第27卷第4期2008年4月 分析测试学报FENX I CESH I XUEBAO (Journal of I nstrumental Analysis ) Vol 127No 14396～400
收稿日期:2007-05-06;修回日期:2007-08-06
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20665003);教育部科学技术研究重点资助项目(207087);广西自然科学基金资助项目
(0728214)
第一作者:陈绪胄(1982-),男,广西容县人,硕士研究生
通讯作者:李建平,Tel:0773-*******,E -mail:likianp ing@2631net
新型磁性纳米金修饰过氧化氢生物传感器的研制
陈绪胄,李建平,俞建国
(桂林工学院 材料与化学工程系,广西 桂林 541004)
摘 要:利用共沉淀法合成纳米Fe 3O 4颗粒,将半胱氨酸吸附到纳米Fe 3O 4微粒表面,借助半胱氨酸的巯基
(—S H )对纳米金的强烈吸附,使纳米金自组装到磁性颗粒上,再通过静电吸附作用自组装辣根过氧化酶
(HRP ),合成了Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 纳米复合粒子,最后通过磁力将其修饰到固体石蜡碳糊电极表面,制得
新型过氧化氢生物传感器。以对苯二酚作为电子媒介,用计时电流法对H 2O 2进行测定,线性范围为214×10-3～610×10-6mol/L,检出限(S /N =3)为215×10-6mol/L,响应时间小于10s 。磁性纳米微粒Fe 3O 4/Cys/
Au 能够高效地保持HRP 的生物活性。该新型传感器已用于实际样品测定。
关键词:磁性纳米粒子;辣根过氧化酶;生物传感器;自组装
中图分类号:S951142 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2008)04-0396-05
Devel opment of a Novel Magnetic Nano Gold Modified
Hydr ogen Per oxide B i osens or
CHEN Xu 2zhou,L I J ian 2p ing,Y U J ian 2guo
(Depart m ent of Materials and Chem istry Engineering,Guilin University of Technol ogy,Guilin 541004,China )
Ab s trac t:Based on the Fe 3O 4/cysteine /Au /horseradish per oxidase (HRP )particles abs orbed on the
s olid paraffin carbon paste electr ode thr ough a magnet,a novel hydr ogen per oxide bi osens or was de 2
vel oped .U sing hydr oquinone as the electr on mediu m ,the H 2O 22sensing p r operties were studied u 2
sing cyclic volta mmetric and chr onoa mper ometric techniques .Vari ous experi m ental para meters,such
as the hydr oquinone concentrati on,pH,the te mperature,and the app lied potential were op ti m ized .
The linear range of the calibrati on curve f or H 2O 2by chr onoa mper ometry was 214×10
-3-610×10-6mol/L with a detecti on li m it of 215×10-6mol/L (S /N =3).The res ponse ti m e was less than 10s .
I nterferences fr om other bi ol ogical compounds were als o studied .
The Fe 3O 4/cysteine /Au particles could maintain the enzy matic activity of HRP efficiently .
The sens or has been used for the deter m ina 2
ti on of H 2O 2in disinfectant with satisfact ory results .Key wo rd s:magnetic nanoparticles;horseradish per oxidase;bi osens or;self 2asse mbly
