北京鸭生长激素受体基因cDNA部分序列的克隆及其在
胸肌组织表达的研究
王勇生
摘要：试验成功克隆北京鸭GHRcDNA345bp的部分序列，共编码114个氨基酸。编码氨基酸的保守域分析表明GHR编码的蛋白含有FN3结构域。在北京鸭7、14、21、28、35、42日龄胸肌组织都可检测到GHR mRNA 的表达，但各日龄间GHRmRNA表达丰度值之间差异都不显著（p<0.05）。北京鸭胸肌组织内GHR的表达与北京鸭的胸肌生长速度没有相关性。
关键词北京鸭；生长激素受体基因；克隆；表达
中国分类号：文献标示码：文章编号：
生长激素(GH)是腺垂体分泌的具有广泛生理功能的生长调节激素，其功能有代谢效应、增殖效应和分化效应，主要作用是促进机体生长，促进合成代谢（张逊，1999；张镜如，1998）。生长激素对机体生长、发育的促进作用，主要从肌肉、脂肪和骨骼三方面表现出来，在哺乳动物如猪中，GH通过对营养物质向不同组织的分配等途径来调控肌肉、脂肪的发育（Hodik，1997，V asilatos-Y ounken，2000）。GH在组织和细胞水平发挥作用的第一步是和靶细胞膜表面的受体（Growth hormone receptors，GHR）结合,由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。组织中GHR量的多少、功能的正常与否将影响GH生理效应的发挥。关于GHR基因在机体组织中的表达来探讨GH基因对机体组织和细胞影响的研究已有大量报道（李宁，1994；Burnside等，1992；Mao等，1998；高萍，2005）；而关于GHR基因在鸭不同组织中表达的研究还未见报道，因此本试验对鸭GHR基因部分序列进行了克隆，并对鸭GHR基因在北京鸭胸肌组织表达特点进行了研究，以期为GH、GHR基因对北京鸭胸肌发育调控的研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品
分别取7、14、21、28、35、42日龄北京鸭公鸭胸肌样品，液氮速冻后放入-80 ℃冰柜保存，备用。
1.1.2 引物设计
（1）根据鸡GHR基因序列（GenBank收录号NM-001001293），利用Primer5.0软件设计一对引物用于扩增鸭GHRcDNA长度大约为350bp的部分序列。引物序列碱基组成为：
[收稿日期]
[基金项目] 国家“十一五”农林动植物育种专项“优质肉鸭新品种选育（2006BAD01A09）
[作者简介] 王勇生（1975-），男，宁夏中宁人，助理研究员，主要从事水禽育种研究。
[通讯作者]
上游：5’-TTACTTCAACACATCCTACACC-3’
下游：5’-TCATAATCTCTTCCCATCTTCA-3’
引物由北京奥科生物技术公司合成。
（2）北京鸭胸肌组织GHRmRNA表达丰度检测内标基因β-actin扩增引物。参照Ruqian Zhao等[11]报道的序列设计内标基因β-actin的扩增引物：
上游: 5’- ACGTCGCACTGGATTTCGAG -3’
下游: 5’- TGTCAGCAATGCCAGGGTAC -3’
引物由北京奥科生物技术公司合成，预期扩增片段长度为282 bp。
1.1.3 试剂
pMD-18T载体试剂盒、反转录试剂盒、内切酶 EcoR V 和Pst I 购自大连宝生物公司；Trizol 试剂盒、质粒提取试剂盒、DH5α感受态细胞、DNA marker等购自北京天为时代公司；DNA回收试剂盒、琼脂糖购自北京博大泰克生物技术公司；琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等购自北京华绿源生物公司；其它常规试剂购自北京化学试剂公司。
1.2 北京鸭 RNA的提取
北京鸭 RNA的提取按照T rizol 试剂盒使用说明书进行。
1.3 北京鸭 RNA的RT-PCR
1.3.1 RT反应
北京鸭 RNA的RT反应参照反转录试剂盒使用说明书进行，反转录产物立即进行PCR扩增或放于-20 ℃保存备用。
1.3.2 GHR cDNA 部分序列及内标基因β-actin的PCR 扩增
PCR扩增反应体系参照反转录试剂盒使用说明书进行。扩增条件均为：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，51℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环;最后72 ℃延伸1O min。扩增产物用20g/L的琼脂糖胶电泳检测。
1.4 RT-PCR产物的回收及测序
