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清肠栓对大鼠溃疡性结肠炎白细胞介素受体表达的影响

第17卷第5期第309页2009年10月 中国中西医结合消化杂志Chin J Integr T rad W est M ed Dig

Vol.17No.5P.309

Oct.2009

收稿日期:2009 06 04

作者简介:陈 江(1969 ),男,江苏苏州人,医学博士,从事中西医结合消化疾病的临床与实验研究

文章编号:1671 038X (2009)05 0309 04

清肠栓对大鼠溃疡性结肠炎白细胞

介素受体表达的影响

陈 江1

, 马贵同2

, 谢建群2

, 唐志鹏2

, 龚雨萍2

, 张 涛

2

(1苏州市中医院消化科,江苏苏州215003;2上海中医药大学附属龙华医院消化科,上海200032) 摘要:[目的]从白细胞介素受体(IL R)角度探讨中药清肠栓防治溃疡性结肠炎(U C)的作用机制。[方法]三硝基苯磺酸(T NBS)诱导建立大鼠U C 模型;41只雄性SD 大鼠随机分成6组(正常组,模型组,5 氨基水杨酸栓组,清肠栓大剂量、中剂量、小剂量组),治疗组均分别予肠道给药;1周后处死,EL ISA 法检测血清、结肠组织可溶性IL R(sIL R)2、4、6水平;R T PCR 半定量法检测结肠黏膜IL 2R 、IL 4R 、IL 6R mR NA 的表达。[结果]清肠栓各剂量组sIL 2R 、sIL 6R 的水平降低,与模型组比较P <0.01;中、大剂量组IL 2R 、IL 6R mRN A 表达降低,与模型组比较P <0.01或<0.05;清肠栓各剂量组皆有降低IL 4R mR NA 表达的趋势,与模型组比较P >0.05。[结论]清肠栓有效防治U C,其作用机制与降低sIL 2R 、sIL 6R 水平,下调IL 2R 、IL 6R mRN A 表达,抑制T 淋巴细胞活化增殖,减少炎症递质产生有关。

关键词:清肠栓; 结肠炎,溃疡性; 白细胞介素受体 中图分类号:R 574.62 文献标志码:A

Experimental studies on the effects of interleukin receptors expressions

in model rats with ulcerative colitis by Qing chang suppository

CH EN J iang 1

,MA Gui tong 2

,X I E J ian qun 2

,TA NG Zhi p eng 2

,GONG Yu p ing 2

,ZH AN G Tao 2

(1

Department of Gastroenterology,Suzhou Traditional Chinese Medicine Hospital,Suzhou 215003,China;2

Department of Gastroenterology,Shanghai Longhua Hospital,Shanghai 200032,China) Abstract:[Objective]T o inv estig ate the mechanism of curative effect o n UC by Qing chang suppositor y from the angle of interleukin receptor ex pressions.[Methods]Rat mo dels w ith ulcera tive colitis induced by a so lution containing tr initrobenzene sulfonic acid and ethanol w ere estab lished.All forty one SD rats w ere randomly divided into six g roups(nomal contro l,mo del co ntro l,5 ASA supposito ry,three different dose of Qing chang suppository gro ups).The latter four

浓缩回输术加芪遂逐水膏穴位敷贴的方案治疗1个月后,其在临床有效率及QOL 上,与对照组比较,差异均有统计学意义(P <0.05)。研究还发现,治疗组由于在随访期继续使用芪遂逐水膏穴位敷贴巩固治疗,其在治疗结束3个月随访期能维持患者获得较高的QOL,显著优于对照组(P <0.01)。因此,笔者认为芪遂逐水膏穴位敷贴疗法不仅能促进腹水消退,降低复发率,尤其能显著提高并维持患者获得较高的QOL 。

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groups were administered by enema once a day fo r a w eek.Soluble interleukin receptor s2,4,6 bo th in serum and in colo n tissue w ere ex amined by ELISA,and mRNA ex pr essions o f interleukin receptor2,4,6by RT PCR.[Results]T he levels of sIL 2R,sIL 6R in each Qing chang suppository group markedly reduced,and mRNA expressio n o f interleukin receptor2,6in hig h and medium dose gr oup decreased,P<0.01or P<0.05com parison w ith those of model gro up;Each qing chang suppository g roup presented descending trends of interleukin4receptor mRNA ex pression, but P>0.05co mparison w ith m odel g roup.[C onclusion]Qing chang suppo sitory has cur ative effects o n UC,o ne o f its mechanism may be in relation to r educing the level of soluble interleukin receptors2,6,dow nregulating mRN A of inter leukin r eceptors2,6effetively,inhibiting T cells' pro liferatio n and reducing inflammation mediators.

