分类号：五号宋体字密级：五号宋体字
UDC：五号宋体字学校代码：11065
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血管内皮生长因子基因多态性与急性心肌梗死的相关性研究
摘要
目的：急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth faetor，VEGF)是对血管内皮细胞有高度特异性的有丝分裂原，高浓度的VEGF可有效促进血管内皮细胞生长、分化及迁移，诱导新生血管
形成，促进体内组织建立起丰富毛细血管网；并且可增加毛细血管后静脉和小静脉通透性，而且还与心肌梗死患者免疫功能低相关。VEGF基因具有高度多态性，目前至少发现了30多个单核昔酸多态性(SNP)位点。本研究通过检测入选的急性心肌梗死患者的VEG血清浓度、VEGF的SNPs、生化、血常规、尿常规等，进行如下分析：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析；2.血浆VEGF浓度与VEGF基因SNPs的关系；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性；4．LV- remodling 与VEGF浓度及多态性的相关性；5.心肌梗死面积分别与VEGF血清浓度及VEGF 的SNP的相关性。为急性心肌梗死的研究提供更多的临床数据参考。
方法：采用基于医院的病例一对照研究方法，将入选的患者分为急性心肌梗死患者组（研究组）和对照组，检测入选的急性心肌梗死患者的VEGF血清浓度、VEGF的SNPs、生化、血常规、尿常规；检测随访6月后的左室功能（左室重塑）；AMI发生6个月后再行如下检查：a．研究对象随访观测MACCE；b.行核素心肌显像测定心肌面积；c.行超声心动图测定左室重构。通过记录6个月内的心血管事件发生率。对比和研究以下数据：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析；2.血浆VEGF浓度与VEGF基因SNPs的关系；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性；4．LV-remodling与VEGF浓度及多态性的相关性；5.心肌梗死面积分别与VEGF血清浓度及VEGF的SNP的相关性。
结果：通过对比和研究以下数据：1．VEGF基因SNPs与AMI发病风险的关联分析，结果表明VEGF基因SNPs与急性心肌梗死正相关（r=0.312）；2.血浆VEGF 浓度与VEGF基因SNPs的关系成正相关(r=0.573)；3.VEGF血浆水平与MACCE发生率相关性分析表明，VEGF血浆水平、多态性与MACCE正相关（r=0.618）；4．LV- remodling与VEGF浓度及多态性正相关(r=0.187)；5.心肌梗死面积分别与VEGF 血清浓度及VEGF的SNP的相关性结果表明，心肌梗死面积与VEGF血清浓度成正相关（r=0.736），心肌梗死面积与VEGF的SNP成正相关（r=0.582）。
结论：血管内皮生长因子的检测数据与急性心肌梗死其他检测的数据相关性分析表明，各数据间均呈正相关，对急性心肌梗死的血管内皮生长因子的检测对急性心肌梗死的研究诊断具有重要意义。
关键词：血管内皮生长因子；急性心肌梗死；单核苷酸多态性；血管生成；易感性
Abstract
Objective：Acute myocardial infarction (acute myocardial infarction, AMI) coronary acute myocardial ischemia and hypoxia caused by persistent necrosis. After more than a clinically severe and persistent chest pain, rest and nitrates can not complete remission, accompanied by increased serum enzyme activity and sexual ECG changes, may be complicated by arrhythmias, shock or heart failure, and often life-threatening. Vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth faetor, VEGF) is a vascular endothelial cells have highly specific mitogen, a high concentration of VEGF can effectively promote vascular endothelial cell growth, differentiation and migration, induce angiogenesis, and promote the body organizations Since the rich capillary network; and after the increase permeability of capillaries and venules veins, but also associated with lower immune function in patients with myocardial infarction. VEGF gene is highly polymorphic, currently found at least more than 30 single-core Xi acid polymorphism (SNP) sites. In this study, serum concentrations of selected VEG detection of acute myocardial infarction, VEGF of SNPs, biochemistry, blood, urine, etc., make the following analysis: 1. VEGF gene SNPs associated with AMI risk analysis; 2 between plasma concentration of VEGF and VEGF gene SNPs in; 3.VEGF plasma levels correlated with the incidence of MACCE; 4. LV- remodling polymorphism and VEGF concentration and correlation; 5 infarct size, respectively, serum concentrations of VEGF and VEGF SNP correlation. Provide more clinical data reference for the study of acute myocardial infarction.
Methods：A case-control study of hospital-based approach, the patient will be enrolled into patients with acute myocardial infarction (study group) and the control group, the serum concentrations of VEGF selected patients with acute myocardial infarction, VEGF of SNPs, biochemistry, blood, urine; detection followed up for 6 months after left ventricular function (left ventricular remodeling); AMI occurred six months after check the following: a. Study follow-up observations MACCE;. B-line determination of cardiac radionuclide myocardial perfusion imaging area;. C echocardiography left ventricular remodeling. By recording the incidence of cardiovascular events within six months. Compare and study the following data: 1. VEGF gene SNPs associated with AMI risk analysis; 2 between plasma concentration of VEGF and VEGF gene SNPs in; 3.VEGF plasma levels correlated with the incidence of MACCE; 4. LV-remodling polymorphism and VEGF concentration and correlation; 5 infarct size, respectively, serum concentrations of VEGF and VEGF SNP correlation.
Results：By comparing and research the following data: 1. VEGF gene SNPs associated with the risk of AMI analysis showed that VEGF gene SNPs are associated with acute myocardial infarction (r = 0.312);. 2 plasma concentration of VEGF and VEGF gene SNPs in relation to a positive correlation (r = 0.573); 3.VEGF plasma levels and the incidence of MACCE correlation analysis showed that, VEGF plasma levels of polymorphism and MACCE positive correlation (r = 0.618); 4. LV- remodling positive correlation with VEGF concentration and polymorphism (r = 0.187);. 5 infarct size were serum concentrations of VEGF and VEGF SNP correlation results showed that the myocardial infarct size and serum VEGF concentrations were positively correlated (r = 0.736), myocardial infarct size and VEGF SNP positive correlation (r = 0.582).
Conclusions：Vascular endothelial growth factor correlation analysis of the data and testing data to other detection of acute myocardial infarction showed a positive correlation between the data, the detection of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction has important significance for the study of the diagnosis of acute myocardial infarction.
