细菌总数的测定法
一、细菌数测定的基本概念
药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH 位、培养温度和时间等）每1g、lml、l0cm2供试品液经培养后所生长的菌落数。所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧条件下，30～35℃，一般培养48h,在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。细菌数的测定方法有多种：平板法、薄膜过滤法、涂抹法。
药品细菌数测定是活菌计数，最常用的平板法是以平板菌落计数为依据，即每个菌落代表个菌细胞，但有的菌落也可能是多个菌细胞形成，如双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，很可能是多个菌细胞在一起。故准确地说，细菌数测定值实际上是菌落形成单位数( CFU)。
平板法菌落计数法，是受一定条件的限制：如供试液是否均质，供试液中的细菌是否充分分散；培养基的质量、培养温度及培养时间的影响；有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某此受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌在规定的培养基上不能生长，因而不被计数。在试验操作中应考虑到这此问题。
二、设施、设备、仪器及器皿
1、设施
细菌数测定全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净净度l0000级和局部洁净度100 级单向流空气区域内进行，以防止再污染。
2、设备、仪器
恒温培养箱（30～35℃）、微波炉、匀浆仪（4000～10000r / min ）、康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果验证并应定期请有关部门检定）
菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色计、全封闭可拆卸或开放式的薄膜过滤器。
3、器皿
锥形瓶（250～300ml ）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×18mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、载玻片、玻璃或搪瓷、不锈钢消毒缸（带盖）。
玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管上端距0 .5 cm 处塞入约2 cm 左右的适当疏松棉花，装入吸管筒内或牛皮纸口袋中。锥形瓶、量筒、试管塞（硅氟塑料塞），再用牛皮纸包扎。使用的器皿应采用经验证合格的方法进行灭菌。
4、用具
大、小橡皮乳头（置干净带盖的容器中并应定期用5%来苏尔溶液浸泡），无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后用布袋或牛皮纸包严）灭菌，备用。也可使用一次性无菌衣、帽、口罩。接种环(白依金或镍铬合金）、乙醇（酒精）灯、乙醇棉球或碘伏锦球、灭菌剪刀、镊子或灭菌的手术刀、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔等。
二、培养基、稀释剂
除另有规定外一般使用营养肉汤琼脂培养基, 可按处方配制亦可采用干燥脱水培养基。
主要稀释剂有0. 9％无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液（供试品稀释用），0.9%无菌氯化钠溶液（对照菌稀释用）。
三、检验方法
1、试验前的准备
1）、将试验用灭菌的器皿、稀释剂及供试品外包装去掉，内包装消毒后移至无菌室内。每
次试验所用物品必须事先计划周密，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
2）、开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min 。
3）、操作人员用肥皂洗手，进入缓冲问，换上工作鞋。再消毒液洗手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
4）、用碘伏棉球或乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后，用灭菌的手术剪刀将供试品启封。
2、检查方法
1）、供试液的制备：2）、供试液的稀释（l0 倍递增稀释法）：根据微生物限度要求或对供试品污染的程度估计，选择适宜的、连续2～3个稀释级的供试液。
用1 ml 灭菌吸管吸取1 ：10供试液lml，沿管壁徐徐注入装有9ml稀释液的试管中，（注意吸管尖不要触及管内稀释液），摇匀．制备成l : l 00的供试液，另取l 支吸管同法操作制备1 : 1000 的供试液.