用DNA回收试剂盒回收RT-PCR产物，将回收产物与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，接种转化后的DH5α感受态细胞于含有氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB固体培养基上，37 ℃培养12-16 h后挑取阳性菌落，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 160 r/mim培养过夜；对菌体进行PCR鉴定，同时提取质粒，用Eco R V和Pst I进行酶切鉴定。将PCR和酶切鉴定均为阳性的细胞送北京博雅生物工程公司测序。
1.5北京鸭GHR cDNA 部分序列生物信息学验证分析。
利用GenBank在线Blast软件对北京鸭GHR cDNA部分片段的核苷酸序列与推测的氨基酸序列进行生物信息学验证分析，并分析编码氨基酸的保守区域。
1.6 半定量PCR法检测不同日龄北京鸭胸肌组织GHR mRNA的表达丰度
分别取7、14、21、28、35、42日龄北京鸭胸肌样品,如上述方法提取其RAN,并进行RT-PCR 扩增。以β-actin为内标基因采用半定量PCR法检测胸肌组织GHR mRNA的表达丰度[11]。每个日龄取4只鸭的胸肌样品，每样品测定2次。以GHR基因与β-actin基因灰度的比值作为GHRmRNA表达的丰度值。采用Gel-Pro R Analyzer Ver3.1 for Windows TM (Media Cybernetics, L,P)软件进行丰度分析；SAS (6.2)软件进行显著性检验。
2 结果与分析
2 结果与分析
2.1 北京鸭GHR 部分cDNA 序列的PCR 扩增结果
由图1可知，扩增产物长度大约为350 bp ，与预期长度一致。扩增产物间无杂带，可以进行回收、连接、转化及测序。
图1 北京鸭GHR cDNA 部分片段的PCR 产物电泳图
M ． DNA marker ；1,2,3．GHR cDNA 部分片段
Fig.1 Electrophoresis figure of PCR product of Beijing duck GHR partial cDNA
M. DNA marker ；1,2,3. Beijing duck GHR partial cDNA
2.2 北京鸭 GHR cDNA 部分序列的测序结果
测序结果显示，序列由345个碱基组成(图2)，引物序列部分完全匹配。按照六读码框翻译法进行编码氨基酸预测，发现克隆的序列共编码114个氨基酸（图3）。
1 ttacttcaac acatcctaca cctctatatg gataccatac tgtgttaagc ttgccaataa 61 agatgaagta tttgatgaaa aatgtttcag tgttgatgaa atagtactac ctgatccccc 121 tgtccacctt aactggactc tgctaaatac tagtcaaact gggatccatg gggatatcca 181 agtaagatgg gatccaccac caacagcaga tgttcagaag ggatggatta ctctggagta 241 tgagttgcag tacacagaag ttaatgagac aaaatggaag gagttagaac ccaggctctc 301 aacaatggtt ccactgtact ctctgaagat gggaagagat tatga
图 2 GHR cDNA 测序结果
Fig.2 Nucleotide sequence of Beijing ducks GHR partial cDNA
1 YFNTSYTSIW IPYCVKLANK DEVFDEKCFS VDEIVLPDPP VHLNWTLLNT SQTGIHGDIQ
61 VRWDPPPTAD VQKGWITLEY ELQYTEVNET KWKELEPRLS TMVPLYSLKM GRDY
图 3 克隆的GHR 基因部分 cDNA 序列编码的氨基酸序列
Fig.3 Deduced amino acid sequence of Beijing ducks GHR partial cDNA
2.3 北京鸭 GHR cDNA 部分序列的生物信息学验证
通过在线Blast 软件对克隆的北京鸭GHR cDNA 部分片段的核苷酸序列与推测的氨基酸序列分析表明，克隆的序列与鸡、鸽子、火鸡GHR 基因的同源性较高，说明克隆的序列即为鸭GHR 基因M 1 2 3
900bp→ 600bp→ 500bp→ 300bp → 200bp → 100bp→