Key words: Vascular endothelial growth factor; acute myocardial infarction; single nucleotide polymorphism; angiogenesis; susceptibility
目录
引言 (1)
第一章研究对象与方法 (5)
1.1研究对象 (5)
1.2研究对象血标本收集及DNA提取 (6)
1.3 仪器与试剂 (8)
1.3.1实验仪器 (8)
1.3.2实验试剂 (9)
1.4 外周血白细胞DNA的提取 (10)
1.5 DNA纯度的测定 (10)
1.6 血标本的采集及DNA的提取 (19)
1.7 统计学分析方法 (22)
第二章实验结果 (24)
1 两组研究对象的一般特征 (24)
2 VEGF-460 T/C和- 1154G/A单核苷酸多态性分布与急性心肌梗死发病风险
相关性分析 (24)
3 PEDF基因各SNP位点等位基因频率的组间比较 (27)
4 eNOS基因SNP位点等位基因频率的组间比较 (29)
5 Ang-2基因SNP位点基因型及等位基因频率的组间比较 (30)
6 相关SNP与ROP的logistic分析 (31)
第三章讨论 (33)
1 VEGF基因SNP与ROP发病的关联分析 (33)
2.本实验中釆用的研究方法和策略的探讨 (43)
3 展望 (45)
结论 (56)
参考文献 (57)
综述 (1)
攻读学位期间的研究成果 (19)
致谢 (20)
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引言
急性心肌梗死（AMI）是临床上常见的急危重症，随着社会老龄化，现代生活节奏的加快，饮食习惯的改变以及社会、心理等因素的影响。我国AMI的发病率也呈现逐年升高的趋势。根据流行病学调查显示，AMI的发病率各地报道不一，地区之间有很大差异。据国外资料显示，北美和欧洲各国AMI的发病率如下[1]：美国（508/100 000），加拿大（605/100 000），芬兰（82/100 000），英国（823/100 000），法国（31/100 000），意大利（270/100 000），澳大利（22/100 000）和日木（101/100 000）。尽管是在同一国家的不同地区，AMl的发病率也呈现有较大差异：西班牙吉普斯夸省的数据调查结果显示，其发病率为313/10万[2]。英国伍斯特市对1975年-2005年AMI的总体发病率作统计所得，每10万人就有66人发病[3]；在澳大利亚，原住民的发病率为4030/10万，高于非原住民[4]。我国急性心肌梗死的发病率为45/10万-55/10万。从上述流行病学调查结果来看，发达国家AMI的发病明显高于我国。这种差异的出现可能与种族、气候、生活水平、生活习惯、饮食习惯等不同有关。在美国，每年有96 000例小于65岁的女性患者被诊断为AMI，占全部女性AMI患者的20‰，而在ST段抬高型急性心肌梗死（Stelevation myocardial infarction，STEMI）患者中，女性的平均发病年龄为76岁，男性62岁，非ST段抬高型急性心肌梗死（non-Stelevation myocardial infarction，NSTEMI）女性平均发病年龄为76岁，男性为70岁[5]。国内研究显示，AMI在中青年（＜60岁）的发病率逐渐增加[6]，北京阜外心血管病医院对近15年11859例AMI患者年龄演变趋势作研究发现，首发和再发病例中男性平均年龄随年度增加总体呈下降趋势，再发病例中女性平均年龄则总体上升，且高峰发病年龄段1997年-2008年稳定在65岁-74岁[7]。在哈尔滨，男性发病高峰期为41岁-70岁，女性41岁-50岁进入发病期，高峰期为51岁-70岁，天津医科大学第二医院对1961例AMI患者调查显示，患者年龄分布呈负偏态分布，年龄跨度为74岁，平均发病年龄63.31岁[8]。我国AMI的发病年龄有年轻化的趋势，这与我国中青年精神压力大、饱餐、酗酒、过度疲劳[9]、吸烟、运动不足、肥胖、盐敏感性、血脂异常[10]等危险因素关系密切与≥60岁老年人相比。美国一项调查发现在235257例NSTEMI和126172例，STEMI患者中分别有女性102081例，占43%和17236例占37%[5]。西班牙吉普斯夸省的一项研究中，<60岁的女性
AMI患者首次发作后28 d的生存率比男性高，但≥60岁各年龄段首发心肌梗死后5年生存率则相反[2]。国外另有报道，女性患者心肌梗死后3个月的死亡率高于男性11:5。在欧洲，OPTIMAAI跨国公司在7个西欧国家（丹麦、芬兰、德国、爱尔兰、挪威、瑞典和英国）发起一个调查试验显示，AMI女性患者患病平均年龄和医院死亡率均高于男性[11]。在欧洲，女性AMI发病高峰年龄为61岁~70岁，发病的平均年龄比男性晚10岁[12]。在我国，山东大学附属齐鲁医院研究发现，AMI女性患者在院死亡率比男性高出5%。在安徽AMI男性发病率明显高于女性；男性发病有年轻化趋势，发病年龄小于女性，但女性绝经后AMI 的患病例数明显升高[13]。在太原地区，AMl的男女发病比例接近3:1，年龄低于60岁者比例更高[14]。在天津市，男女患者的比例为2.03:1，但中数位年龄女性比男性大6岁，>60岁的女性患者构成比大于男性，部分年龄组绝对病例数甚至超过男性[8]。从流行病学资料中，我们发现60岁是AMI女性患者的年龄分水岭，60岁之前，男性的患病率远高于女性，一旦超过60岁，女性患病率和死亡率增幅大于男性，国内外研究其原因不尽相同，国外认为女性患者容易得急性高血压和缺少导管介入诊断[9]，女性患者接受溶栓治疗较少有关[11]；雌激素对心血管系统的保护作用，而老年患者绝经后卵巢合成和分泌雌激素的功能衰减，血中雌二醇水平明显降低[12, 15]。国内则认为，女性高血压、糖尿病、高脂血症的发病率，以及Killip，心功能分级均比男性高[11]，发病至入院时间、空腹血糖、严重心律失常和急性左心功能不全是预测女性急性心肌梗死患者近期死亡的独立预测因素[16]。瑞士心肌梗死注册中心研究显示，AMI再狭窄事件取决于距离上一次病发时间。但总体而言，尽管考虑其他不良因素，急性心肌梗死的再狭窄时间仍在不断下降[17]。在台湾有对银屑病患者跟踪随访5年的结果研究显示，银屑病可能会成为亚洲人AMI的独立危险因素[18]，美国以医疗系统为基础的队列研究显示，艾滋病患者的梗死率高于非感染艾滋病毒患者少[19]。由炎性细胞分泌的基质金属蛋白酶（matriXmctalloprotcinascs，MMPs）是降解细胞外基质的锌依赖性酶家族的成员[20]，其中MMP-1，MMP-3，MMP-8和MMP-9在动脉粥样硬化易损斑块的水平要比纤维斑块明显升高[21, 22]。炎症因子在冠心病的整个演变过程包括斑块的破裂都具有重要作用[23]，白介素-6（IL-6）更是被多番证实在急性冠脉综合征中有显著提高[24]。C反应蛋白（CRP），血浆脂蛋白-a（Lp-a）、同型半
肤氨酸（HCY）成为了AMI患者新危险因素的前三位[25]。陈连娣[26]对86例AMI 患者进行回顾性分析，发现高水平的CRP是急性心肌梗死的危险因素，该检测因子可以有效地评估AMI的发生率及临床治疗观察。陈红英等[27]对136例AMI 患者研究发现，AMI患者血浆Lp-a水平，与冠状动脉狭窄程度，梗死相关动脉（IRA）血流量、闭塞率及密切相关。据INTER-HEART研究显示，在我国，经过调整其他混杂因素，来源于工作、家庭以及经济的心理压力，泪丧的情绪，负性生活事件以及差强人意的生活环境都是增加急性心肌梗死的危险因素[28]。心理社会因素在AMI发生中的作用应予充分的重视，其中负性生活事件作为心理社会因素中较为客观的指标，预防负性生活事件的发生可减少l4.83%的AMI发生[25, 29]。
过去30年中，急性心肌梗死（AMI）病人的短期和长期病死率都有非常显著的降低，主要得益于药物治疗和介入治疗方案的不断完善。诸多随机临床试验证实，阿司匹林、β受体阻滞剂、溶栓治疗、他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和氯吡格雷等药物能够显著降低AMI病人的病死率或病残率，高危病人得益更多。另一方面，经皮冠状动脉介入治疗通过迅速开通闭塞的冠状动脉、挽救濒死心肌，进一步改善AMI病人的预后及生活质量。与介入治疗相比，强化的药物治疗方案不仅价格便宜，而且更容易推广实施。在我国，AMI 的介入治疗和药物治疗都远未达到最佳水平。冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是严重危害人类健康的常见病和多发病，是许多微效累加基因和环境因素共同作用产生的多基因复杂疾病，遗传因素在CHD发生中起着重要的作用。在基因组中，不同个体的DNA序列上的单个碱基的差异被称作单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）。SNPs 检测对于多基因疾病如冠心病的遗传易感性探讨起重要作用。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP 等位位点被称作单体型（haplotype）。在复杂性疾病研究中，由多个变异位点组合构成的单体型分析优于单个SNP的分析。少数的SNP是有功能性的变异:发生在基因调控区域能调控基因转录，发生在基因编码区则能影响蛋白质的功能。大多数不具有功能性的SNP则可以作为寻找致病基因的标志。因此在大规模的病
