本科生毕业论文（设计）
题目: 柳枝稷PvPIP2;1基因的克隆与表达分析
姓名:
学院: 草业学院
专业: 草业科学
班级: 草业111
学号:
指导教师: 职称:
2015年5月23日
南京农业大学教务处制
目录
摘要 (3)
关键词 (3)
Abstract (3)
Key words (3)
引言（或绪论） (3)
1材料与方法 (5)
1.1试验材料 (6)
1.1.1植物材料、试剂 (6)
1.2试验方法 (6)
1.2.1 RNA的提取与反转录 (6)
1.2.2 PvPIP2;1基因的克隆及序列测定 (6)
1.2.3荧光定量PCR分析柳枝稷PIP基因表达特性 (6)
1.2.4 PvPIP2;1序列的生物信息学分析 (7)
2结果与分析 (7)
2.1柳枝稷PIP基因全长cDNA的克隆和序列分析 (7)
2.1柳枝稷PIP氨基酸序列的组成分析和结构预测 (8)
2.1柳枝稷PIP同源性和系统进化分析 (9)
2.1柳枝稷PIP荧光定量PCR结果分析 (9)
3讨论 (11)
3结论 (12)
致谢 (12)
参考文献 (12)
柳枝稷PvPIP2;1基因的克隆与表达分析
摘要：柳枝稷（Panicum virgatum L.）属禾本科黍属作物，是原产于北美的多年生暖季型优良牧草。其具有耐瘠薄、抗旱、耐盐碱土壤等特性，是水土流失和荒漠化治理的理想植物。近年来，因其生物学产量和乙醇产率高，柳枝稷已成为国际上重要的生物能源植物。本实验用PCR克隆技术从柳枝稷中克隆了PvPIP2;1基因的cDNA。经生物信息学分析, 该基因开放阅读框为861 bp, 其编码的蛋白含有286个氨基酸, 蛋白分子式是C1373H2111N353O376S9，分子量为29.87 kDa，理论等电点(pI)为8.24。对其同源性的分析表明：PvPIP2;1基因与粟（Setaria italica）PIP2-6（93%），玉米（Zea mays L.）PIP2,4（92%）的质膜水通道蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果显示：在低温（4℃）、ABA 和Nacl胁迫的24小时内其相对表达量均高于对照。此外光周期对其表达也产生重要影响。推测PvPIP2;1基因在柳枝稷的生长发育及逆境胁迫应答中起到重要作用。研究结果将为今后进一步探讨该基因在非生物逆境胁迫中的作用提供基础信息和研究依据。
关键词：柳枝稷；PvPIP2;1；生物信息学；非生物逆境
Cloning and Expression Analysis of the Plasma Membrane Aquaporin Gene PvPIP2;1 of Switchgrass
Abstract：Switchgrass (Panicum virgatum L.) is a perennial warm season high yield forage grass, which is originated from North American. It has a wide adaptability to barren soil, drought and salinity conditions. It is the ideal plant for controlling soil erosion and desertification. In recent years, because of its biological yield and high rate of ethanol production, switchgrass has become an essential bio-energy plant. The full-length cDNA sequence of PvPIP2;1 was obtained from switchgrass using RT-PCR. Sequence analysis indicated that the open reading frame (ORF) contained 861 bp nucleotides encoding 286 amino acids. The molecular weight of the protein was 29.87 kDa and theoretical pI was 8.24. Similarity alignment of plant demonstrated that amino acicls showed high identity with the PIP2-6 of Setaria italica (93% ) and the PIP2,4 of maize (92%). The expression of PvPIP2;1 was significantly higher than those of control within 24h of cold, ABA and NaCl stress. In addition, the light cycle has an important effect on its expression. This indicated that PvPIP2;1 might play an important role in plant growth, development and response to environment stresses. These results provided important information for further studies on molecular regulation mechanism underlying abiotic stress resistance in switchgrass.
