微生物实验报告
霉菌的培养及观察实验
刘欣怡201100140057
生物科学基地班
组别：周一下午三组
同组者：曹平平，周楠，
刘艺，刘希伟
实验完成时间：2012年11月12号
一、实验原理
1. 观察霉菌的菌落特征，学会霉菌的一般制作方法。
2. 观察并理解多种霉菌的个体形态及生长繁殖方式。
3. 进一步巩固无菌操作以及显微镜的使用
二、实验器材
1. 菌种：
黑曲霉，毛霉，青霉，根霉的培养 7d 的马铃薯琼脂平板培养物（小室培养）。
2. 仪器：
无菌操作台，分析天平，玻璃棒，三角瓶，小烧杯，加热炉，漏斗，纱布，培养皿，载玻片，盖玻片，U 型玻璃棒，解剖刀，镊子，接种环，移液管，酒精灯，火柴，显微镜等。
3. 试剂及培养基：
马铃薯培养基（其配方见附录），蔗糖，琼脂，去离子水100，现配的20%
甘油，酒精溶液等。
三、实验原理及方法
1、霉菌
霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝生长到一定阶段又可分化出繁殖菌丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10μm）,常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。（如果用水封片，常因渗透作用而膨胀，水也易使菌丝、孢子和气泡混为一团，影响观察。）
霉菌菌落特征：
A。因霉菌的菌丝较粗且长，故形成的菌落较疏松，常成绒毛状、絮状、蜘蛛网状或毡毯状，一般比细菌和放线菌菌落大几倍到几十倍。
B。在固体培养基上菌落最初往往是浅色或白色，当菌落上长出各种颜色的孢子后，由于孢子具有不同形状、构造和颜色，使菌落表面呈现肉眼可见的不同结构和色泽，如黄、绿、青、黑、橙等。
C。有些霉菌的菌丝还能分泌一些水溶性色素扩散到培养基内，使培养基正面和反面呈现不同的颜色。
D。同一霉菌在不同成分的培养基上可形成不同特征的菌落，但各种霉菌在固定的培养基上形成的菌落，其形状、大小、颜色等特征是稳定的，因此菌落特征是鉴定霉菌的重要依据之一。
2、观察方法
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本次实验采用载玻片培养观察法（小室培养法）。
3、载玻片培养观察法（小室培养法）
用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌
即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。
4、有隔菌丝和无隔菌丝：
5、关于本实验所用霉菌的初步认识及比较：
四、实验内容
根据本实验提供的四种霉菌，即根霉、毛霉、黑曲霉和青霉，运用小室培养的方法在28℃下正置培养这四种霉菌，一个培养皿中有两个琼脂小块，分别接种两种霉菌，一周后用显微镜观察这四种霉菌各自的形态特征，记录观察的结果并比较不同霉菌间形态特征上的区别
五、实验步骤
1、配制马铃薯培养基
配制100ml马铃薯培养基（PDA），其成分配比及配制方法见附录。将土豆去皮后切成小块，称取所需量的土豆块后将其放入盛有去离子水的小烧杯中，加热煮沸20分钟，期间可用玻璃棒进行搅拌。加热结束后，添加去离子水使烧杯中溶液为100ml。先用一层纱布（放置在另一个干净烧杯口）进行过滤，然后在用6层纱布过滤上一步中的滤液。最后，向其中加入称量好的糖和琼脂，把液体转移到锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸封口，然后放入灭菌锅中进行灭菌。
2、需要灭菌的其他器材
取6个干净的平皿，其中4套平皿中各放入一张滤纸片、一个U型玻璃棒，一个载玻片和4个盖玻片。将这6套平皿包在一起；选取两个2ml的滴管，分别用牛皮纸包好。
3、制作琼脂块
灭菌后，在酒精灯旁无菌操作倒培养基少量于灭菌培养皿（其底部已经画好了格子）中，静置冷却凝固成薄层。将已在酒精中浸泡一段时间的解剖刀取出，在酒精灯上进行灼烧。解剖刀稍稍冷却后，解剖刀沿着平皿底部已经划好的线切割该培养基，得到为若干1cm2左右的琼脂块。
4、无菌操作台的准备工作
打开无菌操作台的电源，打开通风开关和紫外线灯开关，关上两侧的玻璃门紫外线照射20分钟。实验操作开始前，关上紫外线灯并打开日光灯。稍打开玻璃门，能放入手的开口距离即可，放入酒精灯并点燃。实验操作过程中，一直通无菌风。
5、制作小室
在平皿底部铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上放一U型玻棒。在玻棒上放上一块载玻片。取方形琼脂块，将其移至载玻片上，载玻片两端各放置一块。小室培养的平皿如下图所示(图片是从课本照下来的)。
6、接种
在酒精灯上方进行无菌操作，将接种环灼烧两次后稍冷却，挑取很少量的菌落接种于琼脂块的边缘上，然后用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。一个培养皿中的U型玻璃棒上有一个载玻片，其上两边各放一个琼脂块，两个琼脂块都需要接种，而且接不同的霉菌,琼脂块上接种了霉菌后，要左右做好标记，以防弄混了各个琼脂块上的霉菌。
7、培养
两个琼脂块均接种后，用无菌镊子夹取平皿中的盖玻片盖在琼脂块上。然后，继续无菌操作去灭菌的2ml滴管在每个培养小室中的滤纸片上各滴加2ml的20%灭菌甘油,然后盖上皿盖,于27℃正置培养。
8、镜检观察
一周后，从培养箱中取出培养皿。直接取出载玻片放在显微镜上进行观察。先在低倍镜后高倍镜进行下观察并记录四种霉菌菌丝体及孢子的形态特征，必要时可换油镜观察。
9、实验完成
实验结束后，仪器归位并整理实验台。
六、实验结果
1、实验记录照片
黑曲霉观察视野（图中黑色球状边缘不规则）
青霉观察视野图（图中可以看到帚状孢子梗）
根霉在油镜下的观察视野（图中可以清晰地观察到囊轴和孢子囊）
毛霉观察视野（图中可清晰地看到完整的孢子囊和破裂的孢子囊）2、实验结果记录及对比表
青霉曲霉
根霉毛霉
七、实验结果分析
1、获得本实验成功的关键：