例对照关联研究中，当某些等位基因频率比正常人高时则可以提示这些SNPs可能与该疾病相关[30-32]。
总之，VEGF基因多态性几乎与全身各个系统都可能相关，是目前的研究热点和重点。分子靶向药物治疗已是当今急性心肌梗死综合治疗不可或缺的手段，VEGF基因多态性的检测有利于找到准确的靶向位点。尽管各国学者对VEGF基因多态性与急性心肌梗死的关系进行了大量深人的研究，但不容忽视的一个现实是:研究几乎是单中心、有明显的区域、国度以及种族的限制，基于此VEGF基因多态性的研究的结果无法全球共享，因此多中心、大样本量、跨区域、多种族的研究是很有必要的。
第一章研究对象与方法
1.1研究对象
选取2013年3月到2014年3月期间于青岛大学医学院附属医院心内科病房住院的急性心肌梗死患者，釆用病例对照研究。
心肌梗死组：Ml组患者630例，其中男469例、女161例，平均年龄（63.02±9.78）岁。均选自2005年7月至2012年8月入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，符合世界卫生组织关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，其中急性心肌梗死391例，陈旧性心肌梗死239例。
对照组：对照组600例，其中男429例，女171例，平均年龄（62.03±10.05）岁。选自同期因疑似冠心病入住青岛大学医学院附属第二医院心内科的住院患者，均无典型胸痛症状，经心电图、运动平板、心肌酵谱等排除冠心病诊断，所有入选者经冠脉造影证实其主要血管完全正常。
本研究所有受试者均排除了既往炎症相关疾病（包括哮喘、过敏史、关节炎、风湿性心脏病），癌症，慢性肝病，肾衰竭，辦膜性心脏病及其他心脏疾病。所有受试者均为中国青岛地区汉族人，个体之间无血缘关系。对照组与Ml组相比，年龄及性别构成差异均无统计学意义（P>0.05）。该研究在执行过程中严格符合赫尔辛基宣言并获得了医院的伦理委员会的批准。所有入选者均征得患者或其家属同意并签署知情同意书。
我们详细收集了所有研究对象的基本资料，主要包括年龄、性别、身高、体重、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟史、高血压史、糖尿病史，以及血浆总胆固醇（total cholesterol，TC）水平、甘油三醋（triglyceride，TG）水平、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C）水平、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平。体重指数（BMI）=体重（kg）/ 身高（m2）吸烟史定义为：正在吸烟或既往有吸烟史，吸烟指数（吸烟时间，年X每天吸烟量，支）大于100。高血压诊断标准为:静息时收缩压（systolic blood pressure，SBP）大于140mmHg，或者舒张压（diastolic blood pressure，DBP）大于90minHg，和/或在行降血压治疗。糖尿病的诊断标准为：空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）大于7.8mmol/L和/或在行降血糖治疗。
1.2研究对象血标本收集及DNA提取
1.2.1 样品的收集管理
向每位研究对象收集血液（抗凝血）有形成分约4ml。从白细胞中提取DNA，完成相关基因型的鉴定。为保障课题样本釆集器械的安全质量，要求抽血时使用统一购置塑胶抗凝真空管（2ml，EDTAK3，标准紫色橡皮密封盖）;采血管上标明患者编号、姓名和病历号;采il前仔细核对研究对象编号和负压釆血真空管编号一致，确认空腹情况（确认是否饮食、饮食品种、数量和时间）。
1.2.2 DNA提取步骤（适用于10ml全血）
1. 登记血样及白细胞保留情况，有问题及时反馈。
2. 估计血样总量为4ml，加入全血血样3倍体积1×的红细胞裂解液至50ml 离心管，贴好标签。
3. 用一次性吸管将血样全部吸取至50ml离心管中，并用少量红细胞裂解液清洗取血管2次，清洗液移入50ml离心管，注意样本标签和50ml离心管标签的一一对应，翻转混合多次，直至溶液由混油变澄清。
4. 3500g离心15分钟。（如果离心不彻底可以酌情增加转速或时间）
5. 小心取出离心管，将上清液（为破坏后的RBC碎片）缓慢倒入废液叙，将剩余沉淀充分震荡。
6. 用微量移液器向样品中加入浓度为20ug/ml蛋白酶K 32ul，白细胞裂解液5ml，充分震荡150秒混句至完全液化。
7. 充分混合后，置37℃水浴中孵化30~60分钟。
8. 从水浴锅中取出后，将样本放到-20℃冰箱中冷却5min至室温。
9. 拿出后，加入蛋白沉淀液（-20℃保存）2ml，高速震荡20秒至褐色沉淀出现。
10. 3500rpm离心10min。
11. 离心后，将上清液移至装有5ml异丙醇的管中，注意标签的一一对应，充分轻柔摇混至白色絮状物出现。
12. 3500rpm离心10分钟。
13. 离心后，倾出异丙醇及其他溶液，将离心管倒置在滤纸上大约10-15分钟至挥发干净。
14. 向其中加入75%酒精（-20℃保存）清洗DNA及脱盐，3500rpm离心10min。
15. 离心后倾出酒精，倒置于新滤纸上干燥15分钟。
16. 加入DNA储存液0.8ml，放置室温过夜。
17. 第二天测定DNA纯度与浓度并做记录，分装DNA保存于4°C或更低温度。
1.2.3 聚合酶链反应(PCR)扩增
各基因型检测的PCR引物序列已在之前的文献中详细介绍。引物在生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR扩增包含CCL5 rs 2107538位点，反应总体积为25ul，其中20μM的引物各lμl，Taq DNA聚合酶0.1μl，dNTP2μl，MgCh DNA模板Iμl，l0×PCR buffer 2.5μl补水至25μl。反应条件：95℃预变性2分钟，95℃变性40秒，50℃退火40秒，72℃延伸40秒，1个循环。95℃变性40秒，50℃退火40秒，72℃延伸40秒，34个循环。72℃延伸5分钟，保存于4℃。
PCR增包含CCL2rs024611位点，反应总体积为30μl，其中20μM的引物各1μl，TaqDNA聚合酵0.1ul，dNTP2ul，MgCl21.5μl，DNA模板Iμl，lOxPCRbuffer3III补水至30til。反应条件：95℃预变性5分钟，94℃变性40秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，1个循环。94°C变性40秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，29个循环，72°C延伸10分钟，保存于4°C。PCR扩增包含rs333位点，反应总体积为25μl，其中20nM的引物各Iμl，TaqDNA聚合酶dNTP2μ1，MgCb1.5μ1，DNA模板Iμl，补水至25μ1。反应条件:95°C预变性2分钟，95℃变性20秒，62℃退火60秒，72°C延伸30秒，1个循环。95℃变性20秒，62℃退火60秒，72t:延伸30秒，31个循环。72°C延伸5分钟，保存于4°C。CCR5基因扩增的产物直接用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定分析，凝胶显像仪下观察、记录、拍照。电泳过程使用TaKaRa公司的DL500DNAMarker。其由50bp、500bp的DNA片段组成，第一条带的DNA片段长度为50bp，在50bp、200bp之间的每个DNA片段间相差50bp，在200bp~500bp 之间的每个DNA片段间相差100bp。整个Marker梯度句称清晰。当纯合突变发
生32个碱基缺失时，则出现一个190 bp的片段。在本研究中所有受试者中均未发现CCR 532突变基因型。
PCR扩增包含CCR2 rsl 799864位点，反应总体积为25μl，其中20μM的引物各TaqDNA聚合0.1μl，MgCI2 1.5μl，DNA模板1μl，10×PCR buffer 2.5μl补氷至25μl。反应条件：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，57.3℃退火30秒，72℃延伸30秒，1个循环。94℃变性30秒，57.3℃退火30秒，72℃延伸30秒，34个循环，72℃延伸5分钟，保存于4℃。
琼脂糖凝胶的配置：在称量好琼脂糖粉末中加入适量的TAE缓冲液，微波炉加热煮满两次并摇匀，稍微冷却后以0.1μl/ml的浓度加入Gel Red染料，均匀倒入制胶架中，赶走气泡，待30分钟后凝胶凝固；将PCR扩增产物在此凝胶中跑胶，电压控制在100-120V，约40分钟后在Gel Doc 2000凝胶成像系统上观察实验结果。
1.3 仪器与试剂
1.3.1实验仪器
（1）常用的一般实验器材（北京百泰克生物技术有限公司）
（2）微量加样器（2.5 Hi、10 Hi、20 Hi、100 uU 500 n 1、1000wl）（德国Eppendorf）（3）-80°C超低温冰箱（美国Thermo Forma）