3）、注皿：分别用灭菌吸管吸取不同稀释级供试液各lml ，注入平皿中，每个稀释级2～3个平皿，注入溶化冷却约45℃的营养琼脂培养基15～17ml，快速转动平皿，使供试液与培养基混匀，放置，待凝，倒置培养。除另有规定外，一般在30～35 ℃培养48h 。若污染细菌生长缓慢可延长培养时间。
4）、阴性对照试验：
为确定试验全过程的无菌性（包括稀释剂、玻璃器皿等）应做阴性对照试验。
试验方法：取试验用的稀释剂1 ml ，置无菌平皿中，每次试验做2 个平皿，按上述细菌计数方法进行操作阴性对照平板不得有菌生长。
5）、菌落计数：从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时借助于放大镜观察。点计菌落数后，计算稀释级的平均菌落数，若相同释级的两个平板的菌落数平均数不小于15 ，则两平板菌落数不能相差l 倍或以上。
细菌菌落形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色、红色（如培养基中加人0 . 1%TTC试剂），菌落边缘整齐或不整齐，有放射状、树枝状、锯齿状、卷发状菌落表而有光滑、粗糙、皱折、突起或扁平，菌落大小差别很大，同一平板上可出现针尖大小至大于10mm 菌落，外观多样，小而突起或大而扁平，或石雾状，不规则。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；虎红培养基用于霉菌及酵母菌计数。
3、菌落报告规则
宜选取细菌平均菌落数在30～300之间的稀释级，作为菌数报告的依据。
1）、当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数（见表9.1.1 例l )
2 )、当同时有2 个稀释级的菌落数符合上述规定时，计算二稀释级的菌落数比值（高稀释级除以低稀释级的比值），若二者比值不大于2 ，以两稀释级的菌落平均数乘以稀释倍数报告菌数；若大于2 ，但不超过5时，以低稀释级的菌落平均数乘以稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1例2 、例
3 )
3) 、当二者比值大于5 ，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证（见表9.1.1 例4 )
4）、当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1 例5 )
5）、如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于l 时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1 例6 )
表9.1.1细菌数报告规则举例
4、结果判断
1）、在进行菌落汁数时，应仔细观察。勿漏计细小的、琼脂内和平皿边缘生长的菌落，同时应注意细菌菌落与供试品中颗粒、沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间5～7天，细菌菌落常会生长增大而加以鉴别。
2）、如同一稀释度二个平板菌落数超出一倍以上，不应计数，菌落蔓延成片也不应计数。
3）、若供试品测定。其菌数结果超过标准限度规定时，应从同一批样品中随机取样，独立复试两次，以3 次测定结果的平均值结果。
根据点计结果和前数报告规则报告菌数，若供试品的细菌数超过规定的限值时，应从同一批样品中随机取样、独立复试两次，以3 次测定结果的平均数报告。
5、注意事项
l）、在培养中一些生长鞭毛的细菌具有动力，可因培养基湿度过高给动力菌造成泳动的条件，促使一些菌落蔓延生长，干扰细菌计数。
可在培养基中加入0.001%TTC抑制菌落蔓延生长或将已凝固的琼脂平板开盖，倒置100级层流下1～2h或置换经干热灭菌的陶瓦盖替代原平皿盖，可降低培养皿内水分，减少菌落蔓延生长。
2）、供试液中常会有不溶性颗粒或沉淀物存在，有时很难与菌落区分，必要时可使用放大镜或显微镜进行观察，如仍难区分，可延长培养时间或在未加TTC的营养琼脂培养基平板上加入0.001%TTC5～10ml，30min后菌落即染成深红色可与其他有形物进行鉴别。
3）、供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。
4）、在做10倍递增稀释时，每一稀释级应换l 支吸管，吸管插入稀释液内不低于2 . 5cm ,反复冲洗数次，吸液高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁吸取1cm。靠近液面管壁（但勿接触液面），缓慢地吹出全部供试液至第二个容器中（第一级稀释液所用吸管勿接触第二级稀释液）。将吸管放入消毒筒内。
5）、注皿时培养基应在45℃以下，用水浴保温效果较好。
6）、从供试液制备至倾注培养基，全部操作应在1小时内完成。避免由于时间过长造成人为的污染，细菌繁殖或死亡。稀释液加至培养皿后，长时间末倾注培养基，稀释液边缘干涸，倾注的培养基不能与稀释液混均匀，影响菌落计数。
山西梁汾醋业有限公司 文件类别及编号：LF-GC-01 版次共页第页 菌落总数测定的标准操作规程 1. 目的 规范山西老陈醋菌落总数测定的操作规程，保证山西老陈醋产品的质量。 2. 适用范围 酿造食醋和配制食醋菌落总数的测定。 3. 仪器设备 恒温培养箱，冰箱，恒温水浴箱，天平（0.1g）,均质器，振荡器；无菌吸管1ml(0.01刻度)、10ml(0.1ml刻度)或微量移液器及吸头；无菌锥型瓶，250ml/500ml; 无菌培养皿：直径90mm；PH计或精密PH试纸；放大镜或菌落计数器 4.培养基和试剂 4.1平板计数琼脂培养基， 成分： 胰蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 2.5g 葡萄糖 1.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000ml PH7.0±0.2 制法：将上述加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节PH。分装试管或锥型瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2磷酸盐缓冲液