在载玻片培养观察中，注意无菌操作，接种量要少并尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。
2、区分毛霉和黑曲霉：
一般情况下，毛霉的孢子囊的表面光滑，其孢子都在孢子囊内，而黑曲霉的分生孢子梗膨大成球形，其表面有分生小梗，小梗顶端为一串串孢子。所以黑曲霉的球形部位是粗糙面，而且是不规则的球形。但是如果毛霉的孢子囊破裂，其中的孢子释放出来，则容易将该种毛霉和黑曲霉弄混。此时，要注意观察，因为黑曲霉分生孢子梗膨大的球形表面上的分生小梗长短不一，所以圆形边缘不规则，而且因为孢子是黑色所以不易看到其一个个的孢子，但是破裂的毛霉孢子囊处是孢子散落出一片，近乎无圆形可言，但是毛霉孢子近乎无色，相对容易看到其一个个的孢子（40倍物镜下可以清晰地看到一个个的孢子）。
毛霉菌丝无隔，黑曲霉菌丝有隔。
黑曲霉有足细胞，而毛霉没有。
3、由根霉的观察图可以看出：
根霉的营养菌丝体透明而且无隔，菌丝体交错勾连在一起，呈树根状；气生菌丝发达；营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，要找到两个假根才能找到匍匐枝；与假根相对处向上直立着生孢囊梗，其顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子；孢子囊表面光滑，其底部右半球型的囊轴。在本小组的实验结果中，能较好的观察到根霉孢子囊部分的结构，而且很清楚。对于假根和匍
匐枝这两个本来就不容易观察到的结构，在本班内观察到了
补充：根霉除了无性生殖外，还能进行有性生殖，即结合孢子，大致如下图所示。但是不容易观察到。
该图中两个菌丝间共同形成的孢子即结合孢子。（真正的菌丝是弯曲不规则的。）
八、实验注意事项
1、在使用无菌操作台前，要先打开通无菌风的开关，并打开紫外线灯照射20分钟，这样前期灭菌才彻底
2、打开紫外线灯后，一定要把两边的玻璃门合上，这样紫外线就不会泄漏出来。紫外线灯照射无菌操作台20分钟后，一定要关上再进行实验操作，否则会使眼睛受伤。
3、使用无菌操作台进行制作小室培养的培养皿时，注意要严格无菌操作，玻璃门开口要小，把手放入即可。
4、本实验中虽然在无菌操作台上进行制培养皿操作，但还是要在酒精灯上方进行，双重保险。
5、用马铃薯配培养基时，最好把马铃薯去皮后切成小块，这样放入去离子水中进行加热煮沸时马铃薯中的淀粉更容易溶解。
6、加热煮沸操作中，一开始可以先多加些水，因为要煮沸20分钟，期间会大量蒸发失水，而且，溶液不足100ml要添加去离子水。
7、灭菌时盖玻片不要堆积在一起，而且载玻片、盖玻片不要和平皿接触，防止和平皿粘在一起而不好用镊子夹取。
8、倒薄片时，培养基倒入培养皿中的量要少，制作成很薄的平板。
9、倒平板可以不用再无菌操作台上进行。
10、接种时尽可能将菌种接在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。
11、接种时确认有菌接上即可，接菌量不宜过多，会导致菌丝过密难以观察
12、注意，培养皿底部必需要加甘油，作用是保持培养皿内的湿度。
13、注意，培养皿底部放一小片圆形滤纸片，目的是防止加入的甘油随处流动而沾湿培养基中其他处。
14、注意，本次实验的培养皿要正置培养，千万不要倒过来。
15、解剖刀一定要先在酒精中浸泡，然后使用前在酒精灯上灼烧，保证灭菌彻底，以防在切割培养基时引入细菌。
16、解剖刀在灼烧后要稍稍冷却，否则过热的刀片接触到培养基会使接触处的培养基稍融化，不利于切割。
17、可以先在培养皿底部打上格子，边长1cm的正方形，然后再倒入培养基，静置冷去后沿线用解剖刀划开即可。
18、用灭菌的解剖刀挑起小块培养基，放在载玻片两端。
19、在向小块培养基上盖盖玻片时要注意不要产生气泡，以免影响以后观察。
20、可以直接从培养皿中取出载玻片。放到显微镜上观察。
21、用10倍到40倍的物镜进行观察即可，根据视野进行调整。
22、实验结束后，仪器归位，整理实验台。
九、实验思考题
1、黑曲霉和黑根霉在形态特征上有何区别？
答：①菌丝：根霉无隔有假根，曲霉无隔有足细胞。②孢子梗：根霉位于假根上，曲霉由气生菌丝分化而来。③孢子囊形态：根霉孢子囊表面平滑，曲霉表面不平滑，呈絮状。
2、如果要求对某霉菌不同发育时期（基内菌丝→气生菌丝→孢子丝或繁殖菌丝）进行连续观察，写出实验方案。
答：①选取对数期菌落进行同步培养，分化出处于同一生长阶段的菌。②接种，霉菌至少接五个小室。③培养观察：在适宜条件下培养，每隔一天在相同时间内取出一个盖玻片进行观察记录。
3、可以从哪几个方面进行霉菌菌落形态的观察和对比？
答：菌落的大小（局限生长还是蔓延生长，在培养基上的直径的大小和密度）；菌落的颜色（正面和反面各自的颜色，基质的颜色变化）；菌落的组织形态（絮棉状，蛛网状，绒毛状等，疏松或紧密，有无同心轮纹，有无放射状的绉褶）。
4、要想观察霉菌个体的形态结构，要如何操作？
答：在清洁的载玻片上滴加一滴乳酸酚棉兰液，用解剖针或镊子从菌落的不同部位挑取少许菌丝体，放入玻片上的乳酸酚棉兰液中，使菌丝在液中散开，加上盖玻片，在低倍镜或高倍镜下进行观察。
5、可从哪些方面识别毛霉和根霉？
答：菌丝有无分隔，孢子囊梗有无分支，孢子囊的形状、大小，囊轴的形状，囊托的有无，孢子囊孢子的形状和大小，有无假根，有无匍匐枝，有无结合孢子。
十、实验小结
本次实验，我们小组顺利完成并记录了实验结果。而且一些实验结果较好，比如清楚地观察到了根霉孢子囊部位的结构，囊轴很清楚；比如记录了完好以及破裂的两种毛霉孢子囊；清楚地观察到了黑曲霉的分生孢子梗以及其末端膨大后的球状物。而且，在实验中，我们把多个片在同时放在多个显微镜上并进行比较，根据各种霉菌的特征来一一核对视野中的霉菌，并尽力寻找这四种霉菌各自的全部特征，锻炼了我们的观察能力。但是美中不足的是，我们未能在本组的片子中观察到黑曲霉的足细胞，经分析原因可能是接种的菌量过大使得都长在一起，视野中大片黑；我们未能在自己的片子中找到根霉的假根和匍匐枝，但是我们在另一个小组的片子中进行了观察。