（4）-2℃冰箱（青岛海尔公司）
（5）漩祸混合器（上海医科大学仪器厂）
（6）BACKMAN离心机（德国）
（7）Sigma3kl5离心机（德国）
（8）Sigina3k30离心机（德国）
（9）电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司DK-8D型）
（10）DU800核酸蛋白分析仪（德国Beckman DU800）
（11）超纯水系统（siMPLicnr）
（12）定量 PCR 仪（Applied Biosystemsl2720, USA）
（13）Midea微波炉
（14）Bio-rad maxi电泳槽（北京六一仪器厂）
（15）DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）
（16）UVP凝胶成像分析系统（北京赛宝奥科技有限公司）（17）202- ZA型电热恒温烤箱（上海阳光实验仪器公司）（18）MDF- U50V- 86e低温冰箱（日本三洋公司）
（19）PeR扩增仪Mastereycler5333（德国Eppendorf公司）（20）DYY-HIZ稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）（21）医用微波炉（上海中达医学应用研究所）
（22）Eppendorf Research移液器（德国Eppendorf公司）（23）DYY-III 28 A型电泳槽（北京六一仪器厂）
（24）凝胶成像分析仪Alphalanger 2200（美国Anlai公司）（25）SW-CJ- 2FD型净化工作台（苏州安泰空气技术公司）（26）离心机LXJ- 64- 01（北京医疗仪器修理厂）
（27）台式离心机PQ- 1600A（上海培清科技有限公司）（28）电子天平PB3O22- S（瑞士Mettler公司）
1.3.2实验试剂
（1）Triton- X100 （Sigma）（2）三经甲基氨基烷(Tris) （Sigma）（3）乙二胺(EDTA) （Sigma）（4）十二烷基磺酸钠(SDs) （Sigma）（5）蛋白酶K （Merck，Germany）（6）10 mmol/L dNTPs （赛百盛生物有限公司）（7）琼脂糖（Sigma）（8）溴化己锭（Sigma）（9）100 bp DNA ladder （赛百盛生物有限公司）（10）Taq- DNA聚合酶（赛百盛生物有限公司）
限制性内切酶：(Mnll，Bshl236x)
（11）Mnll （生工生物工程有限公司）（12）Bshl236I （生工生物工程有限公司）（13）引物合成（赛百盛生物有限公司）
1.4 外周血白细胞DNA的提取
采集每位研究个体的静脉血5ml，经构椽酸钠抗凝，置4℃冰箱保存，并于采血后1周内提取外周血白细胞DNA。
DNA提取采用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法。具方法：外周血5ml加冷蒸馏水至50ml，2500rpm室温离心10min，弃上清。重复2~3次至红细胞完全裂解。加入预冷的0.1% Triton-X 10045ml用以上方法再次离心去上清，并洗涤1~2次。于沉淀中加入3ml DNA提取液，充分混匀，悬浮白细胞，加10% SDS 150μl （终浓度0.5%）剧烈振荡至无凝块。加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml（1mg/ml 约400ul），混匀，37℃消化过夜。然后，加入5mol/L的NaCl 1.2ml，剧烈振荡15s，2500rpm室温离心15min。将上清倒入另一离心管中，弃沉淀。上清液中加入100%乙醇8ml，颠倒混匀，挑出DNA至高压灭菌的Eppendorf管中，以70%乙醇洗涤1~2次，倒置Eppendorf管井使乙醇挥发干净。以200μl TE溶解DNA，4℃至少放置24h，彻底溶解后经电泳或测OD值定量。
1.5 DNA纯度的测定
紫外分光光度仪测量260nm和280nm两个波长处的吸光度，通过计算A260/280来检测各个样本DNA浓度和纯度。将各个样本DNA浓度调整一致，-20℃保存待用。
1.5.1 各基因SNP位点及引物
釆取候选基因策略，参考相关文献，选取候选基因及SNP位点，釆用PrimerPremier5.0软件，结合引物设计原则设计各多态性位点引物。
1.5.2 SNPs基因分型:
大部分的SNP基因分型由上海邃志生物技术公司使用美国西昆诺姆公司(Sequenom，Inc.)的MassARRAY实验平台提供检测服务，该平台主要是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的核心技术。通过PCR扩增，SAP酶处理，延伸引物弟碱基延伸，树脂除盐纯化，芯片点样，质谱检测等实验步骤，最终使用Typer4.0软件分析实验数据，获得基因分型结果。(1)原理:将念有目标SNP的DNA序列进行PCR扩增后，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10-9S)强激光激发，由于基质分
子经福射后能吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight，TOF)由检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。
1.5.3 PCR反应
I.根据已抽提样品编制384孔反应表,注明每孔对应的DNA样品的编号和所用引物。II.按表在384孔板各孔中分别加入luLDNA模板,贴膜,2000 rpm / 10秒离心后备用。III.按下表配制PCR反应液:(以样本为例)
表 1 PCR反应液配方
Table 1 PCR reaction liquid formula
试剂名称 1 rxn(μL) 384 rxn(μL)
H2O 0.95 380
PCR Buffer(10×, 含15mM MgCl2) 0.625 250
MgCl2 (25mM) 0.325 130
dNTP(2.5 mM each) 1 400
引物使用液 1 400
Hotstar Taq(5U/μL) 0.1 40
终体积 4 1600
注:以上384孔反应液有4%过量。
IV.取一排12联管,每孔加入配置好的PCR反应液133μL,短暂离心后备用。
V.用10ul排枪取12联管中PCR反应液4ul,加入已有luLDNA的384孔板中,使各孔终体积为5ul。(注意枪头不要碰到384孔板中的DNA样品,如果碰到需调换枪头)
VI.将装有5ul反应液的384孔板短暂离心后放入PCR仪,运行名为“PCR"的反应程序。
VII. PCR反应程序结束后,将384孔板短暂离心后备用,可在4°C保存。
③SAP处理I.配制SAP反应液按以下表次序配制SAP反应液(以样本为例)
表 2 SAP反应液配方
Table 2 SAP reaction liquid formula
试剂名称 1 rxn(μL) 384 rxn(μL)
H2O 1.53 612
SAP Buffer(10×) 0.17 68
SAP酶(1U/μL ) 0.3 120
终体积 2 800
注:以上384孔反应液有4%过量。
II.取一排12联管,将SAP反应液以每孔66μL分装,短暂离心后,用lOul排枪分装于384孔PCR反应板,每孔加2μL,封膜、离心。
IIL将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中,运行名为"SAP”的反应程序。SAP程序:37℃,40min→85℃, 5min→4℃, forever
IV.反应结束,将384孔板取出短暂离心备用。
④延伸反应
I.配制iPlex反应试剂
表3 iPlex反应液配方
Table 3 iPlex reaction liquid formula
试剂名称 1 rxn(μL) 384 rxn(μL)
H2O 0.755 302
iPlex Buffer(10×) 0.2 80
iplex Termination mix 0.2 80
引物使用液0.804 321.6
iPlex enzyme 0.041 16.4
终体积 2 800
注:以上384孔反应液有4%过量。
II. 取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μL分装，短暂离心后，用10uL 排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2hL，封膜、离心。
III.将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序。
IV.反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。
⑤.产物纯化I.取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。II.将反应结束的384孔板lOOOrpm离心Imin，每孔加入25μL去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。III.以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20分钟，3500rpm、5分钟离心后备用。
