油松花粉中总黄酮提取的响应面优化
杨志岩1，尹树花2，白明2，郭丽梅2
（1.天津科技大学现代分析技术研究中心，天津 300457）
（2.天津科技大学材料科学与化学工程学院，天津 300457）
摘要:以总黄酮得率为响应值，采用响应面实验设计方法(RSD)对油松花粉中总黄酮提取工艺进行研究。其最优提取条件为：温
度为80 ℃，溶剂乙醇浓度为56 %，液固比为17.9:1，加热3.2 h回流提取。在此条件下，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定的总黄酮
为1.49 %。
关键词:油松花粉；总黄酮；提取；响应面
中图分类号：TS201.2；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)03-0253-05
Optimization of Extraction of Total Flavonoids from Chinese Pine Pollen
by Response Surface Design(RSD)
YANG Zhi-yan1,YIN Shu-hua2, BAI Ming2,GUO Li-mei2
(1.Research Center of Modern Analysis, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China)
(2.College of Material Science and Chemical Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin
300457, China)
Abstract: The optimization of extraction of total flavonoids from Chinese pine pollen were studied by Response surface design (RSD). Results showed that the optimal reflex temperature, ethanol content, ratio of the liquid to solid and reflex extraction time were 80℃, 56%, 17.9:1
and 3.2h, respectively. Under these conditions, the yield of flavonoids was 1.49%.
Key word: Chinese pine pollen; total flavonoids; extraction; response surface
花粉是花蕊的精细胞，营养丰富，成分均衡，具有很高的药用价值和保健功能，广泛应用于保健品、药品、化妆品和饲料添加剂等领域[1~3]。油松花粉营养丰富、全面，含多种维生素、蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、单糖、多糖、黄酮、核酸、膳食纤维等营养物质被称“花粉之王”。黄酮具有很好的生理功能[4~7]，油松花粉中黄酮含量丰富，含量达1.6 %[8]，本文采用响应面试验设计方法(RSD)[9]对影响总黄酮得率的关键因素进进行了条件优化研究，并用“NaNO2- Al(NO3)3 -NaOH”方法测定了油松花粉中总黄酮的含量，为进一步分析研究油松花粉的营养成份奠定了基础。
响应面试验设计方法RSD是利用合理的试验设计采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归方程寻求最优工艺参数的一种实验设计方法和数据统计方法。
收稿日期：2007-11-01
作者简介：杨志岩（1956-），男，汉，河北滦南县人，高级实验师，主要从事天然植物成分提取、分离和分析方法的研究。 1 实验部分
1.1 试剂与仪器
芦丁对照品，中国（天津）药品生物制品检定所提供；油松花粉：河北承德畅达天然营养品有限公司提供；正己烷，95 %乙醇，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝等试剂均为分析纯。
D-8401多功能搅拌器；VIS-723G可见分光光度计；SHB-IV双循环水式多用真空泵；TDA-8 002水浴锅；FA2004N电子天平（分析）。
1.2 样品总黄酮的测定：参见文献[10]
1.2.1 标准曲线的绘制
1.2.1.1 对照样品溶液的制备
精密称取在120 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品200 mg,置100 mL容量瓶中，加乙醇70 mL，置水浴上微热使溶解放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得0.2 mg/mL的无水芦丁溶液。
1.2.1.2 标准曲线的制备
精密吸取芦丁对照溶液0.0 mL ，1.0 mL ，2.0 mL ，3.0 mL ，4.0 mL ，5.0 mL 和6.0 mL ，分别置于25 mL 容
量瓶中，，往容量瓶中加5 %NaNO 2溶液1 mL ，
使混匀，静置6 min ，加往容量瓶中10% Al(NO 3)3溶液1 mL ，摇匀，静置6 min ，往容量瓶中加4 %NaOH 溶液10 mL ，再加95 %乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min ，以水作参比，在510 nm 的波长处测定吸光度。芦丁溶液形成络合物后显色的紫外吸收图见图1。
图1 芦丁溶液显色后的紫外吸收图
Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of rutin solution
图2 芦丁对照品标准曲线
Fig.2 The calibration curve of control substance of rutin
以吸光度为横坐标,浓度为纵坐标绘制标准曲线,如图2。用MATLAB 线性回归,得芦丁浓度Y(mg/mL)与吸光度X 的关系为: Y=-0.35+4.286X(r=0.9998)。 2 结果与分析
2.1 单因素的确定
2.1.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响
图3 乙醇浓度对提取黄酮的影响
Fig.3 Influence of ethanol concentration to flavonoids
extraction
称取10g 花粉，液固比为10，分别用30 %、40 %、
50 %、60 %、70 %、80 %、95 %的乙醇，
在水浴50 ℃下回流提取2 h,过滤得滤液，减压蒸干液体，得样品，并测定样品的黄酮含量，结果见图3。
从图3可以看出，当乙醇浓度达到60 %时，黄酮的得率最高，因此选取适宜的乙醇提取浓度为50%~70 %。
2.1.2 温度对提取黄酮的影响
称取10 g 花粉，液固比为10，分别在常温，30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃相同浓度的乙醇溶剂条件下回流提取2 h,过滤得滤液，减压蒸干液体，得样品，并测定样品的黄酮得率，结果见图4。
图4 温度对提取黄酮的影响
Fig.4 Influence of temperature to flavonoids extraction
从图4知随着温度的逐渐升高黄酮得率随之升高，考虑到乙醇沸点（78.31 ℃），温度过高溶剂挥发严重，因此选适宜提取温度为60 ℃~80 ℃。 2.1.3 提取时间对提取黄酮的影响
称取10 g 花粉，液固比为10，在水浴50 ℃下分别回流提取1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h 、7 h 过滤得滤液，减压蒸干液体，得样品，并测定样品的黄酮得率，结果见图5。
图5 提取时间对提取黄酮的影响 Fig.5 Influence of time to flavonoids extraction
从图5知提取时间延长，黄酮得率升高，4 h 后黄酮得率基本变化不大，因此选适宜提取时间范围为2 h~4 h 。
2.1.4 液料比对提取黄酮的影响
称取10 g 花粉，液料比分别为5:1、10:1、15:1、
20:1、25:1、30:1、40:1、在水浴50 ℃条件下回流提取2 h，过滤得滤液，减压蒸干液体，得样品，并测定样品的黄酮得率，结果见图6。
图6 液料比对提取黄酮的影响
Fig.6 Influence of liquid-solid to flavonoids extraction
从图6知随着液固比的不断加大，黄酮得率随之升高，达到20:1后，得率增长缓慢，过大的溶剂用量加大回收溶剂时的能耗，因此选15~25为适宜液固比范围。
2.2 实验条件的优化
根据提取时间、溶剂浓度、温度、液固比4个单因素试验所确定的水平范围,使用Design-Expert 7.0.2为辅助手段设计响应面试验，选用中心复合模型(CCD) ，以总黄酮得率为响应值(指标值)，做四因素三水平共30个实验点(6个中心点)的响应面分析实验，表1为响应面实验因素水平表。表2为响应面实验数据表，表3为方差分析表。
为了处理数据的方便,各因素水平要化为标准函数。水平变换公式如下：
时间：A=A′－3
溶剂浓度：B=(B′－60)/10
温度：C=(C′－70)/10
液固比：D=(D′－20)/5
注：A′、B′、C′、D′均为实际水平，A、B、C、D则为参与分析的逻辑水平
从表3 可以看出, 模型是显著的(P<0.000 1) ，回归模型的决定系数为B(乙醇浓度)、C(水浴温度)、AB(时间与乙醇浓度的交互作用)、CD(温度与液固比的交互作用),它们的“Prob>F”值分别为0.0048、<0.0001、0.0133、0.0280，对黄酮得率影响显著，说明该模型的拟合度较好, 可用此模型得黄酮得率1.49%.
