河北农业大学
硕士学位论文
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
姓名：董炳梅
申请学位级别：硕士
专业：预防兽医学
指导教师：王家鑫
2009-06-06
摘要
布鲁氏菌是典型的胞内感染菌，自然感染状态下，由于巨噬细胞表达高丰度的布鲁氏菌模式识别受体，所以成为布鲁氏菌感染的主要靶细胞。研究证明，布鲁氏菌侵入巨噬细胞后可通过抑制TNF-α的分泌而抑制巨噬细胞凋亡，从而可在细胞内生存并大量繁殖，削弱巨噬细胞吞噬功能，使巨噬细胞的杀伤作用与抗原提呈功能部分丧失，最终逃避宿主的免疫监视；另一方面，巨噬细胞激活初始T细胞的能力较弱，也不表达有抗原提呈功能的CD1分子，故不能有效提呈脂类抗原给NKT细胞；这可能是导致布鲁氏菌持续感染形成的原因。
树突状细胞（dendritic cells，DCs)是目前所知功能最强大、且能激活初始性T （na?ve T cell）细胞的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)，不仅可以通过MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类途径提呈抗原，而且还拥有提呈脂类抗原的CD1分子。但由于DCs只表达低丰度的布鲁氏菌模式识别受体，所以捕获布鲁氏菌的能力较弱。
为比较两种细胞负载布鲁氏菌后形态学变化，对负载布鲁氏菌后的巨噬细胞与DCs进行姬姆萨染色。结果显示，巨噬细胞负载布鲁氏菌4h，吞噬布鲁氏菌的数量明显增多；在6 h，巨噬细胞出现胞质脱落现象；至8h胞质脱落现象增多，个别细胞的细胞膜几乎完全消失；至12h，大部分巨噬细胞出现了胞质脱落、细胞膜消失与核固缩现象，并有膜包小泡被释放至胞外。而DCs负载布鲁氏菌后4 h，出现细菌与DCs黏附并有少量细菌被吞噬的现象；6 h～8 h DCs吞噬布鲁氏菌的数量明显增多；
10 h～12 h黏附现象消失，绝大多数DCs吞噬了布鲁氏菌；以上结果证明，巨噬细胞负载布鲁氏菌后形态结构遭到破坏，而DCs捕获布鲁氏菌后结构始终保持完整。因此为了使DCs发挥其强大抗原提呈作用，避免巨噬细胞在布鲁氏菌感染后造成的免疫缺陷，本试验设计了靶向DCs的新型布鲁氏菌疫苗。
布鲁氏菌的脂多糖和外膜蛋白质(outer membrane proteins, OMPs)是构成细菌毒力及免疫原性的重要因素，但脂多糖免疫原性较弱，因此在本试验中选择布鲁氏菌OMPs作为目的抗原。本试验采用去污剂连续抽提与电洗脱的方法，经SDS-PAGE 检测，表明分子量为37.5 kD与47.2 kD的两种布鲁氏菌OMPs已被成功提取纯化。随后用两种蛋白质与弗氏佐剂混合乳化，皮下注射BALB/c小鼠，同时用商品布鲁氏菌冻干疫苗作对照，在第4次免疫后收集外周血制备血清。为检测布鲁氏菌OMPs 的免疫原性，以纯化的布鲁氏菌蛋白质为抗原，分别与疫苗组和蛋白质组小鼠血清作双向琼脂扩散试验，结果显示，在2倍稀释血清孔周围均出现沉淀线，说明两种蛋白质混合后具有很好的免疫原性。用间接ELISA检测各试验组小鼠血清中IgG的含量（P/N＞1.5），检测结果分别为，疫苗组：1:160；蛋白组：1:320；可见2种蛋白免疫效果明显好于疫苗组，因此这2种蛋白质被选作本试验的目的抗原。
甘露糖受体（mannose receptor MR）是DCs和巨噬细胞所特有的膜受体，未成熟的DCs表达高水平的MR，能有效地捕获含有甘露糖残基的生物大分子或微生物。但天然布鲁氏菌蛋白含甘露糖残基甚微，因此为增强MR介导的抗原摄取与提呈功
能，利用糖基化位点数据库O-GlycBase与糖基化位点预测工具软件，确定了两种蛋白质的糖基化位点为赖氨酸分子上的ε-氨基，采用α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯对两种目的蛋白质抗原进行甘露糖修饰，间苯二酚-硫酸法鉴定结果表明，两种蛋白质抗原已被成功糖基化修饰。随后，把糖基化蛋白质与弗氏佐剂混合乳化，同时用弗氏佐剂混合乳化的纯化蛋白质、弗氏佐剂混合乳化的PBS、商品布鲁氏菌冻干疫苗作对照，BALB/c小鼠皮下注射，第4次免疫后眼球采血制备血清。试管凝集试验表明，蛋白质经糖基化后，与纯化蛋白(抗体效价1:240)和疫苗(抗体效价1:120)免疫效果相比，体液免疫水平明显降低(抗体效价1:10)。ELISA试验结果表明，纯化蛋白质组、糖基化蛋白质组与疫苗组IFN-γ血清水平均显著高于PBS对照组(P＜0.01)，并且糖基化蛋白质组IFN-γ血清水平明显高于纯化蛋白质组(P＜0.01）与疫苗组(P＜0.05）；而IL-4血清水平除纯化蛋白质组显著高于PBS对照组外(P＜0.05)，其余两组与PBS对照组相比差异均不显著(P＞0.05)；说明三种抗原注射后都有效引发了机体的Th1细胞免疫应答，且蛋白质经糖基化修饰后免疫效果显著优于未糖基化蛋白质与布鲁氏菌冻干疫苗。据此推测，蛋白质经糖基化修饰后，提高了DCs吞噬与提呈抗原的作用，从而引起了机体更高水平的细胞免疫应答。
为了避免弗氏佐剂的副作用，提高糖基化蛋白质的免疫效果，使糖基化蛋白更好地发挥靶向性作用，本研究选择油包水佐剂50V作为佐剂，与糖基化蛋白混合乳化后接种小鼠，分别在1免后4 d、2免后3 d、5 d、7 d眼球采血制备血清，用ELISA 检测血清IFN-γ的含量。布鲁氏菌冻干疫苗免疫后，在1免4d至2免3d，IFN-γ水平呈上升趋势，并且显著高于糖基化蛋白质组与纯化蛋白质组(P＜0.05)，但2免5 d 后，IFN-γ水平急剧下降，至2免7 d，IFN-γ水平显著低于糖基化蛋白质组与纯化蛋白质组(P＜0.05)，表明布鲁氏菌冻干疫苗接种后虽然在短期内激发了机体高水平的IFN-γ免疫应答，但维持时间较短，且不能产生良好的免疫记忆。而糖基化蛋白质免疫后，IFN-γ水平持续上升，并在2免后5 d至7 d，显著高于纯化蛋白质组与疫苗组(P＜0.05)，说明糖基化蛋白质免疫后随着佐剂不断被吸收，IFN-γ水平不断上升，激发了机体有效的Th1细胞免疫应答，且免疫水平显著高于未糖基化蛋白质与布鲁氏菌冻干疫苗，并能诱导免疫记忆的形成。
本试验结果说明，布鲁氏菌分子质量分别为37.5 kD与47.2 kD 的OMPs具有良好的免疫原性，其赖氨酸分子上的ε-氨基经α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯糖基化修饰后有效提高了DCs的吞噬与抗原提呈作用，从而增强了机体的Th1型细胞免疫应答，因此，开发预防布鲁氏菌病靶向化树突状细胞疫苗是完全可行的。
关键词：布鲁氏菌；巨噬细胞；树突状细胞；甘露糖受体；糖基化
The lipopolysaccharides and outer membrane proteins (OMPs) in Brucella cellular membrane are the main virulent factors and show appreciated antigeneicity. Therefore, the consecutive extraction with eradicator and electric elution was employed to isolate these molecules. The result indicated that the two outer membrane proteins, 37.5 kD and 47.2 kD were successfully obtained after SDS-PAGE analysis. Subsequently, the mice were hypodermically injected with the two proteins mixed and Freund adjuvant, with the Brucella vaccine as control. The serum was prepared and analyzed after the fourth booster.The result showed that the two proteins own better immunogenicity. Furthermore, the antibody titer (1:320) was higher than the Brucella vaccine (1:160). Consequently, the two proteins were selected as the potential candidate antigens.