磁性纳米粒子具有独特的超顺磁性、量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应及宏观量子隧道效应等,在外加磁场条件下易于分离、富集、回收,能够广泛应用于工业、生物工程、环境监测、临床医
学、食品工程等领域[1-5]。当前,由于实际生产需要,将磁性纳米粒子功能化成为研究热点,已不断
涌现出新型复合磁性纳米粒子。在过氧化氢生物传感器研究领域中,辣根过氧化酶是一种重要的分析试剂,近年来酶的固定技术得到很大的发展,主要包括物理吸附、静电吸附、共价交联法、包埋法等,纳米金由于具有良好的稳定性、导电性、生物兼容性、强吸附性、催化性能好等优点,已被成功应用
于生物酶的固定[6-7]。酶生物传感器的寿命一般不是很长,而以往的酶电极表面更新较为繁琐。利用
磁性复合粒子固定酶将有望解决该问题。
1 实验部分
111 仪器与试剂
CH I 660B 电化学工作站(上海辰华仪器公司);辣根过氧化物酶(HRP,E 1C 111111117,Rz >310,250
第4期陈绪胄等:新型磁性纳米金修饰过氧化氢生物传感器的研制
U/mg,Sig ma公司)。实验用水为石英亚沸二次蒸馏水。NdFe B稀土强磁铁(杭州强磁器材有限公司)。112 Fe3O4/Cys/Au复合微粒制备
纳米Fe
3
O4制备参考文献[8]进行,并作了一些改进。将FeCl2与FeCl3按112∶2的摩尔比混合均匀,在50℃恒温水浴中,高速磁力搅拌下,迅速加入2mol/L的Na OH溶液,反应过程控制pH10左右,反应直至pH不变(约115h),再升温至80℃继续搅拌熟化1h。整个反应在氮气保护下进行。通过外加磁场进行分离并用高纯水洗涤6～8次,直至中性后定容,避光保存。取一定量悬浮液真空烘干作固体含量分析。
利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备纳米金。参考文献[9],将100mL011%(质量分数)的HAuCl
4
加热煮沸,迅速加入2%(质量分数)柠檬酸钠溶液215mL,搅拌状态下继续加热15m in,得酒红色纳米金溶液,经测定其平均粒径为16n m。
吸取50mL新配制的Fe
3
O4悬浮溶液(约2g/L),加入5mg半胱氨酸,用011mol/L HCl或011 mol/L Na OH溶液调节混合溶液酸度至pH518,氮气保护下搅拌10h后用磁力分离,用二次蒸馏水清
洗至中性,产物记作Fe
3
O4/Cys,之后加水至20mL,加入纳米金溶胶5mL,氮气保护下搅拌混合过
夜。再次磁力分离并清洗,产物记作:Fe
3
O4/Cys/Au,4℃下保存于棕色瓶中,备用。
吸取10mL Fe
3
O4/Cys/Au悬浮液与2mL质量浓度为2g/L的辣根过氧化酶溶液混合,机械搅拌过
夜,合成Fe
3
O4/Cys/Au/HRP复合物,于4℃冰箱保存备用。
113 过氧化氢生物传感器制备
参考文献[10]的方法自制碳糊电极,经抛光清洗后,在015～1mol/L H
2
S O4溶液中用循环伏安法活化,扫描范围110～-110V,反复扫描直至达到稳定的循环伏安图,再将其置于5mmol/L的铁氰化钾溶液中在015～-012V间循环扫描,直至出现1对峰形良好的可逆氧化还原峰。
电极面朝上,用微量取样器取10μL Fe
3
O4/Cys/Au/HRP悬浮液于电极表面,用磁铁吸住电极铁棒尾端。将修饰电极在磷酸盐缓冲溶液中循环扫描数圈至稳定,备用。需更新电极时,移去磁铁,清洗电极,再次吸取一定量酶复合粒子即可。
114 测定方法
室温条件下,在10mL含5×10-4mol/L对苯二酚的01067mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH710)中进行循环伏安法实验,电位扫描速率为50mV/s,扫描范围为018～-018V(vs1SCE);进行计时电流法测定响应电流时,工作电位为-0118V,搅拌状态下测定。电极不用时置于冰箱中4℃下保存。
2 结果与讨论
211 酶复合微粒的合成机制
Fe3O4纳米粒子具有庞大的比表面积,由于形成化学共价键、氢键作用及静电吸附作用等,氨基
酸分子容易被吸附到Fe
3
O4纳米粒子表面,且该吸附过程为不可逆过程,加入强电解质基本不能脱
附[11]。Fe
3
O4在水中容易与水发生配位作用而表面羟基化,其等电点为pH615[12],此时主要以-Fe OH形式存在,当溶液pH小于615时,Fe3O4微粒带正电,主要以-Fe OH+2形式存在,而当pH大
于615时,Fe
3O4微粒带负电,主要以-Fe O-形式存在,其酸碱反应方程可表示为:-Fe OH+
2
-Fe OH+H+,K a1;-Fe
OH-Fe O-+H+,K a2。
