当前位置:文档之家› EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒-广州达健

EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒-广州达健

EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒-广州达健
EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测试剂盒-广州达健

地中海贫血相关基因检测试剂注册技术审查指导原则

附件3 地中海贫血相关基因检测试剂 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对地中海贫血相关基因检测试剂注册申报资料的准备及撰写,同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对地中海贫血相关基因检测试剂的一般要求,申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用,若不适用,需具体阐述理由及相应的科学依据,并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件,但不包括注册审批所涉及的行政事项,也不作为法规强制执行,如果有能够满足相关法规要求的其他方法,也可以采用,但需要提供详细的研究和验证资料,相关人员应在遵循法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的,随着法规和标准的不断完善以及科学技术的不断发展,本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 地中海贫血(简称地贫)是一种常染色体隐性遗传病,是由于珠蛋白基因发生突变(包括点突变和缺失等),致使珠蛋白肽 —1 —

链合成减少或完全不能合成而导致的一组单基因遗传性溶血性疾病,轻者可无临床表现,重者以进行性溶血性贫血为主要特征。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型,地贫分为α-,β-和γ-地贫等,临床上最常见的是α-和β-地贫。地贫主要分布在地中海沿岸、东南亚和少数非洲地区,具有明显的种族特性和地域分布差异。地贫是我国南方地区最常见、危害最大的遗传病之一,尤以广西、云南、广东、海南、四川和贵州等省份为甚,云南、海南和广东的地贫基因人群携带率可达10%以上,广西更是达到了20%以上。 α-地贫主要是由于α-珠蛋白基因发生突变而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3,包括胎儿期和成人期表达的2个基因(α2和α1),基因的排列顺序为5’-α2-α1-3’。根据单倍型的情况,可将α地贫分为3类:(1)缺失型α+地贫(-α/),缺失1个α基因;(2)缺失型α0地贫(--/),2个α基因同时缺失;(3)非缺失型α+地贫(αTα/或ααT/ ),1个α1或α2基因发生点突变或少数几个碱基的缺失。中国现已发现至少19种α-珠蛋白基因大片段缺失和38种α-珠蛋白基因点突变。其中,6 种α-珠蛋白基因的突变:--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/(HBA2:c.369C>G)、αQSα/(HBA2:c.377 T>C);αCSα/(HBA2:c.427T>C)占患病人群总数的98%。 α-地贫基因型和临床分型的关系已经基本阐明。α-地贫的表型严重程度随着功能性α-珠蛋白基因的减少而加重:(1)1个α-基因缺失或点突变(-α/αα或ααT/αα或αTα/αα),称为静止型α-地贫,通常不贫血,血液学表现为小细胞低色素;(2)2个α- —2 —

双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明

双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明 产品说明: 报告基因检测,是真核基因表达调控研究的常用方法。由于检测光量子的方法非常敏感,采用生物发光(bioluminescent)法,是报告基因检测最常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化,发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应,具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围),酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol,但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统,其中Ranilla luciferase通常作为内参照。 本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液,适合于两种荧光素酶活性的保持,且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容;优化的两种酶反应体系,使每种发光反应持续数十分钟,以便于手工操作多个样品;并保证Firefly luciferase发光及时淬灭,不影响后续Ranilla luciferase的测定;优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围,更有利于后续数据的比较。 产品内容: 名称数量保存条件5x Universal Lysis Buffer(通用裂解液)25ml-20℃ Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃ Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃ Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃ Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃可作100次双荧光素酶检测。低温运输,-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。

荧光PCR检测原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团,利用荧光信号来实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。 其特点有: (1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量,进行实时动态连续的荧光监测,避免终点定量的不准确性,并且消除了标本和产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程。 (2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA,或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得,打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团,这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出,利用荧光信号积累,实时监测整个PCR进程,在PCR 循环中,测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值(Threshold cycle)概念,Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数,是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号,可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式。 方程式的斜度可以用来检查PCR的效率,所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2>0.99),这样才能认为实验的过程和数据是可信的,使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件,可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 实时荧光定量PCR技术的应用 1. 基因工程研究领域 ①基因表达研究:对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测,其结果特异性强、定量准确,为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ②转基因研究:利用两种发光探针及适当的循环阈值,扩增一个转移后的基因和一个对照基因,以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测,同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。