成分： 磷酸二氢钾（KH 2PO 4 ） 34.0g 蒸馏水500ml PH 7.2 制法： 贮存液：称取34.0g磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175ml的1mol/L 氢氧化钠溶液调节PH,蒸馏水稀释至1000ml存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25ml,用蒸馏水稀释至1000ml,分装于适宜容器中，121摄氏度高压灭菌15分钟。 4.3无菌生理盐水 成分： 氯化钠8.5g 蒸馏水1000ml 制法：8.5克氯化钠溶于100ml蒸馏水中121摄氏度高压灭菌15分钟。 5 检验程序
6操作步骤 6.1样品的稀释 6.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1min～2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。 6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）
洁净区沉降菌测定规程公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
1.目的:明确洁净区(室) 沉降菌的质量控制标准，规范洁净区(室) 沉降菌的检验操作方法 2.适用范围：洁净区(室) 沉降菌的控制和测试方法，及车间洁净室和洁净区无菌室或 无菌区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境的验证。 3.责任者：质量控制部洁净区(室) 沉降菌检验操作人员车间QC检验操作人员。 4.操作内容和方法： .定义： 4.1.1菌落 4.1.1.1细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU，通常用 个数表示。 4.1.1.2 沉降菌 ⑴用规定的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁 殖到可见的菌落数。 .应对微生物进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。 4.2.1监测方法有沉降菌法、定量空气浮游菌采样法和表面取样法（如棉签擦拭法和 接触碟法）等。 4.2.2动态取样应当避免对洁净区造成不良影响。成品批记录的审核应当包括环境监 测的结果。 4.2.3对表面和操作人员的监测，应当在关键操作完成后进行。在正常的生产操作监 测外，可在系统验证、清洁或消毒等操作完成后增加微生物监测。 4.2.4洁净区微生物监测的动态标准(1)如下：
4.2.4.1表中各数值均为平均值。 4.2.4.2单个沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多个沉降碟连续进 行监测并累积计数。 . 沉降菌测试操作方法： 4.3.1洁净区沉降菌控制限度： 4.3.2、测试操作方法： 4.3.2.1本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培 养平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 4.3.2.2所用的仪器和设备 ⑴高压消毒锅：使用时应严格按照仪器说明书操作。 ⑵恒温培养箱：必须定期对培养箱的温度计进行检定。 ⑶培养皿：一般采用Ф90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。 ⑷培养基：普通肉汤琼脂培养基（微生物限度检查法）或其他药典认可的培养基。 4.3.3.测试操作步骤： 4.3.3.1采样操作方法：将已制备好的培养皿按4.2.4.2的要求放置，打开培养皿 盖，使培养基表面暴露4h，再将培养皿盖盖上后倒置。 4.3.3.2培养。 ⑴全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。 ⑵在30℃--35℃培养箱中培养，时间不少于72h。
细菌总数检测操作规程 1 原理 试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度30℃±1℃培养72h±3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。 2 试剂与仪器 2.1 所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器 2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 2.3 所用试剂和培养基 营养琼脂 取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。 3、操作步骤 3.1配制0.85%生理盐水。 称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。 3.2三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关） 3.3将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121℃灭菌30min。（注意计算数量）3.4将枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成） 3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。 3.6用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。 3.7另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。 3.8选择2个~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。 3.9稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培.
