动物医学进展~Z004~Z5(3D:43-46
Progress in Veterinary Medicine
猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻诊断方法研究进展
黄海龙~胡桂学~陶淑霞
(吉林农业大学动物科学技术学院~吉林长春130118D
中图分类号:S855.3;S858.Z8文献标识码:A文章编号:1007-5038(Z004D03-0043-04
摘要:猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻均是由冠状病毒引起的以仔猪发生呕吐~腹泻和脱水为特征的两种传染病,目前~对这两种传染病的诊断方法主要有病毒中和试验~免疫荧光法~免疫电镜法~ELISA法和RT-PCR法,随着分子生物学的不断发展~ELISA法和RT-PCR法以其敏感性高~特异性强越来越受到人们的重视,文章就各种诊断方法近年来的研究进展进行了综述~并简明地指出了研究中存在的问题以及未来展望~可为这两种传染病诊断方法的进一步研究提供一些新的思路,
关键词:猪传染性胃肠炎;猪流行性腹泻;诊断; ELISA;RT-PCR
猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis~TGE D是由套式病毒目冠状病毒科~冠状病毒属(国际病毒分类委员会第7次分类报告~Z000年D的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV D引起的以猪呕吐~腹泻~脱水为特征的传染病~对新生仔猪具有高度致死率(通常100 D的传染病,虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感~但5周龄以上猪的死亡率则很低, 1 45年~ Doyle在美国首次报道发生了本病,从那时起~世界上许多国家都相继报道发生了本病 1 ,我国1 56年在广东省首次发生了本病~此后全国多数省份也先后有本病发生的报道~给养猪业带来严重危害Z,
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhoea~PED D 是由套式病毒目冠状病毒科~冠状病毒属(国际病毒分类委员会第7次分类报告~Z000年D的猪流行性腹泻病毒(PEDV D引起的一种猪肠道传染病~以水泻~呕吐和脱水为特征,各种年龄的猪均易感~哺乳仔猪~架子猪或育肥猪的发病率可达100 ~尤其哺乳仔猪受害最严重,本病主要发生在冬季~夏季也可发生,Z0世纪70年代初首先发现于英国和比利时,自1 71年以来许多国家均有PED流行的报道~如比利时~德国~加拿大~法国~日本等国~我国从Z0世纪80年代初开始陆续有本病的流行,
1 73年先后在我国上海~辽宁~吉林~黑龙江~四川等地分离到TGE和PED病毒,目前~已成为重要的猪病毒性腹泻病之一 3 ,多年来~包括我国在内的许多国家为了预防和控制TGE和PED~曾投入了一定的人力~物力和财力~但迄今为止这两种疾病仍在世界上许多国家存在~且PED可与TGE混合感染~二者在流行病学~临床症状~剖检变化上非常相似~给临床诊断带来一定困难,近年来随着分子生物学技术的发展~TGE与PED的研究取得了较大进展,本文仅就TGE和PED 诊断方法近年来的应用与研究进展综述如下,
收稿日期:Z003-08-Z1
作者简介:黄海龙(1 73-D~男~吉林省长春人~硕士研究生~主要从事动物病毒学研究xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
,
Har1s and Detecting methods of chlora1phenicol residue
WU Xiao-feng1~YANG Lu-hua Z
(1.Kunshan entry-e:z t1ns pec t zo n an c@uarant z n e B ur e au of th e People s Rep u blzc of C h z na~Kunshan~z an g su~Z15Z00~C h z na;
Z.Dz s e as e P r eze nt zo n an c Co ntr ol Ce nt e r of Kunshan~Kunshan~z an g su~Z15300~C h z na D
Ab stract:Chloramphenicol(CAP D is a broad spectrum antibiotic that had e V er been W idely used at the therapeutic doses for treatment of infections in animal and humans~but se V eral years of clinical use has produced a significant amount of e V idence relati V e to the to X ic effects of Chloramphenicol on humans.There is a potential for misuse in animals because chloramphenicol is effecti V e in the animal therapy and lo W cost~ chloramphenicol residue may be present in the tissue of treated food producing animals thereby posing a heath ris k to consumers.In one hand~Chloramphenicol residue in food can help to promote the e V olution of bacteria
to become resistant to many antibiotics~in another hand~they can cause serious acute reactions~including aplastic anemia.Conse g uently~many countries in the W orld don t permit its use in food producing animals~and stipulate that the residues of chloramphenicol can t be detected in the food products of animal origin.There are many methods for detection of chloramphenicol~but different methods for separation and detection of chloramphenicol appear to ha V e different limit of detection.So the limit of detection of chloramphenicol becomes a global concern.this paper is focused on the harms and detecting methods of chloramphenicol residue
in the food products of animal origin.
