2004年6月June2004
中国油料作物学报
Chinese journal of oil crop sciences
第26卷第2期
Vol.26No.2不同SDS-PAGE分离胶浓度条件下
大豆贮藏蛋白亚基的分辨效果
王显生1,麻浩2*,向世鹏1,张国正2,崔国贤1
(1.湖南农业大学农学院,湖南长沙410128;
2.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部国家大豆改良中心,江苏南京210095)
摘要:采用SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度分别为9%、10%、11%、12%、13%的凝胶系统,探讨不同分离胶浓度条件下大豆籽粒主要贮藏蛋白(7S和11S组分)亚基的分辨效果。结果表明,分离胶浓度大小对大豆贮藏蛋白(7S和11S组分)亚基电泳图谱分辨率的影响非常明显。分离胶浓度为9%和10%时,7S组分亚基(A c、A和B)分辨效果较好;分离胶浓度为13%时,11S组分各亚基(A3、A4A2、A1a A1b、A5、B3、B1a B1b B2和B4)分辨效果较好。如需获得较好的7S和11组分亚基综合分辨效果,以分离胶浓度为12%的凝胶系统为佳。
关键词:大豆;蛋白亚基;SDS-PAGE;分离胶浓度;分辨效果
中图分类号:TQ937文献标识码:A文章编号:1007)9084(2004)02)0075)06
SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)作为对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的经济、快速、且可重复的方法,已广泛应用于大豆、小麦、水稻、烟草等农作物的蛋白质分析测定[1~4]。由于SDS-PAGE分离蛋白质并不取决于蛋白质分子的电荷密度,而只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小,也即决定于蛋白质或亚基的分子量大小。因此,凝胶浓度的正确选择对电泳鉴定效果尤为重要[5]。不同分子量范围的蛋白质应选择不同的凝胶浓度[5,6]。
大豆籽粒中含有超过40%的贮藏蛋白。根据沉降系数的不同大豆籽粒贮藏蛋白可分为2S、7S、11S和15S四种组分,以7S和11S为主,约占总贮藏蛋白的70%[7]。大豆贮藏蛋白亚基的构成对蛋白的功能性和营养特性影响很大[8],因此,对贮藏蛋白亚基正确的凝胶电泳分离鉴别在资源筛选、遗传育种和加工利用上尤显重要[8~10]。大豆贮藏蛋白7S 组分可分为A c(MW~72000)、A(MW~68000)和B (MW~52000)3个亚基[11,12],11S组分可分为A1a (MW~38000)、A1b(MW~38000)、A2(MW~38 000)、A3(MW~45000)、A4(MW~38000)、A5(MW~ 11000)、B1a(MW~19000)、B1b(MW~19000)、B2 (MW~19000)、B3(MW~20000)、B4(MW~19000)等八个亚基[13]。笔者在采用SDS-PAGE对大豆贮藏蛋白亚基进行凝胶电泳分离鉴别时,发现不同分离胶浓度对大豆贮藏蛋白亚基的分辨效果影响很大。本文采用5%浓缩胶浓度,分离胶浓度分别为9%、10%、11%、12%、13%的凝胶系统对7个大豆品种的贮藏蛋白作SDS-PAGE分析,对比其电泳图谱和蛋白质亚基迁移率,以图谱清晰,差异带明显和适宜的迁移率为标准,优化出适宜的分离胶凝胶浓度,以期为大豆贮藏蛋白亚基的分离鉴别提供指导。
1材料和方法
1.1实验材料
供试品种7个,分别为:(1)吉林30,(2)吉育17,(3)新大豆1号,(4)87-17,(5)金大三三二,(6)宁镇1号,(7)文丰5号。供试品种的种子均为2002年夏播收获的种子。
1.2主要实验试剂
丙烯酰胺,N,N c-甲叉双丙烯酰胺,Tris(三羟甲基氨基甲烷),TE MED(四甲基乙二胺),考马斯亮蓝R250,均由上海化学试剂公司进口分装;SDS(十二烷基硫酸钠),上海伯奥生物科技有限公司进口分装;甘氨酸,上海蓝季科技发展有限公司;过硫酸
收稿日期:2003)10)13
基金项目:农业部/9480项目(M2001-207);江苏省/十五攻关0项目(Q200126)
作者简介:王显生(1977)),男,湖南永兴人,在读硕士研究生,主要从事作物品质改良和加工利用研究。*通讯作者,Tel:025-********;E-mail:Lq-ncs i@https://www.doczj.com/doc/746812428.html,
铵,上海东懿试剂有限公司进口分装;2-巯基乙醇,上海化学试剂公司,所用试剂均为分析纯。
1.3主要实验仪器与设备
Avanti高速离心机,Beckman Coulter公司生产; MAXI DRY-LY真空干燥机,Heto-Holten公司生产;EPS301电泳仪,Amersham Pharmacia Biotech公司生产;DYCZ-30型电泳槽,北京六一仪器厂生产; Versa Dco凝胶扫描系统,Bio-Rad公司生产。
1.4电泳实验方法
1.4.1贮液的配制(1)丙烯酰胺单体贮液: 29.10g丙烯酰胺+0.90g N,N c-甲叉双丙烯酰胺加水定容至100ml,用棕色瓶4e保存。(2)浓缩胶缓冲贮液(1.0mol/L Tris-HCl,pH6.80):1
