不同分子量壳寡糖对高脂糖尿病大鼠的
果糖胺和血脂的影响
林强1*，王鑫1，2，葛喜珍1，桑帅1，高伟1
（1．北京联合大学生物化学工程学院，北京100023；
2．北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029）
摘要目的：探讨不同分子量壳寡糖对糖尿病大鼠的作用机制。方法：Wistar大鼠采用高脂高糖饮食同时腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型。将动物随机分为正常对照组、模型组、阳性对照和药物治疗组。给药两周后进行糖耐量试验。四周后处死大鼠取血清测定血糖、果糖胺和血脂各项指标。结果：与正常组比较，模型组血糖、果糖胺水平明显升高（P< 0.01），血脂各项指标明显变化（P< 0.01）。与模型组比较，治疗组各项指标有明显改善(P< 0.05, P< 0.01)，且这种作用具有剂量和分子量依赖性。结论：本模型大鼠血糖升高，并引起脂代谢紊乱，分子量1700的壳寡糖、大鼠日用剂量为140mg.kg-1适合高脂糖尿病患者，可降低血糖、调节血脂，起到保健作用。
关键词壳寡糖；糖尿病；血糖；血脂；果糖胺
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:
糖尿病(diabetesmellitus，DM)病情严重或应激时可发生多种急性代谢性紊乱,研究和开发防治糖尿病及其并发症的药物越来越受到人们的重视。壳聚糖(chitosan)是以虾、蟹、昆虫的外壳或真菌类藻类等细胞壁提取的甲壳素经脱乙酰化反应而得到的一种纯天然多糖类有机聚合物，是自然界中存在的唯一丰富的碱性多糖。研究发现，壳聚糖可降低胆固醇，具有抗肿瘤活性、免疫调节作用和调理肠胃的功能[1]。壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)是壳聚糖的降解产物，分子量小，溶于水，可被人体、动物及植物机体吸收利用，它不仅具有和壳聚糖相似的性质，而且一些生理活性或功能性质更加显著，如提高机体免疫力、抗肿瘤作用、调节血脂、作为促进双歧杆菌生长因子等，其降血糖作用国内外有相关报道[2]。但壳寡糖平均相对分子质量(Mr)在2000～10000之间，不同分子量和用药剂量的药理作用报道不一[3]。本研究拟探讨不同分子量壳寡糖的降糖作用机制，为壳寡糖开发成糖尿病易感人群或患者的保健食品或药品提供实验依据。
1 材料
1.1 实验动物
两月龄wistar清洁级雄性大鼠70只，体重150-200g，由军事科学动物中心提供。许可证号：SCXK-（军）2002-001。
1.2 实验仪器
TGL-16C低速离心机：上海安亭科学仪器厂；Thermo MK3型酶标仪：热电（上海）仪器有限公司；scoutⅡ半自动生化仪：德国scout公司；优越型血糖测试仪：德国罗氏公司；JA2003精密电子天平称：上海恒平科学仪器有限公司；HW.SY11-KD2C电热恒温水浴锅：北京长风仪器仪表公司。
基金项目：北京市教育委员会科技成果转化项目（注：无课题号）。
作者简介：林强（1964年4月-），男，博士研究生，研究方向为天然药物化学。
*通讯作者：林强，E-mail：linqiang@https://www.doczj.com/doc/745112256.html, tel：010-********, 139********
通信地址：北京朝阳区垡头西里三区18号北京联合大学生化学院制药工程研究所林强收邮编：100023
1.3 药物与试剂
链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：sigma公司，临用前以pH4.2的柠檬酸钠缓冲溶液溶解。胆固醇、胆酸钠：北京奥博星生物技术有限责任公司。分子量1700和3000壳寡糖：由本实验室自制。拜唐苹：中国北京拜耳医药保健有限公司。葡萄糖（Glu）、甘油三酯（TG）、高度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总胆固醇（TC）试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司。果糖胺（FMN）、游离脂肪酸（FFA）试剂盒：南京建成生物工程研究所。