K e y w ords:chloramphenicol residue;harm;method for detection
1TGE诊断方法
1.1病毒抗原检测
在小肠上皮细胞~肠内容物或粪便中检测TGEV 是诊断仔猪该病的简单和最常用的方法0免疫荧光法(IF)和免疫过氧化物酶技术都可应用,但前者较常用0若IF或免疫过氧化物酶试验呈阳性,并伴有腹泻症状,则几乎肯定为TGEV[1]0国外在小肠上皮细胞中检测TGE病毒抗原,采集病死猪小肠或腹泻早期将猪捕杀,取空肠和回肠粘膜涂片或将空肠和回肠制备冷冻切片进行直接或间接免疫荧光检测的方法已经建立,并得到广泛应用0但本方法必须在死后或扑杀后才能进行0我国哈尔滨兽医研究所研制成功了扁桃体采样器,采取猪只的扁桃体组织,做成冷冻切片,进行直接免疫荧光法检测TGE病毒抗原0本法是活体诊断,可以迅速做出判断0已广泛应用于疫病普查和口岸检疫,如对从比利时~香港~美国进口的猪作TGE诊断,均获得了良好的效果[Z]0另外,一种用抗TGEV高糖蛋白N的单克隆抗体免疫过氧化物酶技术来检测TGEV(小肠组织)的方法已建立,且TGEV的单克隆抗体已被用IF或免疫过氧化物酶试验中0用上述两种实验方法已在呼吸道组织和鼻腔上皮细胞中检测出TGEV0用抗TGEV单克隆或多克隆抗体双层夹心ELISA方法已被广泛应用于检测在细胞培养~粪便和肠内容物中的TGEV,是一种快速且适用于从活猪中取得大量样品的诊断方法[4-5]0 1.Z病毒的电镜检测
用电镜检测TGEV也是常用的诊断方法之一0通过电镜负染色法证明,在感染猪肠内容物和粪便中有TGEV0发病期间病毒存在于病猪的许多器官中,实验证实除脾脏外,其他器官均可检测到病毒,但是以空肠~十二指肠和肠系膜淋巴结中含毒量最高0通过电镜观察,病毒多分布在胞浆的空泡里和微绒毛间隙0在微绒毛间的病毒往往呈串球状排列0研究证明,免疫电镜(IEM)比常规EM技术更好,前者对检测临床样品或细胞培养物中的TGEV更敏感,并可提供病毒血清学鉴定0此外,用IEM更易区分TGEV和常见的膜类碎片,而且同时可检测其它肠道病毒的存在[6]0经IEM观察, TGEV与PEDV之间未见到免疫交叉反应0
1.3病毒的分离与鉴定
原代和次代猪肾细胞~猪肾传代细胞系~猪唾液腺原代细胞~猪甲状腺原代细胞以及MGClurkin ST传代细胞已成功地用来从被感染猪的粪便及肠道内容物中分离TGEV0初次分离野毒株可能没有明显的细胞病变(CPE),需连续传代才能出现明显的CPE0在ST或猪甲状腺细胞上的典型CPE由具有膨胀的~圆形或长形外观如气球的细胞组成0ST传代细胞已用于蚀斑或IF实验以检测TGEV野毒株,Kemeny(1978)0为提高病毒的分离率,在细胞培养液中加胰酶制剂或胰蛋白酶和使用较老的细胞可进一步提高ST细胞的敏感性, Bohl(1979)0PoGoGk和Garwes(1975)报道,在次代猪甲状腺细胞用弱酸性营养液时TGEV增殖滴度最高[1]0
1.4血清学诊断
TGEV抗体可通过数种不同的血清学方法检测,如间接荧光抗体试验~间接免疫过氧化物酶试验~放射
免疫沉淀试验~病毒中和试验(VN)等,最常用的是VN
试验0已经建立了间接荧光抗体试验方法,但敏感性和
可靠性不如VN试验0近年来研究发现,TGEV与猪呼
吸道冠状病毒(PRCV)有一定相关性,血清中和试验(SN)特异性不强,可能出现假阳性0但在大批量检测或对群体进行监测时,可先用SN试验进行筛选,对阳性
样品再用如阻断酶联免疫吸附试验(B-ELISA)等特异
性很强的试验进行鉴定,使TGE抗体检测更为准确~
快速0ELISA法较之以往的血清学方法具有敏感性高~特异性强的特点0王树成等[7]分别用血清中和试验(SN)和单克隆抗体(TGEmAb和TGE/PRCVmAb)阻断酶联免疫吸附试验(B-ELISA),对81头美国进口猪
血清做TGE抗体检测0SN试验检出7份阳性血清,检