序列。对编码氨基酸进行保守域分析表明，GHR编码的蛋白含有FN3结构域。根据在线GenBank 对GHR编码氨基酸的保守域结构图分析表明FN3为纤黏连蛋白类型三结构域，是血浆纤黏连蛋白三种内部重复结构域之一。在所有动物蛋白中大约有2%的蛋白含有FN3结构域。包括胞内和胞外蛋白（extracellular and intracellular proteins）、跨膜细胞因子受体（membrane spanning cytokine receptors）、生长激素受体（growth hormone receptors）、酪氨酸磷酸酶受体（tyrosine phosphatase receptors）、黏附分子（adhesion molecules）。
2.4 不同日龄北京鸭胸肌GHR mRNA表达丰度的检测
GHR cDNA在北京鸭胸肌组织表达的发育性变化相对灰度值见表1。在7、14、21、28、35、42日龄都可检测到GHR cDNA 的表达。GHRmRNA表达丰度值之间差异都不显著（p<0.05）。从7日龄到42日龄GHR cDNA表达灰度呈增加趋势,但增加幅度在各日龄间相对较低。
徐金先（2004）研究表明猪下丘脑GHR mRNA表达呈明显的时序性变化，在0到120日龄期间呈逐渐上升趋势，180日龄时显著下降(P<0.05)，提示在快速生长期，GH负反馈调控机制逐渐加强。下丘脑GHR mRNA表达还表现明显的品种间差异，在0到180日龄期间大白猪均显著高于二花脸猪(P<0.05)；而垂体GHR mRNA表达相对稳定，品种和年龄间差异不显著，提示GH的负反馈作用位点可能主要在下丘脑。周杰（2003）研究了猪脂肪组织中GHR mRNA的表达有明显的发育性变化及品种差异，二花脸母猪GHR mRNA水平出生时较低，45日龄达到高峰，之后维持稳定；二花脸公猪GHR mRNA水平在出生时较高，至45日龄达到最高值，之后显著下降，但总体上没有性别差异.
李宁（1994）利用原位杂交技术揭示了鸡生长激素受体基因的个体发育性表达规律:肝组织细胞于胚胎期6d龄开始表达生长激素受体基因,表达强度在胚胎期7d龄时就达到最高水平；心脏、肾、肠、肺、脾组织细胞在胚胎期7d龄时也能表达生长激素受体基因,表达强度分别在胚胎期9和10d龄时达到最高峰,在脑、睾丸和卵巢组织细胞中能够发现生长激素受体基因的表达,表达强度相对较弱,所有的骨组织细胞都不存在生长激素受体基因的表达。生长激素受体基因在不同的组织细胞中表达的水平并不相同,其中以肝细胞的表达水平最高。此外,性别对生长激素受体基因的表达没有显著影响。研究结果还表明,生长激素对胚胎的正常生长发有一定作用。Burnside等(1992) 发现在鸡胚胎发育的第15d就能检测到GHR的mRNA,在第17-19d表达量最高。出雏当天开始下降,出雏后2周内维持较低水平,而后逐渐升高,到31周龄仍然有上升趋势。相反,血浆GH水平在出雏后21～28周龄达到最高,然后急剧下降,在10周龄后维持在很低的基线水平。这一结果表明,GH水平与肝脏GHR基因的表达呈显著负相关。不同鸡种GHR表达量不一样。通过对肉鸡和蛋鸡GHR基因在肝脏和肌肉中的表达分析,结果表明肉鸡肝脏GHR的发育比蛋鸡早且快。GHR在肌肉中的表达却呈现完全不同的规律,5日龄鸡肌肉GHR mRNA含量最高,并且蛋鸡高于肉鸡,21和42日龄均未表现品种差异。Mao 等(1998) 对不同品系的肉鸡研究表明,体重和生长速度与肝脏和肌肉中GHR mRNA含量没有差异,他认为调节发生在翻译或翻译后的加工水平,而不在转录水平。本试验研究表明，在7、14、21、28、35、42日龄间GHR mRNA表达丰度值之间差异都不显著（p<0.05）。从7日龄到42日龄GHR cDNA表达灰度呈增加趋势，但增加幅度在各日龄间相对较低。在GHR mRNA表达的差异性方面，本结果与Mao (1998) 研究结果相似，而在GHR mRNA表达的变化趋势上来看，本试验结果与
Burnside等(1992) 在报道的鸡出生后GHR的表达结果相似。由此说明，北京鸭胸肌组织内GHR的表达与北京鸭的胸肌生长速度没有相关性。
表1 不同日龄北京鸭GHRmRNA表达表达的相对丰度值
Table1 The relative GHR mRNA abundances in Beijing duck’s breast muscle from 7 to 42 days
7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d
相对丰度（GHR
/B-actin）0.724±
0.026
0.846±
0.031
0.838±
0.008
0.892±
0.022
0.965±
0.008
0.993±
0.018
4 结论
试验成功克隆北京鸭GHRcDNA 345bp的部分序列，共编码114个氨基酸。编码氨基酸的保守域分析表明GHR编码的蛋白含有FN3结构域。在北京鸭7、14、21、28、35、42日龄胸肌组织都可检测到GHR mRNA 的表达，但各日龄间GHRmRNA表达丰度值之间差异都不显著（p<0.05）。北京鸭胸肌组织内GHR的表达与北京鸭的胸肌生长速度没有相关性。