The mannose receptors (MR) are the intrinsic membrane receptors on DCs and macrophages, belonging to the lectin receptors. The immature DCs express high level of MR that can effectively capture the biological macromolecules and microorganism that contain mannose residues. However, the Brucella OMPs contain possess a small quantity of mannose residues. Hence, in order to enhance the capability of DCs in our research, we make sure of the glycation of ε amino groups of lysines as the glycosylation site of two proteins through the O-GlycBase and the glycosylation site prediction tool. The proteins were glycosylated with α-D-mannopyranosyl-phenylisothiocyanate, and the production was identified with the resorcinol-sulfuric acid reagents analysis. The result indicated that the two proteins were glycosylated efficiently.
To test the immune efficiency of glycosylated proteins, the glycosylated proteins were mixed with Freund adjuvant and hypodermically injected in mice, the purified proteins, PBS and the burcella vaccine as control at the same time, the serum was prepared after the fourth immunity. The result indicated that the glycosylated proteins induced obviously lower level of antibody (1:10) than the pure proteins (1:240) and the brucella vaccine (1:120) after the serum was analyzed by tube agglutination test. On the other hand, the ELISA results suggested that the levels of IFN-γ in the pure proteins group, the glycosylated proteins and the brucella vaccine group were remarkably higher than the control group (P＜0.01). Furthermore, the level of IFN-γ in the glycosylated proteins group was remarkably higher than the pure proteins (P＜0.01)and the brucella vaccine(P＜0.05). But the levels of IL-4 in the three groups were not markedly higer than the PBS control group (P＞0.05), except the purified proteins group. All the resultes indicated that all the three antigens induced the Th1 cellular immune response effectively, and the immune efficiency of the glycosylated proteins was higher than the pure proteins and the Brucella vaccine. Collectively, the brucella glycosylated OMPs enhance the engulf and the antigen presentation of DCs, that induce more efficiently cellular immune response.
To enhance the immune efficiency and the target-capability of the glycosylated proteins, avoiding the side-effect of Freund adjuvant, the glycosylated proteins were emulsied with
the adjuvant-MONTANIDETM ISA 50V (Seppic System), and the mice were hypodemically injected. The mice were subscribed on 4d after the first inoculation and on 3d, 5d and 7d respectively after the second booster. The serum was prepared for the analysis of IFN-γ. The results suggested that the response could not retain a long time, though the Brucella vaccine induced the higher level of IFN-γ immune response in a short time. However, the level of IFN-γ constantly increased and was notably higher than the Brucella vaccine and purified proteins from 5d to 7d after the second inoculation (P＜0.05). These results suggested that the glycosylated proteins induced the efficient Th1 immune response. Furthermore, the most important was that the glycosylated proteins elicited stronger and longer immunological memory than the brucella vaccine.
Our research suggests that the 37.5 kD and 47.2 kD OMPs have good immunogenicity. The glycosylated proteins enhance the engulf capability and antigen presentation of DCs that promote the Th1 cellular immune response. Therefore, the Brucella protein antigen- targeted DCs vaccine is absolutely feasible.
