诺如病毒实验室检测
诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。
诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。
一、标本采集注意事项：
粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。一次流行，至少采集10例患者粪便，每份标本量约1～5ml，成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置4℃可存放2～3周，运送也要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NV意义重要。需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L)浓集病毒后检测。
二、实验室检测：
1、电镜检查：电镜法分直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM 法观察的灵敏
度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。
2、免疫法：免疫法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin
Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比IEM 法可提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是可广泛应用的检测方法。
3、分子生物学检测：分子生物学检测方法杂交技术和逆转录聚合酶链反应
(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。等温核酸扩增法(NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。病毒浓缩病毒浓缩 NV 浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有强
烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品 pH 值，使毒粒与样品微粒分开，PEG 把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。核酸提取食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是RT-PCR 反应抑制因子。NV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起来，效果较好，只是成本偏高。
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
食品安全国家标准 食品微生物学检验诺如病毒检验 1范围 本标准规定了食品中诺如病毒(N o r o v i r u s)的实时荧光R T-P C R检测方法三 本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜二瓜二坚果等硬质表面食品,草莓二西红柿二葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测三 2设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 2.1实时荧光P C R仪三 2.2冷冻离心机三 2.3无菌刀片或等效均质器三 2.4涡旋仪三 2.5天平:感量为0.1g三 2.6振荡器三 2.7水浴锅三 2.8离心机三 2.9高压灭菌锅三 2.10低温冰箱:-80?三 2.11微量移液器三 2.12p H计或精密p H试纸三 2.13网状过滤袋:400m L三 2.14无菌棉拭子三 2.15无菌贝类剥刀三 2.16橡胶垫三 2.17无菌剪刀三 2.18无菌钳子三 2.19无菌培养皿三 2.20无R N a s e玻璃容器:见E.1.2三 2.21无R N a s e离心管二无R N a s e移液器吸嘴二无R N a s e药匙二无R N a s e P C R薄壁管:见E.1.3三 3试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无R N a s e超纯水:见E.2.1三3.1 GⅠ二GⅡ基因型诺如病毒的引物二探针:见A.1三 3.2过程控制病毒的引物二探针:见A.1三