出率为8.64%,B-ELISA试验检出7份PRCV抗体阳
性血清,检出率为8.64%,无TGE阳性0由此说明用SN试验检测TGE抗体,与PRCV抗体存在交叉反应,特异性不强,B-ELISA能特异性检测~鉴定TGE抗体,
并能区分TGE与PRCV感染0Carman S等[8]用B-ELISA鉴别诊断TGE和PRCV抗体也取得了良好的效果0张净等[9]用阻断ELISA和SN法对来自美国和
中国的196份猪血清检测TGEV抗体,结果表明上述
两种方法的检测结果存在显著差异0这些TGEV-SN
阳性的血清(1Z1头份)在用阻断ELISA检测PRCV抗
体时有57头呈现阳性反应,这与Callebaut等(1989)的
试验结果相一致,说明用SN法检测TGEV抗体时出
现假阳性是由于PRCV与TGEV之间能呈完全中和
交叉反应所致0随着分子生物学的发展,重组抗原用于TGE血清学诊断的方法已有报道0周仲芳等[1O]报道了采用杆状病毒表达系统生产的TGE病毒纤突蛋白(S
蛋白)建立了一种竞争ELISA检测猪TGE血清抗体,
获得了较为理想的特异性和准确性0之后又报道了采用
同样的重组抗原建立了一种间接ELISA用于TGE血
清抗体的检测,同时由于在结果判定中采用终点滴定技
术,使得检测结果的判定更直观和迅速0试验中,用间接ELISA对Z O头免疫小猪血清进行抗体检测,从第7天已经能检出阳性抗体(63.63%),对11份样品的检测中比血清中和试验(SN)(54.54%)多检出1份014<后两种方法的检出抗体阳性率均达到了1OO%0这个结果表明,用重组TGEV纤突蛋白建立的间接ELISA在TGE的抗体检测中是可以代替SN的0该间接ELISA 一般在4~5h就可以有结果,而微量SN可能需要1周以上的时间,因此前者更适合于TGE的早期快速诊断0同时,试验中用重组抗原包被的ELISA板在-Z O c保存15O<后,对TGE抗体的检测效果没有影响,证明TGEV重组纤突蛋白的稳定性0由于检测方法中使用的其他试剂是商品化的,从而稳定性也很高,这就为这种方法在较大范围的推广使用奠定了基础0
1.5病毒核酸检测
进年来,伴随着分子生物学的发展,检测TGE病
毒核酸的方法越来越受到人们的重视0已发展了用核酸
杂交探针技术来检测粪便样品,感染组织或感染细胞中
的TGEV基因序列[11]0用这些探针可区别不同的肠TGEV毒株0RT-PCR和非放射性标记物GDNA探针
44动物医学进展Z OO4年第Z5卷第3期(总第131期)
也已被用来区分TGEV和PR V(猪呼吸道冠状病毒)分离物[12]1997年,Woods和Paton等应用RT P R 技术检测TGEV,结果证实RT P R是一种特异~敏感的TGEV诊断方法[3 4]李军等[13]建立了检测TGEV 的RT P R方法用此RT P R方法检测56份猪腹泻粪样,同时用夹心ELISA法作对照结果显示,RT P R法检测的2O份阳性粪样,用夹心ELISA法检测有14份呈阳性,两者的符合率为89%试验结果表明, RT P R法可检出1pg的TGEV RNA,比夹心ELISA法敏感性更高说明RT P R方法可用于TGEV的诊断和流行病学调查Gradzki[14]报道了应用以氧化物标记的ODNA探针诊断TGEV,本方法适用于病猪粪便和细胞培养物的检测,可检测到3.5*7.O ng的TGEV RNA在韩国,hae,Kim O等[15]应用RT P R法对韩国的639个猪场进行了TGEV和PEDV的调查Kim O等[16]用多重RT P R法鉴别诊断TGE与PED,通过与其它方法的比较,得出RT P R法是目前鉴别诊断TGEV和PEDV最敏感~特异的方法
2PED诊断方法
2.1免疫电镜法