对于本次有关霉菌的实验，我学会了很多。我学会了一种培养霉菌进行观察的方法——小室培养法；我学习了很多关于霉菌的知识，尤其是根霉、毛霉、黑曲霉和青霉这四种酶的相关知识，并运用在本次实验的观察、识别、比较中，加深了自己对这四种霉菌的印象；我还学会了如何使用无菌操作台。除此之外，我还熟练并巩固了无菌操作以及显微镜的使用，自己的实验能力进一步提高。总之，我受益良多。
十一、参考文献
沈萍陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社
十二、附录
马铃薯培养基配比及制作
制作：马铃薯去皮,切成块煮沸20分钟,然后用纱布过滤，先是一层纱布，然后是六层纱布,补足水至100ml，加入糖和琼脂，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌30min。
油镜的使用和维护 目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯 原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。 步骤：显微镜油镜的使用和维护 1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。 2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。 3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。 4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。 5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸
擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。 6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。 革兰染色 目的：掌握革兰染色的原理及操作。 材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h 培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液 原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。 步骤： 1. 细菌标本的制作 （1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。 （2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。 （3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go 2微生物挑战性实验 2.1实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国菌株 （药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉 大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V 金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同） 德国 （S&M公
日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 至少选一种 发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 至少选两种 非发酵革兰氏阴性杆菌 变形菌属 日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋 葱假单胞菌荧光假单胞菌 至少选一种 酵母 恶臭假单胞菌 黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母 至少选一种 霉菌近平滑假丝酵母 黑曲霉 至少选一种 产芽砲菌 黄绿青霉 枯草芽砲杆菌 供选用 生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基 牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基
2.3试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡 摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4接种 2.4.1接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
微生物实验 微生物实验 细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察 一、实验目的 1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 2.掌握细菌的三种形态 3.掌握临床常见细菌的形态及染色 4.掌握细菌的特殊结构 5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点 二、实验原理 1. 普通光学显微镜（油镜）的使用 1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头 2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时 停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护 1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前 2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最 后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头 3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4.