2.10g Tris 溶于80ml水,用4NHCl调pH至 6.80,定容至100ml,4e保存。(3)分离胶缓冲贮液(1.5mol/LTris -HCl,pH8.80):18.15g Tris溶于80ml水,用4NHCl 调pH至8.80,定容至100ml,4e保存。(4)10% SDS:10g SDS加水定容至100ml。(5)10%过硫酸铵: 0.1g过硫酸铵加1.0ml水。(6)10%TE MED:0.1ml TE MED加0.9ml水。
1.4.2凝胶浓度的定义凝胶浓度用T和C来表示。T是两个单体(丙烯酰胺和N,N c-甲叉双丙烯酰胺)的总百分浓度,C是与浓度有关的交联百分度。
T=a+b
m @100%C=b
a+b
@100%
式中:a为丙烯酰胺的克数(g),b为N,N c-甲
叉双丙烯酰胺的克数(g),m为溶液的终浓度(ml)。
1.5大豆贮藏蛋白的提取
1.0g脱脂豆粉加20ml50mmol/L的Tris-HCl
(pH8.0,含有0.01mol/L2-巯基乙醇)缓冲液,在室
温下提取1h,离心(10000@g,20min,4e)后取上清
用1NHCl调pH至4.50,离心(2500@g,15min,4e)
后弃上清,沉淀经真空低温干燥后即得大豆贮藏蛋
白。
1.6电泳样品的准备
称取1.5mg大豆蛋白,加入500L l样品缓冲液
(1%SDS,0.1mol/L Tris-HCl,0.01mol/L2-巯基乙
醇,0.1g/L溴酚蓝,150g/L蔗糖,pH8.0),过夜,点样
前涡旋混匀。
1.7蛋白质亚基迁移率的计算
蛋白质的相对迁移率R f是用每条蛋白带的迁
移距离(分离胶与浓缩胶分界线至带中心位置的距
离)除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的,即:R f=
蛋白带迁移距离
溴酚蓝迁移距离
。
2结果与讨论
2.1不同凝胶浓度的配制
本实验的SDS-PAGE全部采用5%浓缩胶,分
离胶浓度采用9%、10%、11%、12%、13%等5个水
平。凝胶的配置方式见表1。
表1SDS-PAGE凝胶浓度的配制
Table1The preparation of gel content of SDS-PAGE
贮液
Storage s ol ution
凝胶终浓度(C=3%)Final concentration of gel
T=5%T=9%T=10%T=11%T=12%T=13%
丙烯酰胺单体贮液Storage solution of acryla mide monomer/ml2910111213浓缩胶缓冲贮液Buffer storage soluti on of concentrating gel/ml3)))))分离胶缓冲贮液Buffer storage soluti on of res olving gel/ml)7.57.57.57.57.5 10%SD S/L l120300300300300300 H2O/ml 6.813.212.211.210.29.2 10%过硫酸铵10%a mmonium pers ulfate/L l505050505050 10%TEMED/L l505050505050
2.2大豆贮藏蛋白亚基的分辨效果
大豆贮藏蛋白各个亚基的SDS-PAGE带的识别依据Mujoo等[12]和Kitamura[14]的研究结果进行识别。
图1-1为分离胶浓度9%的电泳图谱。从图谱上可以看出大豆贮藏蛋白分子量相对较大的7S 组分A c、A和B3个亚基带能明显分开,而11S组分中,分子量相对较大的酸性亚基可以分离为A3、A4A2和A1a A1b三条带,但分子量相对较小的A5亚基和碱性亚基(B1a B1b B2B3B4)及溴酚蓝却混在一起,未分开。
在样品1(吉林30)的相应扫描图谱(图1-2)上,可以看出A c、A、B、A3、A4A2、A1a A1b形成了6个扫描峰,而A5亚基、碱性亚基(B1a B1b B2B3B4)及溴酚蓝形成了1个扫描峰。
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图1-1 分离胶浓度为9%的电泳图谱
Fig.1-1 SDS -PAGE pattern of 9%resolving gel content
图1-2 图1-1中样品1的扫描图
Fig.1-2 Scanning profile of sam ple No.1of Fig.1-1
图2-1为分离胶浓度10%的电泳图谱。从图谱上可以看出7S 组分A c 、A 和B 3个亚基带能明显区分,11S 组分中分子量相对较大的酸性亚基仍可
以区分为A 3、A 4A 2和A 1a A 1b 3条带,碱性亚基中已
能区分出B 3,而B 1a 、B 1b 、B 2、B 4等亚基还混在一起,A 5
亚基与溴酚蓝带也混在一起未能分开。
图2-1 分离胶浓度为10%的电泳图谱
Fig.2-1 SDS -PAGE pattern of 10%resolving gel content
图2-2 图2-1中样品1的扫描图
Fig.2-2 Scanning profile of sam ple No.1of Fig.2-1
在样品1的相应扫描图谱(图2-2)上,碱性亚基中已能区分出B 3扫描峰、B 1a B 1b B 2B 4扫描峰,但A 5亚基与溴酚蓝带还混在一起形成一个扫描峰。