Key words: brucella; macrophage; dendritic cell; mannose receptor; glycosylation
缩略词索引表
英文缩写英文全称中文译名
TNF Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子
cell 树突状细胞
DCs Dendritic
MHC Major histocompatibility complex 主要组织相容性复合体APC Antigen presenting cell 抗原提呈细胞
CD Cluster of differentiation 白细胞分化抗原
killer 自然杀伤
NK Natural
receptor 甘露糖受体
MR Mannose
IL Interleukin 白细胞介素
PG Peptidoglycan 肽聚糖
IFN Interferon 干扰素
PBS Phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液
OMPs Outer membrane proteins 外膜蛋白
LPS Lipopolysaccacride 脂多糖
BSA Albumin bovine V牛血清白蛋白
SDS Sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠
OD Optical density 光密度
RB51 Rough strain B.abortus 51 粗糙型牛种布鲁氏菌51 VTRSl Rough mutant B.suis 猪布鲁氏菌突变株VTRM1 Rough mutant B. melitensis 16M 羊种布鲁氏菌突变株
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据本人所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者签名：签字日期：年月日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
（保密的学位论文在解密后适用本授权书）
学位论文作者签名：导师签名：
签字日期：年月日签字日期：年月日
学位论文作者毕业后去向：
工作单位：电话：
通讯地址：
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
1 引言
1.1布鲁氏菌病的研究进展
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella sp)引起的人畜共患性传染病，严重威胁着人和多种动物的生命健康。我国将布鲁氏菌病列为二类传染病，世界动物卫生组织将其列为B类法定传染病。布鲁氏菌病呈世界性流行，可引发多种家畜的流产、不育以及人的波浪热，造成严重的经济损失和食品安全问题，在我国29 个省、市、自治区都有不同程度的发生和流行，在全世界170 多个国家和地区存在和流行，而在拉丁美洲它每年造成约6 亿美元的损失，在美国每年造成的损失平均达1.5 亿美元[1]，随着畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病在多数疫区有明显回升的趋势。
疫苗在布鲁氏菌病的防治上发挥了积极的作用，但常规疫苗始终不能有效防止疾病的发生，且存在疫苗生产成本高，注射后会出现副反应和可能干扰诊断准确性的缺点。因此，寻找布鲁氏菌的有效防控措施仍然是摆在各国学者面前的一个重大课题。
1.1.1布鲁氏菌分类及致病性
布鲁氏菌分为七个种19 个生物型。传统上根据布鲁氏菌对宿主的倾向性和危害性进行分类，具有重要公共卫生意义的种类有羊布鲁氏菌(https://www.doczj.com/doc/7c7890893.html,litensis)、牛布鲁氏菌(B.abortus)、猪布鲁氏菌(B.suis)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotanae)和犬布鲁氏菌(B.canis)，还有海洋哺乳动物布鲁氏菌种(B.maris)。羊种布鲁氏菌有1、2、3型，牛种布鲁氏菌有1、2、3、4、5、6、7、9 型，猪种布鲁氏菌有1、2、3、4、5 型，犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌和沙林鼠种布鲁氏菌各有1个生物型[2]。
目前布鲁氏菌被划分为2类生物安全病原体。不同种类的布鲁氏菌大多具有不同宿主间交叉感染的能力，并具有极为明显的宿主危害倾向性。其中牛种、羊种和猪种是三种危害最大的布鲁氏菌。人和羊对羊布鲁氏菌高度易感，引起的危害也最为严重；而牛种布鲁氏菌对人的易感性及危害性相对较轻，但对牛则高度易感，危害严重；猪种布鲁氏菌对猪和人均表现出高度易感性,危害也较为严重，尽管对牛也能感染，但几乎不形成危害[3]。
1.1.2 流行病学
本病的主要传染源是病畜及带菌动物，病畜的分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌，染疫动物首先在同种动物间传播，造成带菌或发病，随后波及人类。布鲁氏菌可经呼吸、消化、生殖系统黏膜以及损伤甚至未损伤完整皮肤等多种途径侵入机体，通过接触或食入感染动物的分泌物、体液、尸体及污染的肉与奶，形成感染。人类感染布鲁氏菌后一般不发生人与人的水平传播。家畜，特别是对羊布鲁氏菌最为易感的绵羊、山羊和牛，是人类最主要的感染源。动物的易感性随性成熟年龄的接近而增高，人类普遍具有易感性。本病一年四季均可发病，但以家畜流产季节为多。发病率牧区高于农区。流行区在发病高峰季节(春末夏初)可呈点状暴发流行。患病与职业有密切关系，兽医、畜牧工作者、屠宰工人、皮毛工人等明显高于一般人群。
河北农业大学硕士学位（毕业）论文
本病在全世界170多个国家和地区存在和流行，约占全世界1/5～1/6 的人受布鲁氏菌病的威胁，全世界现约有500 万～600 万人患布鲁氏菌病，每年新发病人约有50 万人[4]。在中国31个省(市、区)中有28 个省(市、区)的人、畜有布鲁氏菌病存在和流行，全国受布鲁氏菌病威胁的人口约有3.5 亿，现有布鲁氏菌病患者30 万～50 万，每年新发病5 000～6 000 人，每年实际新病25 000～30 000 人[5]。改革开放以来，特别是20世纪90年代后，由于畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病在多数疫区有明显回升趋势。我国布鲁氏菌病疫区经常有疫情暴发的报告，如陕西、山西、内蒙、新疆及河北等地。