由于TGEV与PEDV同属冠状病毒,形状非常相似,在普通电镜下无法区别,为此需用免疫电镜法(IEM)IEM法既可用已知的PEDV高免血清检测未知抗原,又可用已知的PEDV抗原检测未知抗体王继科等[17]把抗原和抗体分别经1O OOO g离心~免疫复合物又经12OOO g离心~最后在电镜下直接观察到典型的病毒粒子形成的免疫复合物,建立了具有3次筛选作用的改良的IEM法,具有简便~直观~快速和定性正确等优点但由于需用电镜设备,不适合于大规模诊断和临床诊断
2.2免疫荧光法
用直接免疫荧光法(FAT)检测PEDV是可靠的特异性诊断方法,目前应用最为广泛崔现兰等[18]应用FAT检查病猪小肠的冷冻切片或小肠抹片,对PEDV 人工感染仔猪的检出率为91.4%,电镜观察阳性率为47.8%应用间接免疫荧光法(IFAT)对PED阳性猪血清的检出阳性率为89%林志雄等[19]用适应于Vero~ PK15等传代细胞株生长繁殖的PEDV G1株建立直接免疫荧光法用该方法检测来自有严重腹泻~呕吐和死亡的6个猪场155份仔猪肠粘膜样品,检出率为52% (81/155),并用血清中和试验检测该6个猪场的PED 抗体,证实被PEDV感染过同时,应用哈尔滨兽研所的荧光抗体方法比较,阳性符合率达95%(19/2O),阴性符合率9O%(9/1O)并不和猪传染性胃肠炎病毒~猪细小病毒~轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应证明该方法具有较高的准确性和特异性朱维正等[2O]用间接血凝试验与间接免疫荧光法(IFAT)比较后认为IFAT法更敏感
2.3微量血清中和试验
林志雄等[21]建立了PED微量中和试验,采用适应于传代细胞生长的PEDV G1株,以PK15作指示细胞,48小时判定研究证实本方法检验准确~可靠,具有较高的敏感性,可用于流行病学调查
2.4ELISA法
ELISA法最大的优点是可从粪便中直接检查PEDV抗原,目前应用也较为广泛朱维正等(1988)应用双抗体ELISA法从腹泻病猪粪便中直接检测PED 病毒抗原,其与电镜检查的阳性符合率为97.37%,阴性符合率为1OO%陈茹等[22]用分离纯化的PEDV抗原,建立斑点酶联免疫吸附试验(Dot ELISA)检测猪流行性腹泻(PED)抗体采用此方法分别对来自加拿大~台湾省进口的种猪和海南省~广东省种猪群的血清样共834份进行了检测,检测的抗体阳性率达21%用琼扩试验与Dot ELISA比较,阴性血清样品检测符合率为1OO%,而阳性血清样品检测符合率为31.8%,说明后者更敏感,且该试验重复性较好检测试剂在4C保存6O d以及室温保存3O d,其检测效果基本一致于强等[2]用PEDV吉株猪胎肠单层细胞培养物,以冻融法制备抗原,建立了间接ELISA法检测PED抗体的方法对3O份直接免疫荧光证实的PED病猪群血清测定,97%为阳性,并证实包被板在2O C可保存两个月Kim O等[23]建立了单克隆抗体基础上的免疫组化法,该方法可在福尔马林固定~石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出PEDV,可用于鉴别诊断TGEV与PEDV
2.5RT P R法
Ishikawa等[24]根据S基因序列设计了一对可扩增
目的片段854bp的引物,成功的建立了诊断PEDV的RT P R法,可进行细胞毒和粪便毒的检测,灵敏度可达1OO T ID
5O/mL,
并可在8h内测出Kubota等[25]根据N基因序列设计了一对可扩增目的片段54O bp的引物,成功地建立了诊断PEDV的RT P R法,可进行细胞毒和粪便毒的检测尽管此法敏感性和特异性都很好,但由于需要特殊的仪器设备,目前只适合于实验室诊断,不适合于临床诊断在韩国Kim O等[16]已建立了TGEV和PEDV的二联RT P R诊断方法,可同时检
测出1O T ID
5O/mL