Key words: Switchgrass (Panicum virgatum L. ) ; PvPIP2;1; bioinformatics; Abiotic stress
引言：
伴随着世界经济与社会的迅速发展，人们对能源的需求量日益剧增。化石能源迅速消耗以及所导致的大气污染、全球气候变暖一系列问题迫使人们寻找传统能源的替代品。利用生物能源作物来生产燃料是一个开创性的理念，国外许多国家特别是美国等对此已进行了十多年的研究，还筛选出了一系列优势作物，如木本植物枫树、白杨、柳树等，但草本能源植物柳枝稷的优势尤为突出[1]。能源作物是重要的生物质能源，它指的是那些一年生以及多年生植物，其栽培目的是生产固体、液体或气体能源材料；能源作物应具备以下特征：高效太阳能转化，高效水分利用，高效能量产出，高抗逆能力，低生产成本，并且环境友好[2]。
柳枝稷(Panicum virgatum L.)为美洲的本土植物，隶属禾本科黍属，是一种多年生暖季型草本植物，通常被用于水土保持、放牧以及生态建设等[3]。柳枝稷的株高在50~250cm 范围内，作为多年生草地植物，其高产期比较长，一般在10 年以上。与传统作物相比，柳枝稷的抗旱能力强，需肥量少，虫害少，产量高，最高产量可达74.1 t/hm2。国内外许多学者认为柳枝稷是一种具有较大发展潜力的能源作物[4]。其不仅具有强适应能力，还有较高的产量潜力和较强的耐旱耐脊薄能力，并且对环境友好，作为一种具有较大发展潜力的能源作物受到关注。近年来, 国际上将其作为一种新型能源模式作物进行了深入研究, 用于火力发电, 以木质纤维素生产乙醇, 还可用于造纸和进行生态环境保护。能源危机使生物能源在全球掀起了研究高潮, 美国对于柳枝稷尤为重视[5-6]。
能源植物不能与粮争地，因此需要重复利用边际地和退化土地。为了进一步提高柳枝稷对边际和退化土地的适应能力，提高其生物产量，有必要进一步增强其抗逆性。处于逆境中的植物，体内会发生一系列的生理生化反应来应答和耐受逆境[7]。首先，植物通过多种途径感应环境变化，然后将这种变化信息传递到细胞内部，细胞内部发生一系列磷酸化级联反应[8]，将信号传递给转录因子，转录因子随后与顺式作用元件结合，启动抗逆基因的表达[9]，从而提高植物的抗逆性。因此，分析植物的抗逆机理，克隆参与抗逆调控的相关基因，能够为抗逆分子育种的开展提供基础。
水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一类从原核生物如细菌到人体和其他哺乳动物都广泛存在的细胞膜上水通透性蛋白, 能够选择性地高效跨膜转运水分子。与动物和微生物相比,植物水通道蛋白基因不仅具有丰富的多样性还呈现出极高的丰度。植物质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP)是水通道蛋白的亚类, 目前已发现的水孔蛋白中多数为PIPs。因与膜内在蛋白(membrane intrinsic protein, MIP)序列同源性和结构相似性程度较高, 属于MIP超家族成员，[10-11]。PIPs的分子量在26-29kD之间，一般由5个短环相连的6个跨膜a-螺旋及伸入胞质的N端和C端组成。水孔蛋白的一级结构呈现出内部同源性，推测为是基因内部扩增而成。两个由3个氨基酸组成的结构域——NAP 盒(aPs-Pro-ala box)高度保守,几乎存在于所有已知的水孔蛋白中，它们参与水通道的形成,对水孔蛋白的功能十分重要[12-13]。
分析存在于高等植物中的PIPs发现，其含有两个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN，分别位于C环和E环，猜测可能对PIPs功能的特异性产生影响。由于N-端和C-端的不同，可以将PIPs分为：PIP1和PIP2,PIP1与PIP2相比，其具有较长的N-端和较短的C-端，而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。