3.3过程控制病毒:制备见附录C三 3.4外加扩增控制R N A:制备见附录D三 3.5 T r i s/甘氨酸/牛肉膏(T G B E)缓冲液:见E.2.2三 3.65?P E G/N a C l溶液(500g/L聚乙二醇P E G8000,1.5m o l/LN a C l):见E.2.3三 3.7磷酸盐缓冲液(P B S):见E.2.4三 3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5三 3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6三 3.1075%乙醇:见E.2.7三 3.11 T r i z o l试剂:见E.2.8三 4检验程序 诺如病毒检验程序见图1三 图1诺如病毒检验程序 5操作步骤 5.1病毒提取 注:样品处理一般应在4?以下的环境中进行运输三实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80?冰箱中,试验前解冻三样品处理和P C R反应应在单独的工作区域或房间进行三每个样品可设置2~3个平行处理三 5.1.1软质水果和生食蔬菜 5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5c m?2.5c m?2.5c m的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)三 5.1.1.2将样品小块移至带有400m L网状过滤袋的样品袋,加入40m LT G B E溶液(软质水果样品,
上海市诺如病毒感染性腹泻防控方案 （试行） 为做好本市诺如病毒感染性腹泻防治工作，依据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法》、《学校和托幼机构传染病疫情报告工作规范（试行）》和《诺如病毒感染性腹泻防治方案（试行）》等，特制订本方案。 一、目的 及时发现本市诺如病毒感染性腹泻聚集性及暴发疫情，规范进行报告和处置，防范诺如病毒感染性腹泻在本市流行。 二、病例定义 （一）临床表现 潜伏期多在24～48小时，最短12小时，最长72小时。发病突然，主要症状为呕吐和腹泻，可伴有恶心、发热和腹痛。儿童病例以呕吐为主，成人病例腹泻为多，24小时内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血。大便常规镜检通常无炎性细胞，白细胞计数<10/HP，未见红细胞。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些感染者仅表现出呕吐症状。此外，有些感染者也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。 （二）诊断 1.临床诊断病例 主要依据流行季节、地区、发病年龄等流行病学资料、临床表现以及实验室常规检测结果进行诊断。符合以下标准者,可初步诊断为诺如病毒感染： （1）潜伏期24～48h； （2）主要症状为呕吐和腹泻，可伴有恶心、发热和腹痛，儿童
病例以呕吐为主，成人病例腹泻为多； （3）病程12～60h； （4）粪便、血常规检查无特殊发现； （5）排除常见细菌、寄生虫及其它病原感染。 2.确诊病例 除符合临床诊断病例条件外，在粪便标本或呕吐物中检测出诺如病毒。 3.聚集性病例 学校、托幼机构等集体单位内同一班级或同一宿舍，１天内发生３例及以上，或连续３天内发生５例以上，以呕吐和（或）腹泻等为主要症状的病例。 4.暴发疫情 学校、托幼机构等集体单位，3天内出现20例及以上临床诊断为急性胃肠炎的病例为疑似暴发疫情；一周内出现20例及以上的诺如病毒感染性腹泻确诊病例为暴发疫情。 三、疫情监测与报告 （一）各级医疗机构肠道门诊开展诺如病毒感染性腹泻监测，对腹泻病例做好登记、诊治等工作。一旦发现同一所学校、托幼机构等集体单位出现呕吐、腹泻等疑似诺如病毒感染性腹泻病例异常增多，立即向所在辖区疾病预防控制中心报告。 （二）各级各类学校、托幼机构开展晨检、每日巡查和缺勤缺课监测报告，一旦发现聚集性病例、疑似暴发疫情，学校疫情报告人立即开展排查，属实后立即向所在辖区社区卫生服务中心、疾病预防控制中心和教育局报告。如怀疑与食品及其生产、加工等相关环节有关，还应报告辖区食品药品监督部门。 （三）养老院等其他集体单位一旦发生聚集性病例、疑似暴发疫
诺如病毒防治知识宣传 一、概述 诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。 诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。 二、临床症状 诺如病毒感染主要引起胃肠炎，具有发病急、传播速度快、涉 及范围广等特点。胃肠炎的症状是恶心、呕吐、腹泻等，部分人主诉有头痛、发热、寒战、肌肉疼痛。症状通常持续1-2天。普遍感到病情严重，一日多次剧烈呕吐。症状一般摄入病毒后24-48小时出现, 但是暴露后12小时也可能出现症状。没有证据表明感染者能成为长期病毒携带者，但是从发病到康复后2周感染者的粪便和呕吐物中可以检出病毒。 三、传播途径 诺如病毒主要经消化道传播，传染性强。感染者粪便和呕吐物中 可以发现诺如病毒，可以通过几种方式感染诺如病毒： 食用诺如病毒污染的食物或饮用诺如病毒污染的饮料;