的TGEV和PEDV Kim O等[26]对免疫组化~原位杂交~RT P R3种方法进行了比较,认为RT P R法检测结果的重复性最好但当被检样品为福尔马林固定时,采用免疫组化和原位杂交这两种方法更适合此外,Kim O等[27]还建立了鉴别TGEV 和PEDV的多重巢式RT P R法此方法适用于检测福尔马林固定的组织,以原位杂交法作对照,结果显示二者检出率完全一致国内乔宪凤等[28]以PEDV的膜蛋白(M)的RNA为模板,根据Durate等人发表的基因序列,设计3条位于PEDV膜蛋白(M)基因上的引物,进行RT P R反应,确立了RT P R最适反应条件,取得了预期的结果
3存在的问题与展望
综上所述,在TGE和PED的诊断方法中,近年来发展起来的ELISA法和RT P R法是目前研究的重点,尤其后者敏感性更高,特异性更强,尽管目前由于仪器设备的限制还不适合于临床诊断,但随着研究的不断深入,RT P R法具有广阔的应用前景在实际工作中,以往的诊断方法可与这些方法结合应用,互相借鉴,
54
黄海龙等,猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻诊断方法研究进展
取长补短,定会收到理想的效果,同时,TGE与PED诊断方法的进一步研究还可为其它冠状病毒病,如SARS,提供一些有益的借鉴,总之,建立对这两种传染病敏感~特异~快速~简便易用的诊断方法还有待进一步的研究,
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Research progress on diagnostic methods to porcine transmissible
gastroenteritis and porcine epidemic diarrhea
-UANG-ai-long,-U Gui-xue,TAO Shu-xia
(College o f anzma l Scz e nc e anc T e chn olog y,z l zn a g zc l t a l UnzU e szty,C han g ch n,z l zn,130118,C hzna)
A bstract:Transmissible gastroenteritis(TGE)and porcine epidemic diarrhea(PED)are tWo kinds of highly contagious diseases caused by tWo members of the Coronaviridae respectively,characterized in piglets primarily by vomiting and Watery diarrhoea and dehydration.At present,main diagnostic methods to TGE and PED are virus neutralization(VN),immunofluorescence(IF),immune electron microscopy(IEM),ELISA and RT-PCR. With the development of molecular biology,the diagnostic methods of ELISA and RT-PCR are becoming more important than before for their sensitivity and specialization.This article revieWed the progresses of diagnostic methods to TGE and PED in recent years,We also briefly discussed its problems at present and developments in future,and provided some neW ideas for further research on diagnostic methods to the tWo diseases.