实验表明PIPs在多个物种中具有运输水的功能。PIPs能够介导水分和中性分子的跨膜转运, 包括甘油、尿素、CO2等。此外, 还有研究表明PIPs与对植物氧化应激反应、损伤修复也起到一定作用。于是人们期望通过将PIPs基因转入农作物中并且表达,来提高作物的抗逆能力。最近也有研究发现PIPs在植物细胞生长方面能够起到促进的作用[14]。植物在整个生命周期中, 经常受到各种环境因子的影响。环境压力所导致的光合作用减少、氧化损伤、激素变化及胁迫相关蛋白积累, 通常会导致植物组织脱水。当植物抵御干旱胁迫、盐胁迫和渗透胁迫时, 植物细胞的PIPs通过发生表达水平、蛋白活性和蛋白结构等不同的适应性改变, 从而发挥着重要的作用[15]。
植物的生长发育在很大程度上依赖于对水分的严格调控。植物水分运动的两个基本影响因子是驱动力（Driving force）和水导度（Hydraulic conductivity，Lp）[16]。水的压力差形成了水分运动的驱动力，比如蒸腾拉力和重力、溶液渗透压、以及细胞壁压力等等。水分在植物体内的运输主要通过3种途径:共质体途径、质外体途径和跨细胞途径。水分跨细胞运输又可通过2种方式实现：自由扩散和以水孔蛋白为媒介的水分运输。植物水分运动的两个基本影响因子是驱动力（Driving force）和水导度（Hydraulic
conductivity，Lp）[17]。水的压力差形成了水分运动的驱动力，比如蒸腾拉力和重力、溶液渗透压、以及细胞壁压力等等。水孔蛋白能增加生物膜对水分的通透性，实现水分快速跨膜运输，有效调节细胞内外的渗透平衡。
当植物处于干旱、盐碱、低温和低氧等胁迫条件下, 脱水能够造成植物体内水分平衡被打破。植物个体为适应环境通常会出现生长缓慢且植株矮小的现象,植物通过这种生长方式保持体内矿质养分的浓度适当和水势足够高，以维持植物机体正常的新陈代谢。此外，植物体在干旱胁迫时也表现出某些部位的木质化组织数量降低,支持组织的周围排列改变,以降低支持结构的能量耗损。植物这种对环境胁迫的作用会造成自身生物量的减少。
而质膜内在蛋白(PIPs)能够介导水分及不带电分子的跨膜转运，在维持植物体内水平衡以及促进水分运输过程中起重要作用。大量研究证明, 水孔蛋白在植物响应环境胁迫过程中表现出主要作用。研究表明, 水孔蛋白PIPs可以在一定程度上调节吸水能力。Aroca等发现, 根部PIPs的表达与PIPs蛋白丰度对干旱胁迫会产生不同应答[18]。通常在干旱条件下, 根部PIP2丰度会降低, 同时PIP1蛋白发生积累。但是PIP蛋白丰度与吸水能力之间未发现明显联系[19]。PIP对于植物抗寒起着重要作用, 它在维持低温条件下植物吸水和避免植物叶片脱水起到重要作用。Lee等(2012)研究发现,拟南芥中PIP2;5过表达植株的茎叶和根部生长与野生型株系相比对低温有更强的耐受性[20]。有研究发现, 延长一些抗寒植物在低温下的处理时间, 其根部渗透系数会恢复到正常生长水平。Aroca 等(2001)根据HgCl2实验发现这种细胞渗透系数的恢复原因是水孔蛋白活性的增加[21]。另外, PIP在维持质膜完整性和饱和脂肪酸含量等方面也发挥作用。有研究发现, OsPIP1;1过表达的水稻对盐胁迫的耐受性会提高[22]。长时间盐处理会导致根部细胞PIP 蛋白大量积累, 从而促进细胞到细胞的水运输途径[23-24]。植物快速适应环境改变能够通过调节PIPs在质膜上运输和丰度实现。
在逆境应答等过程中,水通道蛋白促进细胞内外的跨膜水分运输,调节细胞内外水分平衡。虽然柳枝稷近年来的研究较多,可是关于柳枝稷水通道蛋白基因的研究至今研究较少。