1.1.3 临床症状
本病的潜伏期长短不一，短则两周，长的可达半年之久。家畜患病后症状基本相似，多数病例为隐性感染，早期出现结膜炎和体温升高等症状。妊娠母畜流产多在妊娠2～8 个月，多为死胎或弱仔。但大多数流产两个月后可以再次受孕，公畜睾丸肿大，触之热、痛。人患布鲁氏菌病潜伏期为1～3 周，易转为慢性。轻者出现低热、无力、疲乏，全身酸痛，关节肿大、疼痛，焦躁不安和神经过敏，颈部和腹股沟淋巴结肿大，脾脏肿大用手可触摸到。男性患者常见单侧睾丸或附睾炎；女性患者有时可发生特异性乳腺炎、卵巢炎、子宫内膜炎，孕妇可发生流产。多数病例有长期起伏的发热，称“波状热”。
1.1.4 致病机制研究进展
布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌，主要以巨噬细胞与胎盘滋养层细胞为宿主细胞。然而研究表明，布鲁氏菌在两种宿主细胞中的生存却依赖截然不同的subsets of genes的产生。在自然宿主、人类、以及试验动物感染中，由于巨噬细胞表达更多的布鲁氏菌模式识别受体，所以布鲁氏菌优先感染巨噬细胞[6]，而且造成持续感染的主要原因依赖于布鲁氏菌在噬菌细胞的phagosomal compartment中的生存能力。
1.1.4.1 巨噬细胞
研究证明，布鲁氏菌在牛、人类及鼠类的巨噬细胞中均能很好的生存与繁殖。虽然特异性IgG 和INF-γ的活化促进了巨噬细胞的杀伤能力，但是强毒菌株仍能抵抗细胞杀伤作用，甚至在细胞内大量繁殖，削弱巨噬细胞吞噬功能，使巨噬细胞的细胞杀伤作用与抗原提呈功能部分丧失，从而逃避宿主的免疫防御机制，造成持续感染[7,8]。
布鲁氏菌侵入巨噬细胞后，首先定居于酸性环境并立即与早期内吞小体融合，但却能抑制与晚期内吞小体和溶酶体融合，随后布鲁氏菌被转运至复制吞噬体中(replicative phagosome)，复制吞噬体的内环境更有利于布鲁氏菌的生存与复制；对复制吞噬体的膜成分的研究表明，含有布鲁氏菌的空泡在不断地与巨噬细胞细胞内质网相互作用，表明布鲁氏菌开始自身复制增殖[9]。
羊种、猪种、牛种布鲁氏菌拥有由virB操纵子成分编码的Ⅳ型分泌系统。virB能有效地防止吞噬了布鲁氏菌的吞噬小体与溶酶体的融合，从而阻止布鲁氏菌被消化，使其能在吞噬细胞中寄生[10]。而且virB与细菌N型分泌系统同源，该系统分泌的效应分子决定了布鲁氏菌进入内质网复制相关区。
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
当布鲁氏菌在巨噬细胞的复制吞噬体中由对数生长期发展到稳定阶段时，环境会发生改变，其中包括pH值改变、ROIs的作用。此时布鲁氏菌需要产生对环境改变的持续的抵抗，HF-?是一个RNA编码的蛋白质，在多种细菌复制的稳定阶段，对细菌的基因表达发挥了至关重要的作用。另一方面它能促进CydAB的表达与活化，从而保护细菌免遭氧化。
布鲁氏菌bvrRS操纵子编码了一个含两种成分的调节系统，控制着细胞膜完整性的表达。这些基因编码了大量Omp3组膜蛋白，同时修改了脂多糖的脂肪酸A的一部分，使布鲁氏菌在宿主细胞中成功避免了阳离子杀菌剂缩氨酸的杀菌作用。
布鲁氏菌光滑型脂多糖可保护细菌免遭补体调节的细胞杀伤作用。在早期阶段，布鲁氏菌通过脂多糖与巨噬细胞膜表面的脂筏相互作用，从而侵入宿主细胞；另一方面，LPS还能抑制含有布鲁氏菌的吞噬小体进一步与溶酶体融合，从而避免被降解。最新研究表明，光滑型LPS对布鲁氏菌在巨噬细胞中的长期生存具有免疫调节作用，它可以与巨噬细胞表面的MHCⅡ结合，形成MHCⅡ-LPS复合物，此复合物可干扰巨噬细胞以MHCⅡ的方式提呈抗原，从而削弱巨噬细胞活化抗原特异性CD4+T细胞。
1.1.4.2 胎盘滋养层细胞
布鲁氏菌在怀孕晚期可以在胎盘滋养层细胞中生长繁殖，细菌大量快速的复制可以破坏胎盘的完整性或感染胎儿，最终导致流产或产下弱仔、带菌胎儿。目前对感染了布鲁氏菌的胎盘滋养层细胞中的环境变化知之甚少，反刍动物胎盘滋养层细胞感染布鲁氏菌后可产生大量的赤藻糖醇，此物质可刺激细菌在细胞中的生长繁殖。
1.2 布鲁氏菌抗原的分子生物学特性
布鲁氏菌细胞膜中含有的脂多糖和外膜蛋白，与细菌的毒力及免疫原性相关。布鲁氏菌细胞膜是一个3层膜的结构，最内层的膜称为细胞质膜，外层膜称为外周胞质膜，最外层膜称为外膜。外膜与肽聚糖(peptidoglycan, PG)层紧密结合组成细胞壁，含有脂多糖、蛋白质和磷脂层[11]。根据LPS是否含有O链(O-chain)，将布鲁氏菌分为光滑型(smooth, S)和粗糙型(rough, R)2种。S型布鲁氏菌的LPS含有O链，它的O链部分含有布鲁氏菌表面绝大多数的抗原位点，是一个很重要的保护性抗原，而R型布鲁氏菌的LPS缺少O链[12]。外膜的蛋白质也叫外膜蛋白，在S型布鲁氏菌表面由于受到LPS的遮盖，不能充分表露出来，R型布鲁氏菌表面缺少O链，OMPs能够显露出来。
1.2.1 脂多糖
LPS是革兰氏阴性菌的主要表面成分，目前革兰氏阴性菌的脂多糖几乎与内毒素一词成为同义词。一般说来含有少量或者没有O链的粗糙型布鲁氏菌比光滑型毒力弱，抵抗吞噬攻击能力也弱，然而有些布鲁氏菌种的自然毒力株却是光滑型的。确定LPS作为毒力因子有以下两个依据：第一，布鲁氏菌的LPS比肠杆菌科的LPS免疫原性小，因此非化脓性布鲁氏菌LPS不能明显激活补体替代激活途径，对B细胞是一个刺激较小的有丝分裂原，要引起动物致死和诱导产生干扰素，需要的布鲁氏菌LPS的量是肠杆菌科内毒素量的10倍，因此推测由布鲁氏菌LPS刺激宿主产生的较小的生物反应，或许是这些病原体在吞噬细胞内存活的一个重要原因。第二，LPS缺陷布鲁氏
河北农业大学硕士学位（毕业）论文
菌突变株对补体和多粘菌素B介导的溶菌作用是敏感的。目前，公认光滑型LPS在布鲁氏菌进入吞噬体的早期表现出重要的作用[7]。最近的研究还表明，布鲁氏菌2308株的光滑型LPS还潜在地具有维持细菌在宿主巨噬细胞中长期生存的免疫调节活性。
1.2.2 外膜蛋白的分子生物学特性