做好使用记录 3．微生物知识 1．细菌按形态分类： 球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2．细菌的基本结构 细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3．细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌 鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛 芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌 4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。 原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5．真菌 单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
微生物挑战性实验方法 1.0目的 新产品防腐效果的测试 2.0 范围 公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2微生物挑战性实验 4. 2. 1受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验 此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后
充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。 分析与检测 4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断 受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌
实验三环境微生物的检测 一、实验目的 1.了解周围环境中微生物的分布情况。 2.懂得无菌操作在微生物实验中的重要性。 3.了解四大类微生物的菌落特征。 二、实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。土壤、江河湖海、尘埃、空气、各种物体的表面以及人和动物体的口腔、呼吸道、消化道等都存在着各种微生物。由于它们体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。但是只要稍加留意，我们就可以在发霉的面包、朽木上看到某些微生物群体。这些现象表明，自然界只要有微生物可以利用的物质和环境条件，微生物就可以在其上生长繁殖。据此，我们在实验室里就可以用培养基来培养微生物。 培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行灭菌。所谓灭菌是指采用各类的物理或化学因素，使物体内外的所有微生物丧失其生长繁殖能力的措施。经过灭菌后的物体是无菌的。消毒是与灭菌完全不同的概念，它是指用较温和的物理因素杀死物体表面和内部病原微生物的一种常用的卫生措施。 灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在1.05kg/cm2的蒸汽压力下，温度可达121℃。一般只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本操作技术。为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。
实验五霉菌的形态观察、微生物的测微与计数 一．实验目的 1.学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，初步了解霉菌的形态特征及鉴别依据。 2.学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。 3.了解血球计数板的构造和使用方法。学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。 4.总结并掌握细菌、放线菌和霉菌的鉴别方法。 二、实验原理 1. 霉菌定义及用途 ?霉菌不是真菌分类中的名词，而是丝状真菌的统称。 ?霉菌在自然界中广泛分布，与食品的关系密切，是人类在实践活动中最早利用的一 种微生物，如早期进行的酱和酱油的制作等。 ?霉菌也可以使食品发生腐败变质或产生毒素，影响人体健康甚至危及生命。 2.霉菌特征 ?霉菌可产生分支的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化 产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。 ?菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。 ?霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗的多（约3-10um)，常是细菌菌体宽 度的几倍至几十倍。因此，用低倍镜即可观察。 3.霉菌的菌落 ?松：由于霉菌的菌丝较粗较长，菌丝体疏松，因而形成的菌落也比较疏松，呈绒毛 状、棉絮状或蜘蛛网状； ?大：菌落形态较大，一般比细菌和放线菌的菌落大几倍到几十倍，有时会长满整个 培养皿； ?干：外观干燥，不透明； ?挑：菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取； ?颜色：由于基内菌丝、气生菌丝、孢子颜色不同，不同的霉菌菌落表面呈现不同的 颜色，菌落正反面、边缘与中心颜色常不一致。 同一种霉菌在不同的培养基上或不同的培养条件下所形成的菌落特征可能有所不同。但同一种霉菌在相同的培养条件下和培养基上所形成的菌落特征相对稳定。菌落特征是霉菌鉴定的重要依据之一。 4、霉菌的菌丝形态 ?构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝的宽度一般为3-10μm，比放线菌菌丝宽 很多倍，其菌可伸长并产生分枝。 许多分枝的菌丝相互交织在一起，称为菌丝体。