半胱氨酸是两性化合物,其等电点为5105,当pH518时,半胱氨酸以阴离子形式存在而带负电荷,Fe
3
O4粒子表面带正电荷,此时氨基酸可以因静电吸引作用而较易吸附在Fe3O4粒子表面,同时氨
基酸离子和Fe
3
O4表面羟基形成的氢键作用对吸附也有很大的贡献。
纳米金由于比表面积大、表面反应活性高、较高的稳定性和催化性能,以及良好的生物兼容性、生物分子可较强地固定在其表面且不易渗漏等优点,被广泛地应用于传感器中生物分子的固定[13]。本实验所用纳米金为柠檬酸钠还原氯金酸方法制得,表面吸附了大量的柠檬酸根负离子作稳定剂,因而表面带强负电荷,HRP的等电点为819[14],在pH小于819时带正电。半胱氨酸分子组
装到Fe
3O4粒子后,由于它含有巯基—SH,能够与Au形成牢固的Au—S键,纳米金容易自组装到
793
分析测试学报第27卷
磁性粒子表面。再凭借纳米金对辣根过氧化酶的强吸附性,以及静电吸附作用,辣根过氧化酶得以牢固地固定在磁性粒子表面,形成Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 复合物。过程如图1所示。
Fig 11 Pr ocess of synthesizing enzy me compound
212 Fe 3O 4纳米粒子透射电镜(TE M )表征
图2为实验所得晶种Fe 3O 4的TE M 图片。从图中可以看出,Fe 3O 4粒子分散性较好,颗粒大小均匀,平均粒径为20n m 左右。
图2 Fe 3O 4粒子的透射电镜图Fig 12 TE M i m age of Fe 3O 4
particles 图3 Fe 3O 4/Cys/Au 修饰电极在加入H 2O 2前后的循环伏安图Fig 13 Cyclic v olta m mogra ms of Fe 3O 4/Cys/Au modified electr ode bef ore and after adding H 2O 2(a )0,(b )510×10-4mol/L,
(c )115×10-3mol/L H 2O 2;
v =50mV /s;01067mol/L P BS (pH 710)containing 015mmol/L hydr oquinone
213 Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 复合物磁力测定
采用振动样品磁强计(VS M )对Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 复合粒子
进行磁力测量,测得比饱和磁化强度σ为2123e mu /g,矫顽力较低,
具有较强的磁学性能,且基本无剩磁和磁滞现象,表现为超顺磁性,
即在外磁场存在下有磁性,外磁场撤除时磁性消失,可用于借助外磁
力从溶液中进行纳米磁性颗粒的分离。
214 酶电极的电化学行为
在辣根过氧化酶传感器中,对苯二酚是一种常用的理想的电子媒
介体。图3和图4分别为Fe 3O 4/Cys/Au 修饰电极和Fe 3O 4/Cys/Au /
HRP 修饰电极在含5×10-4mol/L 对苯二酚的磷酸盐缓冲溶液中加入
H 2O 2前后的循环伏安曲线图。在空白溶液中,出现了1对几乎对称
的准可逆的氧化还原峰,该峰为对苯二酚在电极表面发生氧化还原反应所致。当加入510×10-4mol/L H 2O 2时,Fe 3O 4/Cys/Au 修饰电极上的电流变化极小,而Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 修饰电极的循环伏安曲线
有明显变化,其对苯二酚的氧化峰电流明显减小,还原峰电流急剧
增大。当进一步加入110×10-3mol/L H 2O 2时,Fe 3O 4/Cys/Au 修饰
电极的响应电流值依然变化极小,而对苯二酚在Fe 3O 4/Cys/Au /
HRP 修饰电极上的氧化峰电流继续减小,还原峰电流继续增加。表
明在没有固定HRP 前,磁性粒子对H 2O 2的响应可忽略,而固定
HRP 后,酶电极对H 2O 2的还原表现出优异的电催化活性,说明对
苯二酚在固定化HRP 和石蜡碳糊电极之间能够有效地传递电子,纳
米金良好地固定了HRP,并保持其良好的生物活性。
图5为Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 修饰电极在含5×10-4mol/L 对苯二
酚的磷酸盐缓冲溶液(pH 710)中在不同扫速下(10～300mV /s )的循环伏安图,内插图为氧化还原峰电流值与对应的扫描速率的平方根的关系曲线图。其氧化还原峰电流值均与扫描速率的平方根(v 1/2)成正比,表明电极过程受扩散控制。215 实验参数的优化
21511 电子媒介体浓度的影响 不同电子媒介体浓度对响应电流值有很大影响,将对苯二酚的浓度从110×10-5mol/L 增加至110×
10-3mol/L,其氧化还原峰电流也依次增加,继续增大浓度时,电
