,携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体(vector)。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增;(3)载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择性的遗传标记,如有抗四环素基因(Tc r),抗新霉素基因(Ne r)等,以此知道它是否已进入受体细胞,也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件,它是基因工程中常用的载体之一。 质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1~120kb之间,具

有双链闭合环状结构的DNA分子,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型(stringent control)和松弛控制型(relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制,在细胞里,它有许多拷贝,一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等,拷贝数较少,复制受到严格控制。小的质粒,如ColE Ⅰ质粒(含有产生大肠杆菌素E1基因),拷贝数较多,复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,染色体DNA复制受阻,而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝,此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%-50%。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106-107范围内,如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106,质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内,共价闭环DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA)常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫做开环DNA(open circular DNA,简称ocDNA)。在电泳时,同一质粒如以cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度快,因此在本实验中,自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1.掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2.了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂

细胞和分子生物学实验重点知识点汇总

细胞和分子生物学实验重点知识点汇总 Experiment1细胞有丝分裂 间期:有明显的细胞核,染色质分布较均均,由于染色质易与碱性染料结合,故细胞核的染色比细胞质深。核中可见1~3个染色较浅的呈球状的核仁 前期:细胞核膨大,染色质逐渐螺旋化为丝状的染色丝,其后染色丝进一步缩短变粗,形成一定形态和书目的染色体(这时候的每条染色体由两条染色单体组成,但在光镜下一般不易看清),核膜、核仁逐渐消失 中期:每条染色体中的成对染色单体逐渐分开(但着丝粒仍未分离)全部染色体(2n=16)移向细胞中央的赤道面上,形成赤道板。在赤道板到两面有许多纺锤丝连接细胞两极和染色体的着丝点,成为纺锤体,但不易观察到,此时染色体形态最典型 后期:着丝粒纵裂为二。这是,每条染色体的两条染色单体已完全分开,由于纺锤丝的牵引,分别向细胞的两极移动,形成了数目相等的两组染色体(这是所观察到的染色体数目比原来增加1倍,是由于S期内DNA含量倍增的结果) 末期:染色体移到两极并解旋为染色质,细胞中部出现细胞板,并逐渐向边缘发展。当染色质构成核网时,核膜、核仁重新出现。细胞板达到两边,分裂结束,形成两个子细胞,细胞又进入间期状态。 Experiment2动物染色体的制备 原理:染色体只有在分裂期的细胞,特别是中期细胞中表现出典型形态便于观察和计数,所以必须采取特殊的技术方法,从发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备。骨髓细胞数量多、分裂旺盛,不需体外培养和无菌操作,便于取材。 秋水仙素的作用:抑制纺锤体的形成,使细胞停留在分裂中期 KCl低渗溶液:使细胞膨胀,促使中期染色体散开 固定液:有固定作用,对染色体还有一定的分散作用 Giemsa染色液:染色 结果:低倍镜下,可见到许多大笑不等被染成紫红色呈圆形的间期细胞核以及分散在它们之间的中期分裂象。小鼠染色体一般呈“U”形,染色体2n=40

现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)

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一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验:先将光滑型致病菌(S型)烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌(R型)分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力;当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时,实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠,发现有大量活的S型细菌。实验表明,死细菌DNA 进行了可遗传的转化,从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌:当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸,子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌,经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测,子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质,但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念:基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。

二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质:1、分子结构相对稳定;2、能够自我复制,使亲、子代之间保持连续性;3、能指导蛋白质的合成,从而控制生命过程;4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性:1、进化上极端保守,特别是H3、H4;2、无组织特异性;3、肽链上氨基酸分布的不对称性;4、存在较普遍的修饰作用;5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白:HMG蛋白;DNA结合蛋白;A24非组蛋白

真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列,而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值,在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的,高等生物的C 值一般大于低等动物,但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大,这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类:不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点:1、真核生物基因组庞大,一般都远大于原核生物的基因组;2、真核基因组存在大量的的重复序列;3、真核基因组的大部分为非编码序列,占整个基因组序列的90%以上,这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别;4、真核基因组的转录产物为单顺反之;5、真核基因组是断裂基因,有内含子结构;6、真核基因组存在大量的顺式元件,包括启动子、增强子、沉默子等;7、真核基因组中存在大量的DNA多态性;8、真核基因组具有端粒结构。