经回归拟合后, 试验因素对响应值的影响可用回归方程表示为:Y=1.34＋0.046A－0.073B＋0.12C＋0.026D－0.066AB－0.044AC＋0.012AD－0.006BC＋0.029BD－0.057CD－0.068A2－0.12B2＋0.032C2－0.063D2
表1 响应面实验因素水平表
Tab.1 Factorial levels of RSD
因素水平－1 0 ＋1
A:时间t /h 2 3 4
B:乙醇浓度/% 50 60 70
C:温度T/℃6070 80
D:液固比15 20 25
表2 响应面实验数据表
Tab.2 Datas of RSD
Std Run Type A B C D 总黄酮含量11 1 Fact -1 1 -1 1 1.05 30 2 Center0 0 0 0 1.41 18 3 Axial 1 0 0 0 1.29 7 4 Fact -1 1 1 -1 1.31 12 5 Fact 1 1 -1 1 1.06 24 6 Axial0 0 0 1 1.21 15 7 Fact -1 1 1 1 1.21
21 8 Axial0 0 -1 0 1.31
22 9 Axial0 0 1 0 1.41 3 10 Fact -1 1 -1 -1 0.67 20 11 Axial0 1 0 0 1.19 28 12 Center0 0 0 0 1.21 26 13 Center0 0 0 0 1.31 2 14 Fact 1 -1 -1 -1 1.17 17 15 Axial-1 0 0 0 1.23 10 16 Fact 1 -1 -1 1 1.21 4 17 Fact 1 1 -1 -1 0.89 19 18 Axial0 -1 0 0 1.23 16 19 Fact 1 1 1 1 1.11 14 20 Fact 1 -1 1 1 1.49 5 21 Fact -1 -1 1 -1 1.36 23 22 Axial0 0 0 -1 1.32 27 23 Center0 0 0 0 1.39 25 24 Center0 0 0 0 1.41 1 25 Fact -1 -1 -1 -1 0.86 6 26 Fact 1 -1 1 -1 1.39 8 27 Fact 1 1 1 -1 1.04 13 28 Fact -1 -1 1 1 1.12 9 29 Fact -1 -1 -1 1 1.01 29 30 Center0 0 0 0 1.34
经软件对表2中实验数据分析后发现用二阶多项
式回归模型较优。
表3 方差分析表 Tab.3 Analyze of mean square
方差来源
平方和
自由度
均方
F 值
Prob>F
Model 0.87 14 0.062 7.14 0.0003 A 0.038 1 0.038 4.37 0.0539 B 0.095 1 0.095 10.900.0048 C 0.27 1 0.27 31.02
<0.0001
D 0.012 1 0.012 1.34 0.2645 AB 0.069 1 0.069 7.88 0.0133 AC 0.032 1 0.032 3.60 0.0771 AD 2.256E-003 1 2.256E-003 0.26 0.6189 BC 7.563E-004 1 7.563E-004 0.086
0.7728
BD 0.014 1 0.014 1.58 0.2282 CD 0.052 1 0.052 5.92 0.0280 A2 0.012 1 0.012 1.35 0.2626 B2 0.036 1 0.036 4.10 0.0611 C2 2.715E-003 1 2.715E-003 0.31 0.5857 D2 0.010 1 0.010 1.16 0.2981 残差 0.13 15 8.748E-003
失拟性 0.10 10 0.010 1.69 0.2925
纯误差 0.030 5 0.006 总差
1.01 29
注:“Prob>F”值如果小于0.05,说明对应的因素对响应值影
响显著。
从表3的分析中得出本实验中显著的交互影响是AB 的交互作用和CD 的交互作用，实验结果见图7，8。从图7看出，随着A （时间）的增加黄酮的得率增加，达到0.5后增加的趋势减慢，并趋于平缓，而B （乙醇浓度）对黄酮得率影响的变化趋势则是随着B 的增加先增加后降低，从相应面的图示可以看出，B 在0到－1.0的范围内，由A 的交互作用，黄酮的得率较高。从图8看出，随着C(温度)的增加黄酮得率增加。D(液固比)对黄酮得率影响的变化趋势，受C 的交互作用的影响，当C 在很低的数值时，随D 值的增加而增加，当C 值增加到一定数值时，随D 值的增加先增加后减小。
从上述回归模型中求最优后所得条件为：反应时间为3.2 h ，乙醇浓度为56 %，反应温度为80 ℃，固液
比为17.9，预测黄酮得率最大值为1.5133 %
。实验进
行验证，得黄酮得率分别为1.49 %，1.51 %，1.48 %，重复性较好。
图7 时间与浓度交互作用对黄酮得率影响响应面
Fig.7 Response Surface of interrelated influence of time and
concentration to flavonoids rate
图8 温度与液固比交互作用对黄酮得率影响响应面
Fig.8 Response Surface of interrelated influence of temperature
and liquid-solid to flavonoids rate
3 小节
响应面法克服了正交设计只能处理离散的水平值,
而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷。本文考察了油松花粉总黄酮的提取, 通过单因素实验考察了提取时间、乙醇浓度、水浴温度、液固比对总黄酮得率的影响，应用响应面设计法优化出其最佳提取乙醇浓度56 %，提取时间3.2 h ，液固比17.9，水浴温度80 ℃，得到油松花粉中的总黄酮含量为1.49 %。 参考文献
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(下转第252页)
图2 木瓜黄酮的紫外光谱特征图
Fig.2 Ultra-Violet Spectrometry of pawpaw flavoids
图3 芦丁标准品的紫外光谱特征图 Fig.3 Ultra-Violet Spectrometry of rutin
木瓜提取物的紫外吸收峰如图2所示，从图可以看出，木瓜提取物的主要吸收峰为221 nm 、278 nm 、330.6 nm 。其中278 nm 的吸收峰说明木瓜提取物中有A-环苯酰系统，330.6 nm 的吸收峰说明木瓜提取物有B-环肉桂酰系统，而另外一个峰可能为一些未分离开的杂质引起的，图谱特征与对照品相似，这一图谱特征说明了木瓜提取物具有类黄酮化合物C 6-C 3-C 6的基
本结构。 4 结论
对纯化提取物的分析结果表明：木瓜黄酮的含量（以芦丁标准品计）为4.8%，对其紫外光谱特征谱图的观察分析发现：木瓜提取物中含有A-环苯酰结构和B-环肉桂酰结构，图谱特征与对照品芦丁相似，这一图谱特征说明木瓜提取物具有类黄酮化合物C6-C3-C6的基本结构。 参考文献