2 方法
2.1 糖尿病大鼠模型的制备
两月龄wistar清洁级雄性大鼠70只，适应性喂养一周。随机选取10只为正常对照组，灌胃0.9%生理盐水，其余60只灌胃高脂乳剂饲料10ml.kg-1。四周后除正常组外，各组均腹腔注射STZ40mg.kg。3天后尾静脉取血测血糖，取空腹血糖大于7.8mmol.L-1的大鼠入选糖尿病模型。
高脂乳剂配方：200g猪油加热溶化，加入100g胆固醇，待溶化后加入20g 胆酸钠，300g蔗糖，充分搅匀后加入200ml吐温80，200ml丙二醇及适量蒸馏水，搅拌，待溶解后冷却至室温再加适量蒸馏水至1500ml并充分混匀，4℃封存，用时37℃水浴加热溶化。
2.2 分组处理
65只大鼠除正常组10只，其余大鼠随机分为5组：模型组、拜唐苹阳性对照组，1700壳寡糖高剂量组，1700壳寡糖低剂量组，3000壳寡糖组；正常对照组、模型对照组：按体重每日生理盐水灌胃(10ml.kg-1)；拜唐苹阳性对照组：按13.5mg.kg-1.d-1的剂量灌胃；1700壳寡糖组：分别按70mg.kg-1.d-1、140mg.kg-1.d-1灌胃。3000壳寡糖组按70mg.kg-1.d-1灌胃，连续给药四周。各组大鼠均自由进食饮水。
2.3 指标检测
2.3.1一般状态观察
观察各组大鼠的一般状况、采食、饮水量等。
2.3.2糖耐量测定
给药两周后禁食12h，大鼠灌胃葡萄糖3g.kg，测定0h、0.5h、1h、2h的血糖值，计算曲线下面积。曲线下面积=0.5×0h血糖+0.5h血糖+1.5×1h血糖+2h 血糖[4]。
2.3.3 血清指标测定
大鼠给药四周后，禁食12h用水合氯醛麻醉，心脏取血。分离血清，-70℃保存备测。葡萄糖测定采用葡萄糖氧化酶法；总胆固醇、甘油三酯采用酶比色法；高密度脂蛋白胆固醇采用清除法；果糖胺采用比色法；游离脂肪酸采用酶法；以上指标测定均严格按照试剂盒说明操作。
2.4 统计学处理
所有的数据用SPSS13.0 软件进行统计分析，所得数据用x±s表示，组间差异采用t检验。
3 结果
3.1 一般状态观察
注射STZ后72h，DM大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食,脱毛、消瘦、活动减少等。拜唐苹组和1700壳寡糖对DM大鼠的一般状态都有明显的改善，可显著改善大鼠体重减轻、多饮、多食等症状，高剂量组症状改善明显。3000壳寡
糖组在一定程度上改善糖尿病大鼠体重减轻、多饮、多食等症状，但效果不明显。
3.2 壳寡糖对DM大鼠糖耐量的影响
模型组与正常组比较，0小时、0.5小时、1小时、2小时血糖和曲线下面积明显升高（p<0.01），治疗组与模型组相比，均有不同程度降低，拜糖平组和1700壳寡糖高剂量组的血糖水平、曲线下面积与模型组相比明显降低，在空腹和2h 时血糖水平、曲线下面积差异有显著性（p<0.01），但仍高于正常组。1700低剂量组和3000壳寡糖组与模型组相比曲线下面积(AUC)略有降低，但无显著性差异（p>0.05）。见表1。
表1 壳寡糖对DM大鼠糖耐量的影响（x±s）
Table 1 Effct of COS on glucose tolerance in diabetic rats（x±s）
group n
glucose（mmol.L-1）
AUC 0h 0.5h 1h 2h
Normal
10 4.12±0.26 5.54±0.24 7.08±1.39 5.72±1.07 23.94±2.54
Model
10 21.26±7.52??33.19±5.47??29.44±8.09??21.56±4.57??109.54±21.80??