图3-1为分离胶浓度11%的电泳图谱。从图谱上可以看出,除A 5亚基仍与溴酚蓝带混在一起外,7S 组分可分为A c 、A 和B 三个亚基带,酸性亚基可区分为A 3、A 4A 2和A 1a A 1b 3条带,而碱性亚基可明显区分为B 3、B 1a B 1b B 2和B 43条带。
在样品1的相应扫描图谱上,碱性亚基中已能区分出B 3、B 1a B 1b B 2、B 43个扫描峰,但A 5亚基与溴酚蓝带仍混在一起形成一个峰。
图4-1为分离胶浓度12%的电泳图谱。从图谱上可以看出A 5带已与溴酚蓝带分离,7S 组分可分为A c 、A 和B 3个亚基带,酸性亚基可区分为A 3、
A 4A 2、A 1a A 1b 和A 54条带,碱性亚基可明显区分为
B 3、B 1a B 1b B 2和B 43条带。但7S 组分各亚基间迁移距离缩小了。
在样品1的相应扫描图谱上,可以看出A c 、A 、B 、A 3、A 4A 2、A 1a A 1b 、A 5、B 3、B 1a B 1b B 2、B 4等亚基形成了10个扫描峰。只是样品1的A 4A 2与A 1a A 1b 峰间较为模糊。
图5-1为分离胶浓度13%的电泳图谱。从图
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王显生等:不同SDS-PAGE 分离胶浓度条件下大豆贮藏蛋白亚基的分辨效果
图3-1 分离胶浓度为11%的电泳图谱
Fig.3-1 SDS -PAGE pattern of 11%resolving gel content
图3-2 图3-1中样品1的扫描图
Fig.3-2 Scanning profile of sam ple No.1of Fig.3-
1
图4-1 分离胶浓度为12%的电泳图谱
Fig.4-1 SDS -PAGE pattern of 12%resolving gel content
图4-2 图4-1中样品1的扫描图
Fig.4-2 Scanning profile of sample No.1of Fig.4-
1
图5-1 分离胶浓度为13%的电泳图谱
Fig.5-1 SDS -PAGE pattern of 13%resolving gel content
图5-2 图5-1中样品1的扫描图
Fig.5-2 Scanning profile of sam ple No.1of Fig.5-1
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中国油料作物学报 2004,26(2)
谱上可以看出11S组分中各酸性亚基和碱性亚基带能明显区分,分成A3、A4A2、A1a A1b、A5、B3、B1a B1b B2和B4等7条带,A5带也特别远离溴酚蓝带;而7S组分中,A c和A亚基带肉眼看较难分开。样品7的B和B c亚基带肉眼看也较难分开。
在样品1的相应扫描图谱上,可以看出形成了A c、A、B、A3、A4A2、A1a A1b、A5、B3、B1a B1b B2、B4等10个扫描峰。
由以上的电泳图谱和扫描图谱可以看出,分离胶浓度的改变可直接影响到电泳图谱上的蛋白亚基分辨效果。就分子量相对较大的7S组分亚基而言,分离胶浓度越高,各亚基带间距离就越近;分离胶浓度为13%时,A c和A亚基带就较难区分了。文丰5号(样品7)中的B和B c亚基带也随着分离胶浓度的增高而难以分开。相反,对11S组分而言,分离胶浓度越高,各亚基带间距离就越大,特别是碱性亚基,如分离胶浓度为9%时,碱性亚基只一条带并且与溴酚蓝带混在一起;当浓度每增加1个百分点,就多出1~2条带;到12%时,大部分亚基都能明显分辨了。
2.3蛋白亚基的迁移率
不同SDS-PAGE分离胶浓度条件下,大豆贮藏蛋白各亚基迁移率列于表2。由表2可以看出,所有蛋白亚基的迁移率都随分离胶浓度的升高而降低,表明分离胶浓度的变化可直接影响蛋白亚基在电泳图谱上的迁移率。
表2不同分离胶电泳蛋白亚基迁移率
Table2Mobility of soybean storage protein subunits under different resolving gel contents
蛋白亚基Protein subuni t
分离胶浓度Resolvi ng gel content
9%10%11%12%13%
A c0.362?0.026*0.304?0.0130.256?0.0130.220?.0000.174?0.026
A0.394?0.0180.331?0.0290.275?0.0000.239?0.0130.184?0.025
B0.569?0.0180.490?0.0130.409?0.0400.364?0.0000.295?0.026
B c0.587?0.0000.508?0.0350.424?0.0000.373?0.0000.302?0.000
A30.699?0.0210.609?0.0240.513?0.0340.455?0.0000.365?0.023
A4A20.758?0.0310.663?0.0310.560?0.0350.501?0.0260.409?0.026
A1a A1b0.776?0.0310.680?0.0200.577?0.0230.517?0.0000.422?0.021
B30.996?0.0380.948?0.0270.842?0.0360.775?0.0180.662?0.021 B1a B1b B20.964?0.0130.866?0.0710.799?0.0180.685?0.013 B40.886?0.0460.818?0.0130.705?0.018