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92 2012, V ol.33, No.24 食品科学 ※工艺技术 响应面法优化酵母多糖的提取工艺 王 慧1,2，程富胜3，罗永江3，董鹏程3，张 霞1,* (1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；3.中国农业科 学院兰州畜牧与兽药研究所-农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)摘 要：为提高酵母多糖提取率，对其提取过程进行优化。在单因素试验的基础上，利用中心组合试验设计原理，以高压时间、超声功率和超声时间为试验因素，以多糖提取率为响应值，采用3因素3水平的响应面分析法建立数学模型，获得最佳提取工艺。通过二次回归模型响应面分析得出酵母多糖提取的最佳工艺条件为高压时间35min 、超声功率510W 、超声时间26min ；在此条件下，多糖提取率的预测值为29.82%，验证值为29.84%。证明采用响应面法对酵母多糖提取条件进行优化，方法可行，可用于实际操作与实验预测。关键词：酵母多糖；响应面法；提取；优化 Optimization of Polysaccharide Extraction from Yeast by Response Surface Methodology WANG Hui 1,2，CHENG Fu-sheng 3，LUO Yong-jiang 3，DONG Peng-cheng 3，ZHANG Xia 1,* (1. College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China ； 2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China ； 3. Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Discovery, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of New Animal Drug Project, Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730050, China) Abstract ：Response surface methodology was used to optimize polysaccharide extraction from yeast to enhance polysaccharide yield. Polysaccharide yield was investigated with respect to high pressure treatment time, ultrasonic power and ultrasonic treatment time. A quadratic regression model was established based on a three-variable, three-level Box-Behnken design. The optimum conditions of high pressure treatment time, ultrasonic power and ultrasonic treatment time were found to be 35 min, 510 W and 26 min, respectively. Under these conditions, the predicted value of polysaccharide yield was 29.82%, whereas the actual value was 29.84%. Thus, the optimized extraction procedure is feasible for practical operation and experimental prediction. Key words ：yeast polysaccharide ；response surface methodology ；extraction ；optimization 中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)24-0092-05 收稿日期：2011-11-29 基金项目：甘肃省科技支撑项目(0708NKCA082；090NKCA070)；甘肃省农业生物技术项目(GNSW-2007-12；GNSW-2010-07) 作者简介：王慧(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为动物生理学及药物免疫学。E-mail ：wang_hui_1011@https://www.doczj.com/doc/742793818.html, *通信作者：张霞(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为动物生理药理学。E-mail ：zhxcfs@https://www.doczj.com/doc/742793818.html, 微生物多糖是目前生物发酵工程和生物医药领域的研究热点之一[1]。现代科学研究表明，绝大多数真菌多糖都具有一定的生物学活性，其生理活性物质既可存在于子实体中，也可存在于培养菌丝体和发酵液中[2]。酵母(yeast)是一类与人类生产生活密切相关的真核微生物，在其细胞膜的外面包裹着一层厚度为100～400nm 的细胞壁[3]，酵母细胞壁干质量的近75%为多糖[4]，其中50～60%为β-D -葡聚糖[5]。酵母多糖在抗炎、抗诱变、抗氧化、抗肿瘤、促生长、免疫促进等方面发挥着重要的生物活性作用[6-9]，是一种很有发展前景的饲料添加剂和具有抗生素兼益生素双重作用的免疫促进剂。但由于酵母细胞壁独特的结构，使其破壁不易，给相关科研工作的开展带来不少的 困难。目前，酵母多糖有效成分提取的方法较多，如研磨法、冻融法、高压均质法、超声波法、碱溶法、常规水提法、索氏提取法等[10-11]，这些传统方法存在着提取温度高、时间长、能耗大、活性受损、提取率低等不足。对于将冻融法、高压均质法、超声波法、碱溶法综合为一体的提取方法目前还未见报道。响应面法(response surface methodology ，RSM)利用合理的试验设计并通过试验得到一定的数据，采用多元二次回归的方法，将多因子试验中因子指标的相互关系用多项式近似拟合，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，以最经济的方式、较少的试验次数和时间对所选试验参数进行全面的分析和研究，已
Design-Expert 软件在响应面优化法中的应用 （王世磊郑州大学450001） 摘要：本文简要介绍了响应面优化法，以及数据处理软件Design-ExpertDesign-Expert的相关知识，最后结合实例，介绍该软件在响应面优化法上的应用实例。 关键词：数据处理，响应面优化法，Design-Expert软件 1.响应面优化法简介 响应面优化法,即响应曲面法( Response Surface Methodology ，RSM)，这是一种实验条件寻优的方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题。它囊括了试验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等众多试验和统计技术；通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制、可方便地求出相应于各因素水平的响应值[1]。在各因素水平的响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件。 响应面优化法，考虑了试验随机误差；同时，响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法[2]。 响应面优化法，将实验得出的数据结果，进行响应面分析，得到的预测模型，一般是个曲面，即所获得的预测模型是连续的。与正交实验相比，其优势是：在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，而正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析。 当然，响应面优化法自然有其局限性。响应面优化的前提是：设计的实验点应包括最佳的实验条件，如果实验点的选取不当，使用响应面优化法师不能得到很好的优化结果的。因而，在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素与水平。 结合文献报道，一般实验因素与水平的选取，可以采用多种实验设计的方法，常采用的是下面几个： 1.