革兰氏阴性细菌的OMPs被证明能够调节吞噬细胞的功能，能够激活细胞活素的产生[13]。布鲁氏菌主要的OMPs在20世纪80年代首次被鉴定具有免疫原性和抗原保护作用[14]。布鲁氏菌OMPs 分组首先由Verstreate等[15]在1982年提出，即将去污剂连续处理抽提法提取的OMPs经SDS-PAGE 后分为三组：第一组分子量范围88 kD～94 kD，多数菌在94kD出现一条带，但有的出现在88kD，此组蛋白有热稳定性。研究表明，第二组蛋白质其分子量范围在35 kD～40 kD，Santos等[16]对牛种、绵羊附睾种、犬种、羊种布鲁氏菌粗糙型菌株OMPs经SDS-PAGE后分为两类：一种是粗糙型牛种、绵羊附睾种和犬种布鲁氏菌，与光滑型牛种布鲁氏菌一致含有三组主要蛋白质，另一种是粗糙型羊种布鲁氏菌，在第一组和第二组蛋白质之间多了一条分子量为48kD的带。Afzal[17]发现绵羊附睾种的第二组蛋白有54 kD蛋白质，因此第二组蛋白在数量上是多变的，这可能是由于提取方法不同、菌株变异或不同培养条件等原因造成的。第三组蛋白分子量范围在25 kD～34 kD之间，此组蛋白表现为异质性，SDS-PAGE迁移率有所不同。
随着分子生物学技术的快速发展，大量研究表明，布鲁氏菌的OMPs有很强的免疫原性[18]，可能与布鲁氏菌在巨噬细胞内存活有关。目前，分子生物学上研究的主要OMPs有7种[19,20]，即10 kD，16.5 kD，19 kD，25 kD～30 kD，31k D～34 kD，36 kD～38 kD和89 kD～94 kD。
除这些主要OMPs外，已鉴定出的布鲁氏菌胞蛋白、外周蛋白及一些膜蛋白中也有许多蛋白质具有免疫原性。它们除能够引起宿主体液反应外，更多的是与布鲁氏菌在巨噬细胞内存活和抗巨噬细胞杀伤能力有关。对这些蛋白的研究，将有助于揭示布鲁氏菌蛋白质抗原诱导和躲避T细胞介导的巨噬细胞活性的机理，从而研制出安全有效的新型布鲁氏菌病疫苗。
1.3 布鲁氏菌疫苗研究现状
布鲁氏菌病因其独特的致病机制及感染后难以根治的特点，防控该病一直是以应用疫苗进行预防为主。布鲁氏菌病疫苗的种类较多，包括弱毒活菌苗、灭活疫苗、突变株疫苗以及新型疫苗等。其中布鲁氏菌新型疫苗是在20世纪80年代末和20世纪90年代初研制出的，包括布鲁氏菌病基因工程苗[21]和抗独特型抗体苗[22,23]。目前使用的大多数有效的疫苗都是布鲁氏菌减毒活疫苗，弱毒苗造价便宜，免疫保护持续时间长，免疫保护效率高。到目前为止，还没有一种灭活苗的免疫保护效果优于减毒活疫苗。现在国际上普遍使用的布鲁氏菌疫苗主要为S19、Rev.1和RB51 (Rough strain B.abortus 51)。
1.3.1 弱毒疫苗
弱毒疫苗分为人用活菌苗和畜用减毒活菌苗两种。
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
1.3.1.1 人用活菌苗
主要有BA219和104M两种。BA219是1947年Bepmnnoba从美国引进S19株，经严格挑选集落，选用毒力低、集落均一的菌株。104M是1950年Kotlyarova从牛流产胎儿中分离到T株和M株，经实验证明M株毒力低、稳定、免疫力强。这两种疫苗只有少数国家和地区用于人，由于毒力返强，便很快停止使用。
1.3.1.2 兽用减毒活菌苗
目前使用的大多数有效的布鲁氏菌疫苗是减毒活疫苗牛型19号(B.abortus strain 19)弱毒活菌苗、羊型ReV1(B.melitensis Rev.1)弱毒活菌苗、羊型5号(M5)弱毒活菌苗和猪型2号(S2)弱毒活菌苗等4种。牛型19号弱毒活菌苗是以流产布鲁氏菌自然减毒的19号菌株制成的，该菌株能传染人，并会引起怀孕母畜的流产，在公畜中也限制使用。ReV1是1957年Elbrg从链霉素及不含链霉素培养基上选育出的返祖菌株，此菌株作为疫苗仍具有相当的毒力，并且在适当的条件下，毒力可以完全恢复，免疫动物后也会干扰临床诊断。虽然对牛、羊布鲁氏菌均具有免疫力和保护力，且对牛的保护力要优于S19，但此菌株作为疫苗尚有一定的毒性，而且在一定的条件下毒力可完全恢复，因此作为疫苗还需要进一步改进[24]。M5弱毒活菌苗是我国哈尔滨兽医研究所于1962年将羊布鲁氏菌H28强毒菌株，连续通过鸡减毒制成。S2弱毒活菌苗是我国农业部兽医药品监察所于1952年从猪胚筛选出猪布鲁氏菌自然减毒的变种研究制成，受到绵羊布鲁氏菌攻击时，S2菌苗的免疫保护率远远高于ReV1弱毒苗和H38灭活苗。
1.3.2 灭活疫苗
灭活疫苗有牛型45/20和羊型H38两种。牛型布鲁氏菌45/20是从病牛体分离，然后经过豚鼠多代培养得到粗糙型的减毒苗，但是在应用过程中疫苗效果不理想。羊型H38死菌佐剂苗是1957年Renoux等将强毒羊布鲁氏菌H38号菌株的培养液，经福尔马林灭活后与mayoline (一种轻质石蜡油)及rlace A(一种经特别处理过的甘露醇单油酸脂)混合搅拌制成的乳化佐剂苗。此菌苗对人畜安全,但有局部副作用，可能引起注射部位化脓，同时血清学反应也呈阳性。用其免疫羊，主要在法国应用，其他国家少用。
1.3.3 突变株疫苗
突变株疫苗主要有RB51突变株疫苗、VTRM1(羊种布鲁氏菌突变株Rough mutant B. melitensis 16M) 和VTRSl (猪布鲁氏菌突变株Rough mutant B.suis)等3种。RB51疫苗株是由光滑型牛布鲁氏菌2308株经体外反复传代，并经利福平和青霉素的筛选获得。多年的应用证明其免疫力和保护力均优于S19[25]，而且保护效果好而又不干扰诊断结果，是当前应用最为广泛的布鲁氏菌疫苗。VTRM1和VTRSl是利用RB51的研制技术，把布鲁氏菌M16和猪型4号株进行断裂突变后得到粗糙型突变株疫苗[26]，二者均具有良好的保护性。
1.3.4 新型疫苗
目前研究出的布鲁氏菌新型疫苗主要包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗和抗独特型抗体疫苗3种。
河北农业大学硕士学位（毕业）论文
由于机体的细胞免疫是控制布鲁氏菌感染的关键，因此作为研究布鲁氏菌DNA疫苗的候选分子主要集中在刺激T细胞引起的细胞免疫的几个分子。目前布鲁氏菌DNA疫苗包括P39、L7/L12、GroEL 和Omp31等4种。另外还有诸如GroES、YajC、UvrA、BA14等基因编码的蛋白质都具有良好的刺激T细胞的能力，这些基因也都是用作布鲁氏菌DNA疫苗的候选基因。DNA疫苗研究虽然取得了一些有意义的成果，但是至今还没发现一种DNA疫苗可以完全代替灭活苗和减毒苗。
布鲁氏菌重组蛋白疫苗主要有OMP28和Cu-Zn SOD(超氧化物歧化酶)两种。由于重组亚单位苗一般以体液免疫为主，对于以细胞内感染为主的布鲁氏菌，其能达到的保护效果还需要进一步的探讨。和DNA疫苗一样，其研究仍停留在实验室阶段。