当今世界各国都面临能源危机，寻找可再生能源成为摆在科学家前面一条唯一的道路。柳枝稷属于禾本科黍属，因其产量高、抗性好、对环境友好以及能作为液体燃料提取材料等被国内外学者广泛关注。作为一种能源植物,柳枝稷具有适应性强，对自然条件要求不高，可以在不适宜其他作物生长的边际土地上生长并获得较高的产量。利用柳枝稷进行能源生产不仅不会占用耕地,还能充分利用边际土地,改善环境,增加农民收入。我国耕地面积有限,但是目前我国尚有相近于耕地面积的约1亿多公顷不宜垦为农田的边际土地,可种植高抗逆性能源植物。
水是生命之源,是最重要、最基本的环境因子,植物的固着性造成了植物对水的强依赖性。研究表明，植物70-90%的水是通过AQP介导来实现水分跨膜运输的，因此，水孔蛋白在植物的水分运输中起着关键作用。近年来,在分子水平上,相关领域尚未具体揭示柳枝稷对水分的利用机制。因此, 本研究以柳枝稷为试材, 利用RACE技术克隆了柳枝稷水孔蛋白PvPIP2;1基因。通过运用不同的生物信息工具对柳枝稷的PIP基因及其编码蛋白序列进行了生物信息学分析, 预测它们潜在的生物学功能, 同时利用干旱胁迫下的柳枝稷叶片，探讨了PvPIP2;1的表达模式，为后期基因的功能研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1植物材料、试剂
供试材料：本实验的研究材料是柳枝稷品种Alamo，于种子成熟期采集，储存于4°C以
备用。取大小一致饱满的柳枝稷种子若干粒，置于灭菌的蛭石中栽培,加适量无菌水以及相应的培养液置于室温培养，待叶片生长至30cm高时，剪下叶片，用铝箔纸包裹后迅速投入液氮中，放于-80℃备用提取总RNA。
试剂：RNApure超纯总RNA提取试剂盒（原平皓生物技术有限公司）
反转录试剂盒（TaKaRa公司）
荧光定量PCR试剂盒（原平皓生物技术有限公司）
1.2试验方法
1.2.1 RNA的提取与反转录
采用购自原平皓生物技术有限公司的超纯总RNA提取试剂盒提取柳枝稷总RNA。按照试剂盒操作说明进行提取, 灭菌去离子水溶解RNA，利用酶标仪值计算浓度, 并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒试剂盒进行反转录。
1.2.2 PIP基因的克隆及序列测定
按照已知PIP基因功能保守域，设计扩增引物如下：
PvPIP2;1_CDS_F (ggatccATGGGCAAGGAGGTGGACG)
PvPIP2;1_CDS_R (aagcttGGCGTTGCTCCGGAAGGAG)
利用上述引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性1min；98℃变性10s，68℃延伸15min，30个循环；然后72℃延伸10min。使用BamHI和HindIII双酶切PCR产物，并利用琼脂糖凝胶DNA快速纯化回收试剂盒对其行回收纯化，用DNA Ligase I链接入pEntryD载体，转化到的DH5Aα大肠杆菌感受态细胞中，37℃预培养1 h后涂布于LB固体培养基的平板上，37℃倒置培养16 h左右，观察平板上菌落生长情况。挑选阳性克隆的菌落，接种于含有卡那霉素LB液体培养基，利用DNAman软件将3'序列、中间片段和5'序列进行拼接得到PvPIP2;1全长序列。在拼接全长序列两端设汁引物.将扩增序列测序后同拼接序列比较。证实得到PvPIP全长cDNA。
1.2.3荧光定量PCR分析柳枝稷PIP基因表达特性
将生长株高为30cm的柳枝稷置于以下三种条件200mM的氯化钠，20％（重量/体积）PEG6000低温（4℃）和100um的ABA下处理，并各自设置0.5、1、2、4、8、12和24小时对照。将这些植物在30℃（除了低温处理）的1/2Hogland营养液中培养。处理完成后，每种处理至少选取三个植株的从顶端计数的第三叶片，剪取，合并，并立即在液氮中冷冻并贮存于-70℃条件下，分别提取RNA，反转录成cDNA，用于qRT-PCR 研究水孔蛋白PIPs家族的基因表达情况。筛选在逆境诱导下表达量显著升高的基因进行下游工作。
依据qRT-PCR引物设计要求，设计PvPIP2;1基因的特异引物，