Acarbose
10 6.76±4.01**27.66±10.23 24.59±9.80 12.95±3.10**82.38±26.57** 1700 low
dose
15 10.37±3.95**30.89±8.30 26.11±11.16 19.50±6.62 94.74±31.46 1700 high
dose
12 6.99±2.37**27.85±8.88 24.39±6.66 14.74±6.56*82.67±20.58**
3000
COS8 14.45±8.31
*30.61±9.13 31.35±5.06 19.7±7.65 104.56±21.38 VS Normal p<0.05, p<0.01；VS Model p<0.05,p<0.01（as follows）
3.3 血清指标的测定
3.3.1 壳寡糖对DM大鼠血糖、果糖胺的影响
与正常组相比，模型组血糖和果糖胺水平明显升高（p<0.01）。与模型组相比，各治疗组果糖胺水平均显著降低（p<0.01），1700壳寡糖高剂量组血糖水平明显降低（p<0.01），1700壳寡糖低剂量组、3000壳寡糖组血糖水平与模型组相比也有明显降低（p<0.05）。各治疗组与给药前相比，血糖水平均显著降低（p<0.01）。见表2。
表2 壳寡糖对DM 大鼠血糖、果糖胺的影响（mmol.L-1，x±s）
-1
3.3.2 壳寡糖对DM大鼠血脂的影响
模型组与正常组相比，总胆固醇、甘油三酯明显升高，高密度脂蛋白胆固醇明显降低（p<0.01）。1700高、低剂量组与模型组相比各指标都有显著性差异（p<0.01，p<0.05）。3000壳寡糖组总胆固醇比模型组明显降低（p<0.05），甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇与模型组相比无显著性差异（p>0.05）。见表3。
表3 壳寡糖对DM大鼠血脂的影响（mmol.L-1, x±s）Table 3 Effct of COS on serum lipoprotein in diabetic rats（mmol.l，x±s）
Group
TC TG HDL FAA
Normal
1.45±0.54 0.46±0.28
2.08±0.29 0.34±0.24
Model
3.61±1.67? 2.95±0.36??0.54±0.14?? 1.31±0.85??
Acarbose
2.01±0.59*0.97±0.80** 1.40±0.32*0.36±0.3**
1700 low dose
1.69±0.35** 1.56±0.54** 1.34±0.35**0.57±0.26**
1700 high dose
1.48±0.48**0.81±0.70** 1.01±0.16** 1.16±0.35*
3000 COS
1.92±0.34* 1.00±0.35 1.14±0.56 1.3±0.66
4 讨论
本实验在高脂高糖饮食基础上腹腔注射STZ复制大鼠DM模型，模型大鼠血糖、果糖胺水平升高，血脂含量也明显变化，说明高脂糖尿病模型造模成功。在模型基础上灌胃治疗，各治疗组血糖水平明显降低。其中1700壳寡糖高剂量组（140mg.kg-1）降血糖效果最明显，低剂量组（70mg.kg-1）降糖效果次之。从分子量分析3000壳寡糖组血糖降低与同剂量1700组无明显差异。说明壳寡糖具有一定的降血糖作用，而且这种作用具有剂量依赖性。提示临床应用壳寡糖降糖时应注意使用剂量，大鼠的日用剂量为140mg.kg-1时降糖效果最明显，本研究选用的两种分子量壳寡糖在降糖方面无明显差异。
壳寡糖治疗四周后空腹血糖有下降趋势，高剂量组糖耐量显著改善，各给药组果糖胺水平明显降低。果糖胺又称糖化血清蛋白，它是血清中的各种蛋白质与葡萄糖发生缓慢非酶促反应的产物，而血清中占70%左右的白蛋白代谢较稳定，半衰期为19d，故血清中果糖胺的含量能够反映前2-3周的血糖平均水平，且不受饮食、药物及血糖波动的干扰，是评估降糖方案中期血糖水平的客观依据[5]。本研究中各组间果糖胺的差异且呈现剂量效应关系，进一步证明了壳寡糖的降糖作用及剂量关系。
2型糖尿病发生血脂代谢发生紊乱的原因可能是一方面体内胰岛素分泌不足，而直接导致血脂代谢紊乱，而另一方面可能是血糖浓度过高，机体不能分解利用，过度合成血脂提供能量，使患者食量增加，机体内血脂增加[6]。近年来游离脂肪酸作为脂毒性的重要标志，其意义越来越引人关注。高游离脂肪酸血症是脂肪组织（主要是内脏脂肪）胰岛素抵抗后大量分解的后果，而一旦游离脂肪酸浓度升高，过多的游离脂肪酸可通过多种途径导致胰岛素抵抗的发生[7]。由表3可看出1700壳寡糖两个剂量组的游离脂肪酸与模型组相比都具有显著性差异，且具有剂量效应。本研究壳寡糖不仅能改善糖尿病大鼠的一般状况，增加体重，而且还能显著降低DM大鼠的TC、TG、FFA含量，显著升高HDL-C含量，证明壳寡糖在降低血糖的同时能改善脂代谢紊乱。本研究中在降脂方面3000壳寡糖组作用不显著。1700壳寡糖组两种剂量降血脂效果与模型组相比都有显著性差异。提示壳寡糖降血脂作用与其分子量和结构有关。
本研究提示壳寡糖作为药用或保健食品，分子量1700、日用剂量140mg.kg-1适合高脂糖尿病大鼠，能起到降低血糖、调节血脂的作用。