化妆品微生物挑战试验 刘树葆臧跃扬桂菊 （天津化妆品科学技术研究皖有强公司） 摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。 关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。 目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。 评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。 １．实验方法 ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验 ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。 １．２试验仪器 恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。 Ｉ．３．培养基和试剂 生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。 ｌ＿４挑战用微生物 测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。 菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。 １．５待测样品 选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。 １．６接种的方式和数量 接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。 接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８。Ｃ（霉菌培养箱中培养。
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
正面 侧面 计数室（2个） 每个小格的面积 盖玻片下液体高度 微生物实验专题 一、探究酵母菌的呼吸方式【C 】 （一）、实验原理： 1. 酵母菌是兼性厌氧型生物，无氧和有氧呼吸都产生CO 2，无氧呼吸还能产生酒精。 2. 检测产生CO 2：→可使用澄清石灰水；或溴麝香草酚蓝溶液（现象：蓝→变绿→变黄）。 3．检测酒精产生：→用酸化的重铬酸钾。实验现象：溶液由橙色变为灰绿色。 （二）、实验设计（及方法步骤）：→设计如下图装置进行对照实验： 1. 设计成有氧条件（甲组）与无氧 条件（乙组）进行对照实验。 2. NaOH 溶液的作用是： →除去空气中CO 2，排除对实验干扰。 3. 培养液要进行灭菌，灭菌后的培养液 要冷却后才能接种酵母菌。 4. 进行乙组实验时，必须让B 瓶密封放置反应一段时间，才能将导管连通到澄清石灰水瓶中。 ★其目的是：→消耗掉瓶氧气，防止酵母菌进行有氧呼吸对实验结果的干扰。 5. 实验中要观察甲、乙组澄清石灰水的变化，并检测A 和B 瓶中有无酒精产生。 ★检测酒精时，要将重铬酸钾溶于浓硫酸溶液中进行酸化处理，再加入到被检测溶液中。 （三）、实验结果（现象）及其分析： 1. 甲、乙两组的澄清石灰水都变浑浊，甲组变浑浊快和程度大；说明酵母菌有氧和无氧条件下 都产生CO 2，有氧条件下比无氧条件下产生的CO 2多。注意：据该实验现象不能确定呼吸方式。 2. 检测酒精时，若A 瓶中无酒精产生（检测时不变灰绿），则说明A 瓶酵母菌只进行有氧呼吸； 若B 瓶中有酒精产生（检测时变灰绿）；则说明B 瓶中酵母菌进行了无氧呼吸。 二、探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化【C 】 （一）、实验原理： 1. 液体培养酵母菌时，种群的增长受培养液营养成分、空间（含氧量）、温度和pH 等因素的影响。 2. 在理想条件下，酵母菌种群的增长呈“J ”型曲线；在各种资源有限或者存在环境阻力的情况下， 酵母菌种群增长呈“S ”型曲线。◆酵母菌种群数量变化表现为：增长→保持稳定→衰减。 3. 对酵母菌进行观察计数，需要用到血球计数板和显微镜。★血球计数板构造如下图： （二）、实验设计（方法和步骤）： 1. 将10mL 无菌的5%的葡萄糖溶液加入试管。 2. 将酵母菌（干酵母）接种到试管培养液中， 将试管在 28℃条件下连续培养7天。 3. 采用抽样检测法，每天取样测定酵母菌数目， 每天抽测3次，取平均值。 【取样计数的操作方法】 （1）先将盖玻片盖在血球计数板计数室上，再用吸管吸取培养液滴于盖玻片边缘。 ★特别提醒：→吸取培养液前，要振荡几下试管，摇匀培养液（否则数据会偏差较大）。
细菌截留验证程序和方案形成 应使用标准方法确证膜过滤器的微生物截留能力。然而，对于某种产品来说，仅证明缺陷假单胞菌在水溶液中被截留，而不是在特定产品中，不足以验证此产品的除菌过滤工艺。 为了确定正确的挑战测试方法，应将测试微生物直接接种在承载流体（产品或替代品）中以证明其生存性。微生物应以与挑战实验中使用的同等方式培养，以保留其生物形态特征和生理特征。用于生存性研究的测试暴露时间应该等于或超过实际工艺过滤时间。 当测试微生物在产品中的生存性已经完成测试，就应该形成挑战方法和方案了。细菌挑战实验的条件应模拟实际生产工艺。既然细菌挑战实验通常都在实验室里进行，那么方法的规模也应相应调整。通量应调整到每单位面积的流速，表示为基于滤芯表面积的形式(ml/min)/cm2。如果过滤过程按压差控制，则挑战实验压差至少等同于最大工艺压差。如果制订方案过程中遇到关于测试方法可接受性的问题，则建议联系相关管理机构以获取指导。