qRT PvPIP2;1a_F (GGCATGATCTTCATCCTCGT)与
qRT PvPIP2;1a_R (CGTAGAAGCCGCTCTGAAAG)分别以对照和不同时间点处理的柳枝稷叶片cDNA为模板。对基因在非生物逆境胁迫下的表达进行qRT-PCR分析。利用设计好的引物进行预PCR扩增, 反应程序为94 ℃ 5 min; 94 ℃30 s, 55 ℃30 s, 72 ℃30 s, 30个循环; 72 ℃, 7 min。电泳检测, 并将PCR产物进行电泳检测和测序, 进一步验证引物的特异性
1.2.4 PvPIP2;1序列的生物信息学分析
利用Phytozome10.2搜索PvPIP2;1基因的全长，将所得PvPIP2;1编码序列通过NCBI进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测：用BLAST软件进行同源性比对；软件ExPASY 的ProtParam计算蛋白质的相对分子量、等电点、不稳定系数和理论的跨膜区分析；SOPMA预测二级结构；使用BLASTx程序对测序所得的PIP基因序列与GenBank数据库中序列进行相似性分析；应用NCBI网站(https://www.doczj.com/doc/772435877.html,/)中的Conserved Domains工具和ORF finder程序分析保守功能区、基因开放阅读框(ORF)
并推导氨基酸序列；使用Scan Prosite (https://www.doczj.com/doc/772435877.html,/tools/secondary)进行蛋白结构域预测。Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW软件构建PvPIPl与其他相关物种水通道蛋白同源氨基酸序列的系统进化树。
2 结果与分析
2.1柳枝稷PIP基因全长cDNA的克隆和序列分析
为了获得柳枝稷PvPIP2;1基因全长编码序列，通过RT-PCR方法，从柳枝稷获得了柳枝稷PIP的cDNA全长序列。以10% PEG处理6 h的柳枝稷叶片cDNA为模板。根据已知的水通道蛋白保守区序列设计中间引物，进行PCR扩增得到中间片段，采用RACE方法经过两轮PCCR扩增得到PvPIP2;1基因5′和3′端未知序列BamHI和HindIII 双酶切PCR产物，纯化、回收后用DNA Ligase I链接入pEntryD载体，转化感受态细胞, 选取阳性克隆进行测序。
图1 柳枝稷PvPIP2;1扩增结果
Fig. The PCR result of PvPIP2;1 of Panicum virgatum L.
注：M：2000Maker
图2. PvPIP2;1基因序列
Fig. 2Nucleotide sequence of PvPIP2;1
注：第1~88位的88个核苷酸为5′端非编码区(5′ UTR)；第950~1680位的731个核苷酸为3′端非编码区(3′ UTR)；第89~949位的861个核苷酸为开放阅读框（ORF）；*为终止密码子
测序后经序列比对分析, 获得柳枝稷PvPIP2;1含有完整编码区的基因序列，其cDNA 全长为1680bp，包含一个完整开放阅读框为861bp，编码286个氨基酸。5’端非编码区(5’UTR) 88bp，3’端非编码区(3’UTR)731bp。
2.2柳枝稷PIP氨基酸序列的组成分析和结构预测
根据ExPASy 网站提供的ProtParam预测显示，蛋白分子式是C1373H2111N353O376S9，分子量为29.87 kDa，理论等电点(pI)为8.24。已发现的植物PIP类基因的编码产物等电点大都在9左右。只有水稻中的PIP等电点约7.14大豆的PIP等电点约8.29.等电点的差异有可能使PvPIP与其他PIP在功能或调控上存在差异。