现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第三版)上

第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答:脱氧核糖核酸(DNA, Deoxyribonucleic acid),核糖核酸(RNA, Ribonucleic acid)4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质?写出这些实验的主要步骤。 答:一,肺炎双球菌感染实验,1,R型菌落粗糙,菌体无多糖荚膜,无毒,注入小鼠体内后,小鼠不死亡。2,S型菌落光滑,菌体有多糖荚膜,有毒,注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3,用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内,小鼠不死亡; 二,噬菌体侵染细菌的实验:1,噬菌体侵染细菌的实验过程:吸附→侵入→复制→组装→释放。2,DNA中P的含量多,蛋白质中P的含量少;蛋白质中有S而DNA中没有S,所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质,用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后,细菌体内无放射性,即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部;而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后,细菌体内有放射性,即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三,烟草TMV的重建实验:1957年,Fraenkel-Conrat等人,将两个不同的TMV株系(S株系和HR株系)的蛋白质和RNA分别提取出来,然后相互对换,将S株系的蛋白质和HR株系的RNA,或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起,重建形成两种杂种病毒,去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答:1,DNA重组技术;2,基因表达调控研究;3,生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学;4,基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体,DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白,它与DNA组成核小体,含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等,他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体,在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构,这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下,由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕,每圈6个核小体,形成外径为30nm,内径10nm,螺距11nm的螺线管,这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构,称为超螺线管,这是染色

细胞分子生物学名词解释最全版

, 内膜系统的膜结构破裂后自己重新封闭起来的小囊泡(主要 是内质网和高尔基体), 是异质性的集合体, 形态、大小及功能常因生物种类和细胞类型不同而异。据微体内含有的酶的不同可分为过氧化物酶体、糖酵解酶体和乙醛酸循环体。在蛋白质合成过程中,同一条mRNA分子能够同多个核糖体结合,同时合成若干条蛋白质多肽链,结合在同一条mRNA上的核糖 叠的多肽链相互作用的蛋白质,能够加速正确折叠的进行或提供折叠发生所需要的微环境。动物体细胞在体外可传代的次数,与物种的寿命有关,它们的增殖能力不是无限的, DNA在核小体连接处断裂成核小体片 色体末端的特殊结构,即染色体末端DNA 序列的多个重复,其作用是保护和稳定染色 RNA 依赖性DNA 聚合酶,为一种核糖核蛋白酶,是合成端粒必需的酶。在双线期中,交叉数目逐渐减少,在着丝粒两侧的交叉向两端移动.这个现象称为 成染色体联会的两条同源染色体互相紧靠,进而缠绕在一起,基质开始附着到染色丝上,成为一条短而粗的染色体。据染色体被拉向两极所受到的力的不同,后期可分为后期A 和后期B,此时的染色体 启动DNA复制的关键因子,是真核细胞DNA M期促进因子。

能够促使染色体凝集,使细胞由G2期进入M 物质多肽的形式合成,其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列。引导前体多肽 是指具有摄取、处理及提呈抗原能力的细胞,能摄取病原体蛋白并将其加工将成短肽段,呈递给T细胞。 ,从中 于高等真核细胞中,是内层核被膜下纤维蛋白片层,纤维纵横排列整齐呈纤维网络状。 成串排列在一起,主要集中在染色体的着丝 DNA和组蛋白构成,是染色质的基本结构 在一定时期的特种细胞的细胞核内, 它由不表达的DNA序列组成, 分裂过程中,核仁出现周期性变化。一般在分裂前期逐渐消失,其纤丝和颗粒成分散失于核质之中;在分裂末期又重新出现。核仁的形成常与特定染色体的一定区域密切相关。 色体片段, 通过次缢痕与染色体主要部分相连。 指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、 是卵母细胞进行第一次减数分裂时, 停留在双线期的染色体。含4条染色单体,形似灯刷。 由核内有丝分裂产生的多股染色单体平行排列而成。

