棉花学报Cotton Science 2013，25（3）：189~196
棉花纤维发育早期RNA-Seq 转录组分析
李锡花1,2，吴
嫚2，于霁雯2，张金发2，范术丽2，宋美珍2，庞朝友2，喻树迅2*
（1.西北农林科技大学，陕西杨凌712100；2.中国农业科学院棉花研究所/
棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）
摘要：为了揭示棉花纤维发育早期基因表达变化情况，本研究以纤维长度存在显著差异的两个陆海回交近交系NMGA-062（32.58mm ）和NMGA-105（27.06mm ）为材料，利用Illumina HiSeq TM 2000对0、3DPA （Days
post anthesis ）的胚珠及10DPA 的纤维进行RNA-Seq 测序。六个文库进行拼接，共得到长度大于200bp 的Unigene 98464个，总长度约为88.2Mb 。对10DPA 的纤维转录组数据进行差异表达分析，共筛选到1931个差
异表达基因，1536个Unigene 上调，395个Unigene 下调。GO （Gene ontology ）功能显著性富集和Pathway 显著性富集分析发现，差异表达基因富集在脂质转移活性（Lipid transport activity ）分子功能组和脂质代谢通路（Lipid metabolism pathway ），由此推测脂类相关基因可能在纤维伸长发育过程中起重要作用。通过对棉纤维发育10DPA 基因转录水平差异比较分析，为深入开展纤维伸长相关功能基因的克隆和功能验证提供了丰富的资源，并为揭示棉花纤维伸长的机制打下了坚实的基础。关键词：棉纤维发育早期；RNA-Seq ；qRT-PCR 中图分类号：S562.035.3
文献标志码：A
文章编号：1002-7807(2013)03-0189-08
Transcriptome Analysis of Early Developing Cotton Fiber by RNA-Seq
LI Xi-hua 1,2,WU Man 2,YU Ji-wen 2,ZHANG Jin-fa 2,FAN Shu-li 2,SONG Mei-zhen 2,PANG Chao-you 2,YU Shu-xun 2*
(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China ;2.Institute of Cotton Research,CAAS
/State Key Laboratory of Cotton Biology,Anyang,Henan 455000,China )
Abstract:To obtain global insights into early developing fiber transcriptome characteristics,six sequencing libraries of early de-veloping cotton fiber were constructed and sequenced using Illumina RNA sequencing.These libraries represented initiation (0d post-anthesis (DPA)and 3DPA)and elongation (10DPA)stages from two backcross inbred lines having significant differences in fiber length:NMGA-062(32.58mm)and NMGA-105(27.06mm).Each sample yielded 4.6Gb of available transcriptome data,with 98464unigenes longer than 200bp obtained by de novo assembly.When we compared NMGA-062with NMGA-105at 10DPA,we uncovered 1931differentially expressed genes(DEGs),of which 1536were up-regulated and 394were down-reg-ulated.Gene Ontology functional enrichment and pathway enrichment analyses revealed that the DEGs were primarily associat-ed with lipid transport and metabolism pathways,suggesting that lipid-related genes play an important role in cotton fiber elon-gation.The large number of DEGs detected by comparative analysis of 10-DPA cotton fiber transcriptome profiles provides a firm foundation for cloning and functional verification of fiber-related genes.
