广东药学院
硕士学位论文
mPEG-BSA-5-FU的合成及其抗癌活性初探
姓名：戴会群
申请学位级别：硕士
专业：药剂学
指导教师：朱亮
20090101
中文摘要
mPEG-BSA-5-FU的合成及其抗癌活性初探
目的减小其达峰浓度
探讨其体外药效学特性
方法在pH9.0的硼酸缓冲液中和白蛋白偶联在pH8.0的硼酸缓冲液中和所制备的BSA-5-FU反应得mPEG-BSA-5-FU复合物H22
ò?5-FUí¨1y????ò?á??ê??2ìmPEG-BSA-5-FU的药效学
每只小鼠予含相当于3 mg5-FU量的5-FU原药和
mPEG-BSA-5-FU????á?×éò???μ?ê±??-浓度曲线
结果修饰度为43.37%的mPEG-BSA-5FU明显高于5-FU 组及5-FU-BSANAP组
０．０５
其回收率日间系数分别为103.7% 6.35%
′?oó?aò??¨?è???ù?μμí
并在较长一段时间内１２ ｈ
mPEG-BSA-5-FU组药代动力学结果显示其半衰期T1/2明
显高于5-FU原药组的T1/2,达到了明显的长循环效果
C max明显比5-FU原药组(57.8 mg/L)低而药物浓度曲线下面积
明显比5-FU原药组１２３７ ｍｇ＊ｍｉｎ／Ｌ
结论但结果不是很稳定
且有批量差异
药动学结果显示目标产物
mPEG-BSA-5-FU的T1/2明显延长C max有很大幅度的降低有可能克服5-FU短时间内血药浓度高副作用大的问题
白蛋白药动学药代动力学
Abstract
The synthesis and preliminary exploration of antitumor
activity of mPEG-BSA-5-Fu
Pharmacy
Postgraduate : Huiqun Dai Supervisor: Liang Zhu professor Objective: To extend the half-life and reduce the peak concentration of 5-FU, we prepared the mPEG-BSA-5-FU compounds, and explore its pharmacodynamic properties in vitro and invest its initial pharmacokinetics in vivo.
Methods: Prepare 5-FUAC active ester with NHS-activated method, and coupled with albumin in borate buffer of pH9.0; prepare mPEG active aster with NHS-activated method, and coupled with BSA-5-FU prepared in pH 8.0 boric acid buffer solution, at last the compounds of mPEG-BSA-5-FU were got. Establish animal model of solid tumor of mouse with hepatoma cell line(H22), review the pharmacodynamics of the compounds of mPEG-BSA-5-FU comparison to 5-Fu
days coefficient 5.64%
of original drug 5-FU group, which reached a significant effect of long-circulating. The C max(4.6mg/L) of mPEG-BSA-5-FU was significantly lower than the C max(57.8 mg/L) of 5-FU group, and the AUC(2721 mg*min/L) is significantly higher than the AUC(1237 mg*min/L) of 5-FU group.
Conclusion: the processes of coupling and modification were simple, but the result was not stable, the goal of the proceeds was a complex product, and there was difference in batches. Pharmacodynamic results showed that the anti-tumor rate of mPEG-BSA-5-FU was significantly higher than that of 5-FU group and 5-FU-BSANAP group. Pharmacokinetic results showed that the T1/2 of mPEG-BSA-5-FU was significant prolonged; the peak time prolonged; the C max had a substantially lowered; the AUC increased, which was possible to overcome the problems of 5-FU in high plasma concentration in short time, short activity, big side effects and so on.
Key words:5-fluorouracil; albumin; mPEG; pharmacodynamics; HPLC; pharmacokinet
广东药学院学位论文原创性声明
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不包含其它个人或机构已经发表或撰写过的研究成果
均已在文中明确说明和致谢
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论文作者签名论文导师签名
日期
第一章 前言
肿瘤是一种严重危害人类生命和健康的疾病经历了半个多世纪的发展和完善依然是综合治疗的主要手段
细胞存在着严重的毒副作用
缓控释及靶向给药体系是减少抗肿瘤药物毒副作用
也是目前抗肿瘤药物研究领域的热点之一
自1957年由Heidelberg开发问世以来它可以单用或联合用药治疗各种类型的恶性肿瘤口服吸收困难限制了5-Fu的进一步应用[1,2,3]?μμí???±×÷ó?