分子生物学名词解释

RFLP:个体之间DNA的核苷酸序列存在差异,称为DNA多态性。由于碱基组成的变化而改变了限制性内切酶的酶切位点,从而导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化,称为RFLP。 翻译:是指在多种因子辅助下,由tRNA携带并转运相应氨基酸,识别mRNA上的三联体密码子,在核糖体上合成具有特定序列多肽链的过程,称为翻译。突变:DNA的结构发生永久性改变,即突变. 转化:通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 转导:当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。受体:是细胞膜上或细胞内能识别外源化学信号并与之结合的成分,其化学本质是蛋白质,个别糖脂。 粘粒:又称柯斯质粒,是一类由人工构建的含有λDNA 粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。它是为克隆和增殖真核基因组DNA的大区段而设计的,是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。质粒:是存在于细菌染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。端粒:以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体,仅在真核细胞染色体末端存在。端粒DNA由重复序列组成,人类端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC. 克隆:通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 探针:用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”。 转录:以DNA为模版,由DNA依赖的RNA聚合酶(RNApol)催化4中NTP聚合,生成RNA 的过程。 增强子:其含有多个作用原件,可以特异性地与转录因子结合,增强基因的转录活性的段短DNA序列。 启动子:能被RNA聚合酶特异性识别并与其结合,启动转录的DNA序列。 操纵子:由功能相关的一组基因在染色体上串联,共同构成的一个转录单位。沉默子:某些基因的负性调节元件,当其结合特异蛋白因子时,对基因转录起阻遏作用。 反转录:在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。 点突变:DNA序列上单个碱基的改变称为点突变,可分为转换与颠换两种。 信号肽:是分泌蛋白新生肽链N端的一段能被细胞转运系统识别的保守性的氨基酸序列。 领头链:顺着解链方向生成的子链,复制是连续进行的,这股链称为领头链。G蛋白:鸟苷酸结合蛋白(G protein)简称G蛋白,亦称GTP结合蛋白。是一类含乌苷酸的蛋白质,存在于细胞外膜内表面,为生物信息转导过程中关键的中介体,可以决定信号传输通路何时打开和关闭。 SD序列:mRNA起始密码子AUG上游8~13个碱基处存在的一段特定的核苷酸序列,该序列称为SD序列,是mRNA的起始密码子之所以能与小亚基定位结合的关键。SD序列与小亚基中16SrRNA3’端的互补序列配对结合,使起始密码子定位于翻译起始部位。 RNA编辑:可在改变转录后RNA的序列,而使翻译得到的蛋白质的序列与推导的不同。其机制有两种即位点特异性脱氨基作用和指导RNA(gRNA)介导的尿嘧啶插入和删除。 RNA复制:以RNA作为基因组的病毒称为RNA病毒,这类病毒除反转录病毒外,在宿主细胞都是以病毒的单链RNA为模板合成RNA,这种RNA依赖的RNA 合成又称为RNA复制。 RNA干扰,RNAi:是由双链RNA引发的转录后基因静默机制。在此过程中,与双链RNA有同源序列的mRNA被降解,从而抑制该基因的表达。是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNA干涉:是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程,可使基因表达受到抑制。 反义RNA:指与mRNA互补的RNA分子,也包括与其它RNA互补的RNA分子。 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类:Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA 的S D序列和(或)部分编码区,直接抑制翻译,或与靶mRNA结合形成双链RNA,从而易被RNA酶Ⅲ降解;Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合,引起mRNA构象变化,抑制翻译;Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。RNA聚合酶:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。 是催化以DNA为模板(template)、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。 RNA印迹:利用与DNA印记相类似的技术来分析RNA,成为RNA印记。 DNA的变性:在某些理化因素作用下,DNA双链解开成两条单链的过程。DNA复性:在适当条件下,变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象,这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程称为退火。 DNA损伤:各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化称为DNA损伤。DNA印迹:DNA样品经限制性内切酶消化后行琼脂糖凝胶电泳,将含有DNA区带的凝胶在变性溶液中处理后,再将胶中的DNA分子转移到NC膜上。DNA克隆:应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。也称基因克隆或重组DNA DNA载体:为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 DNA芯片技术:基因芯片,将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果。 cDNA文库:cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA 经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体,它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 基因组DNA文库:基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息(包括所有的编码区和非编码区)以DNA片段形式贮存的克隆群体。 PCR技术:利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成,可将微量目的DNA片段大量扩增。可用于已知序列或部分已知序列的检测;或扩增出已知片段,再利用其他方法作进一步分析。灵敏度高、产率高、重复性好、快速简便,已成为基因诊断的主要和首选技术。但易出现假阳性,应注意优化实验条件。 逆转录PCR:将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术,先以RNA 为模板,在逆转录酶的作用下的作用下合成cDNA,再以cDNAcDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。