基因检测试剂行业分析资料

基因检测试剂行业分析 一、行业与市场 中投顾问发布的《2017-2021年中国基因检测行业投资分析及前景预测报告》表示,基因检测在我国的发展随着技术手段的进步正在越来越快速,虽然中国的基因公司数量众多,但实力强大的主流公司只有华大基因、贝瑞和康、安诺优达、达安基因、诺禾致源、百迈克、凡迪生物等,数量不超过十家。在1999年,华大基因公司成立,该公司的核心人物全部来自人类基因组的中国部分。目前员工数量超过5000人,最近几年公司的收入规模已经达到10亿元级别。公司业务范围广泛,几乎囊括了其余公司的所有业务种类。而行业中其他各基因公司所涉及的业务范围都没有明显差异,他们主要靠的科技服务和医学服务的收入起家。华大基因公司业务涉及面广,主要包括无创产前基因检测、辅助生殖、单基因病、新生儿筛查、肿瘤个体化治疗、遗传性肿瘤筛查、心血管病筛查、血液病筛查等项目。无论从测序仪器还是人才储备来说,都是中国基因检测行业的老大。而同行中贝瑞和康的业务主要集中在无创产前基因检测技术(NIPT)和科技服务,很少涉及其他领域,在中国无创产前基因检测技术这个行业中只有华大基因的市场占有率高于贝瑞和康。 1、产业综述

(1)近几年来基因测序市场飞速发展,从2007年的7.94亿美元增长到2013年的45亿美元,年复合增长率为33.5%,预计未来几年依旧会保持快速增长,2018年将达到117亿美元,年复合增长率为21.1%。 (2)基因测序技术以二代基因测序技术为主,三、四代测序技术产业化还在探索中,由于第三、四代DNA测序技术目前面临测序成本高和测序结果准确度相对较低的市场化瓶颈,其大规模商业化仍然需要较长的时间,所以二代测序在5-10年内仍然是基因测序的主流技术。 (3)目前国内企业大多集中在测序服务市场,壁垒低,小企业增长迅速,竞争较为激烈。中国测序平台拥有量仅次于美国,全世界规模较大的基因组研究中心有多个在中国,其中华大基因拥有世界上数量最多、种类最齐全的第二代测序仪,产能约占全球的10%-20%。 (4)基因测序行业的下游产业主要包括医院应用、科研应用、商业应用等,目前科研应用占比最大,其次是商业应用,医疗应用占比最小。 (5)行业平均盈利水平比较高,产业链上游企业掌握大部分话语权。

Braf基因突变检测试剂盒说明书

人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明书 【产品名称】 通用名:人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒(荧光PCR法) 英文名:Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上,是一种癌基因,属RAF基因家族,有18个外显子,编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白,是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子,参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变,其中第15外显子上V600E点突变最常见,约占所有突变的90%以上,该突变导致B-raf蛋白被异常激活,从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议,对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者,应进一步检查B-raf基因的突变状态,以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本,用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测,为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性,其相关性主要来自文献报道,因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台,结合等位基因特异性扩增(ARMS)技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增,通过设计特异性ARMS引物,对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大,并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂,使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因,降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求,提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性,试剂盒设置了内质控和外质控,内质控基因是人类基因组的一个保守片段,长