接触诺如病毒污染的物体或表面，然后手接触到口； 直接接触到感染者（如照顾病人，与病人同餐或使用相同的餐具）。 食物和饮料很容易被诺如病毒污染，因为病毒很小，而且摄入不到100个病毒就能使人发病。食物可以被污染的手、呕吐物或粪便污染的物体表面直接污染，或者通过附近呕吐物细小飞沫污染。尽管病毒在人体外很难繁殖，但是一旦存在食品或水中，就能引起疾病。 有些食品在送至饭店或商店前可能被污染。一些暴发是由于食用从污染的水中捕获的牡蛎。其它产品如色拉和冰冻水果也可能在来源地被污染。 四、治疗方法 诺如病毒引起的感染尚无特殊的治疗手段，以对症治疗为主，病 程一般为2~3天，恢复后无后遗症。然而不能喝足够多水来补充呕吐、腹泻丢失的水分，可能出现脱水，需要特殊的医学观察的人包括儿童、年老者和不能自理的所有年龄段人。 五、预防措施 预防诺如病毒感染性腹泻的关键是把好病从口入”这一关，要注意饮食和饮水卫生，养成良好的卫生习惯。 1、保护环境卫生。不乱扔垃圾，不随地大小便，对病人的呕吐物及粪便要及时消毒处理，确保周围环境的清洁；被污染衣物应该用肥皂水彻底清洗； 2、注意饮食卫生，以免病从口入” A、不吃不洁净的食物、不购买街边小店的零食，如：烧烤、串串香、凉
2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析 发表时间：2014-04-09T14:43:02.983Z 来源：《中外健康文摘》2013年第39期供稿作者：刘婧媛 [导读] 2011-2013年两年间辽阳市均有流感病毒流行,通过实验室检测得知两年的流行病毒毒株型别不同,证实了流感病毒抗原性变异的特性。 刘婧媛 (辽阳市疾病预防控制中心质量管理科辽宁辽阳 111000） 【摘要】流行性感冒病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，传播迅速,常会引起暴发，甚至造成世界大流行。上世纪流感病毒就引起四次世界大流行，造成相当严重的损失[1]。目的为了探究流感病毒流行和变异规律，了解其根据流感病毒核蛋白（NP），M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲（A）乙（B）丙（C）三型[2],病毒具有抗原性变异的特性,提供控制流行的科学依据,对 2011—2013年度辽阳市流行性感冒的病原学监测结果进行分析。方法采集流感样病例的咽拭子标本,采用real time-PCR进行核酸检测，分别用人红细胞、狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2011年4月~2012年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%,经分型鉴定A型H3N2亚型2株(20%),B型Victoria5株(50%),B型Yamagata3株(30%),A型H1N1亚型、新H1N1未检出；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本593份,核酸检测PCR 阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%,经分型鉴定A型H1N1亚型2株(6.67%)，A型H3N2亚型,15株(50%),新H1N112株(40%)，B型Yamagata,1株(3.33%)，B型Victoria未检出。结论:2011~2012年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0179-02 1.材料和方法 1.1标本 2011年4月1日-2012年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本388份；2012年4月1日-2013年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本593份。 1.2流感病毒核酸 real time-PCR 1.2.1采用Quant One step RT-PCR kit RNA 提取试剂盒提取流感病毒样本核酸。 1.2.2QIAGEN real time (荧光定量PCR法)检测试剂盒扩增病毒核酸，反应体系见表1 组分体积（μl） 2×QuantiText Probe RT-PCR Master Mix12.5× 上游引物（40μM）0.5× 下游引物（40μM）0.5× Probe （10μM）0.5× QuantiText RT Mix0.25× Rneasy Free Water UP to 25 病毒核酸RNA 5.0× 1.2.3将上述加好的反应体系的反应管放于PCR仪进行反应，反应程序如下：见表2 步骤反应温度(℃)时间(min)是否采集荧光循环数 逆转录酶605否1 5030否1 预扩增9515否1 950.25否45 扩增及荧光收集550.5否45 720.5是45 725否1 1.2.4结果判定及标准 对照：阴性对照无CT值或CT值为零，阳性对照CT值＜30。 样品：CT值≤35报告为阳性。 样品：37≤CT值≤40为灰区，需重新采样检测。 样品：无CT值或CT值为零报告为阴性。 1.3流感病毒分离 上述PCR结果为阳性的样本接种培养好的MDCK细胞生长液，观察细胞病变情况。 1.3.1将已长成单成的MDCK细胞生长液，用DPBS液洗两遍。 1.3.2每瓶接种标本0.5ml，每个标本接种1瓶，轻摇，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附2小时。 1.3.3倒掉感染液，用DPBS液洗两遍，每瓶加入含2μg/ml胰酶的病毒维持液10ml，35℃培养。 1.3.4次日起每天观察有无细胞病变（CPE）并记录，如病变明显细胞脱落可收获并做血凝，如未有病变，继续观察7日收获做血凝。 1.4血凝实验