基因:合成有功能的蛋白质,多肽或RNA所必需的全部DNA序列,是基因组的一个功能单位。 基因组:细胞或生物体中,一套完整单倍体的遗传物质的总和。 癌基因:细胞内控制细胞生长和分化的基因,它的结构异常或表达异常,可以引起细胞癌变。 原癌基因:是细胞中的必需基因,进化过程中序列高度保守,对维持细胞正常生理功能、调节细胞生长与增殖起重要作用。但如受到致癌因素作用下可发生变化,表达产物的质或量改变或表达的时空方式改变,而导致细胞恶性转化。 抑癌基因:又名抗癌基因(TSGs ) 、隐性癌基因。是一种抑制细胞生长和肿瘤形成的基因。在生物体内与癌基因功能相抵抗,共同保持生物体内正负信号相互作用的稳定。 管家基因:执行重要生物功能,在生物体几乎全体细胞中持续表达的基因。如rRNA、通用转录因子、代谢酶系、细胞骨架蛋白等。 奢侈基因:仅在特定细胞内选择表达的基因,决定分化细胞的独特性状。 结构基因:基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。 目的基因:我们感兴趣的基因或是DNA序列 病毒癌基因:指致癌病毒存在的某些核苷酸序列,能引起细胞转化。 基因表达:是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程,合成特定的蛋白质,进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。 基因敲除:指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因,从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程。 基因诊断:利用分子生物学技术方法,直接检测体内DNA或RNA的结构或水平的变化以及是否存在异常的外源核酸,从而对疾病作出诊断的方法。 基因治疗:基因治疗是指通过一定方式将目的基因或有治疗作用的DNA片段导入人体的靶细胞,使其发挥生物学效应,从而达到治疗疾病目的技术疗方法。基因增补:不删除突变的致病基因,而在基因组的某一位点额外插入正常基因,在体内表达出功能正常的蛋白质,达到治疗疾病的目的。 基因置换:用正常基因通过重组原位替换致病基因 基因失活:有些疾病是由于基因的过度表达引起的,向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸,如干扰小RNA等,可降解相应的mRNA或抑制其翻译,阻断致病基因的异常表达,达到治疗疾病的目的。 基因工程:实现基因克隆所采用的方法及相关的工作,称基因工程, 又称重组DNA。 基因组文库:基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息(包括所有的编码区和非编码区)以DNA片段形式贮存的克隆群体 基因表达的时间特异性:按功能需要,某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生,称之为基因表达的时间特异性 基因表达的空间特异性:在个体生长全过程,某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现,称之为基因表达的空间特异性。 组成性基因表达:无论表达水平高低,管家基因较少受环境因素影响,而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。区别于其他基因,这类基因表达被视为组成性基因表达。 第二信使:环腺苷酸(cAMP)、环鸟苷酸(cGMP)、甘油二酯(DAG)、三磷酸肌醇(IP3)、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)、Ca2+等可以作为外源信息在细胞内的信号转导分子,称为细胞内小分子信使,或称为第二信使。 生长因子:通过质膜上特异的受体,将信息传递至细胞内部,调节细胞生长与增殖的多肽类物质。 解链温度:解链过程中,紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。 转录模板;即以双链DNA中的确定的一条链(模板链用于转录,编码链不用于转录)为转录模板. 转录因子:真核基因的转录调节蛋白又称转录调节因子或转录因子。 转录空泡:是由DNA双链,RNA聚合酶与新合成的RNA局部形成的结构,它贯穿于延长过程的始终。 遗传密码:DNA编码链或mRNA上的核苷酸,以三个为一组(三连体)决定一个氨基酸的种类,称为三联体密码。转录和翻译是连续的,因此遗传密码决定蛋白质的一级结构。 原位杂交:利用核酸分子单链之间互补的碱基系列,将有放射性或非放射性的外源核酸与组织、细胞或染色体上待测的DNA或RNA互补配对,结合成专一的核酸杂交分子,经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。 Southern blot杂交:是研究DNA图谱的基本技术,在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的方法是将标本DNA用限制性内切酶消化后,经琼脂糖电泳分离各酶切片段,接着,使酶切片段DNA发生变性并转印到一固相支持物 (通常是硝酸纤维素薄膜或尼龙膜)上,经固定后和标记探针进行杂交。这种方法不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因,而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息。 Northern 印迹(Northern blot):是通过检测RNA的表达水平来检测基因表达,将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上,定性分析mRNA的常用方法. Western blot (蛋白免疫印迹)技术:是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印到化学合成膜的支撑物上,利用特异性抗体进行反应,定性分析蛋白质。诱导/阻遏表达:在特定环境信号的刺激下,基因的表达开放或增强 / 关闭或下降的现象。 阻遏蛋白:可识别、结合细菌基因的操纵序列,在转录水平抑制基因表达的蛋白质。 蛋白激酶:能够将γ-磷酸基团从磷酸供体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。 克隆载体:为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体:为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。生物芯片:又称DNA芯片或基因芯片,它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 核酸探针:指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段单链DNA或RNA分子。 印迹技术:利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上,使之成为固相化分子。“blotting”,译为印迹技术。 接合作用:当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)的DNA转移称为接合作用。 回文结构:在DNA链上,两个拷贝反向串联在一起,中间没有间隔序列。 转基因动物:应用转基因技术培育的携带外源基因并能稳定遗传的动物。 冈崎片段、后随链:在DNA复制过程中,以亲代链(5’→3’)为模板时,子代链的合成不能以3’→5’方向进行,而是按5’→3’方向合成出许多小片段,因为是冈崎等人研究发现,因此称冈崎片段。由许多冈崎片段连接而成的子代链称为后随链。