Key words:early developing cotton fiber;RNA-Seq;qRT-PCR
收稿日期：2013-01-25
作者简介：李锡花（1987-），女，硕士，lixh87@https://www.doczj.com/doc/755266577.html, ；*通迅作者，yu@https://www.doczj.com/doc/755266577.html,
基金项目：国家973计划（2010CB126006）；国家863计划（2012AA101108-02-03）
棉花是重要的经济作物，棉纤维是纺织工业的重要原材料，在国民经济发展中具有重要作用。近年来随着纺织工业的发展，全球原棉生产的品质结构也发生了根本变化，表现为纤维类型多样化。而我国棉花纤维品质相对较差，95%棉纤
维集中在中绒棉类型，缺乏长纤维和粗短纤维，不能完全满足纺织工业的需求。因此，改良棉纤维长度对国民经济的发展具有重要意义。棉纤维的发育过程可分为4个时期，分别为纤维分化突起、纤维伸长、次生壁增厚和脱水成熟，
相
棉花学报25卷邻时期之间没有截然区分的界线，且有所重叠，
但每个时期都各具特点[1-2]。纤维细胞分化突起和伸长阶段的发育程度决定纤维的数目和长度，因此对纤维起始和伸长阶段关键基因的挖掘和功能分析可以为棉花纤维品质的分子改良提供良好的资源。
近年来，许多学者利用芯片杂交技术筛选出大量纤维发育相关基因，从分子水平上对纤维发育机理进行了解[3-10]，但该技术受参考序列的限制，不能充分检测转录本。转录组测序技术（又称RNA-Seq）可以在没有完整基因组序列的前提下，研究所有的mRNA转录本的丰度信息，发掘新的转录本和可变剪接体，且可以得到定量更准确、分析更可靠、重复性更高及检测范围更广的结果[11]。目前，该技术已经被广泛应用。Wang等[12]利用DGE（Digital gene expression）技术分析徐州142和fl（fuzzless/lintless）突变体胚珠在纤维发育起始阶段（-2～1DPA,day post anthesis）和伸长阶段（2～8DPA）的基因表达情况，发现表达差异大的几个基因是纤维素合成酶基因、磷酸（脂）酶基因和脱氢酶基因。Pang等[13]利用454高通量测序技术对海岛棉（Pima Phy76）和陆地棉（Acala 1517-99）10DPA纤维进行分析，其中Pima Phy 76拼接到的1900条EST contigs中，分别有1005、1064条Contigs与A2、D5同源，738条Con-tigs与A2、D5均同源。Lacape等[14]利用454高通量测序技术结合DGE、芯片技术对海岛棉、陆地棉的10DPA、22DPA纤维发育相关基因进行研究，揭示膨胀素、脂质转移蛋白在海岛棉10DPA 的纤维中上调表达。但海岛棉与陆地棉的背景差异大，因此通过对海岛棉和陆地棉同一纤维发育阶段比较得到的大部分差异表达基因可能源于物种间本身的差异。目前，对遗传背景差异小且纤维长度差异显著的材料进行转录组测序分析的相关报道还未见到。
本研究选取陆海回交近交系中遗传背景相似且长度性状有显著性差异的两个材料，运用新近发展起来的RNA-Seq转录组测序技术，研究影响棉花纤维发育快速伸长期（10DPA）基因表达情况，以期建立棉花纤维发育早期的分子学研究平台，为改良棉花纤维品质提供理论基础。1材料和方法
1.1实验材料
利用陆地棉SG747与海岛棉Giza75杂交，得到的F1用SG747连续回交2次、自交5次获得BC2F6高世代重组回交自交系（BILs）群体。结合4年5环境的田间性状，选取纤维长度差异显著的2个BILs后代NMGA-062（纤维长度32.58 mm）和NMGA-105（纤维长度27.06mm）作为研究材料。两个材料的农艺性状除长度以外非常相似，利用实验室已有的466个SSR多态性位点，进行遗传相似性分析显示相似性达到0.80。因此，所选两个材料的遗传背景相似性很高，是近等基因系。
将两个材料2011年种植在河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验基地，共3次重复，每个小区单行种植，常规大田管理。开花当天按重复对棉铃挂牌标记，摘取0、3DPA的胚珠、10 DPA的纤维，立即投入液氮中。之后放于-70℃超低温冰箱保存。
1.2RNA的提取及质量检测
采用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（购于TIANGEN公司）分别提取两个材料0、3 DPA的胚珠、10DPA的纤维总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度及完整性，用Agi-lent2000进一步检测RNA的浓度和OD260/OD280、OD260/OD230比值。
建好的测序文库用Illumina HiSeq TM2000进行测序。
1.3数据分析
1.3.1原始数据处理。测序得到的原始图像数据经Base calling转化为序列数据，称为Raw reads；对含有带接头的、重复的、测序质量很低的Reads 过滤，得到Clean reads。
1.3.2序列组装。采用Trinity[15]软件进行De no-vo从头组装得到Unigene。用Tgicl将其去冗余和进一步拼接，同源转录本聚类，最终得到All-Unigene。对Unigene去冗余聚类的参数如下：重叠区域的长度最小为60bp，重叠区的相似度不低于94%，比对不上的序列长度最大为20bp。
1.3.3基因注释。通过Blastx将Unigene序列
190
3期李锡花等：棉花纤维发育早期RNA-Seq 转录组分析注：NMGA-062_0表示NMGA-0620DPA 的胚珠，NMGA-105_0表示NMGA-1050DPA 的胚珠。
Notes:NMGA-062_0is the 0DPA ovule of NMGA-062,NMGA-105_0is the 0DPA ovule of NMGA-105.