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910216955.3 (22)申请日 2019.03.21 (71)申请人 梧州市食品药品检验所 地址 543000 广西壮族自治区梧州市万秀 区梧州西环路中段198号 (72)发明人 罗达龙 黄琳 覃蓝 李夷君 (74)专利代理机构 广州市越秀区海心联合专利 代理事务所(普通合伙) 44295 代理人 黄为 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种水中诺如病毒的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种水中诺如病毒的检测方 法，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富 集；(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核 酸溶液；(3)配置RT -PCR反应液；(4)荧光定量PCR 仪检测；所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃ 30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65 ℃30s，循环45次，荧光通道检测选择FAM、VIC通 道。本发明的水中诺如病毒的检测方法，使用荧 光定量PCR仪进行检测，灵敏性和准确度较高，并 可定量分析。权利要求书1页 说明书9页 附图1页CN 109735664 A 2019.05.10 C N 109735664 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109735664 A 1.一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)水样处理与诺如病毒的富集； (2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液； (3)配置RT-PCR反应液； (4)荧光定量PCR仪检测； 所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃ 30min；95℃ 5min；95℃ 15s、60℃ 30s采集信号；65℃ 30s，循环45次；荧光通道检测选择FAM、VIC通道。 2.根据权利要求1所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤为：取水样，加入MgCl2溶液使其浓度达到0.03～0.05mol/L，调节水样使pH至 3.0～5.0，使水样通过混合硝酸纤维素膜，用牛肉膏-甘氨酸洗脱液震荡洗脱滤膜；去除滤膜，调节洗脱液pH至6.0～8.0，向洗脱液中加入PEG8000溶液放置过夜，离心保留沉淀；加入无RNA酶的超纯水溶解沉淀，离心后上清液为病毒粗提取物。 3.根据权利要求1所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述诺如病毒RNA的提取步骤为：取病毒粗提取物，加入裂解液，充分混匀，然后漂洗液漂洗数次，加入洗脱液，离心后得到纯化的病毒核酸溶液。 4.根据权利要求2所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述MgCl2溶液的浓度为2.5mol/L。 5.根据权利要求2所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述牛肉膏-甘氨酸洗脱液的配置方法为：将30.0g牛肉膏和3.75g甘氨酸搅拌溶解于超纯水中，调节pH至9.5，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min。 6.据权利要求2所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤中，洗脱液与PEG8000溶液的体积比为1:0.25。 7.据权利要求2所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述PEG8000溶液的配置方法为：将400.0g PEG8000和87.0g氯化钠搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min。 8.根据权利要求3所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述加入裂解液的体积为600μL。 2