【CN209988403U】一种生物基因检测用试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920324735.8 (22)申请日 2019.03.14 (73)专利权人 袁海燕 地址 537200 广西壮族自治区贵港市桂平 市人民西路7号桂平市人民医院 (72)发明人 袁海燕 刘婵媛 李慧敏 侯佳兴  其他发明人请求不公开姓名  (51)Int.Cl. B65D 81/18(2006.01) B65D 77/04(2006.01) B65D 25/10(2006.01) B65D 81/107(2006.01) F25D 3/08(2006.01) B65D 85/30(2006.01) (54)实用新型名称 一种生物基因检测用试剂盒 (57)摘要 本实用新型公开了一种生物基因检测用试 剂盒,包括盒体,盒体内腔的底部设置有冰袋放 置腔,盒体内腔的底部远离冰袋放置腔的一侧固 定连接有放置板,放置板的顶部固定连接有放置 筒,放置筒内腔的顶部与底部均固定连接有固定 块。本实用新型通过设置盒体、冰袋放置腔、放置 板、放置筒、固定块、压缩弹簧、滑板、滑块、卡杆、 橡胶套、试管本体、海绵垫、隔板和保温腔的配合 使用,解决了现有的生物基因检测用试剂盒在使 用时,由于试剂盒内部的试管放置架对试管的固 定效果较差,导致现有的生物基因检测用试剂盒 在使用过程中易造成试管松动,导致内部液体流 失的问题,方便了使用者的使用,提高了生物基 因检测用试剂盒的实用性。权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 209988403 U 2020.01.24 C N 209988403 U

pcr检测技术

《食品安全学》综述 PCR快速检测技术综述 1.前言 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,是肉眼能直接观察和判断;可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情,用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 该酶促反应最基本的3个环节是:[1]模板DNA的变性,即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA;[2]引物与模板链的特异性复性;[3]引物链的延伸。 2.研究的目的与意义 聚合酶链反应(PCR)技术建立以来,定性技术不断改进和完善,可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸,而不是某一特定序列存在与否,借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数,此测定可以是绝对的,如每微克样本中靶DNA的分子数;也可以是相对定

量,即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个,即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊,对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术。但是,由于核酸的含量较少,一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是,当时的基因序列分析方法尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现,寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段,这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年,美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下,经过两年的努力,发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是,最初的PCR技术相当不成熟,在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性。尔后,Saiki 等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用,使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里,PCR方法被不断改进:它从一种定性的分析方法发展到定量测定;从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止,PCR技术已有十几种之多,例如,将PCR与反转录酶结合,成为反转录PCR,将PCR 与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 3.国内外研究现状 3.1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员,几乎每天都在使用PCR,可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此,PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法,可用于达到以下目的: [1] 扩增目的基因和鉴定重组子; [2]克隆基因; [3]基因功能和表达调控的研究; [4]基因组测序; [5]制备单链模板; [6]致突变; 3.2. PCR在临床上的应用[2] [1]在遗传学上的应用:人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变,使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点,通过PCR结合限制片段长度多态性分析(PCR-RFLP),就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如,血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病,患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变,产生了一个新的PstI酶切点,因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 [2]在肿瘤研究中的应用:PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如,差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物,并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面,在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR 技术检测微小残留病灶,以进一步改进治疗方案。此外,由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化,因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。

地中海贫血基因检测试剂盒标准操作规程

1.目的: 本试剂盒用于定性检测α地中海贫血和β地中海贫血,可用于检测从人血液或血斑样本中获得的人基因组DNA中与地中海贫血相关的25个突变位点,包括19个β地中海贫血和6个α地中海贫血的突变位点。检测结果可以辅助临床诊断,也可用于流行病学调查、婚检及产前检测等领域。 2.责任人: 3.适用范围: 本标准化操作规程适用于晶芯?地中海贫血基因检测试剂盒(微阵列芯片法)整体解决方案操作使用的全过程。 4.PCR扩增: 4.1 设备与耗材 4.1.1 4℃/-20℃冰箱; 4.1.2 超净工作台2台(分别用于PCR体系配制和模板加样); 4.1.3 微型高速离心机(Eppendorf,5424); 4.1.4漩涡混合器; 4.1.5 PCR扩增仪(博奥生物集团有限公司,晶芯?E-Cycler TM96 PCR仪); 4.1.6单道移液器(1000μl,200μl,20μl),8道移液器(10μl),灭菌枪头(1000μl,200μl,20μl); 4.1.7 离心管架,96孔板,1.5ml离心管,PCR扩增管或八连排管(200μl); 4.1.8 记号笔,手套(无粉乳胶,PE); 4.1.9 75%酒精棉,废液缸和消毒液; 4.2 试剂 晶芯?地中海贫血基因检测试剂盒(微阵列芯片法)B部分中的扩增试剂A,B,C,D,