⑥检测I. Nanodispenser SpectroCHIP 芯片点样将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片。II. M assARRAY Analyzer Compac 质谱检测将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。III.TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。
1.5.4 PCR的电泳检测
ACEI/D多态性釆用PCR电泳法检测，在妇幼保健院中心实验室完成，方法如下: ⑴试剂
①.6xloa(iing buufer (上海莱枫)
②.琼脂糖(生工生物)
③.DL2000 Marker(上海莱枫)
④.dNTP (上海莱枫)
⑤.rs4340引物(生工生物合成)
⑥.Taq酶(上海莱枫)
⑦.DL2000 Marker(上海莱枫)
(2)仪器与设备
①.电子分析天平
②.SMA1000浓度测试仪
③.电热恒温水浴锅
④.台式离心机(Thermol)
⑤.96孔板离心机(Eppendorf)
⑥.电泳仪
⑦.凝胶成像仪(上海天呈)
⑶质检
①SMA 1000进行DNA浓度测定:
I 打开SMA1000软件,选择测量的样品种类为DNA。
II 测量前用去离子水对测量平台以及取样臂进行清洗2-3次。
III 以2μLDNA样品溶解溶液为空白对照。
IV 吸取2μL待测DNA样品进行样品测量。
V 记录测定数据,并进行保存。
②PCR扩增rs4340引物验证:
I在96孔板中加入18nL PCR Master Mix反应液。再加入2nL DNA样本,终体
积为20μL。
表 4 PCR Master Mix反应液配方
Table 4 PCR Master Mix reaction liquid formula
试剂名称1X(μL)
H2O 13.2
PGR Buffer 2
dNTP(2.5 mM each) 1.6
rs4340引物-F 0.4
CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT re4340引物-R 0.4
GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT Taq 酶0.4
终体积18
II将96孔板lOOOrpm离心1分钟后放入PCR仪,运行反应程序。
III将PCR产物进行凝胶电泳,查看扩增条带。PCR产物为490bp,判断基因型为插入型,PCR产物为190bp,判读为缺失型,PCR产物为190bp和490bp时,判断为插入和缺失的杂合型结果。
1.5.5 DNA测序实验
ND +597 C/A多态性釆用DNA测序法检测，在深圳市妇幼保健院中心实验室完成，方法如下：（1）实验伩器：PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪（美国ABI公司）；SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳
早泄（Premature ejaculation , PE ）是最常见的男性性功能障碍疾病，对患者及其伴侣的生活质量有着严重影响。近年流行病学研究显示，PE 的患病率约为20%~30%[1]。Revicki 等[2]就PE 对患者及其伴侣的生活影响进行了一项多国参与的、大样本定量分析研究，显示PE 对各国患者及其伴侣的心理、性满意度及其他多方面的生活都有着严重的负面影响。目前研究认为早泄的发生发展与患者的心理性、行为性和生物性等多方面因素有关，并提出了PE 的心理学、神经内分泌学和神经生物学发病机制，但这些机制并不能揭示所有PE 患者的病因，因此进一步阐明PE 病因进而为更好治疗PE 提供思路具有重要意义。鉴于部分研究发现PE 还受到遗传因素的影响，最近一些研究开始关注PE 发病与基因多态性之间的相关性。本文旨在综述PE 基因多态性方面的发病机制的研究进展。 1943年Schapiro 首次提出PE 发病具有一定的遗传性，他发现PE 患者家庭的其他男性成员更易出现PE 。Waldinger 等[3]研究支持了上述观点，他发现PE 患者的一级男性亲属中PE 发病率可高达91%。最近研究表明在早泄发病的多种因素中，遗传因素占其中30%左右[4]。在PE 的最新分类中，PE 被分为4大类：原发性PE 、继发性PE 、自然变异性PE 和早泄样射精功能障碍。4种类型PE 的病因不尽相同，其中与遗传学关联最大的是原发性PE 。当前，对PE 发病的基因多态性研究主要集中在5-羟色胺（5-hydroxytryptamine ，5-HT ）相关基因和多巴胺相关基因上，在其他基因如催产素和后叶加压素相关基因方面也有一定报道。 一、PE 与5-HT 相关基因多态性 大量动物研究和人类研究表明5-HT 是射精活动中重要的神经递质，在射精过程中发挥着重要作用，其调控异常会导致射精加快或延迟。5-HT 相关基因也是PE 基因学发病机制研究中被研究得最多的基因。迄今发现至少有3个亚型的5-HT 受体即5-HT1A 受体、5-HT1B 受体和5-HT2C 受体参与射精活动的调控。5-HT1A 受体的激活可以加速射精，而5-HT2C 受体的激活则会延迟射精[3]。研究表明PE 与5 -HT 神早泄基因多态性研究进展 王俊龙 综述 李 铮 审校 上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科 （上海 200127） 经传递降低有关，即5-HT1A 受体功能亢进和（或）5-HT2C 受体功能低下可导致PE 的发生[5]。 5-HTT （5-HT transporter ）是位于突触间隙的跨膜转运蛋白，为了防止突触后膜5-HT 受体的过度刺激，其能迅速地将5-HT 从突触间隙再摄取到突触前神经元，5-HT 在此进行代谢、失活，从而调控5-HT 作用的时间与强度。人类5-HTT 基因是由位于染色体17q12上的单基因SLC6A4所编码，其转录区域的多态性是由一44bp 长度的插入（‘ long allele ’ [L]）和缺失（‘ short allele ’ [S]）所致，表现出基因型为S/S 、L/S 、L/L 的多态性。5-HTT 不同的基因型转录活性亦不同，L 等位基因的转录活性明显高于S 等位基因，两者通过影响5-HTT 蛋白的合成与作用进一步调控5-HT 作用的时间及强度，相对于S 等位基因，L 等位基因可增加5-HTT 的表达和5-HT 的再摄取。 罗顺文等[6]对119例原发性PE 、60例继发性PE 和90例健康成年男性的5-羟色胺转运体基因连锁多态性区域（5-HT transporter gene-linked polymorphism, 5-HTTLPR ）基因进行分析、比较发现，原发性PE 组中S/S 基因型的频率明显高于健康对照组，L/S 基因型的频率明显低于健康对照组，S 等位基因出现的频率比健康对照组显著提高。进一步研究将PE 组按阴道内射精潜伏期（intravaginal ejaculation latency times ，IELT ）长短分成3组，发现各组间基因型和等位基因频率的差异并无统计学意义，提示5-HTTLPR 基因多态性可能并不影响PE 的严重程度。Ozbek 等[7]对70例PE 患者和70例正常成年男性的5-HTTLPR 基因型进行分析，得出了同样的结论。5-HTT 基因的L 、S 等位基因可以改变5-HTT 蛋白的表达从而导致其功能上的差异，L 等位基因的表达水平比S 等位基因高3倍，即5-HTT 基因启动子区的多态性可以影响5-HTT 的表达。由于S 纯合子与S 杂合子在功能上表现出的差异并不明显，从而推测出S 等位基因可能在转录中占主导作用[8]。Janssen 等[9]研究了89例原发性PE 患者和92例正常男性的5-HTTLPR 基因型，结果发现两组的L 、S 等位基因和基因型均无统计学差异，但在PE 患者组中Ｌ/Ｌ基因型者的IELT 明显短于S/S 、L/S 基因型者，因此认为5-HTTLPR 多态性与原发性PE 患者的
基因多态性 多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。 基因多态性分类生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为3大类：DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。 DNA片段长度多态性DNA片段长度多态性（FLP），即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。又称限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。 DNA重复序列多态性DNA重复序列的多态性（RSP），特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatellite）DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了小卫星DNA长度的多态性。微卫星（microsatellite）DNA 的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，在CG序列上频繁出现。这是目前倍受关注的一类多态性。 SNP通常是一种双等位基因的（biallelic），或二态的变异。SNP大多数为转换，作为一种碱基的替换，在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。 遗传背景知识遗传和变异各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity）。但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性。