Key words:Q ing chang suppository; ulcerative colitis; inter leukin receptor

清肠栓是根据马贵同教授的经验方研制而成的纯中药栓剂。长期临床实践结果表明,局部应用清肠栓对于溃疡性结肠炎(UC)病变在左半结肠以下,尤其以直、乙状结肠者疗效最佳[1]。大量动物实验研究[2~5]显示,清肠栓方具有抗炎、促进溃疡愈合、调节免疫等作用。笔者尝试从白细胞介素受体(IL R)角度,观察中药清肠栓对U C模型IL R表达的影响,进一步探讨清肠栓的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及主要药物 清洁级雄性SD大鼠41只,体重(175 20)g,由上海中医药大学动物实验中心提供。5%三硝基苯磺酸(T NBS)50m g/ ml,美国Sigma公司产品。清肠栓:马齿苋、青黛、参三七、五倍子等药物组成,规格2g/枚,上海中医药大学龙华医院制剂室生产(批号041207);5 氨基水杨酸(5 ASA)栓,规格1g/枚,丹麦辉凌制药公司产品(批号N J732S)。

1.1.2 主要试剂和仪器 可溶性IL R(sIL R)2、4、6ELISA试剂盒(进口分装):上海广实生物科技有限公司提供;T rizol试剂盒:Gibco公司产品; TaqDNA聚合酶及其缓冲液:5U/ l,GIBCO公司产品;RNAsin(RNA酶抑制剂):40U/ l,Promega 公司产品;M M LV反转录酶及其缓冲液:200U/ l,GIBCO公司产品;dNTP:10mmo l/L,博彩生物技术公司提供;DNA m ar ker:上海生工生物技术公司提供;二硫苏糖醇(DT T):100mm ol/L,上海中医药大学实验中心提供。紫外分光光度计:U V 260型,日本岛津公司产品;PCR基因扩增仪:9600型, PE公司产品;电泳仪:DY 1型,上海医用分析仪器厂产品;凝胶图像分析系统:FR 2000型,上海复日科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 U C模型的建立 随机选择35只大鼠进入造模前准备(余下6只作为正常组饲养),禁食24h。参照国内外文献[6,7]方法,笔者在前期清肠栓动物实验[2,5,8]及预初试验的基础上,选择TNBS100 m g/kg及50%乙醇0.25m l直肠内注入,再注入约0.3m l空气,夹闭肛门并手抓倒置约10min;72h 内大鼠出现程度不等的稀便、黏液便或脓血便;剖取大鼠结肠,肉眼可见肠黏膜充血水肿、局部糜烂或溃疡形成即为造模成功。

1.2.2 分组给药及样本采集 在确定U C模型成功建立的基础上,造模大鼠随机分成5组,各7只;除正常组及模型组常规饲养外,各治疗组大鼠分别经肠道内注入药物。5 ASA栓组:5 ASA100mg/ (kg d),清肠栓大剂量(大剂量)组:清肠栓672 m g/(kg d),清肠栓中剂量(中剂量)组:清肠栓336m g/(kg d),清肠栓小剂量(小剂量)组:清肠栓168mg/(kg d),上述2种栓剂分别配制成混悬液,每天1次,连续给药7d。治疗结束后6组大鼠同时麻醉处死,腹主动脉取血,离心保存;剖腹截取病变结肠段,纵行剪开冲洗,液氮冻存备用。

