在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。
基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d 光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小
苗，按编号移栽入土。
将双T载体p13HSR转化脆茎稻，共获得96株转基因苗（T0代）。PCR检测表明其中41株既含潮霉素抗性基因又含目的基因，42株只有潮霉素抗性基因没有目的基因，4株有目的基因没有潮霉素抗性基因，9株目的基因和潮霉素抗性基因都没有。双T-DNA区表达载体p13HSR在水稻中的共转化频率为42.7％。没有选择标记的13株（13.5％）T0代转基因苗，是逃过抗生素的抑制幸存下来的，从技术上和理论上都无法控制其出现频率，即使含有目的基因也没有实际操作价值。所以我们在实验中挑选了目的基因和选择标记都有的T0代植株进行后续的花培纯合实验。
从先期获得的6株T0植株中，检测出5株同时含选择标记基因和目的基因。将这些植株按单株进行花药培养，共获得花培苗233株，其中189株二倍体，7株四倍体，37株单倍体。二倍体植株的PCR检测结果表明，有68株既含潮霉素又含目的基因，24株只有潮霉素没有目的基因，74株目的基因和潮霉素都没有，23株有目的基因没有潮霉素。无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的总得率为9.87％，这些植株生长正常，株高、分蘖、穗长、单穗粒数等参数和对照相仿（资料未显示）。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录（图2，3）。以上结果表明，将遗传转化技术与花药培养相结合，快速获得了纯合的，同时含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因但不含潮霉素抗性基因的二倍体转基因水稻（图4）。
2.3 DHT0代群体中选择标记基因和目的基因的分离
5株T0转基因株分别进行花药培养，获得5个DHT0代群体。对群体中的二倍体植株进行了目的基因（为方便计，记作G)与选择标记基因（S）的PCR检测。结果表明5个株系中都有S+G+，S+G-，S-G+和S-G-四种类型的植株。假定在农杆菌转化过程中，2个T-DNA分别独立插入到水稻基因组的不同源的染色体上，则其花培群体的分离比应为1：1：1：1。卡平方测定结果（表2）表明，1、3、5号群体的分离比符合预期假设，但2、4号群体的分离比与预期结果不符，而且S+G+和S-G的比例明显高于S+G-和S-G+，提示双T结构可能插入到同源染色体的同一染色单体上，并在减数分裂期间发生了遗传交换。由于花药培养获得的DH群体直接反映了交换事件，因此2、4号群体的交换频率分别为18.0％和28.6％。
2.4 双T-DNA区三价表达载体在转化过程中部分目的基因的丢失
在对T0代和DHT0代进行选择标基因及目的基因检测的过程中，发现处于同一T-DNA区不同启动子启动的三个目的基因，在转基因植株中的出现频率也不是完全一致的。T0代的45株目的基因阳性株系PCR检测结果表明有1株包含hLF无SB401和RZ10，1株无hLF有SB401和RZ10。RT-PCR结果显示：DHT0代的91株中有6株有hLF无SB401和RZ10，3株无hLF有SB401和RZ10（图5）。
植物转基因对改良植物品质、增加抗性、提高产量等方面，都具有明显作用。尽管WHO（1991）
和FDA（1994）已经声明，食物中的标记基因本身并无安全性问题，但是从转基因作物的食用和环境安全性考虑，人们对抗性基因是否有向其他生物转移的可能性仍有诸多疑虑(Widmer等1996，1997；Kohli等1999)。此外，就育种方法而言，转基因品种中标记基因的存在，对它再次进行转基因聚合育种也带来一定困难（Yoder and Goldsbrough 1994）。因此，转基因植物标记基因的剔除，是转基因育种的一个重要内容。本研究表明利用双T载体转化水稻，再通过花药培养技术即可快速获得有目的基因却不含选择标记的转基因株系，有效消除选择标记基因的安全隐患，大大加快了研究成果的应用速度。在本研究中，无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的得率为9.87％。于恒秀等（2005）用双T-DNA双元载体转化水稻，T0代共转化阳性的转基因植株自交后得到T1代植株中无选择标记基因而有目的基因AP1的比例介于25%-33%之间。张秀春等（2006）利用双T载体获得的无选择标记的转基因大豆，T1代无选择标记基因而有目的基因的比例为18.75%，用同样的方法，Zhou等（2003）报告T1代的无选择标记基因而有目的基因的比例为19.5%。由于这些T1代的目的基因存在纯合与杂合两种情况（比例约为1：2），因此虽然纯合基因型的比例与本实验基本一致，但还需要继续加代和检测才能获得纯合的植株。而将双T载体转化与花药培养相结合的方法，仅一代就可获得纯合目的植株，大大加快了研究进度。