使用已有文献报道的结果，确定响应面优化法实验的各因素与水平。 2.使用单因素实验[3]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 3.使用爬坡实验[4]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 4.使用两水平因子设计实验[5]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 在确立了实验的因素与水平之后，下一步即是实验设计。可以进行响应面分析的实验设计有多种，但最常用的是下面两种：Central Composite Design-响应面优化分析、Box-Behnken Design-响应面优化分析。 Central Composite Design，简称CCD，即中心组合设计，有时也成为星点设计。其设计表是在两水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，通常实验表是以代码的形式编排的,实验时再转化为实际操作值（,一般水平取值为0,±1,±α,其中0为中值,α为极值, α=F*（1/ 4）； F 为析因设计部分实验次数, F = 2k或F = 2 k×（1/ 2 ），其中 k为因素数，F = 2 k×（1/ 2 一般 5 因素以上采用，设计表有下面三个部分组成[6]：(1) 2k或 2 k×（1/ 2 ）析因设计。(2)极值点。由于两水平析因设计只能用作线性考察,需再加上第二部分极值点,才适合于非线性拟合。如果以坐标表示,极值点在相应坐标轴上的位置称为轴点(axial point) 或星点( star point) ,表示为(±α,0,…, 0) , (0,±α,…, 0) ,…, (0, 0,…,±α)星点的组数与因素数相同。(3)一定数量的中心点重复试验。中心点的个数与CCD设计的特殊性质如正交
植物黄酮类化合物提取与分离研究进展 摘要：结合目前已报道的多种植物黄酮类化合物提取与分离的技术方法，对植物黄酮类化合物提取与分离研究进展进行了综述。 关键词：植物黄酮类化合物；提取；分离 中药主要起源于我国，我国对其有着悠久的研究历史。中药作为中华民族的瑰宝，为中华人民和世界人民的健康做出了巨大的贡献。尤其是近年来随着西药毒副作用的日益明显，以及对中药学研究的深入，中药学引起了人们越来越多的兴趣和重视。黄酮类化合物是中药的有效成分之一，物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花叶部位，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科、与菊科等。许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，除利用其抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有显著效果所以提取分离出具有较高生物活性的黄酮类化合物对医药及食品工业是十分重要的。关于黄酮类化合物提取及分离、纯化方法的研究报道很多，总结起来主要包括以下几个方面的内容。 1黄酮类化合物的提取方法 1.1溶剂提取法 包括有机溶剂提取法、水提取法及碱水提取法三种。 1.1.1有机溶剂提取法 对苷类和极性较大的苷元如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等,常用某些极性较大的溶剂如甲醇、乙醇或混合溶剂提取,对大多数苷元则用乙醚、氯仿、乙酸乙酷等极性较小的溶剂提取。虽然有机溶剂对黄酮的提取率高,但缺点是（1）大多有机溶剂都易燃易爆;（2）多数有机溶剂有毒或具有强刺激性,会危害人体和污染环境;(3)一般成本较高。
邵金华等[1]人以桂花叶为原料,采用有机溶剂提取法对桂花叶中黄酮类化合物的提取工艺进行研究,通过单因素试验研究了不同浸提溶剂,提取时间,提取温度,乙醇体积分数,固液比对桂花叶黄酮提取率的影响,采用正交试验优化得出桂花叶中黄酮类化合物提取的最佳工艺条件为:浸提时间2h,提温度85℃,乙醇体积分数75%,固液比1︰20(g/mL),在该条件下桂花叶黄酮提取率达1.926%。 1.1.2水提取法 由于黄酮苷类物质易溶于水，所以对黄酮苷类物质含量较高的原料，可以采取热水提取法。浸提、煮提均可。但由于水的极性大，易把蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液存放时，易腐败变质，为后续的分离带来困难，但是因为消耗溶剂的成本比其他方法低，设备简单，仍为一种可取的提取方法。 李秀信等[2]以紫苏茎为实验材料，按如下步骤：称取干燥样品10g,加人20倍样重的水,在水浴锅恒温90℃提6h,趁热过滤,渣重提1次。合并滤液,浓缩至一定体积,加人无水乙醇,使多糖、蛋白质等大分子沉淀,过滤,继续浓缩直至加人无水乙醇后无絮状沉淀产生,将滤液浓缩至膏状,将浸膏在50一60℃烘箱中烘干,得粗黄酮,称重,最后算粗提物中黄酮含量。实验测得黄酮的提取率为19.6%，略低于同时进行的80%乙醇提取法所得的2.138%和60%丙酮提取法所得的2.0064%。 另外，阮俊等[3]以野菊花为实验材料得到水提法的最佳工艺：即野菊花用水提取2次,水的用量依次为8、6倍,提取温度100°C,提取时间为40、40min。 1.1.3碱水提取法 由于黄酮类化合物大多具有酚羟基，其易溶于碱水而在酸水中溶解度较小。因此，在提取黄酮类化合物时，可先用碱水浸出;然后再酸化提取液;这样可使黄酮类成分形成沉淀析出。常用的提取碱水溶液有饱和石灰水和氢氧化钠水溶液。但建明等[4]:应用正交设计法,考察氢氧化钠浓度、体积、提取温度、提取时间等因素对甘草黄酮提取率的影响。实验结果表明最佳提取工艺条件为:氢氧化钠的浓度为0.2mol L,甘草渣提取剂为1∶14,提取温度为90℃,提取时间为0.5h。此提取条件下的提取率高达96%。
中草药叶下花总黄酮提取方法 作者：杨发忠，杨斌，杨德强，陈厚琴，代红娟，张丽，李东海 【摘要】目的对叶下花总黄酮的种类与提取方法进行初步研究。方法采用定性检测、光谱分析、单因素测定、正交实验等，研究黄酮种类，考察乙醇体积分数、温度、固液比、时间对提取率的影响。结果叶下花含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等多种黄酮类化合物；所考察的影响因素中，对总黄酮提取率影响程度大小顺序为乙醇体积分数＞温度＞时间＞固液比。结论最佳提取条件为A1B2C3D3 (乙醇体积分数30%、温度65℃，提取时间180 min，固液比1∶80)，在此提取条件下，提取量高达5.233%。 【关键词】叶下花总黄酮提取方法正交实验 Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction conditions for the total flavonoids from Ainsliaea pertyoides Franch and to study the categories of the total flavonoids. MethodsThe methods of the chemical qualitative detection, the spectral analysis, single factor determination, orthogonal test were adopted to study the categories of the total flavonoids, and the effect of four factors, i.e. the volume fraction of ethanol, the temperature, the ratio of solid to liquid, the