细菌总数的测定 水与人类的生产活动和日常生活息息相关。经济建设的高速发展，往往会使生活用水的水源水受到水中有害有毒物质的污染；而生活污水、人、畜粪便会使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。被污染的水都不宜饮用。当水体中含大量的病原问生物是往往会引起传染病的发生，人体和动物体的肠道中大约有400多种细菌，虽然，其中的腐生菌进入水体不会引发人类的疾病，但随着粪便一起排除的致病菌，如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、阿米巴虫、脊髓灰质炎病毒和传染性感染病毒等致病性微生物，则会引发人体的肠道传染病。为保护人体健康，防止因水源水污染而造成的疾病发生和流行，必须对生活用水及其水源水进行严格的水中细菌学检查。 测定水样是否合乎引用标准，一般包括：水中细菌总数测定和大肠菌群测定。本实验以自来水和天然水为水样进行细菌总数的测定 一、实验目的 （1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法 （2）了解和掌握平板菌落计数的原则 二、试验原理 水中的细菌数可反映出水体被有机物污染的程度。细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，本试验应用平板菌落计数来测定水样中的细菌总数。由于水中细菌的种属不一，它们对营养成分和生长条件的要求差别很大，不可能设计出一种培养基在同一固定的条件下，能满足水中所有细菌的营养要求使其都能生长繁殖，形成菌落。然而，肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。故而水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的 卫生学指标规定：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个（1×102）。 三、试验材料和用具 （1）培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 （2）用具灭菌三角烧杯（体积为50ml或100ml），具玻塞的试剂瓶（体 积为250ml，需灭菌），灭菌培养基（Ф=9cm ），灭菌吸管或灭菌的 塑料吸嘴，稀释水样用无菌水（在Ф16mm×160mm试管中加9ml 蒸馏水，灭菌），酒精 四、试验方法 （1）以无菌操作、用10倍稀释法稀释水样。 （2）用平皿倾注制备待测水样平皿。 五、实验内容 1、水样的采取 （1）自来水先将自来水龙头用火焰（酒精灯火用长柄镊子夹酒精棉球）灼烧2-3min灭菌，再开启水龙头水水流出5min。以灭菌三角烧杯接取水样，待测（为节约用水，自来水龙头一次灭菌后，试验者依次采取水样）。 （2）池塘水、河水或湖水应取距水面10-15cm的深层水样。先将已灭菌具玻
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
1.目的：建立沉降菌、浮游菌检测的标准操作程序，用以规范检测操作。 2.范围：适用于公司内部生产洁净区内的沉降菌、浮游菌检测工作 3.责任：中心检验室主任、检验员对本规程的执行负责。 4.内容： 浮游菌检测 4.1.1 检测前的准备 4.1.1.1按照药典规定制作平皿培养基。 4.1.1.2领出检测仪器，去掉防尘护罩。 4.1.1.3先用喷洒方法对仪器及采样管进行消毒，无法喷洒的地方应用擦拭或 浸泡办法进行消毒，消毒后置放十分钟使仪器基本干燥。 4.1.1.4将采样器放在采样工作台面上，拧下采样盖，使整个缝隙完全暴露在 空气中，便于直接采样。 4.1.1.5当在较高位置取样时，可把仪器采样盖拧紧，插上采样塑料管，把管 子延伸到所要采样的空间。 4.1.1.6打开采样器透明外罩，迅速将准备好的平皿放入采样托盘内，拿去平 皿上盖，立即拧上透明外罩密封。 4.1.1.7拧松外罩顶部装有指针的螺母，让指针自然下落或使指针底部刚接触 到培养基为止。 4.1.1.8调节狭缝螺母，使狭缝上升直至到头，再反方向调节使狭缝面下降， 将齐狭缝大螺母侧面的色标线与指针于水平线上。（保持狭缝的底平面与培养基表面相距1-3mm）。
4.1.1.9将指针向上轻轻拔起，使其底部离开培养基表面，并拧紧螺母，使之 固定不动。 4.1.2 采样操作 4.1.2.1将采样器后面板上的电源插上，按下仪器面板上的电源开关，指示灯亮， 时间显示窗内的数码应为“P”。 4.1.2.2根据采样现场环境的洁净度，选择采样时间中的某一档，并按下相应按 钮，指示灯亮，数码由“P”显示为“Y”，约经10分钟后气泵自动开启进 行采样。当采样时间达到时，气泵自动停止运行，数码显示终点采样时间。 4.1.2.3关掉电源开关，打下仪器的活动透明外罩，迅速把平皿上盖盖上并从仪 器中取出。 4.1.2.4按照上述方法，再放入新的平皿，进行第二次采样，直到采样完毕。4.1.2.5采集样品的平皿应置入培养箱，在培养48小时后，按检验规程检查菌 落数。 4.1.2.6采样工作结束，关断仪器电源，将程序： 4.2沉降菌检测 4.2.1消毒φ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。 4.2.2称取普通肉汤琼脂培养基31克，加蒸馏水1000ml，加热溶解分装，经 116℃30分钟灭菌备用。 4.2.3在无菌条件下将消毒的培养基注入培养皿中备用。 4.2.4放平板前应先洗手，穿消毒好的无菌衣、裤、帽、口罩。 4.2.5将已制备好的培养皿按净化级别要求选择放置位置和平皿块数。 4.2.6到车间打开培养皿盖，使培养基表面暴露，再将培养皿盖盖上后倒置。 4.2.7全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。（温度30℃~35℃， 时间不少于48h）。 4.2.8每批培养基应有对照试验，可选2~3只培养皿作对照培养，以检验培养 基本身是否污染。