E以及PCR扩增酶试剂,阳性对照品(博奥生物集团有限公司)。 4.3 样本 人基因组DNA(提取方法详见干血斑基因组提取标准操作规程)。 4.4 实验前准备 4.4.1 打开超净台紫外灯照射20min,开风机15min后打开日光灯进行操作; 4.4.2 准备实验用品,包括PCR扩增试剂,离心管架,96孔板,移液器等; 4.4.3 从-20℃冰箱取出PCR扩增试剂及基因组DNA,室温融化,涡旋混匀后瞬时离心; 4.4.4 核对样本名称及数量,排好顺序,将样本的加样顺序记录下来。 4.5 操作过程 4.5.1 用75%酒精棉擦拭双手,超净台面,移液器,96孔板及离心管架; 4.5.2 按照加样顺序准备PCR反应管,并在管盖和管身同时做好相应标记; 4.5.3根据样本数目准备5倍数量的200μl PCR扩增管,在试剂准备区内,将融化后混匀的PCR 扩增试剂A、B、C 、D、E按17μl/管,分别分装到5个PCR 扩增管中。再分别向这5个PCR扩增管中加入3μl的PCR扩增酶试剂。

突变基因检测试剂盒研发方案

突变基因检测试剂盒研发方案 一、×××试剂盒研发背景 二、×××试剂盒检测方法及原理 三、×××试剂盒成分 四、×××试剂盒使用步骤 五、×××结果检测和分析 六、×××试剂盒成本计算 人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒 中文名称: 英文名称: 包装规格: 储存条件:-20℃可保存6个月,4-8℃保存一周,避免反复冻融。 有效期: 适用仪器:ABI7500 ARMS real-time PCR检测系统 适用样本类型:新鲜组织、石蜡包埋组织、血液等 检测方法局限性:本试剂盒只适用于规定的仪器和检测系统,检测结果仅供临床参考,不得作为临床诊治的唯一凭据。 注意事项:本试剂盒仅用于体外研究。 一、BRAF突变检测试剂盒研发背景 B-raf基因位于7号染色体长臂上,是一种癌基因,属RAF基因家族,有18个外显子,编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白,是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK 中重要的转导因子,参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变,其中第15外显子上V600E点突变最常见,约占所有突变的90%以上,该突变导致B-raf蛋白被异常激活,从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议,对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者,应进一步检查B-raf 基因的突变状态,以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本,用于肿瘤组织B-raf基因V600E点突变的定性检测,为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。对黑色素瘤患者选用BRAF基因靶向药物威罗菲尼,结直肠癌患者使用 二、BRAF突变检测试剂盒检测方法及灵敏度 本试剂盒基于实时荧光PCR平台,结合等位基因特异性扩增(ARMS)技术PCR扩增技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA 互补才能有效扩增,通过设计特异性ARMS引物,对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大,并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测,提高了检测