A50.983?0.0230.886?0.020溴酚蓝带Band bromophenol blue 1.000?0.032 1.000?0.000 1.000?0.026 1.000?0.018 1.000?0.018 *M ean?s d
要获得较好的SDS-PAGE电泳分辨率,根据郭尧君[5]的研究结果,迁移率应控制在0.25~0.85之间。但由于大豆贮藏蛋白既存在分子量相差较大的亚基,大的蛋白亚基如A c其分子量为72000,小的蛋白亚基如A5仅为11000;又存在分子量非常近似的亚基,如A1a、A1b、A2、A4等亚基的分子量都为38 000,B1a、B1b、B2、B4都为19000,因而在电泳时,大豆贮藏蛋白在相对较低浓度分离胶系统中,由于凝胶孔径相对较大,样品分子的移动只要稍受阻碍,速度较快,迁移率就高,对小分子量的亚基(B3、B1a B1b B2、B4、A5)而言,它们均随着缓冲液向前推进而不能得到很好的分离;在相对较高浓度分离胶系统中,由于凝胶孔径相对较小,样品分子的移动速度因受阻较大而减缓,迁移率就相对较低。对大分子量的亚基(如A c、A、B)而言,所受阻力较大,其迁移率降低程度相对较明显,而小分子量的亚基(如B1a、B1b、B2、B4等),所受阻力相对较小,其迁移率降低程度相对较不明显。
通过对5种分离胶浓度条件下蛋白亚基迁移率和电泳图谱清晰程度分析,结果表明:在分离胶浓度较低(9~10%)时,7S组分亚基分辨效果较好(迁移率在0.304~0.587之间),在分离胶浓度较高(13%)时,11S组分蛋白亚基分辨效果较好(迁移率在0.365~0.886之间);在既要考虑分辨率又要考虑11S和7S组分亚基分离综合效果时,大豆贮藏蛋白亚基电泳分离胶浓度以12%为佳(迁移率在0.220 ~0.983之间)。
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The resolving effect of soybean storage protein subunits under
different separation gel concentrations of SDS-PAGE
W AND Xian-sheng1,MA Hao2,XIANG Shi-peng1,ZHANG Guo-zheng2,CUI Guo-xian1
(1.Agronom y School,Hunan Agricultural University,Changsha4100128,China;
2.National Key Lab o f Crop Genetics and Germ plasm Enhancement,
National Center f or So ybean Im provement,Department o f Agriculture,Nanjing210095,China) Abstract:The experiment attempt to investigate the resolving effect of soybean major stora ge protein(7S and11S fraction)subunits under different separation gel c oncentrations of sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel elec-trophoresis(SDS-PAGE).The results showed that the resolving effec t of soybean major storage protein subunits c ould be greatly affected by the concentration change of resolving gel.The good resolving effect of7S fraction subunits(A c、A and B)of soybean stora ge protein could be obtained when the resolving gel concentrations were9%and10%,and the good resolving effect of11S fraction subunits(A3、A4A2、A1a A1b、A5、B3、B1a B1b B2and B4)of soybean storage protein could be obtained when the resolving gel concentrations were13%.Furthermore,12%resolving gel c oncentration should be the best choice to obtain the good resolving effect of11S and7S frac tion subunits.
Key word:Glycine max(L.)Merrill;Protein subunit;SDS-P AGE;Resolving gel concentration;Resolving ef-fect
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