01.0 目的 01.1 阐述洁净室（区）空气中沉降菌检测操作规程，保证药品的质量，防止生产环境对 产品的污染，保证实验室的环境达到检测产品的要求。 02.0 适用范围 02.1 适用于本公司的洁净室（区）的沉降菌监测和洁净度等级的验证。 03.0 人员职责 测试人员对洁净室（区）沉降菌的测试。 04.0 内容 04.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 04.1.1 菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的细菌集落，简称CFU，通常用 个数来表示。 04.1.2 沉降菌：用GB/T16292-2010 提及的方法收集空气中的活性微生物粒子，通过专门 的培养基在适宜的生长条件下系繁殖到可见到的菌落数。 04.1.3 沉降菌菌落数：规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以cfu/ 皿表示。 04.2 测试原理：本测试方法利用沉降法，即通过自然沉降原理收集空气中的生物粒子于 培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培 养中的菌落数来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 04.3 监测周期：A级洁每次室验做监控， B 级每周一次，C级每季度一次，D级每半年一 次监控。 04.4 测试方法： 04.4.1 使用设备与材料 高压灭菌锅：使用时应严格按照操作规程进行。 恒温恒湿培养箱：必须定期对培养箱进行校验。 培养皿：一般采用φ90mm×15mm培养皿。 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；已灭菌配制好的培养基平皿放入30-35 ℃ 恒温培养箱中培养72 小时，若培养基平皿上确无菌落生生即可供采样用，制备好 的培养基平皿应放在2- 8℃的环境中存放。 清洁剂：75%酒精 04.4.2 测试时间： （1）对单向流，如 A 级净化房间内及超净工作台，测试应在净化空调系统正常运行不 少于10 分钟后开始。
纯化水微生物限度检测 计数方法适用性试验 1.供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45#C。供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。 (1)水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6?8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.接种和稀释 按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。 (1)试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混勻，使每lm l供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。 (2 )供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。 (3)菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试%液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。 供试品检查
检验量即一次试验所用的供试品量(g、m l或cm2)。 一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。 供试品的检査 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。 阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。 1.平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。 培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30?35°C培养3?5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20?25°C培养5?7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，ij*算lg 、lm l或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位4效数字报告。
菌落总数的测定 基础知识： 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每g（mL）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。由于厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际其中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生长过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。中国国家标准是国内常用的检验方法。 菌落总数测定的卫生学意义： 食品本身的新鲜程度 加工、贮存运输过程中是否受到污染 卫生学指标：食品中菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全 面的评价。 细菌在平板计数琼脂上的菌落特征蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征方法来源：
GB 4789.2-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 1、范围 本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2、术语和定义 菌落总数aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃~5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 无菌袋。 3.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。 3.7 无菌培养皿：直径90mm。 3.8 放大镜或/和菌落计数器。 4、培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 按照称取23.5g培养基溶于1000mL蒸馏水的比例进行配置，分装到锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2 0.85%无菌生理盐水 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水。一般用1000mL锥形瓶配置，称取6.8g的氯化钠，加入800mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min。