PCR技术在食品检测中的应用汇编

许昌学院食品与生物工程学院2015-2016学年第一学期《现代食品检测技术》课程论文 PCR技术在食品检测中的应用

PCR技术在食品检测中的应用 许昌学院食品与生物工程学院,河南许昌461000 传统检测食品中微生物的方法主要是分离和培养鉴别,该方法操作繁琐,有些微生物很难培养。尤其是针对检测食品中的弱势菌,使用传统的方法基本无法检测出来。聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,由于它可以将微量的DNA大幅增加的特点,所以能够比较准确地检测食品中微生物。本文主要介绍PCF技术的操作原理和目前运用到食品检测中的几种具体的PCR技术特点,包括:多重PCR技术、实时荧光定量PCF检测技术、免疫PCR检测技术。并且对PCR技术在食品检测方面予以展望,为解决食品安全问题和相关食品检测做出导向作用。 关键词:食品检测;微生物培养;聚合酶链式反应;食品安全问题

、、■ 刖言 食品⑴是指原料不经加工或经过加工或改变性状、具有一定营养价值、对人体无害、可供人类食用的物质。它不仅富含营养成分和水等物质更容易滋生微生物,而且它能最直接的与人体接触,进入人体的消化系统,所以食品安全问题[2-4] 不容轻视。现代食品行业,在生产、运输、销售过程中有很多有害的微生物,这将严重危害食品的品质和人们的健康,甚至会引起一些严重的疾病。现代食品检测技术⑸是对食品按其原定用途进行制作和食用时不会使消费者受到伤害的一种担保。为保证食品安全急需一些快速、敏感、特异的检测方法,以及时发现致病菌,控制污染及其可能对人体健康产生的危害。PCR检测技术具有敏感性、 特异性、简便、快速的优点,现已广泛应用于微生物检测,尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定方面,具有常规方法无法比拟的优越性。 随着分子微生物学和分子化学的飞速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中,尤其是聚合酶链反应(PCR)成为世人瞩目的生物技术革命的新产物,已逐步应用于食品的检测,具有广阔的发展前景。 1 PCR技术的原理 PCR是在体外人为控制的合适条件下,以单链DNA或RNA为模板,以1 对人工合成的寡核苷酸序列为引物,在耐热Tap DNA聚合酶作用下特异性扩增基因片段的技术。整个反应过程除了需要加入待扩增的DNA片段和两个决定特 异性的引物外,还需加入适量的缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸溶液(dNTP)、Tap DNA聚合酶、Mg2+等。每个PCR循环包括模板DNA变性、模板DNA与引物的退火(复性)、引物的延伸3个基础步骤。反应时,首先将靶DNA双链加热变性为单链状态,然后降低溶液温度,加入2段人工合成的与靶DNA端邻序列互补的寡核苷酸片段作为引物,即左端引物和右端引物,使合成引物在低温下与其靶序列特异配对,形成部分双链。然后,在Tap DNA聚合酶和4种dNTP 底物存在的情况下,引物沿模板DNA链(靶DNA单链)按5 '末端向3 '末端方向延伸,自动合成新的DNA双链,新合成的DNA片段又可作为扩增的模板。如此重复改变温度,由高温变性、低温复性、和适温延伸组成一个周期,每个周