食品科学研究中实验设计的案例分析 ——响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸 班级：学号：姓名： 摘要：本文简要介绍了响应面曲线优化法的基本原理和使用步骤，并通过软件Design-Expert 7.0软件演示原文中响应面曲线优化法的操作步骤。验证原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》各个数据的处理过程，通过数据对比，检验原文数据处理的正确与否。 关键词：响应面优化法数据处理 Design-Expert 7.0 车前草 前言： 响应曲面设计方法(Response SufaceMethodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法（又称回归设计）。 响应面曲线法的使用条件有：①确信或怀疑因素对指标存在非线性影响；②因素个数2-7个，一般不超过4个；③所有因素均为计量值数据；试验区域已接近最优区域； ④基于2水平的全因子正交试验。 进行响应面分析的步骤为：①确定因素及水平，注意水平数为2，因素数一般不超过4个，因素均为计量值数据；②创建“中心复合”或“Box-Behnken”设计；③确定试验运行顺序(Display Design)；④进行试验并收集数据；⑤分析试验数据；⑥优化因素的设置水平。 响应面优化法的优点：①考虑了试验随机误差②响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量，解决生产过程中的实际问题的一种有效方法③与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。 响应面优化法的局限性: 在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素和水平。因为响应面优化法的前提是设计的试验点应包括最佳的实验条件，如果试验点的选取不当，实验响应面优化法就不能得到很好的优化结果。 原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》采用经典的三因素三水平Box-Behnken 试验设计，以熊果酸的提取率为响应值，通过回归分析各工艺参数与响应值之间的关系，并由此预测最佳的工艺条件。本文利用软件验证原文中的数据处理过程，以检验原文数据是否处理正确。 1 确定实验因素 原文利用超声波辅助提取车前草中的熊果酸，而影响熊果酸提取率的因素有很多，如超声波的功率、提取时间、溶剂温度、溶剂种类、液固比等。原文参考文献《柿叶中总三萜的提取以及熊果酸分离, 纯化研究》中提取熊果酸的方法提取熊果酸，即将干燥的车前草粉碎后过筛，取20～40 目的车前粉，用石油醚在 55℃脱脂 3 次，干燥备用。精密称取一定量的车前粉，加入一定量的乙醇，称量，在一定的超声波功率下提取一定时间后，擦干外壁，再称量，用乙醇补充缺失的质量，离心。用注射器抽取一定量上清液，过 0.45μm 滤膜，进行检测。每个实验进行 3 次平行实验。取其平均值。结果以提取率(E)的来表示。
总黄酮的提取方法 1、熔剂法热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法 2、微波提取法微波提取是利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异，使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被提取物质从基体或体系中分离，进入介电常数较小，微波吸收能力相对差的提取剂[1]。这种方法的优点是对提取物具有较高的选择性、提取率高、提取速度快、溶剂用量少、安全、节能、设备简单 3、超声波提取法用超声波提取法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。原理是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外，还利用其次效应，如机械振动、扩散、击碎等，使其加速被提取成分的扩散、释放。超声波提取法具有设备简单，操作方便，提取时间短，产率高，无需加热，同时有利于保护热不稳定成分，省时，节能，提取率高的优点。 4、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是利用超临界流体处于临界温度和临界压力以上，兼有气体和液体的双重特点，对物质具有良好的溶解能力，从而作溶剂进行萃取分离。可做超临界流体的物质很多，一般为低分子量的化合物，如CO2、C2H6、NH3、N2O 等。目前多采用CO2 做萃取剂，因为它具有密度大、溶解能力强、临界压力适中、临界温度接近常温、不影响萃取物的生理活性、无毒无味、化学性质稳定、生产过程中容易回收、无环境污染、价格便宜等一系列优点。但单一的CO2作萃取剂只对低极性、亲脂性化合物有较强的溶解能力，对大多数极性较强的组分则不起作用，因此，在其中加入夹带剂，通过影响溶剂的密度和溶质与夹带剂分子间的作用力来影响溶质在二氧化碳流体中的溶解度和选择性[15]。超临界流体萃取技术有许多传统分离技术不可比拟的优点：过程容易控制、达到平衡的时间短、萃取效率高、无有机溶剂残留、对热敏性物质不易破坏等[16]。但它所需要的设备规模较大，技术要求高，投资大，安全操作要求高，难以用于较大规模的生产。 5、酶法提取酶解法适用于被细胞壁包围的黄酮类物质，利用酶反应的高度专一性，破坏细胞壁，使其中的黄酮类化合物释放出来。黄剑波等[22]采用纤维素酶辅助法从甜茶中提取黄酮类化合物，黄酮类物质的提取率为91%，提取纯度为54%。王悦等[23]对桔皮细胞进行游离酶、固定化酶和常规法提取，黄酮得率分别是%，% 和%，和传统的方法相比，游离酶法的总黄酮得率提高了81%。
食品科学研究中实验设计的案例分析 —响应面法优化超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究 摘要：选择对ACE 抑制率有显著影响的四个因素：超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4)，进行四因素三水平的响应面分析试验，经过Design-Expert优化得到最优条件为超声波处理时间28.42min、超声波功率190.04W、超声波水浴温度55.05℃、酶解时间2.24h，在此条件下燕麦ACE 抑制肽的抑制率87.36%。与参考文献SAS软件处理的结果中比较差异很小。 关键字：Design-Expert 响应面分析 1.比较分析 表一响应面试验设计 因素 水平 -1 0 1 超声波处理时间X1(min) 20 30 40 超声波功率X2(W) 132 176 220 超声波水浴温度X3(℃) 50 55 60 酶解时间X4(h) 2.Design-Expert响应面分析 分析试验设计包括：方差分析、拟合二次回归方程、残差图等数据点分布图、二次项的等高线和响应面图。优化四个因素（超声波处理时间、超声波功率、超声波水浴温度、酶解时间）使响应值最大，最终得到最大响应值和相应四个因素的值。 利用Design-Expert软件可以与文献SAS软件比较，结果可以得到最优，通过上述步骤分析可以判断分析结果的可靠性。 2.1 数据的输入
2.2 Box-Behnken响应面试验设计与结果 2.3 选择模型
2.4 方差分析 在本例中，模型显著性检验p<0.05，表明该模型具有统计学意义。由图4知其自变量一次项A，
B，D，二次项AC,A2,B2,C2,D2显著(p<0.05)。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本例P值为0.0861>0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。 图 5 由图5可知：校正决定系数R2(adj)(0.9788>0.80)和变异系数（CV）为0.51%，说明该模型只有2.12%的变异，能由该模型解释。进一步说明模型拟合优度较好,可用来对超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究进行初步分析和预测。