表1
测序产量统计
Table 1
Output statistics of sequencing
Samples Total raw reads Total clean reads Total clean nucleotides Q20percentage N percentage GC percentage
NMGA-062-05838209453424868480823812096.28%0.01%43.92%NMGA-105-05422040451135598460220382098.92%0.00%45.46%NMGA-062-35620562253147114478324026098.86%0.00%46.40%NMGA-105-3
5755045252674242474068178098.90%0.00%45.43%NMGA-062-105483912651744444465699996098.84%0.00%47.55%NMGA-105-10
57816334
54333714
4890034260
98.55%
0.00%
48.36%
与数据库NR （Non-redundant Protein Sequence Database in GenBank ）、Swiss-Prot （Swiss-Prot Pro-tein Sequence Database ）、KEGG （Kyoto Encyclo-pedia of Genes and Genomes ）和COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins ）比对（Evalue ＜10-5），并通过Blastn 将Unigene 与核酸数据库NT
（Non-redundant Nucleotide Sequence Database in
GenBank ）比对(Evalue ＜10-5)，得到Unigene 的功
能注释信息。
根据NR 注释信息，使用Blast2GO 软件进行
GO 注释，得到每个Unigene 的GO 信息后，用WEGO 软件做GO 功能分类统计。
采用Path_finder 软件并依据KEGG 注释分析Unigene 的代谢通路。
1.3.4荧光定量PCR 分析。不同组织样品的总
RNA 利用PrimeScript R RT reagent Kit （Perfect re-al time ）（购于TaKaRa 公司）反转录试剂盒合成cDNA 第一链。利用UltraSYBR Mixture （With ROX ）试剂盒（购于CWBIO 公司）在Bio-Rad 公
司的荧光定量PCR 仪上采用SYBR green Ⅰ荧光染料法进行qRT-PCR 。利用CFX ManagerTM
1.6软件，以Ghhis 3基因为内参，采用相对定量2
－△△Ct
法进行结果分析。利用Primer 5.0和Oligo
6.0软件设计基因的引物序列GhLTP 3（F:CAAAAGAATCCCTGCTACC ，R:GCTGATTGT-CGTGGTTAG ）、GhABP （F:GTGTTGGGGACTT-GAATG ，R:AAAGGCTGGTGTTACTGC ），委托Invitrogen 公司合成引物。
1.4基因表达分析
Unigene 表达量的计算使用FPKM 法（Frag-ments per kb per million fragments ）。根据基因的
表达量（FPKM 值）计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。差异表达基因定义为FDR ≤
0.001且倍数差异在2倍以上的基因。得到差异
表达基因之后，对差异表达基因做GO 功能分析和KEGG Pathway 分析。
2结果与分析
2.1RNA 提取
由图1可以看出，RNA 具有清晰的28S 和
18S 条带，且28S 亮度约为18S 的2倍。随后用Agilent 2000对RNA 各项指标进行测定，结果显
示所提取的RNA 质量较好，进而构建测序文库并利用Illumina HiSeq TM 2000进行测序。
2.2测序产量统计
6个文库测序得到的Raw reads 及过滤之后
的Clean reads 统计如表1，后续分析都基于
Clean reads 。
M:Marker Ⅲ;1:NMGA-062-0DPA;2:NMGA-062-3DPA;3:NMGA-105-0DPA;4:NMGA-105-3DPA;5:NMGA-062-10DPA;6:NMGA-105-10DPA.