布鲁氏菌抗独特型抗体苗是根据Jerne(1974)提出的免疫网络调节学说，1981年Nisonoff和Roitt 提出具有抗原“内影像”的抗独特型抗体可作为抗传染病的疫苗。
随着牛种和羊种布鲁氏菌全基因组测序的完成，人类对于布鲁氏菌各种功能基因的认识越来越透彻，在此基础上研制布鲁氏菌新型疫苗将具有更为广阔的前景。
1.4 树突状细胞生物学特性
DCs是目前所知道的功能最强、能激活初始性T细胞的专职APC。它不仅可以通过MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类途径提呈抗原，而且它还拥有提呈脂类抗原的CD1分子[27,28]。
DCs是启动初始免疫应答最重要的抗原提呈细胞，并且抗原提呈是一个动态过程[29]。大多数DCs来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织。
1.4.1 抗原捕获途径
DCs摄取抗原可分为三条途径。第一通过巨吞饮作用，即细胞骨架依赖型的、由膜皱折和形成大的囊泡(1～3μm)形成的液相内吞作用，DCs可吞入非常大量的液体，每小时可达其细胞体积的一半，在抗原浓度10-10 mol/L时即可由巨吞饮作用使抗原得到提呈；第二条途径是由受体介导的，DCs表达FcγRII受体，可有效捕捉抗原-抗体复合物；表达MR，可摄取甘露糖化及岩藻糖化抗原，受体介导内吞后，FC受体及Igs与抗原一起被降解，而MR可在内吞体的pH环境中释放出其配体，并进入再循环过程，由此实现通过少量受体捕捉和浓集较多的抗原物质。第三条途径是由DEC-205受体介导的，DEC-205受体cDNA于1995年被克隆，因其为205 kD蛋白而命名，为C型凝集素，其配体特异性与甘露糖受体不同。DEC-205主要分布在小鼠DCs上，在一些上皮细胞、胸腺皮质细胞及B细胞上亦有部分表达。抗DEC-205抗体一方面可以介导胶体金颗粒被迅速内吞后进入DCs并运送至内吞体；另一方面可以被DCs有效提呈给兔Ig特异性T细胞克隆；即DEC-205在DCs上的作用，与B细胞上的IgG的作用相似，可促进抗原内吞，从而促进DCs的抗原提呈[30]。
1.4.2 抗原提呈方式
DCs以定居的器官特征分为：定居于所有淋巴器官的血源性DCs，以不成熟状态定居于外周组织与其引流淋巴结的DCs[31]。非淋巴样组织内定居的未成熟DCs，具有强大的抗原摄取功能，是机体进行免疫防御的前哨细胞。接触抗原后，一方面摄取抗原进行加工处理，另一方面表型和功能发生改变，离开原位游走进入引流淋巴结，在淋巴结内的T细胞区完成抗原提呈并激活初始T
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
细胞，从而启动适应性免疫应答。与此同时，外周组织内的DCs可以不断得到补充，当抗原刺激出现在外周组织时，骨髓前体细胞进入抗原刺激部位，迅速分化为DCs，捕获抗原并迁移至引流淋巴结[32,33]。
研究证明，当携带抗原的DCs进入引流淋巴结后，可以直接提呈抗原给初始性T细胞，启动T 细胞应答[34,35]；另一方面，迁移的DCs也可以把抗原信息转交给淋巴结定居的DCs，再由淋巴结定居的DCs提呈抗原给初始性T细胞，启动CTL免疫应答[36]。Marc Jenkins (Minneapolis, MA)的研究显示，皮下注射的抗原在30min内就可通过囊下窦的淋巴管到达引流淋巴结，在3 h内便可被淋巴结内定居的DCs捕获与加工提呈；而注射位点的DCs捕获抗原后在18h才到达淋巴结T细胞区提呈抗原；这一研究又为抗原提呈揭示了另一途径，那就是，抗原可直接通过淋巴管进入淋巴结，被淋巴结定居的DCs捕获，然后再由其提呈抗原给初始性T细胞启动免疫应答，并且这一途径要快于已经得以证明的经典途径[37,38]。
1.4.3 树突状细胞与布鲁氏菌
由于DCs与巨噬细胞的同源性[39]，所以骨髓来源的DCs也可能是布鲁氏菌的靶向感染细胞。最近研究表明，DCs对布鲁氏菌也具有易感性，布鲁氏菌也可在DCs细胞内生长繁殖[40]。布鲁氏菌可依赖其外膜蛋白Omp25抑制TNF-α的分泌，从而进一步抑制感染了布鲁氏菌的DCs的成熟与提呈抗原给初始性T细胞的功能，并且可抑制IL-12的分泌[41]。另有研究证明，布鲁氏菌脂蛋白能够促进DCs的成熟与T细胞向Th1免疫应答的发展[42]。在布鲁氏菌感染过程中，DCs的活化在刺激与调节T细胞分泌IFN-γ方面发挥了重要作用，因此对DCs感染布鲁氏菌的研究为免疫治疗，以及新型疫苗的开发，提供了新的技术方法与策略。
1.4.4 甘露糖受体
MR是DCs(DC-SIGN; CD209)和巨噬细胞(CD206)所特有的膜受体，属多凝集素受体，可识别细胞表面或病原体细胞壁上的多种糖分子如甘露糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖等，通过参与受体介导的内吞作用和吞噬作用，维持机体内环境的稳定，并可将天然免疫与获得性免疫结合起来，形成机体的免疫防御系统。未成熟的DCs表达高水平的MR，能有效地捕获甘露糖化的抗原分子。当甘露糖化的抗原分子在MR的介导下被摄取后，在内吞系统中可释放其配体，自身进行再循环，而内化的抗原又可与MHCⅡ类分子结合并被递呈至表面[43-45]。巨噬细胞MR可结合含有末端甘露糖残渣的低聚糖，转运抗原至早期内体[46]；然而DC-SIGN识别高分子甘露糖寡糖，转运抗原至晚期内体或溶酶体而降解[47,48]。研究发现，甘露糖化的抗原分子可快速循环于胞膜和内体(endosome)间，在较短的时间内吞噬细胞即可内化大量的抗原，在15 min内所内化的抗原量足以诱导强有力的细胞应答。MR介导的抗原摄取，能有效地增强DCs对抗原的捕获及MHCⅡ类分子限制性抗原提呈，从而可诱导MHCⅡ类分子限制的抗原特异性T细胞克隆的增殖能力提高200～10 000 倍。因此根据DCs膜表面特有的MR，对相关抗原进行甘露糖修饰，可增强MR介导的抗原摄取、提呈功能。目前，对MR的研究涉及其特性及在抗原递呈过程中的作用。己证实与细胞因子产生的信号转导通路有关。虽然巨噬细胞也含有MR，但是相比DCs要少很多，所以不能有效地提呈甘露糖修饰的抗原[49]。
河北农业大学硕士学位（毕业）论文
1.5 蛋白质抗原的糖基化
蛋白质糖基化是真核生物常见的蛋白质翻译后修饰过程，合成后的或正在合成的蛋白质在糖基转移酶的作用下，将活化的单糖加到肽链上。根据糖与肽链中氨基酸的连接方式不同，可将糖基化修饰分为三种形式：N-糖苷(N-glycan)、O-糖苷(O-glycan)、糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)。