图1列出了在为特定过滤器和产品/工艺组合选择合适的验证策略时需要考虑的关键步骤。 （1）非杀菌性的工艺和流体 直接在产品中接种测试微生物是测试除菌级过滤器微生物截留能力的首 选方法。当产品和工艺流体被证明在产品和工艺条件下没有杀菌效力的时候，这样是可行的。在这些工艺中，应使用足够浓度的挑战微生物在产品中接种，而且要在实际工艺条件下，包括时间、压差、流速和其它关键变量（例如温度），应尽量减少稀释，以避免不必要的产品改变。 （2）抑菌的/杀菌的/非分散的挑战流体 在杀菌性的产品中进行细菌截留测试，使得与验证相关的一些问题更难回答，例如：产品对过滤器有什么影响，产品对其中的生物菌落有什么影响。在杀菌性产品中或是在不利于微生物活性的条件（例如，温度上升）下进行的细菌截留测试不一定能得到正确的结果。 为了评估产品/工艺对过滤器的潜在影响，可以使用产品和实际的工艺条件，包括流速、压差、温度和时间，对过滤器进行预处理。这种预处理可在一个闭路系统中将产品循环通过测试过滤器或者单路通过测试过滤器，接着对滤
山东大学实验报告2017年11月6日 ________________________________________ _________________________科目：微生物学实验题目：霉菌的培养及形态观察姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握观察霉菌形态的基本方法。 2.了解四类常见霉菌的基本形态特征。 二、基本原理 霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗的多（约为3-10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种： 1. 直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石碳酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染色制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；染色的蓝色能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。 2．载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌就在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期培养物。 3．玻璃纸培养观察法：玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表面，然后将霉菌接种于玻璃纸上，经培养，霉菌在玻璃纸上生长形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持霉菌的自然生长状态，也便于观察不同生长期的形态特征。
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人
申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
微生物学实验复习题 一、选择题 1.革兰氏染色的关键操作步骤是： A. 结晶紫染色 B. 碘液固定 C. 酒精脱色 D. 复染 2.放线菌印片染色的关键操作是： A. 印片时不能移动 B. 染色 C. 染色后不能吸干 D. A和C 3.高氏培养基用来培养： A. 细菌 B. 真菌 C. 放线菌 4.肉汤培养基用来培养: A. 酵母菌 B. 霉菌 C. 细菌 5.无氮培养基用来培养: A. 自生固氮菌。 B. 硅酸盐细菌 C. 根瘤菌 D. A、B 均可培养 E. A、B、C 均可培养 6.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加: A. 二甲苯 B. 水 C. 香柏油 7.常用的消毒酒精浓度为: A. 75% B. 50% C. 90% 8.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是: A. 20ml/M3 B. 6ml/M3 C. 1ml/M3 9.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是: A. 121℃/30min B. 115℃/30min C. 130℃/30min
10.巴氏消毒的工艺条件是: A. 62-63℃/30min B. 71-72℃/15min C. A.B. 均可 11.半固体培养基的主要用途是: A. 检查细菌的运动性 B. 检查细菌的好氧性 C. A.B. 两项 12.半固体培养基的琼脂加入量通常是: A. 1% B. 0.5% C. 0.1% 13.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是: A. 排冷气彻底 B. 保温时间适当 C. 灭菌完后排气不能太快 D. A-C 14.目镜头上的“K”字母表示: A. 广视野目镜 B. 惠更斯目镜 C. 补偿目镜 15.目镜头上的“P”字母表示: A. 平场目镜 B. 广视野目镜 C. 平场补偿目镜 16.物镜头上的“PL”字母表示: A.正低相差物镜 B.正高相差物镜 C.负高相差物镜 17.物镜头上的“UVFL”字母表示。 A. 无荧光物镜 B. 照相物镜 C. 相差物镜 18.镜头上标有“TC”字母的镜头是: A. 相差调整望远镜 B. 摄影目镜 C. 相差目镜 19. “PA”表示: A. 马铃薯培养基 B. 高氏培养基 C. 肉汤培养基 20.无菌室空气灭菌常用方法是: A. 甲醛熏蒸 B. 紫外灯照射