图1
NMGA-062与NMGA-105的纤维总RNA 检测Fig.1
The total RNA detection of fiber of NMGA-062
and NMGA-105
←28S ←18S
2000bp →1200bp →800bp →
191
棉花学报25卷
表2
功能注释结果统计
Table 2
Statistics of annotation results
Database
NR
Swiss-Prot KEGG COG NT GO ALL Annotated number 70094427343796424709661243236376724Annotated ／total Unigene
71.2%
43.4%
38.6%
25.1%
67.2%
32.9%
77.9%
由表1可以看出，每个样品Clean reads 的总数量均达到51M 。PE91双末端测序得到的序列长度为90bp ，因此每个样品的测序总核苷酸数均大于4.6Gb ，与目前测序完成的雷蒙德氏棉基因组大小为775.2Mb [16]相比，深度达到6倍。表1中每个样品均符合Q20比例大于80%，N 比例小于0.5%，GC 比例在35%～65%之间的衡量指标，表明测序质量较好，可以进行下一步分析。
2.3Trinity 组装
鉴于棉花A t D t 异源四倍体的基因组测序尚未完成，我们采用短Reads 组装软件Trinity 拼接
得到98464个All-Unigene 。
组装序列长度是组装质量的一个评估标准。对组装出来的All-Unigene 做长度分布特征分析（图2）显示：All-Unigene 的长度均大于200bp ，长度为200～300bp 的Unigene 所占比例最大，约占50%；长度大于1000bp 的Unigene 比例达到32%。98464个All-Unigene 的总长度约为
88.2Mb ，平均长度为896bp ，N50长度为1397bp ，均比单一文库的值大很多，表明进一步拼接
的结果比较理想。
2.5NMGA-062与NMGA-105的10DPA 纤
维转录组比较分析
对NMGA-062与NMGA-105的10DPA 纤
维的转录组数据进行差异比较分析（图3），得到
1931个差异表达基因，其中，红色散点部分表示1536个上调基因，绿色散点部分表示395个下调
基因。
对1931个差异表达基因的GO 功能注释分类结果（图4）进行统计。细胞组分（Cellular com-
ponent ）、分子功能（Molecular function ）、生物学过
程（Biological process ）三大功能分类分别包含了
6、7和21个功能分类。在细胞组分分组中，差异
表达基因在细胞（Cell ）、细胞组分（Cell part ）类型所占比例最高，分别为35.2%、30.8%；膜封闭腔（Membrane-enclosed lumen ）含量最低，仅有25个
Unigene 。在分子功能分组中，结合（Binding ）、催
化活性（Catalytic activity ）类型中差异表达基因所占比例最高，均为45.0%；受体活性（Receptor ac
2.4基因注释
利用公共数据库NR 、Swiss-Prot 和KEGG 等
对得到的98464个All-Unigene 进行Blast 比对（表2）结果显示，77.9%（76724个）的Unigene 有
功能注释。其中，71.2%的Unigene 与NR 蛋白数据库有同源比对信息，比对到同源序列比例最高的6个物种分别为葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿、毛果杨和陆地棉。
图2All-Unigene 的长度分布
Fig.2Distribution of All-Unigene length
192
3期图4NMGA-062与NMGA-105的10DPA 纤维中的差异表达基因GO 分类图Fig.4
GO annotation of DEGs in 10DPA fiber of NMGA-062and NMGA-105
tivity ）类型中仅有1个Unigene 。在生物学过程分
组中，细胞过程（Cellular process ）、代谢过程（Metabolic process ）所占比例分别为21.5%、
19.6%。差异表达基因的GO 功能显著性富集结
果显示，在分子功能分组中，脂质转移活性（Lipid
transfer activity ）是显著富集的类型，说明2个材
料10DPA 的纤维中的差异表达基因行使的主要分子功能是脂质转移活性。
图3
NMGA-062与NMGA-105的10DPA 纤维中的基因差异表达
Fig.3Differentially expressed gene （DEG ）in 10DPA fiber of NMGA-062and NMGA-105
FDR ≤0.001AND ∣log 2Ratio ∣≥1