基因检测试剂盒

试剂盒: 文库制备试剂盒/DNA建库试剂盒 DNA Sample Prep Kit. 因为样本不一样(样本量大小,GC含量等),或根据制备时间长短需求,市面上有多种文库制备试剂盒 (DNA测序胶及缓冲液试剂盒DNA SequencingGel& Buffer Kit) 检测试剂盒/测序反应试剂盒Reagent Kit/Assay Kit 仪器生产商自己有设计生产与仪器对应的检测试剂盒,其他机构也会根据需要设计标准试剂盒或者独特的试剂盒 个性化试剂盒: 为了利用新一代测序技术的强大优势对特定疾病状态进行研究,关键的一点是要靶向这些特定的基因组区域。通过与临床研究领域的领导者共同开发,安捷伦科技得以为特定遗传疾病的研究提供HaloPlex 新一代测序靶向序列捕获试剂盒。 癌症试剂盒,心肌病试剂盒,心律失常试剂盒,结缔组织病试剂盒,努南综合征试剂盒,ICCG 试剂盒,X 染色体试剂盒。 同时试剂盒提供商会设计配套的软件来分析测序数据 无创产前: 测序仪: 博奥生物自主研制生产BioelectronSeq 4000 胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法) 人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测试剂盒(微阵列芯片法) 通过CFDA认证 在临床应用中,该仪器与同时获批的体外诊断(IVD)产品胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒,以及与仪器配套的专用生物信息分析软件配合使用,适用于胎儿染色体21三体、18三体、13三体的非整倍体检测。 据介绍,子宫颈癌是威胁妇女健康的主要疾病之一,其发病率在女性恶性肿瘤中居第二位,仅次于乳腺癌。世界卫生组织公布的数据显示,全世界每年新发宫颈癌病例超过47万例,我国占28%。 超过99%的宫颈癌患者体内可被检出HPV。在100多种HPV亚型中,有18种HPV病毒株被国际公认为是造成宫颈癌及其癌前病变的高风险HPV亚型。同一型别的高危型HPV的持续感染是妇女患宫颈癌的主要原因。 由于宫颈癌发病缓慢,从HPV感染到宫颈癌发病历时数年,从而为宫颈癌普查普治提供了宝贵时机。 据博奥生物介绍,其自主研发的HPV核酸检测试剂盒(微阵列芯片法)可用于女性子宫颈脱落细胞中18种高危HPV亚型和4种低危HPV的DNA分型检测。宫颈癌筛查需要联合使用HPV-DNA检测和细胞学检测。

DNA用什么试剂鉴定

DNA用什么试剂鉴定 DNA用什么试剂鉴定?亲子鉴定就是利用医学、遗传学的理论和技术,通过子代和亲代遗传标记的比对,分析遗传特征,判断父母与子女之间是否有亲生关系。一般DNA亲子鉴定的采样有血液、带毛囊的头发、羊水及人体组织细胞如口腔粘膜细胞等几种。我们实验室一般是采集血样进行DNA鉴定。 第一步:采血提取DNA 本次实验以采集血样进行DNA鉴定。 杨主任告诉我们:“血样采集其实跟抽血一样,我们只需要在静脉血管中抽取1毫升血液即可。不是大家认为的几百CC的血液,没那么夸张。” 实验人员把采集的血液置于含抗凝剂的1.5毫升离心管中。接下来在PCR实验室DNA提取间,实验人员取少许血液,在其中加入DNA提取液。杨主任表示,之所以加入提取液是为了将细胞中的DNA提取出来,去除其他物质,这样能够更好地进行检测。 第二步:扩增DNA 当DNA提取完成后,实验人员再取出DNA检测试剂盒,在无菌超净台内加样,实验人员的双手在超净台内操作,确保实验在一个相对安全、无菌的环境下进行。 实验人员在新的试管中加入了2微升的DNA,2微升的蒸馏水,6微升的亲子鉴定试剂,据了解,亲子鉴定试剂里面包括酶、引物等试剂,加入了所有的试剂后,实验人员把试剂在混匀器上混匀,让试剂和DNA样本能够充分混合。杨主任解释到,虽然之前提取了一些DNA,但并不全是我们需要的靶基因,量也不多。为此,第二步要在PCR扩增间进行扩增,就是通过引物扩增人体DNA上的靶基因,直到达到所需的量为止。 实验人员把小试管放入扩增仪中,通过变性、退火、复性的循环,靶基因得到循环往复的复制,从而扩增出我们所需的靶基因数量,以便之后的操作。 第三步:电泳比对位点 经过3小时的扩增,实验人员把试管取出,冷却后,开始最后一个环节--电泳。实验人员把DNA产物和电泳试剂混合后放入一个叫做3130荧光自动测序仪当中进行检测。杨主任表示,这个仪器将会自动从试管中提取DNA产物,然后进行电泳,根据DNA片断的长短和不同 ????

