环介导等温扩增技术的改进及其在病原微生物
检测中的应用研究进展
但晓雅１，２，薛强１，邹明强１，董英２
（１．中国检验检疫科学研究院，北京 １００１２３；２．江苏大学，江苏镇江 ２１２０１３）
摘要：环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是近年来发展出来的一种新型核酸扩增技术。自建立以来，该技术不断改进和发展，并广泛应用于病原微生物的检测，文章将就此展开综述。
关键词：环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）；病原微生物；应用
中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２０１２）０２－００５２－０５
２０００年，日本学者Ｎｏｔｏｍｉ等建立了一种新的核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉ－ａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ），它通过针对靶基因的６个区域设计４种特异引物，利用链置换型ＤＮＡ聚合酶，在等温（６０～６５℃）条件下几十分钟就可扩增出１０９拷贝靶序列。通过琼脂糖凝胶电泳判定结果，阳性结果呈现梯状条带。ＬＡＭＰ技术特异性强、灵敏度高、快速简便且成本低廉。十年来，该技术得到不断改进和完善，并已被广泛用于病原微生物的检测。文章就这两方面进行综述，旨在为ＬＡＭＰ技术的进一步发展奠定基础。
１ ＬＡＭＰ技术的改进
１．１ 检测模板 Ｎａｇａｍｉｎｅ等（２００１）研究发现ＬＡＭＰ方法可以省略预变性步骤直接进行扩增反应，免除了预变性过程耗费的时间，使反应在６０ｍｉｎ内完成。Ｋａｎｅｋｏ等（２００７）研究发现，ＬＡＭＰ方法对各种培养基成分具有较强的耐受性，样品可以不进行纯化而直接进行ＬＡＭＰ扩增。此外，Ｋｅｌｌｙ等（２００８）经研究发现，ＬＡＭＰ法可直接用于某些临床样本，而无需对样本中的核酸进行提取。这些发现将使ＬＡＭＰ技术在往后的应用中更加快速简便。
１．２ 引物设计 Ｎａｇａｍｉｎｅ等（２００２）通过在ＬＡＭＰ反应中添加２条环形引物的方法，使得反应时间缩短近一半，可以在不到３０ｍｉｎ内完成，大大提高了检测效率。日本某公司于近年开发出在线设
收稿日期：２０１１－０７－１４
作者简介：但晓雅（１９８７－），女，江苏人，硕士，研究方向：食品营
养与安全。
通信作者：邹明强（１９６４－），男，研究员，博士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｉｎｇｑｉａｎｇｚ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
基金项目：国际科技合作项目（２００９ＤＦＡ３２７２０）；“十一五”国家
科技支撑计划（２００９ＢＡＫ６１Ｂ０４）。计ＬＡＭＰ引物的软件（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ），作者多次试用后认为该软件操作简便且效果出色，值得推广。
１．３ 产物鉴定 Ｍｏｉｌ等（２００１）发现反应副产物焦磷酸离子和反应体系中的镁离子可发生反应生成焦磷酸镁沉淀，因此反应结果可通过检查浑浊程度判定。目前，这种方法已被改进并成功开发出一种实时浊度检测仪，它可以用来定量模板ＤＮＡ或ＲＮＡ。Ｍａｅｄａ等（２００５）在ＬＡＭＰ体系中添加ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ，通过目视检查绿色荧光判定扩增结果。以上两种方法已被证实具有可行性。此外，Ｘｕｅ等（２０１０）在反应体系中添加羟基萘酚蓝（ＨＮＢ）染料，通过裸眼观察颜色是否变蓝判定结果。Ｚａｂｌｏｎ（２０１１）利用横向流动试纸条（ＬＦＤ）判别ＬＡＭＰ扩增产物的结果，与使用凝胶电泳和ＳＹＢＲ?ＧｒｅｅｎⅠ的结果一致。可见，对ＬＡＭＰ产物鉴定方法的研究趋于目视判定，这将使ＬＡＭＰ技术简便快速的优势更加突出。
２ ＬＡＭＰ技术在病原微生物检测中的应用
２．１ 病毒
２．１．１ 人类免疫缺陷型病毒 自艾滋病的病原体被发现，近２５年来，人类免疫缺陷型病毒（ＨＩＶ）的大肆传播，一直是威胁人类健康的重大问题。长期以来，酶联免疫法（ＥＩＡ）一直被认为是可以快速且大规模筛查临床样本的“黄金标准”。
Ｋｅｌｌｙ等（２００８）将ＬＡＭＰ技术用于血浆和感染者血液中ＨＩＶ－１的检测，该法无需从血液样本中提取核酸，从而使整个检测的时间缩短到９０ｍｉｎ左右。研究发现，扩增在进行到３０ｍｉｎ时即能检出ＨＩＶ－１的ＤＮＡ和ＲＮＡ，反应进行到６０ｍｉｎ时灵敏度最高，分别达到每管１０拷贝和１００拷贝。Ｎｏｒｉｍｉｔｓｕ等（２００９）利用ＲＴ－ＬＡＭＰ对ＨＩＶ－１Ｍ组进行检测，扩增反应在３５ｍｉｎ内即可完成，检测
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限达到１２０拷贝／ｍＬ。从５７名感染ＨＩＶ－１的患者和４０名未感染ＨＩＶ－１的居民体内收集血浆样品进行ＬＡＭＰ分析，结果与预期完全一致。由此可见，ＲＴ－ＬＡＭＰ分析在ＨＩＶ诊断上快速灵敏，尤其适用于资源条件不足的环境。
２．１．２ 禽流感病毒 禽流感病毒（ＡＩＶ）能感染人、猪、马、海豹、鲸、各种家禽和野鸟。对ＡＩＶ的快速检测主要运用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和实时定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）。但是这些方法成本较高，很难应用到众多小型的一线实验室。