Up-regulated genes Not DEGs
Down-regulated
6543210-1-2-3-4-4
-3-2-10123456
Log 10NMGA-062FPKM
L o g 10N M G A -062F P K M
李锡花等：棉花纤维发育早期RNA-Seq 转录组分析193
棉花学报25卷
图5GhABP 、GhLTP 3的实时荧光定量RCR 检测结果
Table 5Expression of GhABP and GhLTP 3in different stages of cotton fiber in NMGA-062and NMGA-105
挑取2个差异表达基因通过QRT-PCR 分析其在不同纤维发育时期（0、3、5、7、10、15、20、25
DPA ）的表达情况。图5表明，GhABP 在纤维发育
起始期、伸长期和次生壁合成时期均表达，表达量从0DPA 逐渐升高，在NMGA-062中15DPA
时表达量最高，在NMGA-105中10DPA 时表达量最高，之后表达量逐渐下降。GhLTP 3在纤维发育不同时期的表达量逐渐升高然后降低，10DPA 时达到最高点，15DPA 之后逐渐下降。
结合990个（51.3%）差异表达基因的KEGG 功能注释结果，进行Pathway 显著性富集分析。共得到9条显著富集的Pathway ，包括胞吞作用、醚脂代谢、甘油磷脂代谢、代谢途径、囊泡运输中的SNARE 相互作用、氧化磷酸化、苯丙烷合成、核糖体等代谢通路。其中醚脂代谢和甘油磷脂代谢是与脂类代谢相关的Pathway ，这与差异表达基因显著性富集在脂质转移活性这一类GO 分子功能组是一致的。结果表明脂质相关的基因对
纤维伸长有重要作用。在胞吞作用与SNARE 相互作用通路中，存在许多突触融合蛋白（Syntax-
in ）、网格蛋白（Clathrin ）等与囊泡运输相关的差
异表达基因（表3）。Hovav 等[17]曾报道，Syntaxin 、
Clathrin 、Vesicle transport SNARE 在纤维发育时
期高调表达，推测其对于维持纤维伸长期细胞的迅速伸长起重要作用，但其作用机制并不清楚，有待进一步研究。
表3
Endocytosis 和SNARE interactions in vesicular transport 通路中上调表达的Unigene
Table 3Up-regulated expressed unigene in Endocytosis and SNARE interactions in vesicular transport pathway GeneID NMGA-062-10FP-KM NMGA-105-10FP-KM
log2(NMGA-062-10FPKM/NM
GA-105-10FPKM)FDR Nr-annotation CL6568.Contig2_All 2.52950.7497 1.7545 1.22E-04PREDICTED:ras-related protein
RHN1-like [Vitis vinifera ]
Unigene3706_All 1.87040.3043 2.6198 4.98E-16PREDICTED:clathrin interactor
EPSIN 1-like isoform 1[Vitis vinifera ]
CL3839.Contig1_All 1.46970.1601 3.1985 1.04E-04PREDICTED:vesicle-associated
membrane protein 714[Vitis vinifera ]
CL7012.Contig3_All
3.3925
0.7491
2.1791
1.21E-04PREDICTED:vesicle-associated
membrane protein 713[Vitis vinifera ]
2.87610.4351 2.72477.76E-05PREDICTED:syntaxin-121-like [Glycine max ]CL1009.Contig1_All Unigene33960_All 2.01660.6744 1.5802 1.17E-04syntaxin-121[Arabidopsis thaliana ]CL1248.Contig2_All
3.0086 1.1193 1.4265 2.53E-04syntaxin-132[Arabidopsis thaliana ]
CL7859.Contig2_All 3.7887 1.2037 1.6542 3.48E-05PREDICTED:syntaxin-61-like [Vitis vinifera ]Unigene13334_All 19.9169 6.8492 1.54 3.72E-22hairpin-inducing protein [C asuarina glauca ]Unigene22555_All 4.85240.2447 4.3096 3.11E-04PREDICTED:syntaxin-71[Vitis vinifera ]