黄酮提取工艺 2-1 微波辅助提取金银花总黄酮工艺流程图 3.实验方法 3.1 标准曲线的制备 3.1.1最大吸收波长的选择方法 以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510nm处均有1个强吸收峰，因此选择510nm为测定波长。 3.1.2对照品溶液的制备方法 精密称取芦丁对照品10.2mg置50mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。 3.1.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分别置10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置15min。采用分光光度法，在510nm处测定吸光度，以对照品量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3.2 微波提取单因素实验方法 分别考察不同的微波辐射功率,辐射时间,乙醇浓度,固液比对提取效果的影响 3.3 提取工艺正交试验设计方法 系统考察微波提取法的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用微波辐射功率（A），辐射时间（B），乙醇浓度（C），固液比（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用L9（34）正交表设计，得到供试液。 3.4微波辅助提取法与乙醇回流法比较 比较两种提取方法的处理时间和液固比对总黄酮提取量的影响。传统乙醇回流法提取总黄酮的所需时间比微波辅助提取法提取长得多，且金银花总黄酮提取量比较低;而微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。比较此两种方法在最佳条件下的总黄酮含量。 3.5总黄酮含量测定方法 取0.5mL液，加入5%亚硝酸溶液0.3mL荡摇匀，放置6min加入10%硝酸铝0.3mL荡摇匀，放置6min入4%氢氧化钠试液4mL，30%（V/V）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min分光光度法，在510nm定吸光度值由标准曲线计算得总黄酮含量。 4. 结果 4.1 标准曲线绘制 表4-1 标准曲线表 编号 0 1 2 3 4 5 芦丁浓度 0 0.02 0.03 0.05 0.07 0.09 （mg/mL） 吸光度 0 0.206 0.381 0.548 0.738 0.911 （OD）
响应面优化实验方案 设计
食品科学研究中实验设计的案例分析 ——响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸 班级：学号：姓名： 摘要：本文简要介绍了响应面曲线优化法的基本原理和使用步骤，并通过软件Design-Expert 7.0软件演示原文中响应面曲线优化法的操作步骤。验证原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》各个数据的处理过程，通过数据对比，检验原文数据处理的正确与否。 关键词：响应面优化法数据处理 Design-Expert 7.0 车前草 前言： 响应曲面设计方法(Response SufaceMethodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法（又称回归设计）。 响应面曲线法的使用条件有：①确信或怀疑因素对指标存在非线性影响；②因素个数2-7个，一般不超过4个；③所有因素均为计量值数据；试验区域已接近最优区域；④基于2水平的全因子正交试验。 进行响应面分析的步骤为：①确定因素及水平，注意水平数为2，因素数一般不超过4个，因素均为计量值数据；②创建“中心复合”或“Box-Behnken”设计；③确定试验运行顺序(Display Design)；④进行试验并收集数据；⑤分析试验数据；⑥优化因素的设置水平。
响应面优化法的优点：①考虑了试验随机误差②响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量，解决生产过程中的实际问题的一种有效方法③与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。 响应面优化法的局限性: 在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素和水平。因为响应面优化法的前提是设计的试验点应包括最佳的实验条件，如果试验点的选取不当，实验响应面优化法就不能得到很好的优化结果。 原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》采用经典的三因素三水平Box-Behnken 试验设计，以熊果酸的提取率为响应值，通过回归分析各工艺参数与响应值之间的关系，并由此预测最佳的工艺条件。本文利用软件验证原文中的数据处理过程，以检验原文数据是否处理正确。 1 确定实验因素 原文利用超声波辅助提取车前草中的熊果酸，而影响熊果酸提取率的因素有很多，如超声波的功率、提取时间、溶剂温度、溶剂种类、液固比等。原文参考文献《柿叶中总三萜的提取以及熊果酸分离, 纯化研究》中提取熊果酸的方法提取熊果酸，即将干燥的车前草粉碎后过筛，取20～40 目的车前粉，用石油醚在 55℃脱脂 3 次，干燥备用。精密称取一定量的车前粉，加入一定量的乙醇，称量，在一定的超声波功率下提取一定时间后，擦干外壁，再称量，用乙醇补充缺失的质量，离心。用注射器抽取一定量上清液，过 0.45μm 滤膜，进行检测。每个实验进行 3 次平行实验。取其平均值。结果以提取率(E)的来表示。 C × V E/%= ———× 100
举例说明黄酮的提取分离方法 组长：崔宁 组员：翟雪王璐璐冯子涵赵子惠罗春雨刘红成 1.提取方法 1.1热水提取法 热水提取法一般仅限于提取苷类. 在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素. 此工艺成本低、安全,适合于工业化大生产。以水做溶剂,同时提高浸提温度、延长浸提时间和增加液料比(60倍) ,可以明显提高芦丁的产率。 实例 桑叶：采用热水提取法测定桑叶中各有效成分含量，发现黄酮类化合物含量为1%以上,其中霜后桑叶黄酮类化合物含量最高为1.54% ,其次是晚秋桑叶,春季桑芽和后期桑叶含量最低。 甘草：过去甘草黄酮的提取主要为水提法,其主要原理通过甘草粉与水按一定配比,加热混合至80～95 ℃浸提甘草粉,利用甘草黄酮的水溶性进而提取甘草黄酮。此法虽然要求设备简单,但因提取杂质多、提取时间长、提取液存放易腐败变质、后续过滤操作困难、收率较低等缺点,现已不常使用。 1.2有机溶剂萃取法 其原理是利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同,选用不同的溶剂萃取。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,一般采取乙醇为提取溶剂。高浓度的乙醇(如90 %～95 %) 适于提取苷元,浓度60 %左右的乙醇适于提取苷类。提取次数一般为2～4 次,提取方法有热 回流提取和冷浸提取两种方式。 实例 桑叶：使用乙醇提取桑叶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇的浓度为70%，料液比为1:15，在80℃的条件下浸泡3h。使用多种有机溶剂提取发现桑叶中黄酮类化合物的最佳提取溶剂是60%丙酮。 西芹：使用无水乙醇为提取剂，按西芹鲜重与提取剂的比例(W/ V) 1∶2 ,在80 ℃下回流提取2～4h ,制备西芹总黄酮。 银杏叶：从银杏叶中提取总黄酮时, 随乙醇浓度的增加总黄酮提取率逐渐上升, 当乙醇浓度增至70% 时提取率最高, 之后反而下降, 故选用70% 的乙醇作浸提剂最佳。 生姜：生姜黄酮提取用40倍原料的90%甲醇溶液, 在60 ~ 65℃条件下提取4 h 为其优化组合, 而其试验组合中以用40倍原料的75%甲醇溶液,在60~ 65 ℃条件下提取2 h的提取效果最好。 1.3碱性水或碱性稀醇提取法 黄酮类化合物大多具有酚羟基, 易溶于碱水, 酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黄酮酚羟基的酸性, 二是由于黄酮母核在碱性条件下开环, 形成2′-羟基查耳酮, 极性增大而溶解。因此可用碱性水( 碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 50 %乙醇) 浸出, 浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。 实例 菊花：各取5g干菊花4份, ，在80℃恒温水浴分别以pH为8,9,10,11的NaOH溶液分两次温浸1h和0.5h。pH降低时.由于提取不完全.含量较低；pH为11时,虽然黄酮