Ｍａｓａｋｉ等（２００７）利用ＲＴ－ＬＡＭＰ检测Ｈ５Ｎ１高致病性禽流感（ＨＰＡＩ）病毒，与常规一步式ＲＴ－ＰＣＲ相比，灵敏度提高了１００倍。对感染的野生鸟类进行监测，ＲＴ－ＬＡＭＰ比ＲＴ－ＰＣＲ检出率高出１倍。Ｃｈｅｎ等（２００８）利用ＲＴ－ＬＡＭＰ对ＡＩＶ的Ｈ９亚型进行诊断，６３℃条件下４５ｍｉｎ即可完成扩增反应。该法比ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度高１０倍，检测限达到每反应１０拷贝。对１１２份临床样本的检测结果显示，ＲＴ－ＬＡＭＰ和病毒分离法检出率一致，而ＲＴ－ＰＣＲ漏检了７例。这些结果表明，ＲＴ－ＬＡＭＰ体系为ＡＩＶ的检测提供了新的途径，并可对禽类体内潜在的ＡＩＶ病毒进行监测。
２．１．３ 猪瘟病毒 猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）是诱发典型性猪瘟（ＣＳＦ）的一种瘟疫病毒，具有高度传染性和致死性。ＣＳＦ的临床症状到目前仍未被发现，尤其是感染了低毒性猪瘟病毒株。因此，快速、精确地检测出ＣＳＦＶ，对于控制ＣＳＦ至关重要。目前相对快速的诊断方法包括：荧光抗体技术、抗原捕获酶联免疫吸附试验、ＲＴ－ＰＣＲ技术，但这些技术都需要集中的实验室设施和临床标本，因而很大程度上延误了疾病的诊断。
Ｙｉｎ等（２０１０）对ＣＳＦＶ的Ｅ２基因区段进行ＲＴ－ＬＡＭＰ试验。在对２２７份组织样品的检测中，ＲＴ－ＬＡＭＰ的阳性预测值和阴性预测值分别为９４．７％和３０．８％，优于常规ＲＴ－ＰＣＲ。Ｚｈａｎｇ等（２０１０）进一步将ＲＴ－ＬＡＭＰ体系应用到野生型ＣＳＦＶ的检测，检测限为２．５ＴＣＩＤ
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。对接种的猪群临床样本和试验感染的血液样本进行分析，ＲＴ－ＬＡＭＰ与实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ的检出率一致。结果表明，ＣＳＦＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ法快速，检测成本低，在临床预诊方面，尤其在发展中国家，有潜在的应用价值。
２．１．４ 对虾白斑综合征病毒 对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）是一种有包膜的双链ＤＮＡ病毒，可感染许多甲壳类（包括虾、蟹等），给虾类养殖业造成巨大
的经济损失。目前对ＷＳＳＶ的检测主要基于分子生物学方法，如一步法ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ（ｎＰＣＲ），但这些方法的整个分析过程需耗时４～６ｈ。
Ｃｈｏｕ等（２０１１）将荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）探针技术用于ＬＡＭＰ平台，利用ＦＲＥＴ ＬＡＭＰ技术检测对虾中的ＷＳＳＶ。反应在光循环中进行，可对ＦＲＥＴ信号实时检测。对２１份被感染的虾使用该体系检测，结果与ｎＰＣＲ的检出率基本一致。Ｈｅ等（２０１１）建立了一种可同时检测对虾中ＷＳＳＶ和传染性皮下组织及造血组织坏死病毒（ＩＨＨＮＶ）的方法———多重ＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法，根据ＷＳＳＶ的ＶＰ２８基因和ＩＨＨＮＶ的非结构蛋白１（ＮＳ１）基因设计了２套特异性引物，并分别插入限制性酶切割位点，使得ｍＬＡＭＰ能准确地区分出这两种病毒。ｍＬＡＭＰ对ＷＳＳＶ和ＩＨＨＮＶ的检测限分别比ｎＰＣＲ及常规ＰＣＲ高出１０２和１０３倍。
此外，对冠状病毒、新城疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、虹彩病毒等病毒应用ＬＡＭＰ技术进行检测的方法也已建立起来，并得到不断深入的研究。２．２ 细菌
２．２．１ 沙门氏菌 沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉ－ｃａ）是最常见的一种食源性致病菌。在很多国家，沙门氏菌都是造成食源性感染暴发的主要原因。对食物中沙门氏菌的常规检测法需要继代培养，然后再进行生化和血清学确认，整个过程需要５ｄ。
Ｍａｓａｓｈｉ等（２００８）对鸡中沙门氏菌Ｏ９群运用ＬＡＭＰ检测，检测限为１０３ ＣＦＵ／ｍＬ，比ＰＣＲ（１０６ＣＦＵ／ｍＬ）灵敏，ＬＡＭＰ只需３０ｍｉｎ即可得到最终结果，而ＰＣＲ需耗时１２０ｍｉｎ。利用ＬＡＭＰ对体内感染肠炎沙门氏菌（ＳＥ）鸡的盲肠粪便及试验感染ＳＥ鸡的盲肠粪便进行分析，结果与平板接种法基本一致。Ｌｉ等（２００９）针对沙门氏菌的ｐｈｏＰ基因设计引物，对６６株沙门氏菌和７３份非沙门氏菌株采用ＬＡＭＰ进行鉴别，诊断准确率达到１００％。将ＬＡＭＰ与样品富集技术相结合，可以检测到３５ＣＦＵ／２５０ｍＬ的菌落。整个分析过程耗时２４ｈ，明显优于传统培养法。ＬＡＭＰ与传统培养法和ＰＣＲ相比，在速度上具有明显的优势，因而极有可能成为实验室检测沙门氏菌的标准方法。
２．２．２ 结核分支杆菌 结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ－ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）导致的结核病（ＴＢ），是一种严重的传染性疾病，至今仍是威胁全球公共健康的一个主要问题。临床实验室一般使用传统涂片镜检和以培养为基础的诊断方法。新兴的分子生物学技术，
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如基因探针直接试验（ＡＭＴＤ）、连接酶链反应（ＬＣＲ）、实时定量ＰＣＲ，为临床诊断提供了相对简单快速的辅助工具。