药物代谢酶基因多态性简介 代谢酶基因多态性是指由于编码代谢酶的DNA序列的单核苷酸多态性等可遗传变异，导致的不同种群之间代谢酶的底物特异性无变化，但是代谢酶的活性存在显著的差别的现象。由此可能造成个体间PK和药物反应的差异，进而造成不必要的治疗失败和毒副作用。单核苷酸多态性（SNPs）存在于Ⅰ相代谢酶、Ⅱ代谢酶和转运体等多个方面，其中临床影响较大的为CYP450酶的基因多态性，因此了解不同人群代谢酶活性的差异有助于理解种群间PK差异和实现个性化治疗。SNPs存在于许多亚型的代谢酶中，Sarah等人的研究结果显示如下图，其中高加索人种中CYP2D6多态性的频率最高，其次为CYP2A6和2B6。但是并非所有的CYPs均参与药物代谢，既存在较高频率的多态性，又与药物代谢相关的为CYP1A2, 2D6, 2C9和2C19，其中CYP2D6与多数药物的代谢相关,下文将以CYP2D6为代表阐述其进化特征、功能多样性和临床影响等相关内容。 CYP2D6是由497个氨基酸组成的多肽，其对生物碱类物质具有较高的亲和力，该酶不可被环境因素调控且不能被诱导。最早CYP2D6的多态性是由
于个体间PK差异引起人们注意的，而后随着生物技术手段的提升才逐渐揭开其遗传基础。CYP2D6位于染色体22q13.1上，其邻近包含两个假基因CYP2D7和CYP2D8。至今发现了几十种CYP2D6的等位基因，大多数编码有缺陷的基因产物，最常见的突变型等位基因分布于不同种群中，如CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10和CYP2D6*17等，详细见下图，其可分为彻底失活、活性降低、正常、活性增加和活性本质上的改变五大类，在不同种群中分布特点有明显的差异。亚洲人群最常见的CYP2D6*10，其发生了P34S的有害突变导致了P450折叠功能的丧失而造成不稳定性，且降低了底物的亲和力。非洲人群中常见突变体为CYP2D6*17发生的错义突变导致其活性位点结构发生改变，由此造成底物特异性发生改变，且其活性低于野生型。 如下图演示了CYP2D的演变规律，啮齿动物与人的活性CYP2D基因的数量存在巨大的差异，小鼠有9个不同的活性基因，而人只有1个，且7%的高加索人群缺失该活性基因。由于CYP2D6对于生物碱类的生物毒素具有高亲和力，进化角度可以认为小鼠需要保留较多的活性基因来维持解毒能力，而人类的饮食结构更为严谨进而逐渐不需要更多的活性基因。 不同人群中的CYP2D6的代谢活性可分为超快代谢（ultrarapid metabolizers, UMs）、快代谢（extensive metabolizers, EMs）、中等代谢（intermediate metabolizers， IMs）和慢代谢（poormetabolizers, PMs）四种类型。一般而言，白人种PMs的频率较高约为10%左右，而亚洲人群中
. 人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂 . . ⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。 ⑵琼脂糖。 ⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。 ⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。
基因多态性及其生物学作用和医学意义一、基因多态性： 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。 1.位点多态性：是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP), SNP通常是一种二等位基因（biallelic）或二态的变异。据估计，单碱基变异的频率在1/1000-2/1000。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。 2. 长度多态性：一类为可变数目***重复序列（variable number of tandem repeats, VNTRS），它是由于相同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星DNA （minisatellite）长度的多态性。小卫星是由15-65 bp的基本单位***而成，总长通常不超过20bp，重复次数在人群中是高度变异的。另一类长度多态性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星DNA（microsatellite），它们是由重复序列***构成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重复10-60次。长度多态性是按照孟德尔方式遗传的，它们在基因定位、DNA指纹分析，遗传病的分析和诊断中广泛地应用。 造成基因多态性的原因：1复等位基因（multiple allele）位于一对同源染色体上对应位置的一对基因称为等位基因（allele）。由于群体中的突变，同一座位的基因
如何用PCR法检测基因的多态性 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA 位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变， 用限制酶切割基因组时， 钠 问 亢兔扛銎 蔚某ざ染筒煌 此 降南拗菩云 纬ざ榷嗵 裕 贾孪拗破 纬ざ确⑸ 谋涞拿盖形坏悖 殖莆 嗵 晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素
人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂
1定义： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论
基因多态性的检测方法 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。最早是用Southern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行
药物基因组学 PART 01 药物基因组学 一、药物基因组学 药物基因组学：是研究人类基因变异和药物反应的关系，利用基因组学信息解答不同个体对同一药物反应存在差异的原因。 基因组（genome）：是指生物体单倍细胞中一套完整的遗传物质，包括所有的基因和基因间区域（即编码区和非编码区）。 人类基因组计划是由序列（结构）基因组学向功能基因组学的转移。开启了人类的“后基因组时代”。 后基因组时代研究的重要方向： 功能基因组学 比较基因组学 结构基因组学 蛋白质组学 药物基因组学 …… PART 02 基因多态性 二、基因多态性 基因多态性是指在一个生物群体中，呈不连续多峰曲线分布的一个或多个等位基因发生突变而产生的遗传变异。 CYP450酶超大家族 共涉及1000种药物的代谢（拓展） 12种亚型：CYP1、CYP2、CYP3…… 15个亚家族：A～Q 如：CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A5等 药物转运蛋白－MDR1（多药耐药基因）（拓展） 调控许多药物吸收、分布和排泄过程 与胆红素、抗癌化疗药物、强心苷、免疫抑制剂、糖皮质激素、HIVⅠ型蛋白抑制剂有关 药物靶蛋白－ADRB2 编码人β2肾上腺受体 人类白血球抗原－HLA－B HLA－B变异，将引起某些药物的严重皮肤反应 内容： 1.药物代谢酶的多态性 同一基因位点上具有多个等位基因引起，其多态性决定表型多态性和药物代谢酶的活性，造成不同个体间药物代谢反应的差异。是产生药物毒副作用、降低或丧失药效的主要原因之一。 细胞色素P450酶（CYP）是药物代谢的主要酶系。在细胞色素P450的亚群中，CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19对许多药物的效应非常重要。（拓展） 例： 奥美拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑等质子泵抑制剂由P450酶代谢，主要由CYP2C19，部分由CYP3A4代谢。 因此，CYP2C19的基因多态性会影响质子泵抑制剂的药动学，从而影响后者治疗相关疾病的临床效果。 艾司奥美拉唑仅经CYP3A4代谢。 2.药物转运蛋白 在药物的吸收、排泄、分布、转运等方面起重要作用，其变异对药物吸收和消除具有重要意义。