现代分子生物学总结题库

第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因(遗传因子)是遗传的物质基础,是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称,携带有遗传信息的DNA序列,是具有遗传效应的DNA分子片段,是控制性状的基本遗传单位,通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复(DNA repairing)是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤,只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这修复功能,就无法对付经常在发生的DNA损伤事件,就不能生存。对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃)。 DNA损伤的改变类型:a、点突变:指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。b、缺失:指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入:指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数,则发生读框移动(reading frame shift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frame-shift mutaion)。d、倒位或转位:(transposition)指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂:对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组,(Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构(Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除(geneknockout),是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性和高度保守性。

常见细胞分子生物学名词及其释义

附录常见细胞分子生物学名词及其释义 α-actinin α-辅肌动蛋白一种使肌动蛋白成束的蛋白,有两个相距较远的肌动蛋白结合位点,故形成的肌动蛋白纤维束较为松散。 Akinase (PKA) A激酶因细胞内cAMP浓度升高而被激活催化靶蛋白磷酸化的酶。accessorycell 辅佐细胞在免疫应答过程中,能摄取、加工、处理并将抗原信息提呈给淋巴细胞的免疫细胞,又称抗原提呈细胞. actin 肌动蛋白真核细胞中含量丰富,是构成肌动蛋白丝的一种蛋白质。单体称球形肌动蛋白(G-actin),聚合物称丝状肌动蛋白(F-actin)。 actin-bindingprotein 肌动蛋白结合蛋白在细胞中与肌动蛋白单体或肌动蛋白纤维结合的、能改变其特性的蛋白质。 actinin 辅肌动蛋白一种肌动蛋白结合蛋白,集中分布在Z线和与质膜结合的应力纤维点状黏附端。 actin-relatedprotein(ARP) 肌动蛋白相关蛋白促进肌动蛋白丝集结的蛋白质复合物。activetransport 主动运输溶质通过细胞膜逆浓度梯度运输的现象,是一个耗能的生理过程。 actomere 肌动蛋白粒由未聚合的抑丝蛋白—肌动蛋白复合物和一小段肌动蛋白丝束组成的结构。一旦抑丝蛋白—肌动蛋白复合物发生解离,则引起肌动蛋白聚合成丝。actomyosin 肌动球蛋白肌肉收缩时肌动蛋白与肌球蛋白瞬时接触形成的复合物。adaptin 衔接蛋白参与成笼蛋白衣被形成的一类蛋白质,能同时与跨膜受体以及成笼蛋白结合,在两者间起衔接作用。 adaptorprotein 衔接器蛋白在细胞内信号传递途径中,凡是在不同蛋白质问起连接作用的蛋白质的通称。 adducin 聚拢蛋白质膜骨架蛋白,为异二聚体。在钙离子浓度为毫摩级时,加速血影蛋白到血影蛋白—肌动蛋白复合物的装配。 adherensjunction 黏台连接在质膜的胞质面附着有肌动蛋白纤维的细胞连接,包括连接相邻的上皮细胞的黏着带和体外培养的成纤维细胞底面的黏着斑(focalcontact)。 adhesion plaque(focal adhesion,focal contact) 鞘着斑(斑状黏附) 细胞与非细胞性基底物间形成的黏附结构。该处的质膜中含有整联蛋白分子群,分子的胞外结构域与细胞外基质组分相连,胞内结构域通过接合器蛋白与微丝相连。 adhesion protein 黏附蛋白质存在于细胞外基质中的与细胞黏附于基质有关的一类蛋白质,包括纤连蛋白、层连蛋白和血纤蛋白原等。在细胞的黏附、迁移、增殖、分化等活动中起作用。 adult stem cell 成体干细胞;组织细胞(tissue stemcell) 存在于一种组织或器官分化细胞中的未分化细胞,具有自我更新的能力,并能分化成来源组织的主要类型特化细胞。有的成体干细胞具有可塑性,在一定条件下,可分化成许多不同类型的细胞。 allosome,heterochromosome 异染色体主要和全部由异染色质组成的染色体,如人的Y 染色体和超数B染色体。 amitosis 无丝分裂又称直接分裂,不形成染色体和纺锤体,细胞核直接一分为二,随后细胞质分裂成两个子细胞。多见于某些原生生物中,如纤毛虫等。 mnmlytical cytology 分析细胞学对细胞成分进行定性、定量研究的一门科学。 mphase 后期有丝分裂(或减数分数)过程中的一个阶段.在此阶段中姊妹染色单体分离,并向细胞两极移动,纺锤体延伸和纺锤体两极间距离增加。 anchorage-dependentcell (依赖)贴壁细胞只有贴附于不起化学作用的物体表面时才能生