双T载体转化水稻在T0代有五种插入可能：1.选择标记区（简称S区）和目的基因区（简称G区）仍然相连，或者虽不相连，但插入在同一染色体的同一染色单体上；2. S区和G区分离，分别插在同一染色体的两个姐妹染色单体上；3.S区和G区分离，并分别插在不同的染色体上；4.S区发生T-DNA插入事件，G区被丢掉；5. G区发生T-DNA插入事件，S区被丢掉。选取S+G+的T0代进行花药培养，淘汰了后两种情况，前三种类型在花培的DHT0代植株中又会出现新的分离情况（如表3）。在已有的报道中，选择标记基因与目的基因的分离比数据所体现的均为表3中各种类型综合后的结果，无法明确双T载体的插入方式。而本实验中我们选取了选择标记和目的基因双阳性的T0代植株并按株系进行花药培养，虽然进行花药培养的单株不多，也检出了3个T-DNA结构插入不同染色体（1，3，和5号群体）和同一染色单体（2和4号群体）两种类型，表明通过对DHT0群体的检测，有可能分析双T-DNA结构在转基因中的行为，为转化后载体插入方式的理论研究奠定了基础。当然，个别DHT0群体的二倍体植株较少，可能影响生物统计的结论，因此今后开展同类研究需要保证一定的群体规模。
转化一、两个外源基因，往往不能满足育种上对多项农艺性状的要求，而多次转化又面临时间长，选择标记缺乏等难题，所以研究人员把多个外源基因一次性转入受体材料。Cao 等（2005）将多元载体pYP1203E转化水稻，该载体在同一T-DNA区包含选择标记基因（hpt），报告基因（GUS）以及另外的三个各自独立使用启动子，终止子的外源基因（VHb，tzs和EPSPS），在113株T0代转基因单株中发现有8株发生了一个或两个外源基因丢失的情况。
本研究45株目的基因阳性的T0代株系中也有2株出现了部分目的基因丢失，所以我们推测大片段的T-DNA区在转化过程中会发生不完整插入的现象。DHT0代91株中有9株目的基因片段不完整，说明较长的插入片段在后代遗传过程中有丢失其中一个表达盒的可能，由于基因转录必须具有完整的表达盒，所以RT-PCR结果显示的是hLF的缺失或是SB401和RZ10的缺失。载体p13HSR中，共用启动子的SB401和RZ10表达盒是否会出现丢失其中一个基因，另外一个正常表达的情况，我们的实验结果不能体现，这是因为，RZ10是一个水稻内源的高甲硫氨酸含量的基因，为了便于检测，我们用SB401的序列设计了RZ10的5’端引物，用RZ10的序列设计了3’端引物，所以SB401和RZ10在我们的检测结果中始终是连锁的。对这种可能性的研究需要构建其他特异的表达载体，转化受体材料后，进行分析。我们的研究提示在作物育种过程中引入太大的表达载体可能并不合适，为了将多个基因组合在一起，需要探索更加切实可行的方法。
中国是水稻生产大国，随着育种技术的不断进步，水稻产量大幅增加，但是在收获稻谷的同时也收获了稻草，以收获指数为0.5匡算，每年收割的稻草达2亿吨。面对如此巨量的副产物，农民没有相应的回收利用措施，只好田间焚烧，不仅严重污染环境，而且每到秋收季节，浓烟弥漫，机场被迫关闭，造成重大经济损失和不良社会影响；另一方面，我国南方大多数地区的畜牧饲料匮乏，需要依靠外地调入甚至是进口，而稻草虽然营养全面，却因纤维含量过高，不易被动物分解利用，只能付之一炬。本研究将乳铁蛋白、赖氨酸和甲硫氨酸导入水稻脆茎稻。期望通过转基因提高秸秆的营养价值，从根本上打破烧秸秆—污染环境—缺饲料的农业怪圈，促进农业的可持续发展。目前正在测定外源基因在转基因株系中的表达产物，数据将另行发表。
我国水稻抗虫性研究和应用进展 摘要综述了近年来我国水稻品种对白背飞虱、褐飞虱、二化螟、三化螟等重要害虫的抗虫性、抗性遗传及抗性育种等的研究，介绍了转基因抗虫水稻的研究进展。阐述了水稻抗虫性在害虫综合治理中的重要作用。 植物的抗虫性是指同一种植物在害虫为害较严重的情况下，其中某些植株能避免受害、耐害，虽受害而有补偿能力的特性…。根据植物对害虫的反应，其抗虫性可分为3种类型：①忌避性：指害虫不喜好在某些植物上产卵、栖息或取食的习性。②抗生性：指某些植物体内含有某种对害虫有害的化学物质，或缺少害虫必需的某些营养物质，或因植物体组织结构上的原因，导致害虫死亡率增高，繁殖率降低，生长发育受到抑制，成虫寿命缩短等。③耐害性：指植物虽受害但其本身具有很强的增殖或补偿能力，而不致显著影响产量。这几种抗性机制常互相交错，难于截然划分。 水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全世界约有50％人口以稻米为主食，在我国水稻的产量可占全国粮食总产量的44％。而水稻也是虫害最多的粮食作物，在我国田间为害水稻的昆虫种类在624种以上，但以稻螟、稻飞虱和稻纵卷叶螟发生面积广，为害严重，对水稻的高产和稳产威胁大，是我国各主要稻区的三大害虫。自20世纪60年代菲律宾国际水稻所开始正式进行对稻螟虫抗性的研究以来，对水稻抗虫性的研究和利用发展迅速。近十几年来，各地在已有的基础上进一步开展了对水稻品种抗性鉴定、抗性机制、抗性遗传、抗性育种等方面的研究。 1水稻的抗虫性 水稻对昆虫的抗性是多形式、多方面的，可能是拒异性、抗生性或耐害性中的一种或共同作用的结果。抗虫稻株对稻飞虱的负作用表现为影响其对寄主的趋性、摄食、食物的消化、生长、成若虫的存活、产卵能力与卵孵化率等行为反应。在接虫24～48 h后稻飞虱成、若虫均对抗性品种表现出趋避性。褐飞虱在抗虫品种上的若虫存活率低、发育历期延长、虫体偏轻、羽化率低、种群增长指数小等。褐飞虱在感虫品种上排泄的蜜露是抗虫品种上的3～10倍，食物的同化率较高，飞虱的体重增加，飞虱在抗感品种稻株上的取食量均随秧龄的增加而降低。水稻抗二化螟和三化螟鉴定初步认为叶鞘细胞的硅化程度与水稻对螟虫的抗性有很大的关系。水稻抗稻纵卷叶螟的抗性鉴定、抗性机制等方面的研究表明，野生稻抗稻纵卷叶螟的抗性机制是叶片狭长、质地为革质、主脉较粗、刚直平坦，幼虫无法将叶片纵卷。 稻株受飞虱侵害后表现出某些防御性的生理反应，其光合速率和叶绿素含量均下降、稻株受害后保护酶活性和游离氨基酸成分发生变化。许跃等对稻株内游离氨基酸含量进行分析，认为抗虫品种丙氨酸的含量比感虫品种的低，故认为丙氨酸可能具有刺激白背飞虱产卵的作用。抗性稻株可能具有某些挥发性次生物质和非挥发性次生物质。挥发性次生物质则主要影响昆虫对寄主的趋性反应，非挥