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??óDá?o?μ?éú???àèYD?oíéú???é?μ?aD?
1.1 5-氟尿嘧啶的物理化学性质
5-氟尿嘧啶(5-Fu)结构式见图I-l1其为白色结晶或结品性粉末稍难溶于水乙醇及丙酮氯仿及苯（分解)pKa8.01,在0.1 mol/L盐酸中最大吸收波长
?max265-266 nm
5-Fu因离子化而带负电荷如图1-2中性的5-Fu分子和离子形式的5-Fu都具有亲核性
这就可以确定N位置亲核性的
强弱
它在体内首先转变为5-氟尿嘧啶核苷 (5-FuR)后者受脱氧胸苷激酶催化变成相应的核苷酶(5-FudRP). 5-FudRP可抑制脱氧胸苷酸合成酶与该酶的活性中心形成共价结合因dTMP的缺乏
因而5-Fu可发挥抗肿瘤作用[5]
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2??ü?ú·t?ò??óD?áá?òààμ
D?μ?ò?????D?:
ê3ó???í??1Doμè骨髓抑制:白细胞和血小板
减少其他:脱发７］尤其
是胃肠道粘膜和骨髓用药方案和给药途径
的不同而变化在口服给药时
其代谢产物均无抗肿瘤活性进入肝脏解毒己有相当一部分成为无效药肝功能不
同另外由于它对癌细胞的低选择性而呈现较高的副作用毒性反应比较复杂胃肠道可出现上皮发生溃疡咽炎食管炎胃炎
主要表现为粒细胞减少和血小板减少急性神经系统症状小脑共济失调及运动神经体征
心肌酶升高对皮肤毒性表现为脱发症
皮炎如痰痒性红色皮疹严重病例可形成水疙等等如何改变5-FU的结构
又能减少严重的毒性作用
1.4 近年来国内外5-Fu缓控释药物的研究进展
近年来旨在使氟尿嘧啶聚集靶部位沈正荣等[8]用DL-聚乳酸作载体
易以木[9]等采用乳液固化法制备5-Fu阿拉伯胶-白蛋白毫微球
微球的平均粒径为(228土61) nm,测得平均包封率为30.11%. Paul[10]等分别以聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA),聚乳酸(PLA),聚丙交醋(PL)等为载体用扫描电镜测得聚合物粒子的粒径大约为200nmà??°μè[11]采用界面聚合技术制备了5-Fu毫微囊
测得平均粒径232土17nm
2. 白蛋白
2.1 白蛋白简介
５００，左右.白蛋白由584个氨基酸残基组成,其分子中
氨基酸之间中都以肽键相连接,分子中带有较多的极性基团,对很多药物离子具有高度的亲和力,能和这些药物可逆地结合发挥运输作用
结构含有的"48%的á-螺旋和15%的a-折叠结构,其余为无规则结构空隙,因此无数的网状空隙为镶嵌携带药物创造了有利的空间条件[12,13]
°×μ°°×?úè?ì??ú?T?1?-D?,无过敏反应,在人体内能被降解吸收
静脉注射用白蛋白微球广泛地用于诊断
目前使用的白蛋白有两种,一种是从人血浆中分离制得的人血清白蛋白,另一种是从牛血浆中分离制得的牛血清白蛋白
可以增加血容量和维持血浆胶体渗透压,调节组织与血管之间水分的动态平衡,维持正常与恒定的血容量
还可以治疗失血创伤防治低蛋白血症新生儿高胆红素血症烧伤的治疗白蛋白具有生物可降解性可阻止药物从注射部位的释放白蛋白微球与脂质体和乳剂相比
白蛋白分子中赖氨酸数目众多(约占残基数的10%),便于进行化学偶联或修饰
3. 聚乙二醇
3.1 聚乙二醇简介
macrogol,polyethylene glycol,PEG
易溶于水和多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类和苯等非极性溶剂
还具有微弱的表面活性,随着其水溶液浓度的增加,表面张力逐渐减小
PEG是用环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合,反应通式如下
H 2C
CH 2
+
H 2O
(CH 2CH 2O)n OH
H
图1-3 聚乙二醇的制备 3.2 蛋白的PEG 修饰
蛋白质和肽类分子的化学修饰已经成为生物技术与生物医学领域的研究热点
如聚乙二醇
聚乙烯吡咯烷酮
多聚唾液酸等
Polyethylene glycol
则是应用最
为广泛的大分子修饰剂之一
是目前分子变构化学最重要的技术之一
PEG 是
由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料
ＰＥＧ的分子量范围是6KD 到170KD [16]
?ˉ?§DTê?ê±?ò?à2éó??×???ù??òò?t′?