现代分子生物学考研复习重点

现代分子生物学考研复习资料整理 第一章绪论 分子生物学:是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构及其重要性、规律性和相互关系的科学 分子生物学的主要研究内容 1、DNA重组技术 2、基因表达调控研究 3、生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 5、DNA的复制转录和翻译 第二章染色体与DNA 半保留复制:DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂,双螺旋解旋并被分开,每条链分别作为模板合成新链,产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样,因此,每个子代分子的一条链来自亲代DNA,另一条链则是新合成的,所以这种复制方式被称为DNA半保留复制 DNA半不连续复制:DNA双螺旋的两条链反向平行,复制时,前导链DNA的合成以5′-3′方向,随着亲本双链体的解开而连续进行复制;后随链在合成过程中,一段亲本DNA单链首先暴露出来,然后以与复制叉移动相反的方向、按照5′-3′方向合成一系列的冈崎片段,然后再把它们连接成完整的后随链,这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制称为DNA 的半不连续复制 原核生物基因组结构特点:1、基因组很小,大多只有一条染色体2、结构简练3、存在转录单元,多顺反子4、有重叠基因 真核生物基因组的结构特点:1、真核基因组庞大,一般都远大于原核生物的基因组2、真核基因组存在大量的重复序列3、真核基因组的大部分为非编码序列,占整个基因组序列的90%以上,该特点是真核生物与细菌和病毒之间最主要区别4、真核基因组的转录产物为单顺反子5、真核基因是断裂基因,有内含子结构6、真核基因组存在大量的顺式作用元件,包括启动子、增强子,沉默子等7、真核基因组中存在大量的DNA多态性8、真核基因组具有端粒结构 DNA转座(移位)是由可移位因子介导的遗传物质重排现象 DNA转座的遗传学效应:1、转座引入插入突变2、转座产生新的基因3、转座产生的染色体畸变4、转座引起生物进化 转座子分为插入序列和复合型转座子两大类 环状DNA复制方式:θ型、滚环型和D-环型 第三章生物信息的传递(上)从DNA到RNA 转录:指拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程 启动子:是一段位于结构基因5′段上游区的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性 原核生物启动子结构:存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区,其是RNA聚合酶与启动子的结合位点,能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力 终止子:是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列(促进转录终止的DNA序列) 终止子的类型:不依赖于ρ因子和依赖于ρ因子 增强子:能增强或促进转录起始的序列 增强子的特点:1、远距离效应2、无方向性3、顺式调节4、无物种和基因的特异性5、具

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