黄酮类化合物的提取、药用价值和产品开发应用前景 任红丽2009090141 摘要：对黄酮类化合物的药用价值、提取工艺、分离方法等方面进行综述。在 药用价值方面,讨论了其抗抑郁作用、抗氧化与自由基消除活性作用、对化学性肝损伤的保护作用、抗肿瘤作用、抗骨质疏松作用、抗心肌缺血作用;在提取工艺方面,讨论了溶剂提取法、超声提取法、酶法、微波法等;及其开发应用，为今后黄酮类化合物的深入研究提供理论基础。 关键词：黄酮类化合物提取工艺药用价值 黄酮类物质是一类低分子天然植物成分，是自然界中存在的酚类物质[14]，又称生物黄酮或植物黄酮，属植物次级代谢产物，广泛存在于各种植物的各个部位，尤其是花、叶，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。迄今，已有数百种不同类型的黄酮类化合物在植物中被发现，人工合成的黄酮类化合物也不断问世。最初这类物质仅用于染料方面，自20世纪20年代，槲皮素、芦丁等黄酮类物质用于临床后，才开始引起人们的关注，研究发现其中相当一部分具有显著的生理及药理活性，例如抗氧化、抗病毒、抗炎、调节血管渗透性，改善记忆，抗抑郁、抗焦虑、中枢抑制、神经保护等功能[2,12]诸多生理和药理特性使其广泛应用于食品、医药等领域。 1.提取纯化方法 1．1 传统提取方法 1．1．1 热水提取法 水是最廉价的提取溶剂，是地球最丰富的物质，无色无味无毒，对人体和环境无害，挥发性不大，具有真正的绿色环保意义。但用水作为提取溶剂时，从中药材中提取的黄酮类化合物中杂质含量较多，往往因泡沫或粘液很多，给进一步分离带来许多麻烦，而且浓缩也会很困难。此外，水提取物容易发霉发酵[22]。1．1．2 碱性水、碱性稀醇浸提法 中草药中黄酮类成分多为多酚类化合物，因其结构中具有酚羟基[7]，故可用碱性水或碱性稀醇液来提取中草药中的黄酮类化合物。黄酮母核的多样性主要是由黄酮本身骨架、环系的变化、氧化程度和数量而定，当碱的浓度过高，加热时便破坏黄酮类化合物的母核。 1．1．3 有机溶剂热回流及冷浸提取法 根据杂质极性不同，可选用不同的有机溶剂(如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇、丙酮等)，一般采取乙醇为提取溶剂[15]。
试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应曲面法）应运而生．响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件． 显然，要构造这样的响应面并进行分析以确定最优条件或寻找最优区域，首先必须通过大量的量测试验数据建立一个合适的数学模型（建模），然后再用此数学模型作图． 建模最常用和最有效的方法之一就是多元线性回归方法．对于非线性体系可作适当处理化为线性形式．设有m个因素影响指标取值，通过次量测试验，得到n组试验数据．假设指标与因素之间的关系可用线性模型表示，则有应用均匀设计一节中的方法将上式写成矩阵式或简记为式中表示第次试验中第个因素的水平值；为建立模型时待估计的第个参数；为第次试验的量测响应（指标）值；为第次量测时的误差．应用最小二乘法即可求出模型参数矩阵B如下将B阵代入原假设的回归方程，就可得到响应关于各因素水平的数学模型，进而可以图形方式绘出响应与因素的关系图． 模型中如果只有一个因素（或自变量），响应（曲）面是二维空间中的一条曲线；当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面．下面简要讨论二因素响应面分析的大致过程． 在化学量测实践中，一般不考虑三因素及三因素以上间的交互作用，有理由设二因素响应（曲）面的数学模型为二次多项式模型，可表示如下：通过n次量测试验（试验次数应大于参数个数，一般认为至少应是它的3倍），以最小二乘法估计模型各参数，从而建立模型；求出模型后，以两因素水平为X坐标和y坐标，以相应的由上式计算的响应为Z坐标作出三维空间的曲面（这就是2因素响应曲面）．应当指出，上述求出的模型只是最小二乘解，不一定与实际体系相符，也即，计算值与试验值之间的差异不一定符合要求．因此，求出系数的最小二乘估计后，应进行检验．一个简单实用的方法就是以响应的计算值与试验值之间的相关系数是否接近于1或观察其相关图是否所有的点都基本接近直线进行判别．如果以表示响应试验值，为计算值，则两者的相关系数R定义为其中对于二因素以上的试验，要在三维以上的抽象空间才能表示，一般先进行主成分分析进行降维后，再在三维或二维空间中加以描述．等等………… 2注意事项 对于构造高阶响应面，主要有以下两个问题： 1，抽样数量将显著增加，此外，普通的实验设计也将更糟。 2，高阶响应面容易产生振动。 响应面法(response surface methodology，记为RSM)最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来的。就是通过一系列确定性的“试验”拟合一个响应面来模拟真实极限状态曲面。其基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式代替实际的不能明确表达的结构极限状态函数。响应面方法是一项统计学的综合试验技术，用于处理几个变量对一个体系或结构的作用问题，也就是体系或结构的输入(变量值)与输出(响应)的转换关系问题。现用两个变量来说明:结构响应Z与变量x1,x2具有未知的、不能明确表达的函数关系Z=g(x1,x2)。要得到“真实”的函数通常需要大量的模拟，而响应面法则是用有限的试验来回归拟合一个关系Z= g’(x1,x2)，并以此来代替真实曲面Z=g(x1,x2)，将功能函数表示成基本随机变量的显示函数，应用于可靠度分析中。响应面方法实际上源于一种试验设计方法，试验设计方法是用来研究设计参数对模型设计状况影响的一种取样策略，决定了构造近似模型所需样本点的个数和这些点的空间分布情况。目前广泛应用于计算机仿真试验设计的主要方法是拉丁超立方体抽样和均匀设计，这两种试验设计能应用于多种多样的模型，且对模型的变化具有稳健性。 3响应面分析
实验一植物材料中总黄酮分离提取 --超声波提取植物总黄酮 一、实验目的 为充分利用天然植物资源，避免资源的浪费，探讨植物总黄酮的提取及鉴别方法。 二、实验原理 采用超声波乙醇浸提法从植物材料（黄芩、银杏叶、枇杷叶）中提取黄酮类物质，并用分光光度法测定含量。利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响。 三、实验材料 原料：黄芩、银杏叶、枇杷叶 试剂：95%乙醇AR；无水乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR； 芦丁标准品、蒸馏水 其它：滤纸、吸管、容量瓶、漏斗、试管 四、实验仪器 超声波清洗器（超声工作频率40kHz）； 紫外可见分光光度计； 抽滤机 电炉子 水浴锅 五、实验步骤 （一）试剂配制 a.硝酸铝（10%）：称取20 g硝酸铝溶于蒸馏水中，定容至200 mL，混匀， 贴标签备用。 b.亚硝酸钠（5%）：称取10 g亚硝酸钠溶于蒸馏水中，定容至200 mL，混匀， 贴标签备用。 c.芦丁标准溶液（2 mg/ml）：称取芦丁2 g于1000 mL容量瓶中，加蒸馏 水溶解并定容至刻度，混匀，贴标签备用。 d.乙醇溶液（60%）：600ml无水乙醇，溶于蒸馏水，定容至1000 ml容量瓶 中，混匀，贴标签备用。 e.氢氧化钠溶液（4%）：40 g氢氧化钠溶于水，定容至1000 ml容量瓶中，混 匀，贴标签备用。 （二）总黄酮成分提取 取干燥植物材料（黄芩、银杏叶、香樟叶），粉碎。称取约5 g，加80 ml 95%乙醇，浸泡20min，超声波提取30 min，抽滤。滤渣再加80 ml 95 %乙醇，浸泡20min，再次超声波提取30 min，抽滤，合并两次滤液，减压回收（水浴加热）乙醇至滤液仅剩5～7 ml为止，放置100 ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，