1_肿瘤相关突变基因检测试剂(高通量测序法)性能评价通用注册技术审查指导原则

附件1 肿瘤相关突变基因检测试剂(高通量测序法)性能评价通用注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写,同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求,申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用,若不适用,需具体阐述理由及相应的科学依据,并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件,但不包括注册审批所涉及的行政事项,亦不作为法规强制执行,如果有能够满足相关法规要求的其他方法,也可以采用,但需要详细阐明理由,并对其科学合理性进行验证,提供详细的研究资料和验证资料,相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的,随着法规和标准的不断完善,以及科学技术的不断发展,本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序(high-throughput sequencing)即下一代测 —1 —

序(next generation sequencing,NGS),又称为大规模平行测序(massively parallel sequencing,MPS),体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测,包括对特定基因的DNA/RNA进行测序,以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。 基于NGS测序原理的体外诊断(In Vitro Diagnosis,IVD)检测可能包括以下步骤:样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。同时,某些产品还可能会包括软件部分,但上述相关步骤并不一定被全部包括,应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤,申请人需要结合产品设计和临床意义来建立特定的可接受的质量评价指标和合格判断标准。此外,为满足产品特定预期用途,申请人需通过科学和适当的检测性能研究来确定适用的试剂、消耗品、仪器和软件。基于上述考虑因素,NGS检测产品的设计和工作流程中的任何差异均可能导致结果的不同,因此申请人需要清楚地描述相关检测性能指标。 分析性能评价的初衷在于提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设,然后通过研究进行确认。NGS在测序通量及发现未知基因变异方面具有优势,但是在NGS技术应用需求及使用中存在包括相关临床样本收集处理、NGS检测内容、测序流程、—2 —

基因诊断试剂

基因诊断试剂 在国外,生化诊断试剂的占比已经很低,大约只有30%-40%,市场的主流是检测灵敏度和特异性更高的免疫诊断试剂和基因诊断试剂,而其中的基因诊断试剂又是最高端的产品,它包括在临床已经使用的核酸诊断技术(PCR)产品和当前国内外正在大力研究开发的基因芯片产品。PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短,可进行定性、定量检测,曾广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等的检测。基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶,综合了多种现代高精尖技术,被专家誉为诊断行业的终极产品,但成本高、开发难度大,目前产品种类很少,只用于科研和药物筛选等用途。因此、诊断试剂的高端化是未来发展的必然趋势,预计基因诊断试剂的市场未来增长率将超过25%。 核酸诊断技术(PCR)疾控系列核酸诊断试剂 炭疽杆菌(BA)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 炭疽杆菌(BA)核酸扩增检测试剂盒 鼠疫杆菌(YP)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 鼠疫杆菌(YP)核酸扩增检测试剂盒 脑膜炎奈瑟菌通用型(NM-U)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 脑膜炎奈瑟菌通用型(NM-U)核酸扩增检测试剂盒 脑膜炎奈瑟菌A群(NM-A)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 脑膜炎奈瑟菌A群(NM-A)核酸扩增检测试剂盒 脑膜炎奈瑟菌C群(NM-C)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 脑膜炎奈瑟菌C群(NM-C)核酸扩增检测试剂盒 登革热病毒Ⅰ型(DFV-U)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 登革热病毒Ⅰ型(DFV-U)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法)