194
3期
3讨论
与水稻、玉米等作物相比，棉花分子基础研究薄弱，遗传背景了解相对不足。近年来，基于Illumina测序平台的RNA-Seq转录组测序技术被广泛应用，为快速而高效地建立植物分子基础平台提供了便捷的途径。
棉纤维细胞的伸长是一个复杂的生理过程，受到许多基因的表达调控。纤维细胞分化的早晚直接影响胚珠上成熟纤维的长度。0～3DPA分化的胚珠表皮细胞形成具有重要经济价值的长绒纤维(Lint)，而4～10DPA分化的表皮细胞成为短绒(Fuzz)[18-19]，5～25DPA是纤维细胞伸长期，其中10DPA是纤维快速伸长期[20]，这些时期是影响纤维品质的关键时期[21]。因此选取0、3、10 DPA的胚珠进行测序，通过差异比较分析可能会筛选出影响纤维细胞起始分化和伸长发育相关的基因。本文主要侧重分析2个长度差异显著的棉花材料在纤维发育10DPA基因表达谱变化。2个材料10DPA纤维的差异表达基因中存在木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（Xyloglucanendotrans-glucosylase/hydrolase）、1,4-β-内葡聚糖酶、生长素结合蛋白（Auxin binding protein，ABP）、脂质转移蛋白（Lipid transfer protein，LTP）、脯氨酸富集蛋白（Propine rich ptotein）、微管蛋白（Tubulin）、蔗糖合酶（Sucrose synthase）、CDPK依赖的蛋白激酶（CDPK-related protein kinase）、水通道蛋白（Aquaporin PIP）、E6基因、脱水诱导的RD22蛋白（Dehydration-induced protein RD22-like pro-tein）、过氧化物酶（Class III peroxidase）、膜联蛋白（Annexin）、ACC氧化酶（ACC oxidase）等基因。大量差异表达基因可以为后续的纤维伸长相关基因的挖掘提供理论参考。
生长素结合蛋白（ABP）作为生长素的受体，在生长素信号转导过程中起着关键作用，烟草中过表达AtABP1基因会导致细胞变大[22]。前人利用消减文库和基因芯片技术筛选到棉花ABP基因，其在开花后10DPA表达量最高，比开花当天增长了59倍[23]。孙建波等克隆到GhABP1基因，并进行了序列分析[24]，但未见该基因在棉纤维中作用的相关报道。本文通过时空表达模式发现，在纤维发育0～25DPA时，GhABP的表达量表现出逐渐升高、然后降低的趋势，NMGA-062中该基因的表达量在每个时期均高于NMGA-105，其中在NMGA-062中10DPA时表达量最高，与前人的研究结果一致；在NMGA-105中15DPA 时表达量最高，并且10DPA时在2个材料中的表达量差异显著，推测它可能对棉纤维细胞的伸长发育有着重要的调控作用。
脂质转移蛋白（LTPs）是植物生命活动中一类重要的活性蛋白质，在体外能够可逆地结合和转运多种脂质分子。Ma等[25]克隆到GhLTP3、GhLTP6，两者的表达量在纤维快速伸长期达到最高水平，推测与棉纤维初生壁的增厚有关。随后Orford和Timmis[26]又分离到多个脂转移蛋白基因。这些LTP基因有的在棉花组织中都有表达，有的只在纤维发育早期高表达(6～14DPA)。本研究得到的GhLTP3在纤维较长材料NM GA-062各时期的表达量均高于较短材料NM GA-105，2个材料中均是10DPA表达量急剧升高，之后逐渐下降，与前人的研究结果一致。推测该基因是纤维伸长的正调控基因，其功能需要进一步验证。
本研究采用RNA-Seq测序技术对纤维发育起始及快速伸长期进行转录组测序，共获得Uni-gene98464个，其中在NMGA-062的0、3、10 DPA的胚珠或纤维中分别表达92840、94236、88899个Unigene，在NMGA-105的0、3、10DPA 的胚珠或纤维中分别表达95027、94906、86976个Unigene。98464个Unigene当中，77.9%的（76724个）得到功能注释，72712个能够预测到编码蛋白框。其中，从2个材料10DPA的纤维中筛选到2个与棉纤维伸长相关的差异表达基因GhABP和GhLTP3，推测对棉纤维伸长起到重要的调控作用。通过RNA-Seq测序技术的应用，初步建立了棉花纤维发育早期基因表达变化情况，阐明了表达基因的种类和数量，初步明确了部分基因的功能、GO分类及代谢通路，为进一步分析棉花纤维发育早期相关基因的表达模式，探讨差异表达基因与棉纤维的调控关系，揭示棉花纤维起始及伸长的基因调控机制，建立了良好的分子基础研究平台。
李锡花等：棉花纤维发育早期RNA-Seq转录组分析195
棉花学报25卷
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