水稻转基因实验操作方法步骤 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中； 2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周 （2周愈伤组织更为松散）。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）
水稻(Oryza sativa)是世界主要的粮食作物之一，全球半数以上的人口以稻米为主食。在我国水稻是最重要的粮食作物，播种面积和总产量均占粮食作物首位。水稻虫害是影响产量提高的主要限制因素，不仅会造成水稻减产，而且也使品质下降。水稻螟虫(二化螟、三化螟)和稻纵卷叶螟等是水稻的主要害虫，世界各地稻区均有发生，特别是近年来，二化螟等蛀茎害虫的发生逐年加重，对水 收稿日期：2010-10-02 基金项目：农业部转基因专项(2008ZX08001-001) 作者简介：于志晶(1982-)，女，硕士，主要从事植物分子生物学、遗传转化与代谢工程研究。 通讯作者：林秀峰，女，硕士，研究员，E-mail：linxiufeng8581@ https://www.doczj.com/doc/7d4956990.html, 马瑞，男，博士，研究员，E-mail：ruimaa@https://www.doczj.com/doc/7d4956990.html, 稻生产造成严重威胁。全球每年因螟虫造成的产量损失达1000万t。在我国水稻螟虫发生面较广、危害性大且损失严重。据统计，我国仅二化螟和三化螟年发生危害面积就达1500万hm2以上，防治约3800万hm2，防治代价50亿元左右，残虫造成经济损失约64.5亿元，总经济损失达115亿元左右。长期以来，化学农药的使用对减轻虫害的危害，提高水稻的产量起到了重要的作用。然而，长期大量施用化学农药不但增加生产成本，对环境造成了严重的污染，且生态平衡受到了严重的破坏，同时，许多害虫也产生了抗药性。 通过遗传改良提高水稻的抗虫性是解决这一农业问题的最经济、最有效的途径之一，因此，提高水稻的抗虫能力是水稻育种工作急需解决的关键问题。然而由于现有抗虫水稻种质资源极为匮 文章编号：1003-8701(2010)06-0016-05 水稻抗虫转基因研究进展 于志晶，张文娟，李淑芳，金峰学，林秀峰*，马瑞* (吉林省农业科学院生物技术研究中心，长春130033) 摘要：水稻虫害是影响产量提高的主要限制因素，常常造成水稻减产，品质下降。半个多世纪以来，化学农药的使用对减少水稻虫害起到了重要的作用。然而，长期大量施用化学农药造成严重的环境污染，破坏生态平衡，同时，许多害虫也产生了抗药性。利用基因工程培育抗虫水稻品种是解决这一问题的有效途径。经过近20多年的发展，国内外水稻抗虫基因工程已经取得了很大的进展。本文就抗虫基因的克隆、水稻遗传转化等方面的最新研究进展进行了综述。 关键词：水稻；抗虫基因；基因工程 中图分类号：S511文献标识码：A Advances in Studies on Insect Resistant Transgenic Rice YU Zhi-jing,ZHANG Wen-juan,LI Shu-fang,JIN Feng-xue,LIN Xiu-feng,MA Rui (Biotechnology Research Center,Academy of Agricultural Sciences of Jilin Province, Changchun130033,China) Abstract:Rice pest,which often resulting in grain losses and the quality decline,is the main limiting factor for rice yield.During the last fifty years chemical pesticides have played an important role in rice pest control.However,large quantities of chemical pesticides utilization in long term caused serious environmental pollution,destruction of ecological balance,while many insects have developed resistance.Genetic engineering is an effective alternative to solve the problem.In recent twenty years great progress has been made in genetic engineering of rice for insect resistant.In this paper the progress in cloning of insect resistant genes and genetic transformation in rice were reviewed. Keywords:Rice;Insect resistant gene;Genetic engineering 吉林农业科学2010,35（6）：16-20Journal of Jilin Agricultural Sciences