利用TMHMM 2. 0分析该蛋白质的跨膜结构,表明该蛋白具有5个跨膜区(分别位于氨基酸序列的第45~62、第81~98位、第128~149位、第204~221位、第250~267位)。
PvPIP2;1蛋白二级结构预测显示，其含有大量的α螺旋和β转角，其余部分为无规则卷曲。统计结果表明：PvPIP2;1蛋白二级结构包含54.20%的β转角、37.06%的α螺旋和8.74%无规则卷曲。
2.3柳枝稷PIP同源性和系统进化分析
利用BLAST程序在NCBI网站对PvPIP2;1进行核酸和氨基酸序列相似性的对比研究，结果表明PvPIP2;1氨基酸序列与其他物种的PIP氨基酸序列显示同源性较高：粟米PIP2-6（93%），玉米PIP2,4（92%）
用Predict Protein用Predict Protein亚细胞定位预测程序预测PvPIP2;1蛋白定位在细胞质膜上，根据序列及完整编码序列的相似性比对(BlastX)结果，以及PIP氨基酸序列的相似性比对(BlastP)结果,可确定编码产物属于MIP家族的PIP类，即结合于原生质膜
的水通道蛋白类。
图3. 生物进化树分析PvPIP2;1蛋白与其他同源蛋白的关系
Fig3. The relationship analysis between PvPIP2;1 and other homologous protein through phylogenetic tree 用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW建了包括PvPIP2;1在内的12个PIP 蛋白的系统进化树（图2）。从图中可以看出PvPIP2;1与水稻（Os07g26690.1），玉米（ZmaysG154628_T01）等8个基因型亲缘关系稍近一些。
2.4柳枝稷PIP荧光定量PCR结果分析
为了研究PvPIP2;1基因与柳枝稷对各种胁迫条件应答的关系。在各种非生物胁迫条件，通过定量RT-PCR下进行分析柳枝稷中的PvPIP2基因表达水平。将株高为30cm的柳枝稷置于以下条件下处理：200mM的氯化钠，低温（4℃）和100μm的ABA为0.5,1，2，4，8，12和24小时。这些植物在30℃，除了低温处理的在1/2Hogland营养液中长大。对柳枝稷PvPIP2;1基因的表达特性进行荧光定量PCR分析。设计的荧光定量PCR 引物经预PCR实验检测、测序结果正确, 具有良好的特异性, 可用来进行荧光定量PCR 试验。
为了明确PvPIP2;1基因在转录水平上对冷害、干旱、高盐和ABA等非生物胁迫因子的响应,利用荧光定量PCR分析PvPIP2;1基因在这些胁迫过程中的表达情况(图4) 结果显示:在低温胁迫处理下0.5,1和2h后，柳枝稷中PvPIP2;1的相对表达量呈现稳定上升趋势，并在2h达到最大值。但随着时间延长，其相对表达量逐渐均匀下降，但仍显著高于对照。胁迫24 h时, PvPIP2;1的相对表达量又有所回升。胁迫末期PvPIP2;1基
因表达量仍显著高于对照，说明该基因在低温胁迫中可能起着重要作用。
图4.不同逆境处理对PvPIP2;1基因表达的影响Fig. The expression of Pv PIP2;1 gene under different treatment
在100um的ABA胁迫下，PvPIP2;1表达量呈谷峰曲线变化，即在胁迫0.5和1h 时，相对表达量呈现上升趋势，并在1h达到最高值，为对照的57.9倍，2h时急剧下降，4h，8h，12h基本保持稳定，在8h时有轻微的起伏，但表达量均高于对照。在处理末期24h时表达再一次上升，为对照的55.6倍。说明该基因受ABA调控。
在200mM的Nacl处理下，在0.5h相对表达量显著上升并达到最高，为对照的146.9倍，1h时表达量降低，但仍高于对照，2h再一次上升，相对表达量为对照的94倍。到4h再一次急剧下降并保持稳定到12h。至24h，PvPIP2;1相对表达量上升到对照的133.5倍。
图5. PvPIP2;1基因的表达受植物光周期调控