基因多态性及其生物学作用和医学意义
基因多态性及其生物学作用和医学意义 一、基因多态性： 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2 种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。 1.位点多态性：是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP), SNP通常是一种二等位基因（biallelic）或二态的变异。据估计，单碱基变异的频率在1/1000-2/1000。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。 2. 长度多态性：一类为可变数目***重复序列（variable number of tandem repeats, VNTRS），它是由于相同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星 DNA（minisatellite）长度的多态性。小卫星是由15-65 bp的基本单位***而 成，总长通常不超过20bp，重复次数在人群中是高度变异的。另一类长度多态性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星DNA （microsatellite），它们是由重复序列***构成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及
遗传病及遗传多态性 遗传病（hereditary disease）由基因突变或染色体畸变引起的疾病。已知的遗传病约有5000种，可分为3大类： 单基因遗传病由某一基因突变而引起，又分为：（1）常染色体显性遗传病，致病基因位于1～22号常染色体中的某一对上，且呈显性。如并指、多指、视网膜母细胞瘤、遗传性小脑性运动失调、先天性肌强直、多发性肠胃息肉、遗传性卟啉病等。（2）常染色体隐性遗传病，致病基因位于1～22号常染色体中的某一对上，且呈隐性。如白化病、先天性聋哑症、苯丙酮尿症、半乳糖血症、先天性鳞皮病等。（3）伴性遗传病，由性染色体上的基因发生突变而引起。包括X连锁隐性遗传病（致病基因位于X染色体上且呈隐性），如红绿色盲、血友病、先天性白内障、先天性丙种球蛋白缺乏症等；X连锁显性遗传病（致病基因位于X 染色体上且呈显性），如抗维生素D佝偻病、遗传性肾炎等。 多基因遗传病受多对微效基因控制并易受环境因素影响的遗传病。如唇裂、腭裂、先天性巨结肠、先天性幽门狭窄、早发性糖尿病、各种先天性心脏病等。 染色体异常病由先天性的染色体数目异常或结构异常而引起。又分为：（1）常染色体病，由1～22号常染色体发生畸变而引起。包括单体综合征，某一号染色体为单体，如21单体和22单体，这类病人极少见，大都于胎儿期死亡；三体综合征，某一号同源染色体不是两个而是三个，如21三体（又称先天愚型或唐氏综合征，核型为47XX或XY；＋21）、18三体（Edward氏综合征）和13三体（Patan氏综合征）等；部分三体综合征（由某一片段有三份而引起）如9p部分三体综合征（9号染色体的短臂有三份）；部分单体综合征（由某一常染色体的部分缺失而引起），如猫叫综合征（婴儿期哭声类似猫叫）就是5号染色体短臂部分缺失引起的。（2）性染色体病，由X和Y性染色体数目或结构变异而引起。如女性的特纳氏综合征（45，XO），男性的克氏综合征（47，XXY）等。遗传病目前尚难根治，故应积极预防。预防的措施有检出致病基因的携带者与禁止近亲结婚，推行计划生育，开展遗传咨询，进行产前检查与中止有病胎儿的妊娠等。 遗传多态性（genetic polymorphism）在一个群体内存在两种或两种以上非连续变异类型，而其中最罕见类型的频率不小于0.01（或0.05）的现象。常见的不同水平上的遗传多态性有：（1）基因多态性（gene polymorphism）。经调查人类大多数群体的ABO血型系统的三种复等位基因I A、I B和i的频率，最高的不超过0.55，最低的不小于0.2，所以，ABO血型系统的基因座为多态基因座。据研究，大多数生物的多态基因座约占总数基因座的15%～50%，即约有1/4～1/2的基因座存在两种或两种以上的等位基因。（2）染色体多态性（chromosome polymorphism）。在一群体中的同一染色体上可以发生不同的倒位或易位。例如拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）的第三染色体上存在多种倒位，其自然群体中的倒位类型竟多达20余种。植物群体中的倒位多态性比动物的更普遍。在一些动植物群体中（如蟑螂、直果曼陀罗）还观察到易位多态性。此外，随着研究的深入，在分子水平上还发现核酸有限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），例如，在群体中用同一限制性内切酶“切割”DNA，可得到不同长度的DNA片段。 现在一般用自然选择理论来解释遗传多态性产生的原因，主要有杂合优势说和依赖 选择说。杂合优势说认为，杂合体（如Aa）在适应能力上要优于纯合体（如AA和aa），因此群体中的等位基因A和a的频率就会维持在一个既不过高也不过低的水平上。依赖选
基因多态性及其生物学作用和医学意义 一、基因多态性： 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(genepolymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(sitepolymorphism)和长度多态性(longthpolymorphism)。 1.位点多态性：是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),SNP通常是一种二等位基因（biallelic）或二态的变异。据估计，单碱基变异的频率在1/1000-2/1000。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。 2. 的基本单位*** 如(TA)n 及(CGG)n 基因（ ）一对等1 指由于碱 义突变 2．对 达产物，数个碱基的缺失、片段缺失等匀有可能造成剪接位点的缺失。 3．蛋白质肽链中的片段缺失：无义突变和DNA片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。4．启动子的突变及非转录区的突变：可以使基因的转录水平或活性的增强或降低。 5．基因多态性的基因型频率分布：在人群中符合Hardy-Wenberg平衡。 三、基因多态性的医学意义： 人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性（clinicalphenotypediversity），以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。临床上早期有关基因多态性的研究是从HLA基因开始的，分析基因型在疾病发生易感性方面的作用，如HLA-B27等位基因与强直性脊椎炎发生率的密切关联，可作为诊断的依据。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示人类不同个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。通过对基因多态性与疾病的易感性的联系研究，如P53抑癌基因多态性与肿瘤发生及转移的关系研究，可阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性，不仅为临床医学也为预防医学的发展带来新