1.2.3 sIL R水平测定 上述血清及冻存组织解冻匀浆取上清液,分别按照ELISA试剂盒说明书步骤严格进行操作。

1.2.4 各组结肠组织IL R m RNA表达的检测

1.2.4.1 RNA抽提与引物设计 将上述冻存的结肠组织,按照Trizo l试剂盒说明书的操作步骤,分别进行结肠组织RNA的抽提,紫外分光光度计测定RNA水平;引物设计由上海博彩生物技术公司合成,引物序列如下:IL 2R:(上)5! GGT TT C CGAAGACT GAAT G 3!(下)3! CA TGGTCCTCT TGGAACGT 5!,产物扩增长度192bp;IL 4R: (上)5! GAGCAACCCATACCCATCGA 3!(下)3! T CTAAT TCT TCT ATACCACCCT GGT 5!,扩增长度441bp;IL 6R:(上)5! T CACAGAG

310中国中西医结合消化杂志 2009年10月第17卷第5期

CAGAGAATGGACT 3!(下)3! GT ATGGCT GAT ACCACAAGGT 5!,扩增长度481bp; actin:(上)5! CCGT AAAGACCT CTAT GCCAACA 3!(下)3! T CGT CCT CA TGCTACT CAGGC 5!,扩增长度230bp 。

1.2.4.2 反转录与PCR 扩增 反转录:4*dNT P 1 l 加随机引物1 l 加抽提的组织RNA 2 g,加水至12 l,65?水浴5m in,快速插入冰水中,离心,加入上样缓冲液4 l 、DT T 2 l 、RNAsin 1 l,25?10min,加入M M LV 反转录酶1 l,37?50min,70?15min,-20?保存。PCR 扩增:取上述反转录产物2 l,加入4*dNT P 1 l 、上样缓冲液4 l 、上下游引物各2 l 、Taq DNA 聚合酶0.4 l,加水至40 l,再加石蜡油12 l 。 actin PCR 反应条件为:94?3min,94?40s,55?1m in,72?1min,30个循环;72?5min,最后4?保存(IL 2R 、IL 4R 、IL 6R PCR 反应条件则将退火温度调整为50?、57?、57?)。

1.2.4.3 PCR 电泳及图像分析 取PCR 产物20 l 与上样缓冲液5 l 混匀后,上样于1.6%琼脂糖凝胶中,其中第一孔加DNA m ar ker,电压80V,电泳1h 。凝胶图像分析系统观察,对电泳条带进行光密度扫描,测定目的基因条带与对应内参基因条带光密度值的比值即目的基因相对转录量。

1.3 统计学处理方法

计量资料以 x s 表示,采用SPSS 11.5for w indo w s 完成数据统计。在正态齐性检验基础上行多组间单因素方差分析、均数间两两比较t 检验。2 结果

2.1 各组大鼠血清、结肠sIL 2、4、6R 水平比较

结果见表1。

2.2 各组大鼠结肠IL 2、4、6R mRNA 表达水平比较

结果见表2及图1。

表2 各组大鼠结肠IL 2、4、6R mRNA 水平比较

x s

组别n IL 2R mR N A IL 4R mRN A IL 6R mRN A 模型组

7 1.21 0.551)0.53 0.181)

0.55 0.072)5 A SA 组70.54 0.543)0.41 0.220.40 0.133)大剂量组70.63 0.283)0.29 0.270.32 0.124)中剂量组70.65 0.500.50 0.180.33 0.124)小剂量组70.73 0.390.50 0.140.47 0.23正常组

60.50 0.52

0.29 0.16

0.32 0.16

与正常组比较1)P <0.05,2)P <0.01;与模型组比较3)P <0.05,4)P <0.

01

图中左起第1道为DN A marker ,DN A marker 由上至下注明的标记分别为500、300bp;从右至左依次#?正常组、%&模型组、?(小剂量组、)?中剂量组、+ 大剂量组、

!5 A SA 组图1 大鼠结肠IL 2、4、6R mRN A 表达RT PCR 电泳条带

3 讨论

U C 是现代医学的难治病之一。近年来发病率呈上升趋势。由于该病的病因和发病机制尚未完全明确,目前西药治疗并无特效药物。中医学以,痢疾?,肠澼?等论治,积累了丰富的临床经验,其疗效确切;中药肠道局部治疗因其简、便、廉、验的特点,