参考文献：
[1] Miura T, Usami M, etal. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of chitosan in normal and neonatal streptozotocin induce diabetic mice[J]. Biological and pharmaceutical bulletin, 1995, 18(11): 16-23.
[2]尤行宏，吴勇，彭圆，等. 低分子壳聚糖对糖尿病大鼠血糖、血脂含量的影响[J]. 中国老年学杂志，2005，25：541-543.
[3] 乔新惠,李邦良,宋岚.甲壳低聚糖对NOD小鼠降血糖作用观察[J].南华大学学报(医学版)，2003，31(3)：260-261，271.
[4]郑铁生，王亚娜，宗爱萍. 龙虾壳聚糖干预后糖尿病小鼠血糖和糖耐量的变化[J].中国临床康复，2006，10（31）：67-69.
[5]肖洪广，黄泽红，刘汉欣，等. 糖化血红蛋白、果糖胺与葡萄糖水平在2型糖尿病诊治中的应用[J]. 现代临床医学生物工程学杂志，2005，11（2）：140-142.
[6] 黄金水，刘利东，薛声能. 2型糖尿病患者血脂和糖化蛋白检测的临床意义[J].广州医药，2006，37（5）期：54-56.
[7] 李全民，张素华，任伟，等. 高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠模型游离脂肪酸和胰岛素敏感性的变化[J]. 中国临床康复，2006，10（8）：52-54.
Influence of different molecular chitooligosaccharides on fructosamine and serum
lipoprotein level in diabetic rats
Lin qiang1*,Wang xin1.2, Ge xizhen1, Sang shuai1, Gao wei1
(1. Biochemical Engineering College of Beijing Union University, beijing 100023, China; 2. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical
Technology, beijing 100029, China)
Abstract Objective: To investigate the influence of different low molecular chitooligosaccharides in diabetic rats. Methods: Diabetic model was induced by injecting with streptozotocin (STZ) and the rats were treated with high fat and sugar diet for four weeks. Rats were randomly divided into four groups: normal group, model group, positive control group and different chitooligosaccharides treatment group. Rats were treated with chitooligosaccharides for two weeks, the glucose tolerance were tested. Blood sample was taken out from rats at the end of the experiments after 24 hours’ fasting for determination of the blood glucose,
fructosamine and serum lipoprotein. Results: Comparing with the normal group, the blood glucose, fructosamine and serum lipoprotein were obviously different (P<0.01). The above mentioned index was improved (P<0.05～0.01) at the end of the experiments. And the effect was determined by dosage and molecular. Conclusions: The best molecular of chitooligosaccharides was 1700, and the dosage was 140mg.kg-1.d-1 in this diabetic model.
Key words Chitooligosaccharides; Diabetes mellitus; Blood glucose; Serum lipoprotein; Fructosamine