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木聚糖酶的基因克隆及表达 木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。 木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。见表2。 3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高
植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@https://www.doczj.com/doc/787231228.html, 收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性① 张 国 李 滨 邹 琦② (山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018) 摘要 Rubisco 活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco 活性的酶, 我们利用PCR 技术, 从小麦(Triticum aestivum )叶片cDNA 文库中克隆得到Rubisco 活化酶基因cDNA 片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot 表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco 活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco 活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco 活化酶, 小麦, 衰老 Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi ② (Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University , Tai’an 271018) Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from wheat (Triticum aestivum ). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence Rubisco 是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP 的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco 的活性, 如:底物RuBP 本身就是Rubisco 的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco 易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco 成为光合速率的限制因子, 因 而也成为提高作物光合效率的研究目标。 Salvucci 等(1985)发现了Rubisco 活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase 活性; 也有人认为RCA 是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco 的活化状态实际是Rubisco 的失活速率和RCA 活化Rubisco 速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.doczj.com/doc/787231228.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.doczj.com/doc/787231228.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.doczj.com/doc/787231228.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.doczj.com/doc/787231228.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.doczj.com/doc/787231228.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/787231228.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
生长激素受体基因及其多态性研究进展 生长激素（growth hormone，GH）是一种由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌由191个氨基酸组成的单链亲水球蛋白，对机体的生长发育起重要作用。生长激素受体( growth hormone receptor,GHR) 是GH发挥作用的生理基础, GH必须与靶细胞表面的GHR 结合，诱导GHR 分子同源二聚化，然后激活细胞内一系列信号传导[1]。当体内GH水平低于或等于生理激素浓度时， GH 与GHR 以1：2 相结合。在超生理激素浓度下,激素饱和了所有受体分子形成1：1 的复合物,阻止了受体二聚化和信号传递。当GH 水平增高而GHR基因表达没有增加时,不仅GH作用不能完全发挥,而且可能因为GH过剩而产生负反馈调节,影响其他生理功能[2]。 GHR基因的多态性可能导致GHR在不同个体中的表达水平或是功能上的差异，进而影响GH 生物学效应的发挥。GHR 基因突变的类型多种多样,包括无义突变、错义突变、框义突变、剪接突变和缺失等。其突变的位点主要见于外显子3～7 ,9 ,10 ,故多导致GHR细胞外区功能缺陷, 也可引起细胞内信号转导障碍, 导致IGF-1的分泌变化, 主要影响软骨的生长, 造成生长障碍。此外，GHR基因的多态性还与某些肿瘤的发病风险相关。 1、GHR基因结构 生长激素受体是一个由单一基因编码含620 个氨基酸的跨膜糖蛋白,是促乳素/生长激素/细胞因子/促红细胞生成素( GH/PRL/cytokine/hemopoietin) 受体超家族成员之一[3]。分子遗传学研究表明, 人类生长激素受体基因定位于第5号染色体近端短臂上p12～p13.1 , GHR基因一个重要特征就存在几个5′端不翻译区(5′untranslated－regions , 5′UTRs) , 它们选择性地参与转录, 是导致GHR 分子多态性的重要原因之一。GHR基因含10 个外显子（外显子1－10）,长约87 kb。其中外显子1、2编码5’不翻译区(5’UTR)最后11bp的氨基酸残基、18个氨基酸残基的信号肽和胞外结合区起始5个氨基酸残基；外显子3～7 编码细胞外结构域, 外显子8 编码胞外结构域最后3个氨基酸残基、1 个24 个氨基酸残基的跨膜结构域和胞内区开始的4个氨基酸残基，外显子9～10 编码细胞内结构域和3’UTR [4，5 ]。 2、功能分区： 人GHR cDNA 共编码638个氨基酸,其中包括18个氨基酸的信号肽( - 18～0位)。成熟的人GHR分子是一个含620个氨基酸的单链糖蛋白，分为3个区：胞外区、跨膜区和胞内区，在胞外区，N端246个氨基酸含5个保守的糖基化位点, 构成激素结合结构域，其特定位置上有7个半胱氨酸残基，其中有6个形成二硫键,起着维持GHR胞外区段特定空间结构的作用。在胞外区近细胞膜的位置上有WSXWS样基序(WSXWS-like motif ,WSXWS)，即由Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser等5个氨基酸残基组成的保守序列(其中Xxx代表任意氨基酸) ，这一结构可能在GH与GHR结合过程中起关键作用[6]。第247～270 位为强疏水性氨基酸构成的跨膜区(transmembrane domain ,TMD)，有专家认为[7]，GHR的二聚化是由受体的跨膜区（TMD）介导的，GH与之结合后，引起GHR二聚物构象的改变，进而激活下游的信号转导。C 端350个氨基酸位于胞内构成信号转导结构域[8]。在胞内区,人们发现了两段保守序列(序列框1 ,2) ，其中靠近细胞膜的序列框1 (Box 1) 编码8个氨基酸残基，以脯氨酸残基为主，是GHR与酪氨酸激酶(janus kinase 2 , JAK2) 结合的一个位点；序列框2 (Box 2) 则编码15个氨基酸残基，如果这两段保守序列编码的某一个氨基酸残基发生突变，GH将失去促进生长的作用。由此表明Box 1、Box 2在GHR介导的信号转导过程中起着关键作用。 3、GHR的基因多态性 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指出现在基因组DNA分子的特定位置的单个核苷酸的置换，包括单个碱基的转换、颠换以及单碱基的插入和缺失，是人类可遗传变异中最常见的一种。由于其在染色体上的分布具有相对均一性而密度又远高于 1
目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环
（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中