张国军（首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心） 写在课前的话 病毒性肝炎种类较多，在我国发病率较高，以乙肝最为常见。学员通过本课件的学习，要熟悉病毒性肝炎的类型及共同特点；掌握病毒性肝炎各类型的特征（包括抗原抗体特性）；掌握病毒性肝炎的流 行病学；掌握病毒性肝炎的发病机制；掌握各种肝炎的临床特点；熟悉实验室检测内容。 一．概述 病毒性肝炎是多种肝炎病毒引起的，以肝脏的炎症和坏死病变为主的一组传染病。主要通过粪－口、血液或体液传播。主要的临床表现：疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常，部分病例可以出现黄疸，无症状感染者较常见。 病毒性肝炎是我国感染率和发病率最高的传染病，其中以乙型病毒性肝炎最常见，大约有25% HBsAg阳性者可发展为慢性肝病（慢性肝炎、肝硬化、肝癌），乙型肝炎发生肝癌的相对危险率为10～100倍。 目前已经确定的病毒性肝炎有5型：甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎，最近发现两种：庚型和输血引起的肝炎。 这些肝炎病毒的共同特点：除了乙肝病毒和输血引起的病毒属DNA病毒外，其余的都属RNA病毒；除了乙型肝炎病毒有3个主要抗原抗体系统外，其余的只有一个抗原抗体系统；甲型肝炎和戊型肝炎病毒在肝细胞内复制，可以通过胆汁从粪便排出；病毒的抵抗力较强，耐冷、耐干燥、一般消毒无效。 二．各种肝炎病毒的特征 （一）甲型肝炎病毒 甲型肝炎病毒（HAV）属小核糖核酸病毒科嗜肝RNA病毒属；甲肝病毒是球形，直径27 - 28 nm，无包膜；甲型肝炎病毒只有一个抗原抗体系统。抗甲型肝炎病毒IgM ，存在6个月，属近期感染；抗甲型肝炎病毒IgG，可存在多年，表现既往感染。甲型肝炎病毒抗原可在粪便中检出，通常用于科研。 （二）乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝脱氧核糖核酸病毒科哺乳动物病毒属；病毒颗粒直径42 nm ,含两部分：包膜部分含有表面抗原、糖蛋白、细胞脂肪；核心部分含有乙型肝炎病毒DNA、DNA-P和核心抗原。 HBV基因组的结构与功能：分为正链和负链，正链无编码功能，负链有4个开放的读码区：S、C、P和X。S 区：编码包膜蛋白，前S1、前S2、HbsAg；C区：编码核壳蛋白，HBcAg，前C区编码HbeAg；P区：编码DNA-P，具有逆转录酶活性；X区：编码HBxAg，具有反激活作用。 HBV表面抗原通常出现于病毒感染的1 - 12 周，急性可持续1 - 20周，慢性可存续很多年。临床意义：在急性期是感染的标志，无传染性。
病毒简介 显微镜下的诺如病毒诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。 传播途径 诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。疾控专家称，病程为自限性，一般2～3天即可恢复。 诺如病毒的各种传播途径，如牲畜等感染者粪便和呕吐物中可以发现诺如病毒，可以通过几种方式感染诺如病毒： 1、食用诺如病毒污染的食物或饮用诺如病毒污染的饮料；因为病毒很小，而且摄入不到100个病毒就能使人发病。接触诺如病毒污染的物体或表面，然后手接触到口。 2、直接接触感染者，如照顾病人、与病人共餐或使用相同的餐具也可引起传播。直接接触到感染者(如照顾病人，与病人同餐或使用相同的餐具)。 3、食物可以被污染的手、呕吐物或粪便污染的物体表面直接污染，或者通过附近呕吐物细小飞沫污染。尽管病毒在人体外很难繁殖，但是一旦存在食品或水中，就能引起疾病。 4、有些食品在送至饭店或商店前可能被污染。一些暴发是由于食用从污染的水中捕获的牡蛎。其它产品如色拉和冰冻水果也可能在来源地被污染。 临床表现 潜伏期多在24～48h，最短12h，最长72h。感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻。儿童患者呕吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血。大便常规镜检WBC<15，未见RBC。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些感染者仅表现出呕吐症状。此外，也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。 诺如病毒会引起胃肠道感染。主要症状为恶心、呕吐、腹部痉挛性腹泻，通常持续1-2天，一般在感染病毒后12-48小时出现症状。