Fig. The expression of PvPIP2 gene under photoperiod
对柳枝稷进行光周期处理，早上5:00开始光照，下午17：00结束光照，次日早上5:00开始光照，下午17:00结束光照。在第一天早上5:00相对表达量急剧上升并达到最大值，随后下降至13:00后逐渐保持稳定。次日开始光照后，相对表达量又一次上升，在9：00左右达到第二个波峰，随后开始下降。暗示光照对该基因的相对表达量起到调控作用，并且调控主要发生在光照开始的前期阶段。
3 讨论
本研究通过PCR克隆技术获得PvPIP2;1基因，cDNA 序列由NCBI网站ORF finder程序分析推导的PvPIP2;1蛋白氨基酸序列中含有水孔蛋白高度保守的NPA特征性序列和MIP家族结构的典型特征，因此可以认为PvPIP2;1是典型的植物PIP家族成员。在PIP蛋白分类中, PIP1和PIP2的区别在于N端和C端结构上的不同，PIP1比PIP2具有较短的N端和较长的C端。另外利用Predict Protein亚细胞定位预测程序预测PvPIP2;1蛋白定位在细胞质膜上，利用TMHMM Server v.2.0程序预测该蛋白具有5个跨膜结构域。
在本研究3种处理条件下的结果均表明，PvPIP2;1在柳枝稷应对非生物胁迫中发挥着作用。前很多研究结果显示环境因素如高盐、干旱、冷害都可以引起AQP基因表达的上调,另外转基因技术的建立也揭示了过表达AQP可提高植物对非生物逆境的抗性。尽管AQP 响应很多胁迫，但是AQP 在非生物胁迫中的作用机制还不清楚。本研究通过PCR,在4℃、ABA 和NaCl胁迫过程中分析基因的表达模式发现:在4℃时，PvPIP2;1基因相对表达量先稳定升高后又稳定降低，但在24h出现回升。在200mM NaCl处理下，
前2h相对表达量显著高于后期，但在1h处出现降低。暗示该基因在盐胁迫的前期发挥调控作用。在100μm ABA处理下在1h处达到最高水平，说明该基因对ABA胁迫应答的时间主要在这一时段。此外，三种处理下24时均出现相对表达量回升的现象。三种处理下，PvPIP2;1基因的表达量均高于对照，推测该基因可能在，植物的逆境胁迫过程中起着重要作用，关于基因在柳枝稷逆境胁迫中的基因表达调控功能仍有待于进一步研究。
在光周期处理下的PvPIP2;1基因相对表达量呈现在开始光照初期急剧上升随后下降并保持稳定的状态。暗示光照对该基因的相对表达量起到调控作用，并且调控主要发生在光照开始的前期阶段。
4 结论
本研究通过PCR结合RACE技术成功克隆了柳枝稷PvPIP2;1基因cDNA全长序列,该基因包含一个长度为861bp的开放阅读框,编码286个氨基酸，其蛋白序列包含5个跨膜结构域。生物信息学分析结果表明：其蛋白分子式是C1373H2111N353O376S9，分子量为29.87 kDa, 理论等电点(pI)为8.24。荧光定量PCR分析表明，PvPIP2;1基因参与ABA、盐害、低温等非生物胁迫下的响应，并且该基因的表达受到光周期的调控。通过基因的功能分析，为该基因在非生物逆境胁迫中的作用提供依据和信息，并为柳枝稷利用边际化和退化土地提供理论指导。
致谢
本实验是在徐彬老师的精心指导下完成，从课题的选择设计到论文的完成过程中，老师一遍又一遍地指出稿中的具体问题，严格把关，使学生受益颇多。徐老师的细心指导，以及同时文武武和谢哲倪师姐、于国辉师兄在试验期间提供的指导和帮助，使得实验得以圆满完成。同时也要感谢给予帮助和支持的同学、朋友。最后，我要感谢我的家人，是他们的关心、支持，使我能够顺利完成大学的学习。谢谢你们！谨此一并致以最诚挚的感谢！
参考文献：
[1]Joe Bouton.2008. Improvement of Switchgrass as a Bioenergy Crop. Genetic Improvement of Bioenergy Crops.467:295-308.