Ｌｅｅ等（２００９）将ＲＴ－ＬＡＭＰ与ＥＬＩＳＡ杂交相结合，建立了ＲＴ－ＬＡＭＰ－ＥＬＩＳＡ杂交法，对结核分支杆菌临床分离株的１６ＳｒＲＮＡ进行快速检测，可检测到２０００拷贝，并可重复检测到单拷贝。对１５０份唾液样品进行分析，ＲＴ－ＬＡＭＰ－ＥＬＩＳＡ杂交法与ＡＭＴＤ的灵敏度分别为９１．１％和８８．２％。Ｌｅｅ等（２０１０）在进一步的研究中，又建立了一种单管ＬＡＭＰ－ＰＣＲ－杂交－限制性内切酶－ＥＬＩＳＡ（ｏｎｅ－ｔｕｂｅ ＬＡＭＰ－ＰＣＲ－ＨＹ－ＲＥ－ＥＬＩＳＡ）体系，检测从临床标本中分离出的结核分枝杆菌异烟肼、乙胺丁醇和链霉素耐药株。该体系基于目标耐药基因的突变热点，结合使用ＬＡＭＰ－ＰＣＲ、杂交、限制内切酶消化及ＥＬＩＳＡ比色法，对３种耐药株的临床分离率分别为９８．９％、９４．３％和９３．８％，且１ｄ内就可完成。２．２．３ 创伤弧菌 创伤弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）是一种革兰氏阴性细菌，广泛栖息于温暖的沿海和河口水域，人类感染创伤弧菌大部分是由于食用了未经煮熟的海鲜。细菌培养法是对其定性和定量的常规检测方法，其中包括最大可能计数法（ＭＰＮ）和ＤＮＡ杂交法，但费时费力。目前，分子生物学方法被广泛应用，主要包括ＰＣＲ和实时定量ＰＣＲ。
Ｒｅｎ等（２００９）根据创伤弧菌的溶细胞素基因序列设计ＬＡＭＰ试验，结果表明，该法对创伤弧菌具有高特异性，且比常规ＰＣＲ灵敏度高１０倍。Ｈａｎ等（２０１０）将ＬＡＭＰ分析法与荧光或浊度为基础的判定方法相结合，定量检测生蚝中的创伤弧菌，每个反应的检测限达到１～１０ＣＦＵ，比ＰＣＲ灵敏１００倍。将该体系应用于加标样品，对未富集培养的牡蛎检测限可达６．４×１０４ ＣＦＵ／ｇ，比ＰＣＲ灵敏１０００倍。对纯培养和样品加标的牡蛎创伤弧菌作标准曲线，结果表明，在细胞计数和荧光Ｃｔ或浊度Ｔｔ值之间，呈现出良好的线性回归。因此，此试验建立的实时定量ＬＡＭＰ法可高灵敏和特异地对生蚝中创伤弧菌实现定量分析。
２．２．４ 蜡样芽孢杆菌 蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）在周围环境中广泛存在，其中部分菌具有致病性，能引起食物中毒。目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用生化检测方法，但该方法费时费力。
Ｑｉ等（２００８）首次使用ＬＡＭＰ法快速检测蜡样芽孢杆菌，并将该技术与ＦＴＡ滤膜技术结合。结果表明，ＬＡＭＰ方法检测灵敏度高，蜡样芽孢杆菌的检出限为４．４ＣＦＵ／ｍＬ，比ＰＣＲ检测灵敏度高１０倍；人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检出限为５７ＣＦＵ／ｍＬ。ＬＡＭＰ扩增可在２０ｍｉｎ内完成，对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测（包括ＤＮＡ提取、ＬＡＭＰ扩增和电泳分析）可在２ｈ内完成。
近年来，应用ＬＡＭＰ技术检测致病菌的报道不断增多。致病性钩端螺旋体（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、脑膜炎奈瑟菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、霍乱弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）等的ＬＡＭＰ检测法都已成功建立。与传统检测方法相比，ＬＡＭＰ具有高效灵敏的优势，很有潜力成为快速检测致病菌的最有力工具。２．３ 寄生虫
２．３．１ 弓形虫 弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）是一种专性细胞内寄生原虫，传染途径主要是食用含组织囊肿的生肉或被卵囊污染的食物和水。对弓形体病的诊断有很多不同的方法。血清学方法有间接荧光抗体试验（ＩＦＡＴ）和ＥＬＩＳＡ，其他方法还有免疫组织化学染色、ＰＣＲ、改良凝集试验（ＭＡＴ）、免疫色谱法（ＩＣＴ）及实时定量ＰＣＲ。
Ｉｓａｉａ等（２００８）将免疫荧光试验（ＩＦＴ）与ＬＡＭＰ结合，针对弓形虫Ｂ１和ＴｇＯＷＰ基因进行扩增。对２种基因的检测限达到０．１个速殖子ＤＮＡ。对２６份加入已知数量弓形虫卵囊的水样同时进行ＬＡＭＰ和巢式ＰＣＲ分析，灵敏度分别为１００％和５３．８％。研究人员又对不同地区采得的５２份天然水样同时进行ＬＡＭＰ、ＰＣＲ和ＩＦＴ分析，弓形虫的检出率分别为４８％、１３．５％和０。显然，ＬＡＭＰ在弓形虫检测方面具有快速、特异和灵敏的优越性。Ｚｈａｎｇ等（２００９）应用ＬＡＭＰ法从家畜样品中诊断弓形虫，针对弓形虫２００～３００个拷贝的５２９ｂｐ基因重复序列设计ＬＡＭＰ引物，检测限达到１ｐｇ／μＬ。对疑似感染猪的淋巴结中提取的弓形虫ＤＮＡ进行ＬＡＭＰ和ＰＣＲ验证，阳性检出率分别为８５．７％和７６．９％。
２．３．２ 泰勒虫 泰勒虫（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）是由蜱传播的细胞内寄生的原虫，会引起宿主轻度至重度的感染。对泰勒虫病传统的诊断方法基于姬姆萨染色血液涂片（Ｇｉｅｍｓａ－ｓｔａｉｎｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｉｌｍｓ），但镜检无法检测到低寄生虫血症，特别是在疾病流行地区。近年来，荧光定量ＰＣＲ被认为是极具潜力的诊断方法，但成本高昂、操作复杂。另一种可行的血清学方法是乳胶凝集试验，由于检测不出抗体滴度，故无法检测出早期感染样本。