(mPEG)的衍生物为修饰剂
这主要是因为氨基具有亲核性
PEG 链还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳状的PEG 衍
生物
ＰＥＧ分子中存在的大量乙氧基能够与水形成氢键
分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分子相偶
联
具有良好生物相容性和血液相容性
特别是当蛋白质经过PEG 类修饰剂修饰后
对于各种具有药用潜能的蛋
白来说
(1)增加稳定性
(2)降低免疫原性和抗原性
本实验以5-氟尿嘧啶为药物模型将制得的5-氟尿嘧啶-1-
基乙酸制成活性酯
用mPEG 修饰BSA-5-FU 偶联物与5-FU 原料药相比较
第二章
5-FUAC的合成
5-氟尿嘧啶是一种临床上广泛应用的抗癌药物,但由于其胃肠道反应,骨髓抑制等毒副作用太大[20],在实际应用中受到了限制
研究发现N-取代的5-氟尿嘧啶(如:FUDR 及FT207) 抗肿瘤作用优于5-氟尿嘧啶,而且在肝癌临床
治疗上用碘油混合抗癌药进行导向治疗,可取得较好的疗效[21]
图2-15-氟尿嘧啶-1-基乙酸合成路线
一
实验仪器
表1-1 主要仪器一览表
名称型号生产厂家
紫外﹣可见分光光度仪UV1101 上海天美科学有限公司
傅里叶红外光谱分析仪 Nicolet IR100 赛默飞世尔科技
电子天平 BL-220H 日本SHIMADZU
真空干燥箱 ZK-82A 上海市实验仪器总厂
恒温水浴锅H-88 江苏省金坛市宏华仪器厂超声清洗器 Kq-100型昆山市超声仪器有限公司
2
中国药典2005版二部标准
实验方法与结果
1
水浴加热,60
2
,光谱数据IR,3197.8 cm-1(-COOH伸缩振动最大吸收峰,文献[23]值:3198 cm-1)
1669.3 cm-1(C=O,C=C伸缩振动最大吸收峰,文献[23]值:1669 cm-1)
4000.0
3600
3200280024002000
1800
1600140012001000800600450.0
0.0
4
681012141618202224262830323436384042444648
505254565860626466687072747678808284868890929496100.0cm-1
%T 3195.06
3088.34
3016.56
2971.93
2846.04
2525.79
2348.77
1742.13
1704.12
1487.45
1424.63
1377.54
1345.80
1250.81
1239.141208.35
1191.091145.87
987.06
915.45
900.88886.77
825.10796.31
758.93
728.43
680.90
653.72
563.69
488.15
图2-2 FUAC 的红外图谱
经紫外分光光度计扫描FUAC 紫外最大吸收波长为273 nm 与文献[23]一致
图2-3 FUAC 的紫外图谱
3
í?ê±,反应温度要控制在
50
反应几乎不进行,温度过高则副反应增多,实验结果表明60?ú·′ó|?áê?oó,冷却至室温,先将pH 调至5.5 ,若有微量沉淀析出,
则为未反应的原料5-氟尿嘧啶,此时滤除
产品经水重结晶后用高效色谱法
测得纯度99.57%
第二部分5-FUAC活性酯的合成及其与白蛋白的偶联
为了使FUAC与载体白蛋白偶联
可以活化氨基也可以活化羧基