登革热病毒Ⅰ型(DFV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 登革热病毒Ⅰ型(DFV-Ⅰ)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 登革热病毒Ⅱ型(DFV-Ⅱ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 登革热病毒Ⅱ型(DFV-Ⅱ)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 汉坦病毒通用型(HTV-U)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 汉坦病毒通用型(HTV-U)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 汉坦病毒Ⅱ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 汉坦病毒Ⅱ型(HTV-Ⅰ)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 麻疹病毒(MV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 麻疹病毒(MV)核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 嗜肺军团杆菌(LP)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 嗜肺军团杆菌(LP)核酸扩增检测试剂盒 绿脓杆菌(PA)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 绿脓杆菌(PA)核酸扩增检测试剂盒 肠道病毒EV71核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 肠道病毒EV71核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 肠道病毒EV71/柯萨奇病毒A16型双色荧光检测试剂盒 肠道病毒通用型(EV-U)扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 肠道病毒通用型(EV-U) 核酸扩增检测试剂盒(RT-PCR法) 肠道病毒通用型/EV71/柯萨奇病毒A16型三色荧光 柯萨奇病毒A16型(CAV-16)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 柯萨奇病毒A16型(CAV-16)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 临床检验系列核酸诊断试剂: 甲型肝炎病毒(HAV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 丙型肝炎病毒(HCV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 庚型肝炎病毒(HGV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

PCR及其改进技术在食品检测中的应用

PCR及其改进技术在食品检测中的应用Application of PCR and PCR improved technology for detection in foods 刘辉1,杨利平1,2,张滨1* Liu Hui1,Yang Liping1,2,Zhang Bin1* (1.长沙环境保护职业技术学院,长沙410004;2.湖南师范大学生命科学学院,长沙410081) (1.Changsha Environmental Protection and Professional technique College,Changsha410004,China; 2.Department of life science,Hunan normal university.Changsha410081,China) 摘要:在介绍传统PCR的基础上,简介实时定量PCR、多重PCR、PCR-DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。 关键词:PCR改进技术;传统PCR;食品检测 Abstract:The methods were rapidly upgraded for detection in foods when the factors of food-pollution became more and more complicated.PCR improved technology gradually replace the role of traditional PCR for detection in foods.In this paper,we introduced the application of three PCR improved technologies for detection in foods on the base of introducing traditional PCR. The three PCR improved technologies include real-time PCR,MULTIPLEX-PCR and PCR-DGGE. Key words:Traditional PCR;PCR improved technology;Detection in 近年来,随着我国社会经济的快速发展,人们的生活得到很大改善,对食品质量的要求也越来越高。加入WTO以后,国外对我国出口食品的质量要求也越来越严格。食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题,随着食品生产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用,食品污染的因素日趋复杂,因此食品安全检测的方法也需日新月异。自从1985年问世以来,PCR(Polymerase Chain Reaction)技术因其灵敏、快速、操作简便的优点,在食品检测领域具有广泛的应用。但是传统PCR检测技术一直面临着假阳性污染和定量准确度两大难题,用传统的PCR检测技术都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程,而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中形成气溶胶,使PCR假阳性污染成为可能,而且电泳所用染色剂EB(溴化乙锭)为强烈致癌物质,容易危害操作者的健康。近年来,PCR改进技术在食品检测中的应用研究得越来越多,本文将简介几种PCR改进技术在食品检测中得应用研究进展。 1传统PCR技术在食品检测中的应用及其缺点 PCR(Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应技术,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该技术自从1985年问世以来,最早应用于基因克隆和转基因检测,但由于其精确、微量的特点,已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入,许多致病菌的遗传背景进一步明了,PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景[1]。近年来,PCR技术在食品检测中的应用主要体现在如下几个方面: 基金项目:长沙环境保护职业技术学院生物化学精品课程建设项目资助(项目编号:?) 作者简介:刘辉(1976-),女,长沙环境保护职业技术学院讲师。Email:? *通讯作者,张滨

PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于在体外快速扩增DNA,类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导,通过温度的调节,使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性(退火)成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA(引物的延伸);这种热变性-复性-延伸的过程,就是一个PCR循环;一般通过20-30个循环之后,就可获得大量(106倍)的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备; ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法,其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同,DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子,其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭(有毒!),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种光络合物,在254~365nm波长紫外光照射下,呈现桔红色的

相关主题
相关文档 最新文档