微生物实验注意事项 1.实验过程中要及时详细标清除产物和日期，实验做完以后要对以前的过度产品做个清 理，以免东西积累过多。 2.实验后的DNA和RNA要及时放回冰箱，以免时间长降解，特别是用水溶解的时候。 3.要及时甘油保存你鉴定出的细菌，每个细菌保存两份，存放在-80度冰箱里。 4.实验用的酶类虽然在室温下放一段时间也没什么问题，但还是要及时放回冰箱，以免 活性降低。 5.要及时清理实验台面，保持干净，整洁，有序。 6.无菌操作台用后及时清理干净，操作真菌和细菌等最好不要交叉使用。 7.培养基使用的时候要注意无菌操作，移液器不要插入培养基中，之准许无菌枪头进入 瓶子腔体，如培养基较少，可以倾斜瓶子，移液器取液体最好不要用到最大量程，以免吸液过猛导致与移液器接触。 8.灭好的培养基标签一定要写好，包括名称，日期，是否加抗生素，是否加抗生素非常 重要，特别是在共用培养基的实验室。 9.实验用过的试剂盖子一定要盖好，以免挥发。特别是有毒的物品，如氯仿，苯酚等， 用完后的瓶子及时拿出实验室。 10.带手套接触有毒物品后，要及时处理掉手套。不管是否接触过有毒物品，，不要戴着 手套乱接触其他东西，如开窗等。 11.做实验过程中不要接电话，说话，考虑其他事情。特别是PCR和配溶液的时候。做PCR 和配溶液的时候要把所用的试剂找全，一字排开，加完一种东西就把这种东西放到一边，可防止自己少加错东西。 12.同时作几个实验的时候一定要有定时器，防止自己忘记，特别是在煮东西，加热溶化 溶液等危险操作的时候，切忌。 13.饭前，有活动前不要做实验，这时候匆匆忙忙非常容易出错，特别是作有危险的实验， 更要注意。 14.作好试验记录，不管有没有结果，一定要坚持。还有点用图片，测序结果等，如果不 清楚记录东西多了，就乱了，混了。这个一定要认真做好。 15.要随时写下自己的想法，因为有些想法稍纵即逝。
霉菌的形态观察 一、【实验目的】 1、学习并掌握观察霉菌形态的基本方法 2、了解四类常见霉菌（曲霉、毛霉、青霉、根霉）的基本形态特征 二、【实验原理】 1、霉菌 霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3~10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。 2、观察方法 观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本次实验采用载玻片培养观察法（小室培养法）。 3、载玻片培养观察法（小室培养法） 用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。 三、【实验器材】 1、菌种：曲霉 ( Aspergillus sp. ) ，青霉，根霉 ( Rhizopus sp. ) ，毛霉（ Mucor sp. ），培养 7d 的马铃薯琼脂平板培养物 2、培养基：马铃薯培养基（简称PDA）（配方见附表） 3、仪器或其他用具：平皿，载玻片，盖玻片，无菌吸管，U 型玻棒，解剖刀，镊子， 50%乙醇，20%甘油，显微镜，接种环，酒精灯等 四、【操作步骤】 1、载玻片培养观察法（小室培养法） （1）、培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一Ｕ形 玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，包 扎后于110℃灭菌20~30分钟，烘干备用。 （2）、琼脂薄片的制作：取已灭菌的马铃薯琼脂培养基各6~7ml 注入另两个灭菌 平皿中，使之凝固成薄层。通过无菌操作，用解剖刀将其 切成 1cmx1cm的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻 片上（每片放两块 )。 （3）、接种：通过无菌操作，用接种环从斜面培养物上挑取很少量的孢子，接种
第一部分防腐挑战实验调研结果 1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。 2微生物挑战性实验 2.1 实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国德国菌株 (药典 ) (ISP 公司 ) (药典 ) (Henkel 公司 ) (S&M 公司 ) 白假丝酵母√√√√√ 黑曲霉√√√√√ 红色青霉√ 绿色木霉√ 绳状青霉√ 大肠埃希氏菌√√√√ 镉绿假单胞菌√√√√ 金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√ 产气肠杆菌√ 表皮葡萄球菌√ 日勾维肠杆菌√ 洋葱假单胞菌√√
肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√ 表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性菌至少选一种 表皮葡萄球菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种 变形菌属 日勾维肠杆菌 铜绿假单胞菌 洋葱假单胞菌 荧光假单胞菌 非发酵革兰氏阴性杆菌至少选一种 恶臭假单胞菌 黄杆菌属 不动杆菌属 白假丝酵母 酵母至少选一种 近平滑假丝酵母 黑曲霉 霉菌至少选一种 黄绿青霉 产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上
2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基 2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml ，此悬液再做 3 倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3× 108cfu/ml ）相同为止； 此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1×108cfu/ml 的菌悬液，做细菌 总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10 倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在190～ 210，落在此范围内的菌悬液为我 们所需的 1×108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4 接种 2.4.1 接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容 易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考 价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自 然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