抗原的O-和N-端连接糖基化修饰可以通过化学共价结合的方法，或通过利用真菌优先使用甘露糖的天然功能实现[50]。经典的P.pastoris N-连接糖基化结构，(GlcNAc)2 (Man)9-14，是由一个高分子甘露糖与(α-1,2)、(α-1,3)和(α-1,6)共轭连接而成；相反，O-连接糖基化结构是Ser/Thr的低分子甘露糖(2-3 mannoses)与(α-1,2)共轭连接而成[51,52]。
经糖基化后，蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构产生深远的影响，其主要功能有：
1.5.1 糖基化影响蛋白质分子的生物活性
对于某些蛋白质分子如人绒毛膜促性腺激素(hCG)而言，糖基化是其发挥生物学活性必需的。同时研究表明，改变蛋白质的糖基化还可以使蛋白分子产生新的生物学活性[53]。
1.5.2 糖基化增加蛋白质的稳定性
糖基化可增加蛋白质对于各种变性条件(如变性剂、热等)的稳定性[54]，防止蛋白质的相互聚集[55]。同时，蛋白质表面的糖链还可覆盖蛋白质分子中的某些蛋白酶降解位点，从而增加蛋白质对于蛋白酶的抗性[56]。
1.5.3 糖基化与蛋白质的免疫原性
一方面，蛋白质表面的糖链可诱发特定的免疫反应；另一方面，糖链又可遮盖蛋白质表面的某些表位从而降低其免疫原性。
1.5.4 糖基化与分子识别
长期以来，细胞表面的糖链被认为是“分子天线”参与细胞识别。研究表明，糖链还参与抗原与抗体[57]及抗体Fc段与其受体FcR的相互识别[58]。
1.5.5 糖基化与蛋白质的可溶性
研究表明，蛋白质表面的糖链可增加蛋白质分子的溶解性[59]。
1.5.6 糖基化影响蛋白质的转运
蛋白质表面的糖链可作为蛋白分子的胞内定位信号，如糖蛋白N-糖链经修饰带有甘露糖-6-
磷酸后，这些糖蛋白(多数是水解酶)就被分拣和投递到溶酶体中。糖基化还可增加糖蛋白的分泌效率[60]。
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
1.5.7 糖基化影响治疗用蛋白质的疗效
对于治疗用蛋白质，糖基化还可影响蛋白药物在体内的半衰期[61]和靶向性[62]。
1.6 本实验室关于DCs提呈布鲁氏菌的研究成果
为了探究在布鲁氏菌感染过程中，感染位点DCs的动力学变化，本实验室用冻干猪种布鲁氏菌S2株疫苗经阴道接种BALB/c小鼠。研究发现小鼠阴道接种布鲁氏菌疫苗后，有大量DCs向髂内淋巴结迁移，表明阴道DCs具有提呈布鲁氏菌抗原的能力；但在阴道巨噬细胞清除后，不仅没有使DCs表现更多的迁移，相反，却出现了DCs不向引流淋巴结迁移的现象。这充分表明在布鲁氏菌感染过程中，DCs捕获布鲁氏菌并向淋巴结迁移的过程可能具有巨噬细胞依赖性。
布鲁氏菌感染过程中，DCs的迁移受到了巨噬细胞清除的影响，而机体细胞免疫应答的变化与此结果也呈一致性。健康小鼠用冻干猪种布鲁氏菌S2株疫苗经阴道接种BALB/c小鼠，诱导了明显的Th1细胞免疫应答。而巨噬细胞清除后虽然机体抗布鲁氏菌免疫应答仍以Th1细胞免疫应答为主，但免疫应答的水平显著降低了。以上结果提示布鲁氏菌经阴道接种后也可由其它途径进入淋巴结，从而被淋巴结内的抗原提呈细胞捕获，启动免疫应答，只是免疫应答的强度有所不同[29]。
1.7本研究的目的和意义
针对布鲁氏菌病在人类及动物中的流行，当前还没有安全有效的疫苗来阻止该病的发生与蔓延。抗生素治疗方法也存在着很多问题，治疗时期长，且易复发。所以要想快速控制布鲁氏菌病的流行，在根源上消灭此病，则需依赖于新型疫苗的研制。
布鲁氏菌感染宿主巨噬细胞后，可抵抗细胞杀伤作用，在细胞内大量繁殖，削弱巨噬细胞吞噬功能，使巨噬细胞的细胞杀伤作用与抗原提呈功能部分丧失，从而逃避宿主的免疫防御机制，造成持续感染。而DCs是唯一能激活初始性T细胞的专职抗原提呈细胞，将抗原提呈给T淋巴细胞是诱发机体免疫应答的关键，所以DCs对抗原的提呈能力在诱发机体特异性免疫应答中发挥着重要的作用。因此本研究的目的就是为了避开巨噬细胞的免疫缺陷，使DCs发挥更强大的抗原提呈作用，激发机体强烈的免疫应答。
未成熟的DCs表达高水平的MR，能有效地捕获甘露糖化的抗原分子。MR介导的抗原摄取，能有效地增强DCs对抗原的捕获及MHCⅡ类分子限制性抗原提呈。因此根据DCs膜表面特有的MR，对筛选出的布鲁氏菌OMPs抗原进行甘露糖修饰，可使布鲁氏菌抗原直接靶向DCs，并增强MR介导的抗原摄取、提呈功能，最终引起机体更强烈、更安全有效的免疫应答。此疫苗更有利于布鲁氏菌病综合预防措施的实施，以及快速控制该病的流行，从而为人类提供安全、绿色、环保的畜产品打下基础，最终实现畜牧业的健康、可持续发展。
河北农业大学硕士学位（毕业）论文
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂及药品
Mouse IL-4 Quantikine ELISA Kit R＆D Systems
Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit R&D Systems
RPMI-1640 Invitrogen Corporation
淋巴细胞分离液－小鼠（lympholyte-M）上海普飞生物技术有限公司
南美洲胎牛血清Hyclone
α-D -甘露吡喃异硫氰酸苯酯 Sigma
TritonX-100 Sigma DMSO Sigma 4-甲基吗啉Sigma
2,6,10,14-四甲基十五烷Acros
苯酚红 Amresco Tris-base Amresco
SDS Biosharp
间苯二酚天津市福晨化学试剂厂
Lysozyme Chicken Egg White Calbiochem
两性洗涤剂3-14 Calbiochem
南美洲胎牛血清Hyclone
布鲁氏菌病活疫苗(Ⅱ) 青海生物药品厂
N，N-二甲基甲酰胺天津市鼎盛化工材料厂
马抗小鼠IgG/碱磷酶标记北京中杉金桥生物技术有限公司
二甲苯天津市福晨化学试剂厂
丙酮北京北化精细化学品有限责任公司
双氧水北京北化精细化学品有限责任公司
甲醇北京北化精细化学品有限责任公司
Na2HPO4.12H2O 北京北化精细化学品有限责任公司
KH2PO4北京北化精细化学品有限责任公司
MgCl北京北化精细化学品有限责任公司
KCl 北京北化精细化学品有限责任公司