Ｗａｎｇ等（２０１０）针对瑟氏泰勒虫的表面蛋白（Ｐ３３）基因设计ＬＡＭＰ试验。结果显示，该法的检
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测限达到０．０００００２％，比常规ＰＣＲ灵敏。从水牛和牛体内分别采集１５４和１５９份样品，应用ＬＡＭＰ进行分析，阳性检出率分别达到３０．０％和６０．４％，均高于常规ＰＣＲ。Ｔｈｅｋｉｓｏｅ等（２０１０）针对ＰＩＭ和ｐ１５０基因设计了６条ＬＡＭＰ引物，对小泰勒虫进行检测，检测限达到１ｆｇ。试验结果还表明，该法对从不同国家黄牛和水牛体内分离得到小泰勒虫ＤＮＡ均能检出。ＬＡＭＰ法在分子流行病学研究和监测控制体系中具有潜在的可行性。
２．３．３ 疟原虫 疟疾是一种严重威胁人类生命的疾病。该病由一种原生动物寄生虫—疟原虫（Ｖｉｖａｘ）引起，通过蚊虫叮咬传播。显微镜分析法是诊断寄生于人和蚊子体内疟原虫最常用的方法，到目前为止，被认为是最可靠的标准。但此法要求试验人员具有专业技能且在感染者患病后才能被检出。其他检测方法还有ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ。
Ｈｉｒｏｋａ等（２００８）应用ＬＡＭＰ检测携带疟原虫的蚊子，使用鼠疟原虫和按蚊建立起试验模型，利用ＬＡＭＰ对纯化后的疟原虫ＳＰＥＣＴ２基因进行扩增，检测限达到１×１０２个，且既能检出疟原虫卵囊又能检出孢子体。此外，ＬＡＭＰ成功检出一只仅携带一个卵囊的按蚊，这在显微镜分析法中往往被漏检。这些结果证明，ＬＡＭＰ法比常规诊断法更加可靠和实用。Ｃｈｅｎ等（２０１０）在利用ＬＡＭＰ对间日疟原虫检测的研究中，比较了ＬＡＭＰ、显微镜检查和ｎＰＣＲ ３种方法的灵敏度和特异性。结果显示，ＬＡＭＰ与ｎＰＣＲ的灵敏度和特异性高度吻合，从热处理后的血液样本中提取ＤＮＡ作为模板，ＬＡＭＰ的灵敏度达到９３．３％，特异性达到１００％。
此外，利用ＬＡＭＰ技术检测锥虫（Ｔｒｙｐａｎｏｚｏｏｎ）和根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）的方法也已成功建立。２．４ 真菌 禾谷镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）能产生一些毒枝菌素，如脱氧萎镰菌醇（ＤＯＮ）、瓜萎镰菌醇（ＮＩＶ）和雌激素类化合物玉米赤霉烯酮（ＺＯＮ）。它通过侵染谷类作物引起病害，对其进行检测的方法主要基于ＰＣＲ体系。
Ｌｕｄｗｉｇ等（２０１０）针对禾谷镰孢菌的ｇａｏＡ基因设计了６条特异性引物，进行ＬＡＭＰ分析。在ＬＡＭＰ体系内加入钙黄绿素荧光染料作为标记，使得扩增结果通过肉眼即可鉴别。优化后的ＬＡＭＰ体系在３０ｍｉｎ内即可完成检测，对纯化后靶基因的检测限不到２ｐｇ。将该ＬＡＭＰ体系应用于１３２种真菌，反应只特异地扩增出禾谷镰孢菌ＤＮＡ，证明该方法具有高度的特异性。２．５ 立克次氏体 恙虫病的临床特征为突然发热，伴有极高的发病率和死亡率。该病的病原为恙虫病立克次氏体（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）。Ｄａｎｉｅｌ等（２００８）针对恙虫病立克次氏体的ｇｒｏＥＬ基因设计了ＬＡＭＰ，对线性质粒、Ｖｅｒｏ细胞培养分离、全血样及临床白细胞层的检测限分别为３、２６、１４和４１拷贝／μＬ。ＬＡＭＰ与ｎＰＣＲ的灵敏度基本一致，检测限均低于患病所达到的细菌接种量范围。
３ 小结与展望
ＬＡＭＰ技术自问世以来，由于其诸多优点，受到科学界越来越多的关注，近年来发展迅速，并已广泛应用于多个领域。但ＬＡＭＰ也存在缺点，笔者通过试验发现，ＬＡＭＰ的假阳性率较高，这可能与其过于灵敏有关。若对其继续深入研究和完善，该技术很有可能取代传统核酸扩增技术，成为核酸研究领域的重要工具，并在病原微生物检测等领域发挥重要作用。
参考文献
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中国畜牧兽医 ２０１２年第３９卷第２期生物技术
９ Ｋａｎｅｋｏ Ｈ，Ｋａｗａｎａ Ｔ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｌｏｏｐ－ｍ
ｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｎ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，７０（３）：４９９～５０１．１０Ｋｅｌｌｙ
Ａ Ｃ，Ｄｏｎｎａ Ｌ Ｒ，Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｏ Ｓ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ｂｙｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｔｈｏｄｓ，２００８，１５１（２）：２６４～２７０．１１Ｌｅｅ Ｍ Ｆ，Ｃｈｅｎ Ｙ Ｈ，Ｈｓｕ Ｈ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｅ－ｔｕｂｅ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ－
ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉ－ｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｓｏ－