[2]Mclaughlin S B, Kszos LA. 2005. Development of switchgrass as a bioenergy feedstock in the united states.Biomass and Bioenergy, 28(6):515-535.
[3]刘吉利, 朱万斌, 谢光辉, 林长松, 程序. 能源作物柳枝稷研究进展. 草业学报, 2009,18(3): 232-240.
[4]M.A. Sanderson, R. L.Reed,S. B. McLaughlin.1996.Switchgrass as a sustainable bioenergy crop. Bioresource Technology.56:83-93.
[5]孔宪文,李丽萍.发展生物质能可获得多方面的效益[J].节能,2003,(2):45-47.
[6]杨世诚，绿色能源:植物是明天[J].森林与人类,2000,(5):11 -12.
[7]利容千,王建波. 植物逆境细胞及生理学[M]. 武汉:武汉大学出报社, 2002,1-278
[8]Fowler S, Thomashow MF. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell.2002,14:1675–1690
[9]Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annu Rev Plant Biol.2006,57: 781–803
[10]李红梅, 万小荣, 何生根(2010). 植物水孔蛋白最新研究进展. 生物化学与生物物理进展, 37 (1): 29~35
[11]阮想梅, 李登弟, 李学宝(2009). 植物水孔蛋白的功能和调控. 植物生理学通讯, 45 (1): 1~7
[12]Jung J S, Preston G M. Smith B L, e.tal. Molecular structure of the water channel through aquaporin CHIP:The hourglass nrodel.J Biolehem,1994,269:14648~14654
[13]Mulders S M, Nander KemP A J,Terleuw S A,etal.The exchange of functional domains among
aquaporins with dieffrent transport characteristics. Pflugers Archiv Eur J Physicl,1998，436: 599~607 [14]孙天旭, 李玉花, 张旸(2014).逆境条件下水孔蛋白PIPs作用的研究进展.植物生理学报Plant Physiology Journal 50 (6): 749~757
[15]张渝洁, 全先庆, 李新国(2006). 植物水孔蛋白研究进展. 安徽农业科学, 34 (20): 5168~5170
[16] BOYER JS. Water transport[J]. Annual Review Plant Physiology. 1985, 36: 473—516.
[17]李博主编.中国的草原[M].北京:学出版社,1990.
[18]Aroca R, Porcel R, Ruiz-Lozano JM (2012). Regulation of root water uptake under abiotic stress conditions. J Exp Bot, 63 (1): 43~57
[19]Zhang Y, Wang YX, Jiang LD, Xu Y, Wang YC, Lu DH, Chen F (2007). Aquaporin JcPIP2 is involved in drought responses in Jatropha curcas. Acta Biochim Biophys Sin, 39 (10): 787~794
[20]Lee SH, Chung GC, Jang JY, Ahn SJ, Zwiazek JJ (2012). Overexpression of PIP2;5aquaporin alleviates effects of low root temperature on cell hydraulic conductivity and growth in Arabidopsis. Plant Physiol, 159 (1): 479~488
[21]Aroca R, Tognoni F, Irigoyen JJ, Sánchez-Díaz M, Pardossi A (2001). Different root low temperature response of two maize genotypes differing in chilling sensitivity. Plant Physiol Biochem, 39 (12): 1067~1073
[22]Liu CW, Fukumoto T, Matsumoto T, Gena P, Frascaria D, Kaneko T, Katsuhara M, Zhong SH, Sun XL, Zhu YM et al (2013). Aquaporin OsPIP1;1 promotes rice salt resistance and seed germination. Plant Physiol Biochem, 63: 151~158
[23]Muries B, Faize M, Carvajal M, del Carmen Martínez-Ballesta M (2011).Identification and differential induction of the expression of aquaporins by salinity in broccoli plants. Mol Biosyst, 7 (4): 1322~1335 [24]Marulanda A, Azcon R, Chaumont F, Ruiz-Lozano JM, Aroca R(2010). Regulation of plasma membrane aquaporins by inoculation with a Bacillus megaterium strain in maize (Zea mays L.) plants under unstressed and salt-stressed conditions. Planta, 232 (2): 533~543