K e y w ords:TGE;PED;Diagnosis;ELISA;RT-PCR
64动物医学进展2004年第25卷第3期(总第131期)
猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻诊断方法研究进展
作者：黄海龙， 胡桂学， 陶淑霞
作者单位：吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春,130118
刊名：
动物医学进展
英文刊名：PROGRESS IN VETERINARY MEDICINE
年，卷(期)：2004,25(3)
被引用次数：5次
参考文献(28条)
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11.Jung K;Kim J;Kim O Differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by multiplex RT-nested PCR and comparison with in situ hybridization[外文期刊] 2003(01)
12.Kim O;Chae C Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction,immunohistochemistry,and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs 2002(02)
13.Kubota S;Sasaki O;Okada N Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the nucleocapsid genes among strains of the virus 1999(07)
14.Ishikawa K;Sekiguchi H;Ogino T Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR[外文期刊] 1997
15.Kim O;Chae C;Kweon C H Monoclonal antibody-based immunohistochemical detection of porcine epidemic diarrhea virus antigen in formalin-fixed, paraffin-embedded intestinal tissues[外文期刊] 1999(05)
16.陈茹;罗琼;李树根间接法Dot-ELISA检测猪流行性腹泻抗体的研究[期刊论文]-中国兽医杂志 1997(08)
17.林志雄;李树根;李力复猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用 1994(11)
18.朱维正;郑瑞峰猪流行性腹泻血清学诊断法的研究 1990(01)
19.林志雄;黄引贤;李树根应用直接免疫荧光法检测猪流行性腹泻病毒的研究 1997
20.崔现兰;马思奇;王明应用免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的研究 1990(05)
21.王继科;刘长明;马思奇猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒的免疫电镜诊断的研究 1991(02)
22.Kim O;Choi C;Kim B Detection and differetiation of porcine diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus in clinical samples by multiplex RT-PCR 2000(22)
23.Chae C;Kim O;Choi C Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and TGEV infection in Korean pigs 2000(21)
24.Gradzki Z Application of cDNA probes for detecting and differentiating TGEV RNA 2001(08)
25.Vaughn E M;Halbur P G;Paul P S Use of nonradioactive cDNA probes to differentiate porcine respiratory coronavirus and transmissible gastroenteritis virus isolates[外文期刊] 1996
26.Benfield D A;Jackwood D J;Bae I Detectionoftransmissible gastroent-eritis virus using cDNA probes 1991
27.周仲芳;李力复;罗长保利用重组抗原建立间接酶联免疫吸附试验检测猪传染性胃肠炎血清抗体[期刊论文]-中国兽医杂志 2000(01)
28.斯特劳;阿莱尔;蒙加林猪病学 2000
引证文献(5条)
1.张雷猪传染性胃肠炎病毒的诊断研究进展[期刊论文]-现代畜牧兽医 2010(5)
2.王斌斌.廖章辉.何木荣.温黎俊规模化猪场病毒性腹泻的综合防控[期刊论文]-广东畜牧兽医科技 2010(5)
3.谭德展.谭晨猪传染性胃肠炎临床鉴别诊断及防治[期刊论文]-中国动物检疫 2009(5)
4.谭德展.谭晨猪传染性胃肠炎临床诊断及防治[期刊论文]-动物医学进展 2009(5)
5.方立.徐辉.陈伟杰.赵灵燕.倪柏锋.方维焕猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR鉴别诊断[期刊论文] -浙江农业学报 2006(2)
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