《食品安全地方标准食品中诺如病毒检测》 （DBS 13/001-2014） 编制说明 （一）标准起草的基本情况 1、任务来源 根据《河北省食品安全地方标准制定、修订项目委托协议书(2014年)》，河北省卫计委食品安全标准与监测评估处委托河北省疾病预防控制中心制订《食品安全地方标准食品中诺如病毒检测》（DBS 13/001-2014）。 2、起草单位 本标准起草单位：河北省疾病预防控制中心。 本标准参与（协作）单位：秦皇岛市疾病预防控制中心、邯郸市疾病预防控制中心。 3、起草人 主要起草人有申志新、关文英、白雪、张淑红、侯凤伶、申玉学、韩艳青、王英豪、史红。 4、起草过程简介 （1）收集国内外标准与文献：标准起草负责人组织起草人员收集国内外诺如病毒检测方法标准和相关文献共40余篇。 （2）召开河北省食品安全地方标准专家论证会：省卫计委于2014年7月，在北戴河组织部分省内食品安全专家委员会委员对本项目建议书进行了论证和研讨。与会专家认为本项目建议书思路清晰严谨，科学合理，计划周密可行，具有可操作性，经费预算合理，并已按专家意见进行了修改，经审查合格，同意实施。 （3）制定初步检测方法：在参阅国内外标准和文献基础上，确定方法制定原则、主要内容和方法验证，草拟实施方案。 （4）样品检测：2014年6月-7月，省疾控中心和秦皇岛市疾控中心对北戴河区市售生食海产品进行了诺如病毒检测。共采集贝类样品100份，其中5份诺如病毒阳性，检出率为5%，为我省在食品安全风险监测中首次检出诺如病毒,同时检测包装饮用水样品50份,未检出阳性。 （5）试验验证：根据项目制定方案，秦皇岛市疾控中心和邯郸市疾控中心对本方法进
浅谈计算机病毒的检测技术 摘要：在互联网高速发展的今天，计算机病传染性越来越强，危害性也越来越大。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。本文对其特点以及优缺点逐一进行了叙述。 关键词：计算机病毒检测技术 一、引言 Internet改变了人们的生活方式和工作方式，改变了全球的经济结构、社会结构。它越来越成为人类物质社会的最重要组成部分。但在互联网高速发展的同时，计算机病毒的危害性也越来越大。在与计算机病毒的对抗中，早发现、早处置可以把损失降为最少。因此，本文对计算机病毒的主要检测技术逐一进行了讨论。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。这些方法依据原理不同，检测范围不同，各有其优缺点。 二、计算机病毒的检测方法 (1)长度检测法 病毒最基本特征是感染性，感染后的最明显症状是引起宿主程序增长，一般增长几百字节。在现今的计算机中，文件长度莫名其妙地增长是病毒感染的常见症状。长度检测法，就是记录文件的长度，运行中定期监视文件长度，从文件长度的非法增长现象中发现病毒。知道不同病毒使文件增长长度的准确数字后，由染毒文件长度增加大致可断定该程序已受感染，从文件增长的字节数可以大致断定文件感染了何种病毒。但是长度检测法不能区别程序的正常变化和病毒攻击引起的变化，不能识别保持宿主程序长度不变的病毒。 (2)病毒签名检测法 病毒签名(病毒感染标记)是宿主程序己被感染的标记。不同病毒感染宿主程序时，在宿主程序的不同位置放入特殊的感染标记。这些标记是一些数字串或字符串。不同病毒的病毒签名内容不同、位置不同。经过剖析病毒样本，掌握了病毒签名的内容和位置之后，可以在可疑程序的特定位置搜索病毒签名。如果找到了病毒签名，那么可以断定可疑程序中有病毒，是何种病毒。这种方法称为病毒签名检测方法。但是该方法必须预先知道病毒签名的内容和位置，要把握各种病毒的签名，必须解剖病毒。剖析一个病毒样本要花费很多时间，是一笔很大的开销。 (3)特征代码检测法
For personal use only in study and research; not for commercial use 诺如病毒预防小常识 诺如病毒（英语：Norovirus，NV），又称为诺罗病毒、诺沃克病毒或脓融病毒，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒。感染诺如病毒后最常见的症状是腹泻、呕吐、恶心，或伴有发热、头痛等症状。儿童患者呕吐、恶心多见，成人患者以腹泻为多，呕吐少见。病程一般为2-3 天，此病是一种自限性疾病，恢复后无后遗症。冬春开学季，也是学校诺如病毒爆发疫情的危险期。 对个人要求： （1）保持良好的饮食习惯。不要吃没熟的食物（如海鲜、沙拉类），不吃变质、不洁、生冷、生腌食物，食物需要至少煮沸15～20 分钟后才可放心食用。 （2）养成良好的个人卫生习惯。坚持勤洗手、勤剪指甲。进食或处理食物前，应用肥皂及清水洗净双手。如厕或处理呕吐物及粪便后须彻底洗净双手。 （3）及时就医。出现呕吐、腹泻等胃肠症状时，应尽早到各医院的肠道门诊就诊，不要跟亲朋好友接触。不去人群密集的公共场所，减少传染的机会。 对学校要求： （1）加强健康教育。学校开展多种形式的健康宣教，普及诺如病毒感染胃肠炎防治知识。 （2）加强消毒和通风。每日对教室、卫生间、楼道、门把手等公共场所和用品用具进行消毒，对呕吐物及时清除消毒。搞好环境卫生，保持教室和活动室通风。 （3）加强食品卫生和饮用水管理。工作人员要注意个人卫生，防止带病上岗，加工食物时防止生熟不分和交叉污染。桶装水应符合相关卫生标准，饮水机加强清洗消毒。 （4）加强个人防护。遇有学生在教室等公共场所呕吐，老师要及时疏散周边学生，及时清理消毒呕吐物，处理呕吐物时要注意个人防护，防止感染。 （5）加强风险沟通。与学生家长保持沟通，做好解释工作，防止造成不必