农杆菌介导的转化 一．试剂 1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-5898 2 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-0753 3 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-0640 4 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-5148 5 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-8407 6 Kanamycin USB Cat No. 17924 7 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-7290 8 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-010 9 Cn (Carbenicillin) 国产分装 10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-0765 11 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-8666 12 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-3902 13 Inositol Sigma Cat No. I-3011 14 Phytagel Sigma Cat No. P-8169 15 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-5879 16 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-3783 17 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG 二．溶液 1.MS max NH4NO316.5g KNO319.0g KH2PO4 1.7g MgSO4?7H2O 3.7g CaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g 逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。 2.MS min母液(100×) KI 0.083g H3BO30.62g MnSO4?4H2O 2.23g 或MnSO4? H2O 1.69g ZnSO4?7H2O 0.86g Na2MoO4? 2H2O 0.025g CuSO4? 5H2O 0.0025g CoCl2? 6H2O 0.0025g 注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。 加dH2O定容到1000ml室温保存。 3.N6max母液(10×)
【转基因水稻讲义】转基因抗虫水稻 前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。 概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt 汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。1998年起，美国批准Ventra Bioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。 我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。 首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。 技术比较成熟的有以下四种水稻： 1、抗虫转基因水稻 2、抗除草剂转基因水稻
3、抗花粉过敏转基因水稻 4、金稻 技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。 表格 接下来介绍转基因水稻的工艺流程。 我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步： 1、切（获取目的基因） 2、接（构建基因表达载体） 3、转（将目的基因导入受体细胞） 4、增（扩增DNA重组分子） 5、检（目的基因的检测与表达产物的测定） 每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。 第一步获取目的基因主要有三种方法，分别是鸟枪法（即直接分离目的基因）、人工合成法和从文库中获取。 鸟枪法： cDNA法：将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用反转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆，这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基本原理。
试评价转基因抗虫水稻生态安全性 1转基因抗虫水稻的安全性 现代科学在创造社会文明时给人类带来了不可预知的风险，转抗虫基因植物可能带来的安全性问题已成为焦点，转基因作物是能够自行转移和繁殖的生命活体，转基因水稻的安全首先表现在食品上。目前我国有一半以上的人口以稻米为主食。转基因抗虫水稻的环境安全性主要包括对非靶标生物的影响，对天敌的影响和对稻田节肢动物群落的影响。 害虫对转基因水稻的抗性风险。自二次世界大战以后，生长全周期的调查结果显示，人类与害虫斗争的历史与人类历史一样悠久。人们在不断的探索中开始施用化学农药，这种方法在很长时间对害虫防治的状况取得明显成效。但随着时间的推移和自然的变化规律，有好多种昆虫和螨类对化学农药产生了抗性，与此同时，我们也看到化学农药给环境和人类健康造成的 不良影响，这使生物防治受到人们广泛的重视，如Bt 的生物杀虫剂，由于其专一性强，并且我们也看到它对环境无害，同时也表现出对人、畜安全，因此在好多国家和地区进行了推广和应用。随着科学技术的飞速发展，基因工程技术有了长足的进步，许多植物成功地转入了Bt 毒蛋白基因，对谷物起到了很好的防虫效果；而昆虫对Bt 杀虫剂同样由于适者生存的原因产生了抗性，这种单一的杀虫毒素持续高水平表达单一的杀虫毒蛋白，使害 虫加速对Bt