摘要：对建立化妆品防腐体系的各种要素进行了分析，就国内外有代表性的微生物挑战试验的评价方法进行了比较，提出了符合实践情况并适用于我国化妆品行业的化妆品防腐体系的效能测试方法的评价标准，还为化妆品防腐体系筛选过程的快速判定提供了经验依据。 关键词：化妆品；防腐剂；防腐体系；微生物挑战试验 大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，环境中的微生物一俟进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。因此，一个良好的防腐体系，对于化妆品产品来说是必不可少的。 1 化妆品的防腐体系 化妆品的防腐体系实际上是由若干种防腐剂（和助剂）按一定比例构建而成。防腐体系的基本要素是防腐剂，但其效能大小又与其用量和使用对象的剂型（液态、粉状、乳状、膏霜状等）特性、组成（是否含碳水化合物、蛋白质、动植物抽提物等）、pH值、可能污染的微生物种类和数量等密切相关。 1.1化妆品防腐剂 早期使用的防腐剂有：尼泊金脂类、苯甲醇、烷基二甲基苄基铵氯化物、对氯间二甲酚、苯氧基乙醇、布罗波尔（Bronopol，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-丙二醇）、道维希尔200（Dowicil-200,六亚甲基四胺衍生物）、杰马-115(Germall-115，咪唑烷基脲)、脱氢醋酸、甲醛、山梨酸等。这些防腐剂至今很多仍在使用。近期推广商品化的化妆品防腐剂见表1。至于复配而成的防腐剂商品更是数不胜数。 防腐剂对微生物的最低抑制浓度（cmc）是判断一种防腐剂效果的首先考虑的基本指标，MIC值越小，表明其效力越高。表2是某些化妆品防腐剂对主要测试微生物的MIC。 表1一些化妆品防腐剂商品及化学成分 商品名称化学成分 Enxylk400 甲基二溴戊二腈和苯氧乙醇 Biopure100 咪唑烷基脲 Nipaguard DMDMH 二甲基二羟基乙内酰脲 Nipaguard TCC N-（4-氯苯基-N-3，4-二氯苯基）脲
1.使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察 油镜指的是为了减少高倍镜的折光，在物镜和玻片之间滴上松节油等。所以油镜其实就是给高倍镜物镜和玻片之间加油。而所有高倍镜之前都先要用低倍镜观察，是因为低倍镜下好找目标。低倍镜放大10倍，高倍镜放大40倍，油镜放大100倍，先用低倍镜、高倍镜，既便于找到目标，又方便调焦距。 要使显微镜视野明亮，除采用光源外，还可以采取哪些措施？ 加大聚光器光圈，同样设置下低倍物镜比高倍物镜视野亮 把材料切薄一点透光较好 使用滤光片，增加反差和清晰度。 向上调节聚光器。 2.怎样区别活性污泥中的几种固着型纤毛虫 大多数情况下，会遇到钟虫、柄纤毛虫、累枝虫等。三种虫形态均类似钟的形状，钟虫每个都是独立的，相互之间没有连接；柄纤毛虫类似钟虫，量很大，只是在根部汇聚在一根柄上，可以理解成一根柄上分出很多个钟虫；而累枝虫就像是树，一根柄上分出很多个柄，然后很多个柄上又分出很多个“钟虫”。 用压滴法制作标本片时注意什么问题 4.涂片为什么要固定，固定时应注意什么问题 如果不固定的话你进行染色后水洗去多余染料的同时会将菌体一并冲走 注意的就是不要弄死细胞咯！不知道你用什么方法，如果是用火，那就是不要烧死它们，用载玻片背面靠近火源，过两次就好。Over 一般我都是用酒精灯的外焰烤的但是要注意温度。温度过高挥出现变形细胞。温度已载玻片接触手背，手背不觉得烫为宜。加热只水分蒸发完全后，再在酒精灯外焰上通过两到三次，就成了。 革兰氏染色法中若只做1~4步，不用番红染液复染，能否分辨出革兰氏染色结果？为 什么？
革兰氏染色在微生物学中有何实践意义？ 细菌大多可以按照革兰氏法划分，在杀菌方面自然管用， 还有实验方面， 比方说，实验需要G阳性细菌作为研究材料，如果最后需要杀死细菌获取什么代谢产物，已知是G 阳性细菌，那就有目的地杀除了，摒除了盲目手段。 6.培养基是根据什么原理配制成的？肉膏蛋白胨琼脂培养基中的不同成分各起什么作用 是按照微生物生长的营养需求及其相互比例配制的。牛肉膏和蛋白胨提供微生物生长所需的蛋白质、核酸和维生素、无机盐（微量元素），琼脂只为培养基提供半固体的支撑结构，不提供微生物生长的营养。 有时，也根据所培养的微生物的特殊需要配制培养基，如特别提供某种营养素，或专门缺乏某种营养素，使微生物得以鉴别、分离。 配制培养基的基本步骤有哪些?应注意什么问题 按配方计算培养基中各种成分的用量→称量，（一般动作要迅速一些，因为其中可能有些成分容易吸潮）→溶化（将称好的各种成分溶解在水中，如果是固体培养基，需要使用凝固剂，如琼脂等，熔化时，注意搅拌，防止糊底）→调pH→灭菌（高压蒸汽灭菌）→倒平板 分离活性污泥为什么要稀释？ 答：活性污泥中的微生物种类繁杂，数量庞大。如果不经稀释就直接做分离培养，则培 养基上的菌落会因为数量过多而互相连结，分不清楚了，就达不到分离目的。 用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从那个浓度开始，为什么？ 答：应该从低浓度开始。从低浓度开始到高浓度是不会改变高浓度水样的浓度，如果从 高浓度开始则会影响低浓度水样 要使斜面的线条致密，清晰，接种时应注意哪几点？ 不要在已划线的地方重复划线，不要太用力划破培养基