表1 各组大鼠血清、结肠sIL 2、4、6R 水平比较

pg/ml, x s

组别n

血清sIL 2R

sIL 4R

sIL 6R 结肠sIL 2R

sIL 4R

sIL 6R

模型组

7111.35 25.092)814.46 56.171)

128.32 21.272)200.11 15.542)444.20 143.38179.95 16.362)5 A SA 组754.46 9.994)

831.07 92.98

65.99 10.244)135.38 15.424)489.02 130.73126.26 15.274)大剂量组768.16 18.724)870.98 128.6968.96 7.943)136.88 14.474)480.98 114.33130.64 8.384)中剂量组769.31 15.904)796.70 112.9067.26 11.193)148.70 11.834)451.43 105.15138.08 10.954)小剂量组764.64 12.814)772.59 150.7968.03 13.424)141.91 24.324)468.04 168.34126.59 15.784)正常组

6

44.34 13.01

725.42 52.59

35.51 13.73

104.43 15.50

383.44 35.02

86.10 12.95

与正常组比较1)P <0.05,

2)

P <0.01;与模型组比较4)P <0.01

311 陈 江,等.清肠栓对大鼠溃疡性结肠炎白细胞介素受体表达的影响

逐渐为愈来愈多的患者所接受。清肠栓由马齿苋、青黛、三七、五倍子等组成,具有清热除湿、活血化瘀、敛疡生肌的功效。前期实验研究提示,清肠栓疗效机制涉及细胞因子调控等方面[2~5],具有调节机体免疫功能及类肾上腺皮质激素样作用,能改善局部血供,降低血管通透性,促进组织修复再生及保护肠黏膜等,发挥抗炎愈溃等效应,在一定程度上证实细胞因子参与U C的局部炎症及免疫损伤病理过程,并在免疫学发病机制中发挥重要作用。根据细胞因子的功能进行不同分类,其中IL主要参与免疫调节和炎症反应。其功能的发挥,需要与其特异性的高亲和力受体结合,才能实现信号转导或特定地作用于靶细胞产生生物效应。可溶性受体一般多由膜受体经蛋白酶作用,胞膜外区自膜表面脱落而成;或是受体mRNA经不同剪接后的翻译产物被直接分泌到了细胞外所产生。可溶性细胞因子受体既可以调节分子、拮抗细胞因子的活性;又可作为细胞因子的载体,加强细胞因子的活性。

笔者实验研究结果发现,模型组血清、结肠上清液sIL 2R、sIL 6R和结肠组织IL 2R、IL 6R m RNA 均较正常组明显升高,与国内外文献报道[9,10]一致。进一步提示IL 2R转录活性增强是T淋巴细胞活化的组成部分,sIL 2R是反映T淋巴细胞活化的标志,其异常增高证实U C是由T淋巴细胞为主介导的免疫病理反应;sIL 6R作为促炎细胞因子IL 6的协同剂,大大增强了IL 6的生物活性。从实验数据也可以看到,各组可溶性受体的结肠上清液水平明显高于血清,反映肠道局部受累为主,表明肠黏膜免疫反应异常在UC中占主导地位。实验结果显示,清肠栓各剂量组能明显降低血清、结肠上清液sIL 2R、sIL 6R水平,不同程度地降低IL 2R、IL 6R 的转录水平,至少具有与西药5 ASA栓同等的疗效;尤以清肠栓大剂量组明显,但并未发现各剂量组之间存在量 效关系,可能与实验所观察的样本量少有关。笔者认为,部分IL R参与并介导了U C的发生发展过程,从而补充了U C的免疫学发病机制,并进一步完善清肠栓疗效的作用机制。至于实验结果中IL 4R的变化,尚难完全阐释,值得进一步深入探讨。有研究[11]表明,UC是T h2细胞应答占优势的免疫异常疾病。sIL 4R是T h2型应答递质,对于T h2应答过度的疾病,sIL 4R可以促进T h2应答转化为Th1应答。因此不难解释研究结果出现的趋势:清肠栓通过提高sIL 4R水平,促使U C Th2过度应答转为T h1应答,以利于T h细胞的平衡,恢复正常的免疫应答机制。

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312中国中西医结合消化杂志 2009年10月第17卷第5期

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