盐酸北京北化精细化学品有限责任公司
乙二胺四乙酸天津市福晨化学试剂厂
乙醇天津市福晨化学试剂厂
磷酸二氢钠天津市福晨化学试剂厂
硫酸天津市翔宇化工工贸有限责任公司
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
2.1.2 主要仪器设备
名称型号厂家
酶标仪550 BIO-RAD
4℃冷冻离心机3-18K SIGMA
制冰机SIM-F124 日本三洋公司
高速台式离心机TGL-16G 上海安亭科学仪器厂
低速大容量离心机TDL-5 上海安亭科学仪器厂
冷冻干燥机LGJ-18 北京松源华兴科技发展有限公司
FINEPCR
数字温控槽 ALB128
电泳仪BG-Power BAYGENE
磁力搅拌器S-6 北京金北德工贸有限公司
紫外分光光度计T6新世纪北京普析通用公司
梅特勒-托利多PH计DELTA320 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司超声波清洗器KQ-500E 昆山市超声仪器有限公司
双垂直电泳槽DYCZ-24D 北京市六一仪器厂
水平电泳槽DYCZ-24EN 北京市六一仪器厂
超声波清洗器KQ-500E 昆山市超声仪器有限公司
空气恒温振荡器THZ-CB 北京科尔德实验仪器厂
电热鼓风干燥箱GX-9140MBE 上海博迅实业有限公司
恒温恒湿培养箱HWS-270 宁波江南仪器厂
电子分析天平 SL-N 上海民桥精密仪器公司
电子天平FA-N/JA-N 上海民桥精密仪器公司
电热恒温水浴锅YLE-1000 北京市长风仪器仪表公司
漩涡混合器WH-866 北京科尔德科贸有限公司
净化工作台SW-CJ-1FB 苏州净化设备有限公司
立式蒸汽消毒器R206124 上海三申医疗器械有限公司
河北农业大学硕士学位（毕业）论文
2.2 实验技术和方法
2.2.1 布鲁氏菌负载巨噬细胞体外试验
2.2.1.1 腹腔巨噬细胞的制备
A. 试剂配置
⑴ 0.4%酚红溶液：
称取酚红0.4 g，放入玻璃研钵中，滴加0.1 mol/L NaOH，不断研磨，直至完全溶解，加入0.1 mol/L NaOH 10 mL。将溶解的酚红置于100 mL容量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留液体，并加入容量瓶中，最后加双蒸水定容至100 mL。
⑵无Ca2+、 Mg2+ Hanks液的配制：
储存液：
NaCl 80 g
KCl 4 g
Na2HPO4.12H2O 1.52 g
KH2PO4 0.6 g
葡萄糖10 g
加双蒸水使组分溶解后，加入0.4%酚红溶液50 mL，再加双蒸馏水定容至100 mL，4℃保存。
应用液：将储存液用双蒸馏水做1:10稀释，112.6℃灭菌15 min，4℃保存，一个月内使用。使用前用无菌5.6% NaHCO3调pH值至7.2~7.4。
⑶ 0.5%台盼蓝染液的配制：
①台盼蓝染料 1 g
蒸馏水 100 mL
将染料置于研钵中边研磨边加蒸馏水。
②NaCl 1.7 g
蒸馏水 100 mL
使用前取①、②液等量混合，离心1 500 r/min×15 min，取上清液供染色。
⑷ RPMI-1640 培养液的配制：
RPMI-1640 干粉10.4 g
HePes 5.95 g
三蒸水加至 1000 mL
混匀，置4℃过夜，使其完全溶解，过滤除菌，分装，置-20℃保存。
⑸ RPMI-1640 完全培养液的配制：
RPMI-1640 培养液 170 mL
胎牛血清20 mL
青霉素-链霉素(1万单位/mL) 2 mL
混匀，用5.6% NaHCO3溶液调pH值至7.1左右，过滤除菌，置4℃保存。
布鲁氏菌蛋白质抗原靶向化树突状细胞疫苗的研制
B. 试验方法
⑴小鼠腹腔内注射4%淀粉营养肉汤培养基，2 mL/只，轻揉其腹部；
⑵3天后腹腔注射灭菌PBS缓冲液，5 mL/只，轻揉其腹部5 min；
⑶颈椎脱臼处死小鼠, 75%乙醇消毒其腹部，收集腹腔液，离心：2 000 r/min×10 min，弃上清；
⑷收集细胞沉淀，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，37℃ 5% CO2的培养箱中培养4h，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞；
⑸用台盼蓝染色法检测巨噬细胞存活率；
2.2.1.2 腹腔巨噬细胞的鉴定-免疫细胞化学染色法
⑴将灭菌盖玻片放入 6 cm Nunk培养皿中，取适量腹腔巨噬细胞悬液滴加到培养皿中，37℃5%CO2孵育 12h，巨噬细胞即可贴附于盖玻片上；
⑵取出培养皿中盖玻片，晾干，放入预冷的丙酮中4℃固定20 min，PBS冲洗3次，晾干，加入F4/80(1:100)抗体于盖玻片上，4℃过夜，同时用PBS作对照；
⑶室温放置10 min，PBS冲洗3次；
⑷滴加 3% H2O2 ，室温孵育5 min，PBS冲洗3次；
⑸滴加生物素化兔抗大鼠IgG（1:100），室温孵育1h，PBS冲洗3次；
⑹滴加1:100稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温孵育30 min，PBS冲洗3次；
⑺滴加DAB (1:50)，显微镜下控制显色时间；
⑻滴加PBS，终止显色；
⑼二甲苯透明，中性树胶封片。
2.2.1.3 布鲁氏菌猪种Ⅰ型体外负载腹腔巨噬细胞
A. 试剂配制
⑴0.01 mol/L pH6.8的PBS
⑵姬姆萨染液的配制
储存液：将姬姆萨粉1 g溶于少量甘油，置于研钵中研磨30 min以上，至没有颗粒存在为止，再加入剩余甘油（总计66 mL），56℃作用2h, 加入甲醇66 mL，混匀，置于棕瓶中，置4℃冰箱中保存备用。
工作液：将储存液用0.01 mol/L，pH6.8的PBS做1:10稀释，室温保存。
B. 试验方法
⑴根据负载的不同时间分为10组：①组为负载后2h收获巨噬细胞；②组为负载后4h收获巨噬细胞；③组为负载后6h收获巨噬细胞；④组为负载后8h收获巨噬细胞；⑤组为负载后12h收获巨噬细胞；每组分别以PBS代替布鲁氏菌猪种Ⅰ型作阴性对照。
⑵用血细胞计数板对巨噬细胞悬液进行记数；
⑶把腹腔巨噬细胞与布鲁氏菌按1:500滴加至盖玻片上，37℃，5% CO2孵育；
⑷分别在2h、4h、6h、8h、12h收集盖玻片，放入另一个平皿中，晾干，滴加甲醇固定15 min；
⑸滴加姬姆萨工作液，染色15 min，PBS冲洗3次；