ｎｉａｚｉｄ，ｅｔｈａｍｂｕｔｏｌ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ－ｌｏｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，８３：５３～５８．１２Ｌｅｅ Ｍ Ｆ，Ｃｈｅｎ Ｙ Ｈ，Ｐｅｎｇ
Ｃ Ｆ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＥＬＩＳＡ－ｈｙ－ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ－ｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，７６：１７４～１８０．１３Ｌｉ Ｘ Ｆ，Ｚｈａｎｇ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｈ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｌｏｏｐ－ｍ
ｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｐｈｏＰｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎ ｆｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉ－ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
，２００９，１３３：２５２～２５８．１４Ｌｕｄｗｉｇ
Ｎ，Ｒｕｄｉ Ｆ Ｖ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇａ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａ－ｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
，２０１０，１４０：１８３～１９１．１５Ｍａ Ｘ Ｊ，Ｓｈｕ Ｙ Ｌ，Ｎｉｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓｕａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕ－
ｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１ｖｉｒｕｓ ２００９ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈｏｌ ｂｌｕｅ ｄｙｅ［Ｊ］．Ｖｉｒ－
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，１６７：２１４～２１７．１６Ｍａｅｄａ Ｈ，Ｋｏｋｅｇｕｃｈｉ Ｓ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄｏｎ－
ｔａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ－
ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉ－ｏｌ，２００５，４３（２）：２３３～２３９．
１７Ｍａｓａｋｉ Ｉ，Ａｉ Ｎ，Ｈａｒｕｍｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇ
ｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｈ５ｈｅｍａｇ－ｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，１４１：１７３～１８０．１８Ｍａｓａｓｈｉ Ｏ，Ｙｏｕｓｕｋｅ Ｏ，Ｓｈｕｉｃｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ－
ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅ Ｏ９ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏ－ｂｉｏｌｏｇｙ
，２００８，１３２：１９７～２０４．１９Ｍｏｒｉ Ｙ，Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ，Ｔｏｍｉｔａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ－ｍ
ｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｇ－ｎｅｓｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ－ｍｕｎ，２００１，２８９（１）：１５０～１５４．
２０Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ，Ｈａｓｅ Ｔ，Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ－
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌ
Ｐｒｏｂｅｓ，２００２，１６（３）：２２３～２２９．２１Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｋ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｔｓｕｋａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ－
ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ
Ｃｈｅｍ，２００１，４７（９）：１７４２～１７４３．２２Ｎｏｒｉｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｎｉｃａｉｓｅ Ｎ，Ａｚｕｍｉ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐ
ｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ｇｒｏｕｐ Ｍ ｂｙ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎ－ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［Ｊ］．ＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００９，１５７：１９５～１９９．
２３Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ－
ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０００，２８（１２）：Ｅ６３．２４Ｏｒｉｅｌ Ｍ Ｍ Ｔ，Ｎａｔａｓｈａ Ｅ Ｒ，Ｒｙｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ－
ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒ－ｖａｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＰＩＭａｎｄ ｐ１５０ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
，２０１０，４０：５５～６１．２５Ｑｉ Ｚ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｙｕａｎ Ｙ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐ
ｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅ－ｕｓ ｉｎ ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ ｍｉｌｋ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＦＴＡ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈ－ｎｏｌｏｇｙ
，２００８，１３６：Ｓ５１～Ｓ５２．２６Ｒｅｎ Ｃ Ｈ，Ｈｕ Ｃ Ｑ，Ｌｕｏ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐ
ｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１６４：５１４～５２１．２７Ｗａｎｇ Ｌ Ｘ，Ｈｅ Ｌ，Ｆａｎｇ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉ－
ｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｓｅｒｇｅｎｔｉ ｉｎｆｅｃ－ｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐ３３ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２０１０，１７１：１５９～１６２．
２８Ｙｉｎ Ｓ ｈ，Ｓｈａｎｇ
Ｙ Ｊ，Ｚｈｏｕ Ｇ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎ－ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，２０１０，１４６（４）：１４７～１５０．２９Ｚａｂｌｏｎ Ｋ Ｎ．Ｒａｐ
ｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ａｆｒｉｃａｎｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍ－ｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌａｔｅｒａｌ－ｆｌｏｗ ｄｉｐｓｔｉｃｋ［Ｊ］．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１１，９：２０５～２０９．３０Ｚｈａｎｇ
Ｈ Ｓ，Ｏｒｉｅｌ Ｍ Ｍ Ｔ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎ－ｄｉｉ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉ－
ｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒ－ａｓｉｔｏｌｏｇｙ
，２００９，１２２：４７～５０．３１Ｚｈａｎｇ Ｘ Ｊ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｌｉｕ Ｌ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ－
ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｃｌａｓｓｉ－ｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，１６７：７４～７８．Ｔｈｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｓＤＡＮ Ｘｉａｏ－ｙａ１，
２，ＸＵＥ Ｑｉａｎｇ１，ＺＯＵ Ｍｉｎｇ－
ｑｉａｎｇ１，ＤＯＮＧ Ｙｉｎｇ２
（１．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１２３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ２１２０１３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｓｉｎｃｅ ｉｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐ－ｍｅｎｔ，ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ａｄｏｐｔｅｄ ｗｉｄｅｌｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ．Ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｏｏｐ－ｍ
ｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ·
６５·生物技术
中国畜牧兽医 ２０１２年第３９卷第２期
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 关键词：恒温扩增；PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA 原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA 可用于非
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例 1．LAMP引物的设计： LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F 3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因 的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基 因的B3c区域互补。 如图所示：
2．扩增原理 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c 结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C 所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
文章编号:1001-764X(201105-378-03 ·研究生园地·环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸* 沈会平1,张耀祺1,杨坚2,石磊1,陈涛3,李国周4,赵红波5,莫自耀5(1．华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;2．迪澳生物科技有限公司,广州510663;3．广东省结核病防治研究所,广州510630;4．东莞市慢性病防治院,广东东莞 523008;5．广州医学院呼吸疾病国家重点实验室,广州510230 摘要:目的建立一种快速准确的检测结核分枝杆菌(MTB核酸的环介导等温扩增(LAMP方法。方法以重复插入序列IS6110为目的基因,设计LAMP引物,特异检测MTB核酸。用本法与痰涂片抗酸染色镜检法、实时荧光PCR法对100例可疑患者痰标本进行对比检查。结果LAMP法特异性强,仅扩增MTB复合群核酸;灵敏度高,检测限达100fg;而实时荧光PCR 检测限为1pg。对100例疑似结核病患者痰液标本检测,涂片抗酸染色法、LAMP法、实时荧光PCR法的阳性率分别为28%、39%和38%。结论本研究建立的LAMP方法检测MTB核酸特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为临床快速检测MTB的新方法。 关键词:结核分枝杆菌;环介导等温扩增法;IS6110基因;实时浊度仪 中图分类号:R378．91文献标志码:A Rapid detection for Mycobacterium tuberculosis by loop-mediated isothermal amplification SHEN Hui-ping1,ZHANG Yao-qi1,YANG Jian2,SHI Lei1,CHEN Tao3,LI Guo-zhou4,ZHAO Hong-bo5,MO Zi-yao5(1．College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou510640,Guangdong;2．Diao Bio-Technology Co．Ltd,Guangzhou510663,Guangdong;3．Guangdong Research Institute for Mycobacterium tuberculosis Control,Guangzhou510630, Guangdong;4．Dongguan Hospital for Chronic