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g 氯化钠5.0 g 乳糖5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g 月桂基硫酸钠0.1 g 蒸馏水1 000 mL pH 6.8±0.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH 。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL 。121 ℃高压灭菌15 min 。
菌落总数检验操作规程 一、目的 建立菌落总数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。 二、适用范围 适用于菌落总数的检验操作。 三、职责 1.检验人员 严格按检验操作规程进行检验。 2.QC主管 监督检查执行情况。 四、程序 1.范围 本方法适用于食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定 2.术语和定义 菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 3.2冰箱：2 ℃～5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 3.4天平：感量为0.1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。 3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11放大镜或和菌落计数器。 4.培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1。 4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.2 4.3 无菌生理盐水：见附录A中A.3。 5.检验程序 菌落总数的检验程序见图1。 图1 菌落总数的检验程序 6.操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液 6.1.3用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支
执行编写部门：文件编号：替代版本： 编写人签名：年月日 审核人签名：年月日 批准人签名：年月日 分发部门：执行日期： 沉降菌检验标准操作规程 1.目的 本文件规定了洁净室（区）中沉降菌检验的操作方法，保证检验人员操作规范化、标准化，确保洁净室洁净度。 2.范围 标准规定了医药工业洁净区中沉降菌的测试条件、测试方法。本标准适用于医药工业洁净室（区），无菌室（区）（包括洁净工作台）的沉降菌测定。本公司规定对万级净化实验室沉降菌检测项目进行一星期/次的检验。 3．职责 QC操作人员、QC管理人员严格按照此规程执行；相关使用人员做好洁净室清洁维护工作。 4.内容 4.1. 定义 4.1.1.洁净室（区） 对尘埃及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其 使用均具有减少对区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。 4.1.2.洁净工作台 一种工作台或者与之类似的一个封闭围档工作区。其特点是自身能够供给经过过 滤的空气或气体，垂直层流罩、水平层流罩、垂直层流洁净工作、水平层流洁净 工作台、自净器等。 4.1.3.洁净度 洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子的允许统计数。 4.1.4.菌落 细菌培养后，由一个或几个细菌系列而形成的一细菌集落，简称CFU。通常用个
数表示。 4.1. 5.沉降菌 用本标准提及的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长 条件下繁殖到可见菌落数。 4.1.6.静态测试 洁净室（区）净化空气调节系统已处于正常运行状态，工艺设备已安装，洁净室（区）内没有生产人员的情况下进行的测试。 4.1.7.动态测试 洁净室（区）已处于正常状态下进行的测试。 4.2. 测试方法 4.2.1.方法概述 采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若 干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌 落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。4.2.2.测试仪器和设备 高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、培养皿。 4.2.3.培养基 营养琼脂培养基：培养基的准备及灭菌依照培养基配制及灵敏度测试标准操作规程准备。 4.2.4.测试步骤 4.2.4.1.采样 将已制备好的培养皿按5.3.4.1.3的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面 暴露于空气中0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。 4.2.4.2.培养 全部采样结束后，将培养皿倒置于在30～35℃生化培养箱中培养48h。每批 培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作 对照培养。 4.2.4.3.菌落计数 4.2.4.3.1用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5-10倍放大镜检