响应面分析法优化黄芪多糖的提取工艺 高宛莉，杜瑞卿 （河南南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳473061） 摘要为黄芪的进一步开发利用提供参考，选取黄芪多糖提取时间、提取温度和料液比3个因素进行二次回归正交组合设计试验，对其 提取工艺参数进行优化研究。结果表明:在提取时间为56min 、温度为84?、水体积为276mL 的条件下，黄芪多糖提取最大预测值为8．979μg /mL ，实际提取值8．945μg /mL ，两者基本相符。利用优化工艺参数提取黄芪多糖时，具有最大的提取产量。关键词黄芪多糖;响应面法;提取产量中图分类号TS244文献标识码A 文章编号1004－8421（2012）11－1263－02Optimization of Extraction Technique of Astragalus polysaccharide via Ｒesponse Surface Methodology GAO Wanli ，DU Ｒuiqing (College of Life Science and Tchnology Nanyang Normal University ，Nanyang ，He ’nan 473061，China )Abstract The effects of different temperature ，time and the ratio of solid to solution on the extraction yield of Astragalus polysaccharide were investigated based on composite design of quadratic regression．The extraction technique parameters were optimized with Ｒesponse Surface Methodology．Experimental data were analyzed by solving the regression equation with Design MATLAB 7．0software．It was indicated that the optimum extraction parameters were temperature 84?，time 142minutes and the water volume 276ml．Under those conditions ，the predicted val-ue of polysaccharide extraction yield from Ｒadix Astragali was8．97878μg．mL －1，which was in consistent with the measured value8．945μg．mL －1．It had maximal extraction yield of Astragalus polysaccharide with optimized technique parameters．Key word radix Astragali ;polysaccharide ;response Surface ;extraction yield 基金项目 南阳师范学院科青年科研资助项目(QN2012042) 作者简介 高宛莉(1978－)，女，汉族，河南南阳人，实验师，从事生物化学的教学与实验工作。E －mail :duruiqing8@163．com 收稿日期2012-10-14黄芪（Ｒadix Astragali ）为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是中药补气药中最为常用、且功效显著的一味药物， 含有多种对人体健康有益的生物成分与微量元素。黄芪多糖（Astragalus polysaccharide ， APS ）是中药黄芪中的主要成分，近年来研究发现其具有免疫调节、抗氧化、保护心肌、促进骨髓造血干细胞增殖和调节血糖等多方面广泛的药理作用 ［1－2］ ，是很有价值的免疫增强剂。近年来，黄芪多糖显著 的抗癌作用更受到广泛关注［3－4］ 。笔者等参照有关文献 ［5－6］ 选取提取温度、提取时间、料液比三因素，在单因素试验的 基础上［7］ ，利用二次回归正交组合设计试验（响应面分析 法）［8－9］ ，对黄芪多糖的水提取过程工艺条件进行了研究，以 期为黄芪的进一步开发利用打下基础。 1材料与方法1．1材料 1．1．1黄芪。黄芪药材，购自河南省医药公司，为蒙古黄芪。1．1．2 仪器与试剂。TU －1901双光束紫外可见分光光度 计，北京普析通用仪器有限责任公司；ＲE －52旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；D （+）－葡萄糖，Sigma 公司；其他试剂皆为国产分析纯。1．2方法 1．2．1 多糖含量测定。糖含量测定采用苯酚一硫酸法 ［10］ 。 标准曲线的绘制：精确称取D （+）－葡萄糖20mg ，用重蒸水定容至100mL 作为标准液。将标准液分别稀释成浓度为30μg /mL 、60μg /mL 、90μg /mL 、150μg /mL 和180μg /mL 的溶液，取不同浓度的溶液各0．3mL 置于10mL 试管中，加入50g /L 重蒸苯酚溶液0．6mL 混合后，迅速加入3mL 98%浓硫酸， 混匀，室温静置30min 。用直径10mm 石英比色皿测定489nm 处吸光度，用重蒸水进行空白对照试验。在与标准曲线绘制相同条件下测定多糖样品含量。1．2．2 试验设计。在黄芪多糖提取过程中，影响提取液中 多糖含量的因素很多，经初步试验选定提取温度、提取时间、料液比（水体积）作为主要影响因素，以提取液中多糖含 量为指标， 在单因素试验的基础上［7］ 采用三因素五水平二次回归正交组合设计试验（响应面分析法）［11］ ，对提取工艺 参数进行了优化， 试验因素及水平见表1。表1试验因素、因素水平及水平编码 Table 1Experiment fact0rs ，levels and coding 水平因素 提取时间（x 1）min 提取温度（x 2） ?水体积（x 3）mL 上星号臂γ 72100320 上水平16895310零水平06085280下水平－15275250下星号臂－γ4870240Δj 8 10 30 注：Δj =（x j γ－x j 0）/γ，γ=1．287。 对因素x j 的各个水平进行线性变换，得到水平编码z j = x j －x j 0 Δj ，试验方案见表2。2 结果与分析 三因素五水平二次回归正交组合设计试验结果见表2。利用MATLAB7．0软件，对表2数据进行二次多元回归拟合，得到黄芪多糖提取浓度y 2与三因素z 1、z 2、z 3之间的二次回归方程： y 2=8．69067－0．28795z 1－0．03365z 2－0．09964z 3+0． 17083z 1z 2+0．17758z 1z 3－0．24177z 2z 3－0．40120z 12－0．36497z 22－0．36196z 32 式中， z 1'=z 12－116∑16i =1z i 12=z 12－0．707，z 2'=z 22－116∑16 i =1 z i 22=z 22农技服务，2012，29（11）：1263－1264责任编辑胡先祥责任校对胡先祥