流无明显变化,这是媒介体型传感器的典型特征。在较低浓度的媒893
第4期陈绪胄等:
新型磁性纳米金修饰过氧化氢生物传感器的研制介体溶液中,电流响应主要由酶-媒介体动力学控制,而高浓度的
媒介体产生的响应由酶-底物动力学控制。因为背景电流随媒介体
浓度的增加而增大,实验中选用对苯二酚浓度为510×10-4mol/L 。
21512 缓冲溶液酸度值与温度的影响 缓冲溶液pH 值对酶的反应
速率以及酶的催化活性都有很大影响。试验不同pH 值下酶电极的
电流响应值,发现在pH 710时电流响应最大,说明此时酶的催化活
性最大,这与水溶液中游离态的HRP 催化性能一致[15],因此实验
中采用pH 710。同时,酶的催化活性与温度也有很大关系,实验用
集热式恒温加热磁力搅拌器控制水浴温度,考察了20～60℃范围内
酶电极的电流响应,由实验知,40℃时电流响应最大,但继续升
温,电流有下降趋势。考虑到温度过高,HRP 因变性影响酶电极的
寿命,本实验均在室温25℃下进行。
21513 工作电位的影响 固定H 2O 2含量为510×10-5mol/L,用
计时电流法考察了不同工作电位对还原电流的影响。在0～-250
mV 范围内,随着工作电位的负移,还原电流值不断增大,传感器
灵敏度不断增大,这是因为工作电位越负,越能促进氧化态的对苯
二酚的还原,加快了电子在电极表面与固定化HRP 的氧化还原中心
之间的传输速率。一般来说,较低的测定电位能更好地避免抗坏血
酸、尿酸干扰,有利于提高传感器的选择性,但随着工作电位的降
低,背景电流也相应增大,且达到稳定电流响应值的时间亦增加,
从而导致测定误差增大,且溶液中溶解氧以及其它电活性物质也容
易在电极上被直接还原,造成对测定的干扰,实验结果表明:选择
-180mV 作为工作电位较为理想。
216 酶电极响应时间、线性范围与检出限
在上述最佳实验条件下,用计时电流法对H 2O 2进行检测,图6
为Fe 3O 4/Cys/Au /HRP 修饰电极对不同浓度H 2O 2的计时电流响应
曲线图。该酶电极对H 2O 2浓度的微小变化能产生灵敏的响应,在
工作电位为-0118V (vs 1SCE )时,H 2O 2浓度每增加210×10-5mol/
L,电流值平均增加913μA,并且该酶电极响应速率快,达到95%
稳态响应电流用时小于10s 。该生物传感器对H 2O 2响应的线性范
围为214×10-3～610×10
-6mol/L,相关系数为019993,信噪比为3时,检出限为215×10-6mol/L 。
217 酶电极的重复性、稳定性与选择性
考察了酶电极的稳态响应电流的重复性。用同一酶电极对6×
10-4
mol/L H 2O 2连续测定6次,测定相对偏差为310%。不用时将
酶电极4℃下悬于磷酸盐缓冲溶液(P BS )中(pH 710),1个月后电流响应性能能够保持原有性能的80%,表明纳米金固定HRP,结合
较为牢固,酶电极具有较好的稳定性和重复性。
测定后移去磁铁,将修饰物冲洗掉,用二次蒸馏水冲洗电极,
重新进行磁力修饰,连续制作5支,测得电极间电流响应相对偏差
为516%。
由于本实验中采用较低的工作电位,有利于提高传感器的选择
性。选择性实验表明,在含6×10-4mol/L H 2O 2的溶液中加入1×
10-3mol/L 的柠檬酸、L 2甘氨酸、草酸、尿酸、葡萄糖等干扰物质,
9
93
分析测试学报第27卷以及5×10-4mol/L 的Ca 2+、Mg 2+、Fe 2+、A l 3+、Zn 2+等离子,电流响应无明显变化,基本无干扰。
而加入1×10-4mol/L 的抗坏血酸响应电流略有下降,这是因为抗坏血酸与溶液中的H 2O 2反应,导致
H 2O 2的浓度降低。
218 米氏常数的测定
米氏常数K m (M ichaelis -Menten Constant )为酶促反应的特征动力学参数,是表征酶与底物之间亲和力大小的统计标准。电化学方法测定米氏常数的方程为:1/I ss =1/I max +K m /(cI max ),式中I ss 1加入一定浓度底物后测得的稳态电流,c 1对应的底物浓度,I max 1加入底物达饱和后测得的最大电流,通过1/
I ss 与1/c 作图求得L ine weaver -burk 方程的斜率和截距,从而求得米氏常数为0131mmol/L 。较小的米氏常数说明Fe 3O 4/Cys/Au 复合粒子能够很好地保持辣根过氧化酶的催化活性,可用于酶生物传感器的研制。
219 样品分析
为验证电极的实用性,室温条件下,以01067mol/L P BS (pH 710,含510×10-4mmol/L 对苯二
酚)为测试底液,工作电位为-0118V (vs 1SCE ),采用标准加入法测定稀释的消毒液样品中过氧化氢的含量及回收率,每个浓度测定5次,取平均值,测得回收率为97%～105%。表明准确度较好,可望用于实际样品的测定。
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