水中细菌总数的检测 1. 实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2. 菌落总数standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3. 培养基与试剂 2.1 营养琼脂成分 2.2 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经10 3.43 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌20 min，储存于冷暗处备用。 4. 仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、试管架等。放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5. 样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5 min，用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 地表水的取样：应取距水面10—15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6. 检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约15 ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48 h，进行菌落计数，即为1 ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取1 ml充分混匀的水样，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:10稀释液。 吸取1:10稀释液1 ml，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。用灭菌吸管吸取1 ml未稀释的水样和2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内，
题目：洁净区（室）沉降菌监测标准操作规程 编码：颁发部门：质量部 起草：日期：2015 年月日修订日期：年月日 审核：日期：2015 年月日生效日期： 2016 年月日 批准：日期：2015 年月日发放份数：版次：第 1 版 分发部门：质量部、中心化验室 1.目的：阐述洁净室空气中沉降菌检测操作规程，保证药品质量，防止生产环境 对产品的污染。 2.范围：适用于本公司洁净区 ( 室) 的沉降菌的监测。 3.责任：沉降菌检测员。 4.内容： 基本概念： 菌落 : 细菌培养后 , 由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落 , 简称 CFU.通常 用个数表示。 沉降菌：用 GB/T16292-2010 提及的方法收集空气中的活性微生物粒子，通过 专门的培养基在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。 沉降菌菌落数 : 规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以个 / 皿表示。 测试原理 : 本测试方法利用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒 子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培养皿中的菌落数来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 测试方法： 使用的仪器设备和培养基: 高压消毒锅 : 使用时应严格按照操作规程进行。
恒温培养箱 : 必须定期对培养箱的温度计进行检定。 培养皿 : 一般采用φ 90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿。使用前将培养皿置于121℃湿热灭菌 20min。 培养基 : 胰酪大豆胨琼脂培养基。 将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每 皿约 15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入32℃恒温培养箱中培养72 小时若培养基平皿上确无菌落生长即可供采样用，制备好的培养基平皿应在 2-8 ℃的坏境中存放。 测试时间 : 对单向流，如 A 级净化房间内及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运 行不少于 10 分钟后开始。 对非单向流，如 B 级、 C级、 D 级以上的净化房间，测试应在净化空调系 统正常运行不少于 30 分钟开始。 采样点数目及其布置 : 最少采样点数目 : 沉降菌的最少采样点数可按表 1 确定。在满足最少测点数的 同时，不宜满足最少培养皿数，见表 2 表 1 最少采样点数目洁 净度等级 2 面积（ m） A、B级 C 级D级 ＜10 2-3 2 2 ≥10- ＜20 4 2 2 ≥20- ＜40 8 2 2 ≥ 40- ＜ 100 16 4 2 ≥100- ＜200 40 10 3 注：表中的面积，对于单向流洁净室，指的是送风面积，对于非单向流洁净室，
水中细菌总数的检测 一、实验的目的要求 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 二、实验原理 细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 平板菌落计数法的优点： 能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。 缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。 生活饮用水细菌卫生标准 我国饮用水卫生标准： ≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水