的抗性进化。 现在植物生物技术的发展硕果累累，我们所能看到的转基因作物商品化的历史还比较少，转基因水稻具有极大的发展前景，它能够为粮食安全保障提供全新的途径。目前，随着社会化水平的提高，其商品化生产的瓶颈在于生物安全评估，我们的研究结 果对转基因水稻的生态环境是否存在负效应还没有确定，现在，随着我国对转基因水稻生物安全研究正在不断加大力度，因水稻在其生物安全 使转基性方面能够有利于人类生存与发展。 2转基因水稻对水稻害虫室内抗性评价 2.1试验材料 为转基因抗虫水稻历汕优63，还有感虫对照水稻TNl 等，有严格安全隔离和控制措施的田间试验圃，试验用虫包括水稻螟虫、稻纵卷叶螟、褐飞虱，每份材料分8 行种植40 株，在室内用感虫品种TNl 植株饲养、扩繁，备用。按常规栽培技术进行田间管理，选择性农药扑虱灵防治稻飞虱。 2.2试验方法 2.2.1二化螟在受检转基因抗虫水稻植株选叶3-4 片，以 每粒种子长成的植株作为一个株系，剪取中间约6cm的一段，每份受检材料随机抽取20 个株系进行鉴定，放于小试管中，每株系重复测定3 次。每管接虫10-11 头后用棉球塞紧管口，依据 20 个株系的平均值判断。 2.2.2稻纵卷叶螟取分蘖期的倒l 叶，每培养皿接入一龄 稻纵卷叶螟幼虫10-11 头，每份供试材料随机鉴定20 个株系，在水中剪成6cm长的叶段，接在上、下两层叶片之间。每株系重复3 次，试验环境温度27 度左右。每层3-4 片叶段，叶片平行放置，各株系及每份受检材料的总体抗性按级别进行评价。 2.2.3大螟采用水稻离体叶鞘法进行，供试水稻材料植株去外层黄叶后，分别在分蘖期、齐穗期2 个不同生育期选取新鲜叶鞘2-3 片，
水稻转化方法 水稻转化(来自文献https://www.doczj.com/doc/7d4956990.html,/content/nt36q44450563406/fulltext.pdf) For rice transformation, mature rice seeds were de-husked and sterilised with 3% sodium hypochlorite (30 min). The seeds were thoroughly washed three times with sterile distilled water and transferred onto MS basal medium (Murashige and Skoog1962) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolyte, 2 mg/l 2,4-dichlorphenoxy acidic acid (2,4-D) and 30 g sucrose, for 1 week. The freshly induced calli were dipped in Agrobacterium tumefaciens (AGL1 strain) and transferred onto NB medium (N6 macro-elements, B5 micro-elements) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolysate, and 30 g sucrose. After co-cultivation with Agrobacterium (no dim light, 28℃, 2 days), the calli were transferred onto NB medium containing 2 mg/l 2,4-D, 120 mg/l G418, and 500 mg/l Cefotaxime. The resistant calli were subcultured on fresh plates at 2-week intervals for 4 weeks, and then transferred onto MS medium containing 0.2 mg/l anaphthalene acetic acid (NAA), 3 mg/l 6-benzylaminopurine (6-BA) and 150 mg/l G418 until shoots regenerated. Shoots were transferred onto 1/2 MS medium containing 0.5 mg/l NAA for rooting and further growth. The transgenic plants were grown inthe field or at 28℃ under a 16/8 h light/dark cycle in the greenhouse. 配置1升诱导培养基： 1.水解酪蛋白300 mg/L 2.谷氨酰胺500 mg/L 3.脯氨酸500 mg/L 4.肌醇100 mg/L 5.蔗糖30g/L