五十年代已总结出现在广泛使用的肽键生成方法混合酸酐法[24,25,26]
混合酸酐法它是利用羧酸羰基的亲电性高于碳酸羰基
混酐法具有反应速度快但由于混酐的活性很高要求反应在低温无水条件下进行
2
26-三氯苯酯五氟苯酯
HOSu HOBtò?°?μ?2ù×÷2??èê??è??±?2￠·?à?μ?μ????ˉ?￥óéóú???ˉ?￥??D????￡?èoí?á??μí2￠?ü?ú?óèèμ?ì??t??·′ó|酰卤法
最常用的是酰氯
然后与游离的氨基反应生成酰胺键
而DMAP可以促进酰氯和氨基的反应可以与大位阻的氨基反应很多对酸敏感的基团承受不了
为了克服第一个缺点2
6-三氯-15-三嗪第二个缺点可用酰氟代替酰氯加以克服
碳二亚胺缩合试剂法[28]
该方法是目前应用最广的形成酰胺键的方法大环内酰胺和内酯的构建在缩合试剂作用下这样就无需预先制备酰卤
不仅简捷高效
本文结合活性酯法与缩水剂缩合法对FUAC进行活化
DCC为缩水剂羧基活化的程度与离去基团母体上的氢的解离程度有关酰化后的羧基中羰基的活性越强
因此白蛋白上的游离氨基很容易进攻活化后的羧基中的羰基因此在反应过程中需满足如下条件不引起BSA的不可逆变性
图2-4 FUAC的活化反应
图2-5 FUAC活性酯跟白蛋白的反应
一
实验仪器
表2-1主要仪器一览表
名称型号生产厂家
紫外﹣可见分光光度仪UV1101 上海天美科学有限公司
傅里叶红外光谱分析仪 Nicolet IR100 赛默飞世尔科技
电子天平 BL-220H 日本SHIMADZU
真空干燥箱 ZK-82A 上海市实验仪器总厂
恒温水浴锅H-88 江苏省金坛市宏华仪器厂超声清洗器 Kq-100型昆山市超声仪器有限公司冷冻干燥机LGJ-10 军事医学科学院实验仪器厂
2
中国药典2005版二部标准
NHS
DCC
BSA
5-FUAC活性酯的制备
1
5-FUAC N-二甲基甲
酰胺中DCC
N-羟基琥珀酰亚胺４．６ ｍｇ加入上述溶液中避光剧烈摇动,活化过夜,活化后以10000 r/min 离心15 min ,取上清,弃沉淀;减压蒸除溶剂DMF
FUAC
2
5-FUAC活性酯熔点为255,产率为83.98%
2.2
5-FUA活性酯在268 nm处有最大吸收峰
说明活性酯的生成 3467.3 cm-1(N-H 最大吸收峰)1239.6 cm-1 ( N-H 弯曲振动最大吸收峰)DTA如下所示
图2-6 5-FUA活性酯的紫外扫描图
图2-7 5-FUAC活性酯的红外图谱
图2-8 5-FUAC的DTA图谱
三
试验方法
DMF 另将一定量的BSA溶于适量的pH9.0硼酸缓冲液中
室温下搅拌6小时直至透析液在265 nm 下无吸收称重
偶联率的测定方法加入适量的2.5%的胰蛋白酶PBS溶液水浴中消化2 h后
根据5-FU的标准曲线计算出5-FU的量
ìg/mg
偶联反应的优化偶联时间反应溶剂的pH值等反应条件
2
结果分析
紫外光谱研究表明:纯净的BSA仅在278.5 nm 有吸收峰, 5-FUA单体及5-FUA/ BSA混合样品的紫外光谱在273 nm处出现最大值吸收值,而
5-FU-BSA的紫外光谱在275.5 nm 处出现最大吸收值,这是药物键合在高分子上的一个特征
图2-9 为BSA-5-FU偶联物５－ＦＵＡＣ／ＢＳＡ
3419.9cm-1(N-H 最大吸收峰)
图2-10 BSA-5-FU 的红外图谱
DTA 数据
摩尔比的确定
表2-3 不同摩尔比对偶联率的影响
5-FU
摩尔比１
２０
１
４０
ìg/mg
??áa?ê