作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院(蔡哲钧、冯杰雄);310006杭州,浙江大学医学院(朱圣禾)?综述? 核酸环介导等温扩增技术 蔡哲钧综述 冯杰雄 朱圣禾审校 【摘要】 介绍环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景。环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可检测乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、水痘2带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒、结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。 【关键词】 核酸类; 基因扩增 上世纪90年代以来,出现了几种新的核酸扩增方法:核酸等温扩增法(nucleic acid sequence2based amplification,NAS2BA)、自序列复制法(self2sus2 tained sequence replication,3SR)和链置换扩增法(st rand displacement amplification,SDA)等。Noto2 mi等[1]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(loop2mediated isot hermal amplification,LAM P),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAM P是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。现将该项技术的研究进展作一综述。 L AM P法的原理 该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在15～60min扩增109～1010倍;特异性高,所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的[2]。 1.引物的设计:基于靶基因3′端的F3c、F2c和F1c区以及5′端的B1、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP引物:上游内部引物,由F2区组成,F2区与靶基因3′端的F2c区域互补,与靶基因5′端的F1c区域序列相同。F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。B IP引物:下游内部引物,由B2区组成,B2区与靶基因3′端的B2c区域互补,与靶基因5′端的B1c区域序列相同。 B3引物:下游外部引物,由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。 2.扩增原理:DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下,以FIP引物F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补,以3′末端为起点,通过链置换型DNA聚合酶的作用,一边置换先头FIP引物合成的DNA链,一边合成自身DNA,如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA 链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链,这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,于是发生自我碱基配对,形成环状结构。同时,BIP引物同该单链杂交结合,以B IP引物的3′端为起点,合成互补链,在此过程中环状结构被打开。接着,类似于F3,B3引物从B IP引物外侧插入,进行碱基配对,以3′端为起点,在聚合酶的作用下,合成新的互补链。通过上述两过程,形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列,自然发生自我碱基配对,形成环状结构,于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAM P法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成L AM P法基因扩增循环的起点结构。LAM P 法基因扩增循环:首先在哑铃状结构中,以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。与此同时,FIP引物F2与环上单链F2c杂交,启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样,在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c,B IP引物上的B2与其杂交,启动新一轮扩增。经过相同的过程,又形成环状结构。通过此过程,结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构[2]。 3.L AM P扩增产物的检测:(1)荧光定量检测:利用S Y BR GreenⅠ荧光染料只与双链DNA小沟结合,当它与DNA双链结合时,发出较原先强800～