2003 年 Kripp l等[ 1 ]报道VEGF 936 C等位基因携带者患乳 腺癌的危险性降低, 1 Kripp l P, LangsenlehnerU, RennerW, et al. A common 936 C /T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor is associated with decreased breast cancer risk. Int J Cancer, 2003, 106: 4682 471. 我们进行了一系列的生长因子基因多态性与结 直肠癌关系的研究,已经发现VEGF 61 G/G基因型 和G等位基因与结直肠癌的发生有关[ 9 ] 。VEGF 936 T/C 基因多态性与结直肠癌关系的研究表明 VEGF 936 C /C基因型或936 C等位基因与结直肠 癌的生成无关,但有助于减少术后结肠吻合口瘘的 发生。含有VEGF 936 T基因的结直肠癌患者术后 并发吻合口瘘的机会增加,或许VEGF 936 T基因 可作为检测结直肠癌或预测结直肠癌术后并发吻合 口瘘的一个危险因素,但这需要进一步的研究。同 时观察这一基因多态性在其他伤口愈合并发症中的 作用也将很有意义。 血管内皮生长因子936 T/C基因多态性 与结直肠癌及术后吻合口瘘的关系 吴国洋王效民Michael Keese Till Hasenberg JêrgW. Sturm 血管内皮生长因子基因多态性与肺癌危险度的关系 Lee SJ , Lee SY, Jeon HS, et al/ / Cancer Ep idemiol Biomarkers Prev, 2005, 14: 571 - 575 背景和目的:血管生成是包括肺癌在内的恶性肿瘤发 生、发展和转移中的一个重要过程。血管内皮生长因子基 因( vascular endothelial growth factor, VEGF)变异可以导致 其编码蛋白的产量和活性的改变,通过作用于肿瘤的血管 生成过程,从而引发个体对肺癌易感性的差异。为了检验 这一假设,作者研究了韩国人VEGF基因的3个单核苷酸多 态性( - 460T >C、+ 405C > G和936C > T)及其单倍型和肺 癌危险度之间的关系。方法:研究对象包括432名肺癌患者 和432名年龄和性别匹配的对照。运用贝叶斯定理构建单 体型。采用logistic回归校正相关协变量计算OR值。结果: 在+ 405位点,与CC和CG基因型比较, GG基因型个体小 细胞肺癌危险度显著降低,调整OR 值为0136, 95%可信限 为0117～0178; 936位点变异基因型(CT和CT + TT)个体较 野生基因型(CC)个体小细胞肺癌的危险度降低,调整OR 值分别为0147和0144, 95%可信限分别为0126～0185和 0124～0180。CGT单体型与小细胞肺癌的危险度降低相关, 调整OR值为0139, 95%可信限为0118～0187;而TCC与小 细胞肺癌的危险度增加相关,调整OR 值为1163, 95%可信 限为1114～2133。上述多态性对小细胞肺癌以外的肺癌类 型的危险度没有影响。单体型TCT和TGT与整体肺癌危险 度相关,调整OR值分别为0138和3194, 95%可信限分别为 0125～0160和2100～7176, TCT和TGT单体型的这种作用 在3种主要的肺癌组织类型中均有发现。结论: VEGF基因 多态性与个体肺癌遗传易感性有关。 (冷曙光) Objectives: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent stimulus
氯吡格雷是一种前体药物，本身无抗血小板作用，需要经过细胞色素P450将其转化为活性代谢产物才能实现其血小板抑制效应。部分患者在长期服用氯吡格雷后，血小板活性未得到有效控制导致严重支架内血栓形成、再发心肌梗死等不良心血管事件发生，临床上称这种现象为氯吡格雷抵抗。CYP2C19是氯吡格雷活性代谢产物生成过程中的主要酶，而CYP2C19基因多态性是导致氯吡格雷抵抗的最重要的因素[1]。 2010 年3 月, 美国食品药品监督管理局(FDA) 宣布氯吡格雷抵抗的“黑框警告”，提醒应用氯吡格雷后出现心血管不良事件与CYP2C19 功能缺失的等位基因有关。 CYP2C19 不同位点的等位基因对氯吡格雷的代谢的作用强度不同, 在各等位基因中,*1 为正常功能等位基因；*2 和*3 为功能缺陷型等位基因（其在亚洲人群中突变频率分别为30％～50％和5％～10％）；*17 是功能增强等位基因（其在我国人群中的突变频率为1.2％～3％），携带CYP2C19*2 和*3 等位基因者为CYP2C19 慢代谢型，此类人群氯吡格雷体内活化速率降低、活性代谢产物减少、抗血小板活性降低。Meta 分析的结果表明，在服用氯吡格雷的患者中，携带1～2 个CYP2C19 功能缺陷型等位基因的患者发生不良临床事件的危险性可能会增加55~76％[2]。
建议（1）基因多态性所致血小板反应性差异对个体临床结果的影响尚不能肯定，不推荐常规进行CYP2C19基因型检测。（2）这些个体化用药建议主要用于行PCI 的ACS 患者。目前还没有数据支持CYP2C19基因型检测用于其他场合的用药指导[3]。 常用经由CYP2C19代谢的药物： ①质子泵抑制剂：奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑 ②抗抑郁药：氟西汀、西酞普兰、艾司西酞普兰 ③抗癫痫药：丙戊酸钠、苯妥英钠、苯巴比妥、地西泮 ④其他：伏立康唑、利福平 [1]张丽娜,王浩然,丁虎,等.氯吡格雷吸收和代谢通路相关基因变异与临床个体化用药实践.分子诊断与治疗杂志,2013,5(5):289-294 [2]刘俊,朱艳虹,栾佳杰,等.基因型检测在氯吡格雷个体化抗血小板治疗中的应用价值.中国药房,2014,25(12):1097-1098. [3]钟诗龙,韩雅玲,陈纪言,等.氯吡格雷抗血小板治疗个体化用药基因型检测指南解读.中国实用内科杂志,2015,35(1):38-41
遗传学名词解释 1．遗传（heredity）：亲代与子代之间同一性状相似的现象称为遗传。 2．变异（variation）：亲代与子代或子代之间出现形状差异的现象称为变异。 3．真实遗传（breeding true）/ 纯育（true-breeding）：子代性状与亲代的遗传一致性极高的品系称为纯育，这种生物的性状能够代代稳定遗传的现象称为真实遗传。 4．并显性/共显性（codominance）：一对等位基因的两个成员在杂合体中都表达的遗传现象称为并显性遗传，或共显性遗传。 5．复等位基因（multiple aleles）：在群体中，占据某一同源染色体的同一座位上的两个以上的、决定同一性状的基因称为复等位基因。 6．叠加基因/重叠基因：对同一性状的表型具有相同效应的非等位基因称为叠加基因。 7．性连锁遗传/伴性遗传（sex-linked inheritance）：由性染色体所携带的基因在遗传时与性别相联系的遗传方式称为性连锁遗传，亦称伴性遗传。 8．限性性状（sex-limited traits）和限性遗传（sex-limited inheritance）：只在某一种性别表现的性状称为限性性状，限性性状的遗传行为称为限性遗传。控制限性性状的基因多数位于常染色体上，也有少部分位于性染色体上。 9．剂量补偿效应（dosage compensation effect）：在XY性别决定的生物中，使性连锁基因在两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应称为剂量补偿效应。 10．并发系数（coefficient of coincidence, C）：实际观察到的双交换率与预期的双交换率的比值称为并发系数。并发系数越大表示干涉作用越小。 11．C值（C value）和C值悖理（C value paradox）：一个物种基因组的DNA含量是相对恒定的，它通常称为该物种的C值。物种的C值与其进化复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖理或C值佯谬。 N值悖理（N value paradox）：生物的基因数目与生物在进化树上的位置不存在正相关的事实称为N值悖理或N值佯谬。 12．基因转变（gene conversion）：在子囊菌的减数分裂过程中，由于交换使得异源双链DNA的核苷酸对发生错配，错配的核苷酸对经过修复校正后导致一个基因转变为它的等位基因，从而使减数分裂后的四分体发生异常分离现象，这种现象称为基因转变。（自己总结，仅供参考）13．同线分析（synteny analysis）：将连锁分析原理用于体细胞杂种染色体分析得方法称为同线分析。14．可变剪接（alternative splicing）：同一前体mRNA分子，可以在不同的剪接位点发生剪接反应，生成不同的mRNA分子，最终产生不同的蛋白质分子的一种RNA剪切方式称为可变剪接。15．中断杂交实验（interrupted mating experiment）：在不同品系的大肠杆菌Hfr细胞和F-细胞的杂交过程中，每隔一定时间取样并在搅拌器内搅拌以打断配对的接合管，使接合细胞分开而中断杂交，再检测形成了何种重组子，从而确定各种基因进入F-细胞的时间和次序并进行作图的实验即为中断杂交实验。 16．共转导/并发转导（co-transduction）：在噬菌体对细菌的基因进行转导时，两个基因共同转导的现象称为共转导或并发转导。两个基因之间共转导频率越高说明它们连锁越紧密，且共转导的两个基因之间的距离一般不会大于噬菌体的染色体长度。 17．高频重组菌株（high frequency recombination, Hfr）：细菌的F因子能够整合到细菌的染色体中，带有一个整合的F因子的细菌品系在与F-细菌接合时可以将染色体的一部分或全部传递给F-细胞，当二者的等位基因带有不同的标记时就可以发生重组，且重组频率可达到10-2以上，因此称为高频重组菌株。 18．互补测验（complementation test）/顺反测验（cis-trans test）：将两种不同rⅡ突变型的T4噬菌体对大肠杆菌K（λ）进行双重感染，若能够产生亲代基因型的子代噬菌体，则说明两种突变可以互补，位于不同的顺反子上，这个实验就称为互补测验或顺反测验。利用该测验可以确定基因之间的功能关系。 19．核外遗传（extranuclear inheritance）/细胞质遗传（cytoplasmic inheritance）：在真核生物中，染色体外的遗传因子所决定的遗传现象称为核外遗传或细胞质遗传。核外遗传因子通过细胞质又一代传到下一代，且子代分离比不符合孟德尔定律、正反交的结果不同，核外因子亦不能进行遗传作图。