三、实验仪器和材料 1、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱、冰箱、无菌接种间。 2、消毒酒精、消毒水。 3、试管、三角瓶、平皿、刻度吸管、涂布器等（实验前包扎灭菌处理好备用） 4、培养基 蛋白胨10g 牛肉膏3g 氯化钠5g 琼脂10~20g 蒸馏水1000ml 制备方法： 按照实际的需要量，按上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH 为7.4~7.6，，分装于玻璃容器中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，倒制成平板后储存于冷处备用。 5、水样：自来水、中水。 四、实验内容： （一）、培养基的制备： 实验前事先准备好培养基平板（方法见上），每小组2-4个平板。（二）、取水样： 1、自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌， 打开龙头放水1-2分钟，用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 2、纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用
细菌数量的测定方法 1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重
沉降菌测试方法 1、把ф90m m×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。 2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。 3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。 4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。 5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。 6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。 7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对非单向流，100000级以上净
化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min 后开始。 8、平均菌落数计算：M 1+M 2+M 3 平均菌落数= .........21n Mn M M ++ n —培养皿总数 M 1—1号培养皿菌落数 M 2—2号培养皿菌落数 M n —n 号培养皿菌落数 用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级≤1个；10000级≤3个；100000级≤10个）。若某洁净室内平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。 人员进出洁净生产区的一般程序： 人员进出无菌操作洁净生产区程序：
3M细菌总数测试片操作以及判读一、测试细菌总数操作方法 1、未开封时，冷 藏于≤8℃（≤46 ℉），并在保存期 内用完，高温度时， 凝固水可以排除，包装物最好于室温启开。2、已开封的，将封口以胶带封紧。 3、保存再封的袋 于≤25℃（≤77 ℉）和温度<5 0％，不要冷藏已 开启的包装袋，并于一个月内使用完。 4、制备1：10和更 大稀释的食物样品 稀释液，0称取或吸 取食物样品，置入适 宜的无菌容器内，如均质袋、稀释瓶、WhirlPak bag或者其他灭菌容器内. 5、加入适量的无 菌稀释液,包括Bu ffered peptone Buffer(IDF pho psphate buffer ,用0.0425g/L的KH2PO4调PH7. 2) 、0.1%的蛋白胶水(ISO方法68 87) 、缓冲蛋白胶水(ISO方法6579)、盐溶液(0.85-0.90%)、bisulfite -free letheen broth或蒸馏水. 不可使用含有枸橼酸盐、酸性亚硫酸盐或硫代硫酸盐的缓冲液. 因为它们能抑止菌生长。 6、搅拌或均质样品。 样品的稀释液调PH 6.5－ 7.2 对酸性样品的稀释 液用IN NaOH 对碱性样品用IN HCL调PH 7、将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。8、使用吸管将1mL 样液垂直滴加在测试片的中央处。 9、允许使用上层膜直接落下，切勿向下滚动上层膜。10、使用压板隆起面底朝下，放置在上层膜中央处。
11、轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。12、拿起压板，静置至少1分钟以使培养基凝固。 13、测试片的透明 面朝上，可堆叠至 20片，对有一定 湿度养箱能保持最 少份损失是需要的。14、可目视及用标准菌落计数器或其它的照明放大镜计数，并可参考判读卡计算菌落数。 15、可以分离菌落 作进一步鉴定，即 掀起上层膜，由培 养胶上挑取单个菌 落。 二、测试细菌总数判读方法 Aerobic bacter ia coun t=152 测试片 中含有 一种红 色指示 染剂可 使菌落着色,计算所有红色菌落(不论其大小和颜色深浅均计算之). Count=0 在petrifil m AC测试片上,很容易解释,图2测试片上没有任何菌落生长. Count= 16 图3示有不多的菌落. Count=1 43 Petrifilm AC测试片菌落数适宜计数范围是25 -250,见图 4
大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。 下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。 2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。 4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下： A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml 吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均