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。 水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。 基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d 光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小
水稻转基因 一、实验目的 1.学习水稻组织培养的方法 2.学习水稻转基因的方法 二、实验原理 目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。 历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。 三、试验步骤： 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；
2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周） 一、农杆菌培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。 二、共培养和抗性愈伤组织的选择 1．感菌与共培养： 1）取培养好的菌液500μl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01； 2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟； 3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 4）将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2.5天。 2．选择： 1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；
根癌农杆菌介导的转化方法 将水稻成熟种子去壳。仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次； 将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化； 农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。 新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。 农杆菌介导转化水稻所用培养基 -1-1 626 蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8 N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素 2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖， pH7.0 AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖， 100-400μmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2 N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400μmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2
水稻转基因实验操作 一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织） 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗； 2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在 原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱) 二、预培养 将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升) 三、农杆菌（工程菌）培养 把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。 在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600 四、感菌与共培养 1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次； 2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；
前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。 概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。1998年起，美国批准Ventra Bioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。 我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。 首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。 技术比较成熟的有以下四种水稻： 1、抗虫转基因水稻 2、抗除草剂转基因水稻 3、抗花粉过敏转基因水稻 4、金稻 技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。 表格 接下来介绍转基因水稻的工艺流程。 我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步： 1、切（获取目的基因） 2、接（构建基因表达载体） 3、转（将目的基因导入受体细胞） 4、增（扩增DNA重组分子） 5、检（目的基因的检测与表达产物的测定） 每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。 第一步获取目的基因主要有三种方法，分别是鸟枪法（即直接分离目的基因）、人工合成法和从文库中获取。 鸟枪法：