马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。 马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。 1马铃薯病毒的概况 1.1马铃薯X病毒（PVX） 也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。一般减产5%～10%,症状是叶片从轻型花叶到叶片有较轻的皱缩。马铃薯X病毒靠汁液传播,也是传播最广泛的一种病毒。 1.2马铃薯Y病毒（PVY） 也称重花叶病毒,是马铃薯第二个重要病毒性病害,是一种长680～900nm的线状病毒,在电镜下找不到它的中心孔和外壳蛋白亚基的横纹,它比PVX更细一些、更长一些。通过感染的块茎长期存在并由蚜虫非持续性地传播,产量损失可达80%。症状随着病毒株系、马铃薯品种及环境条件变化很大。1.3马铃薯A病毒（PVA） 又称轻花叶病毒,在许多方面类似于马铃薯Y病毒。在某些品种中出现时,一般比马铃薯Y病毒轻,产量损失可达40%。马铃薯A病毒引起花叶(有时很严重),同时也发生脉缩和卷曲,叶片可能出现闪光。 1.4马铃薯S病毒（PVS） 也称潜隐性花叶病毒,感病块茎变小,一般减产 浅析马铃薯病毒检测技术 景彩艳 （甘肃省定西市农产品质量安全监督管理站定西743000） 摘要：随着科学技术的不断发展,马铃薯病毒检测技术在日益的完善,DAS-ELISA法已经成为马 铃薯病毒检测的常规方法。容易侵染马铃薯的病毒类型主要有6种,分别是马铃薯的PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA病毒。马铃薯在生长的过程中,因受到各种不同病害的侵染,容易造成减产 和退化。血清学技术是马铃薯病毒检测的主要手段。 关键词：马铃薯病毒；血清学技术；双抗体夹心酶联免疫吸附法 215 --
诺如病毒感染防治知识 诺如病毒是急性肠胃炎最常见的病原体，该病毒基因多样且高度变异，每隔数年就会出现新变异株，人一生中可多次获得感染。诺如病毒感染通常表现为自限性疾病，预后良好。 临床特征： 最常见的症状是腹泻、呕吐、反胃、恶心和胃痛，其他包括发热、头痛和全身酸痛等。多数患者发病后1-3天即可康复。如频繁呕吐或腹泻，可导致脱水，引起严重的健康问题，尤其常见于幼小儿童、老年人和基础性疾病患者。脱水主要表现为少尿、口干、咽干、站立时感头晕目眩，在儿童中可表现为啼哭无泪或少泪、异常瞌睡或烦躁。 传播： 诺如病毒传染性强，所有人群均易感。病人发病前至康复后2周，均可在粪便中检到诺如病毒，但患病期和康复后三天内是传染性最强的时期。通常通过以下途径获得感染： ⑴食用或饮用被诺如病毒污染的食物或水； ⑵触摸被诺如病毒污染的物体或表面，然后将手指放入口中； ⑶接触过诺如病毒感染患者，如照顾患者、与患者分享食物或共用餐具。 诺如病毒在密闭场所中（如托幼机构、幼儿园、学校、养老院、游船等）传播速度快，易引起暴发。 治疗： 尚无特异的抗病毒药物。患者应补充足够的水分以预防脱水。轻度脱水时，运动饮料或其他饮品（不含咖啡因或酒精）可起到一定的补水效果，但不能补充重要的营养成分和矿物质，因此，在药店购买口服补水溶液是最有效的治疗方法。严重脱水时应及时住院输液治疗。 预防： ⑴注意洗手卫生，用肥皂和清水认真洗手，尤其在如厕和更换尿布后，以及每次进食、准备和加工食物前。 ⑵水果和蔬菜食用前应认真清洗，牡蛎和其他贝类海产品应深度加工后食用。诺如病毒抵抗力较强，在60℃高温或经快速汽蒸仍可存活。
⑶诺如病毒感染儿童应远离厨房或食物加工场所。 ⑷诺如病毒感染病人患病期至康复后3天内不能准备加工食物或为其他患者陪护。 ⑸及时用含氯漂白剂或其他有效消毒剂清洗消毒被患者呕吐物或粪便污染的表面，立即脱掉和清洗被污染的衣物或床单等，清洗时应戴上橡胶或一次性手套，并在清洗后认真洗手。
附件4 诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案 诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR 产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。 一、标本前处理 1.粪便、呕吐物 1.1设备和材料 微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH 值为7.0－7.4的PBS。 1.2 操作方法 （1）离心管每管分装0.5 mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500 μl的样品。 （2）漩涡振荡每个样品1 min。在2 400 g下离心5 min，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于－70℃。 （3）取澄清的上清液200 μl进行RNA提取。 2.水 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。 2.1设备和材料 DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100 K columns（PALL公司）、Centriprep YM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。