水稻转基因实验操作 （谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理） （2006.7） 一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织） 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱) 二、农杆菌（工程菌）培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100μl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为 0.8-1.0。 三、感菌与共培养 1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。 用含200μmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。 2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。 3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。28℃（组培室）暗培养2.5天。 四、愈伤组织的抗生素筛选 将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。再用含500mg/L羧苄青霉素（Car）的无菌水浸泡30min-1h。最后置于无菌滤纸上沥干2h。 1）第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素（Car）和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，光照培养箱（30℃，24h光照）中培养14天。 2）将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素（Car）和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，30℃，光照培养10天，然后转移到组培室中培养4天。 3）将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素（Car）和80mg/L潮霉素的培养基上进行第三轮选择，组培室中（28℃，16h光/8h暗）培养21天。 五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根 挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中，用封口膜封好，
转基因技术与水稻生产分析报告 水稻在全球的重要意义 1. 近5年来，全球的水稻种植面积基本维持稳定，但水稻的产量较20世纪90年代提 高了12%。由此可以看出，水稻产量的增加是生产水平提高的主要原因。 2. 亚洲是全球主要的水稻生产和消费地区。（例如，亚洲消耗了全球88%的水稻） 3. 全球水稻的交易量只占其生产总量的6%，其中四分之三为籼稻品种。水稻贸易量占 其产量的份额远远低于其他主要谷物（例如，全球13%的玉米产量和22%的小麦产量用于贸易）。 4. 绝大部分的水稻被人类直接食用（88%），这与其他谷类作物形成了对比。72%的小麦 以及少量的大麦和玉米被用来做成食品。大麦和玉米主要用于动物饲料，而这也是小麦的重要用途之一。相比较而言，被用作饲料的水稻仅占3%。 5. 现在的水稻价格处于历史最低水平，近10年已近下降了30%至40%。 水稻生物技术的发展 6. 水稻生物技术领域活跃着众多的公立和私营机构参与者。在16家主要机构中，有5 家跨国生物技术公司，6家专业的生物技术公司，其余为国际和国家机构或组织。 7. 对于5家主要的跨国生物技术公司，水稻一直是它们的研究重点。然而近几年来， 水稻已经下降为二等甚至三等作物（就监管审批和商业开发的优先重点而言）。这很大程度上反映出人们已经认识到水稻的获利空间有限，投资很难获得合理回报。 即便如此，商业组织和国际/国家机构目前仍大量投资水稻基因组测序，这使得水稻成为所有谷类作物中在基因方面被人类了解最多的作物，因此正成为谷类作物研究的模板。此外，在过去的10年里，主要水稻生产国投入了大量公共资金和公共团体提供大力支持用于相关实验室的建设，以便更好地利用现代水稻遗传转化和基因表达方法。 公立与私立机构在开发水稻生物技术上的合作也取得了稳步进展。“金色大米倡议”和“金色大米人道主义委员会”的成立就是典型的例子。 8. 成功实现生物技术的商业化应用，需要种质资源、育种能力和种子繁育三方面的共 同作用。孟山都公司和安万特公司在一些主要的水稻生产国都具备相关的能力。国际水稻研究所依托其在亚洲、非洲和南美洲建立的完善网络成为了先进育种技术、种质资源以及品种的主要来源。除此之外，一些重要的国家（政府资助的）众多育种项目（如印度、中国、越南、马来西亚）都拥有专有种质资源，且可以获得国际水稻研究所的资源。