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提高电镜技术与细胞超微结构实验教学质量

提高电镜技术与细胞超微结构实验教学质量
提高电镜技术与细胞超微结构实验教学质量

提高电镜技术与细胞超微结构实验教学质量

摘要:实验教学是电镜教学的重要内容,它能够培养学生实践操作技能及学生动手和分析解决问题的能力。通过学习对电镜技术在医学研究和临床诊断中的应用有一定的了解,基本掌握细胞正常超微结构及主要细胞器的超微病变特征,为以后医学科研深入研究奠定扎实的理论和操作基础。

关键词:电子显微镜技术实验教学

电镜技术与细胞组织超微结构学(以下简称电镜)是我校为本科生、研究生开设的一门专业基础课程,教学过程中,除了理论讲解,还有大量的实习内容。通过本门课程的学习,有助于学生今后在阅读相关文献以及在实际工作中学习和应用电镜技术。电镜教学的内容属于形态学的范围,提高实验教学质量,具有十分重要的意义[1]。

1、由于电镜结构努力改进实验教学手段和方法,不断提高教学质量

复杂,技术操作精细,概念、原理专业性强,课堂讲授比较抽象,学生感到比较枯燥,理解不透[2]。为了提高学生的学习兴趣和积极性,我室采取了:理论讲授-见习参观-实验操作-实习巩固的教学模式,注重动手操作能力的培养。通过见习参观,学生对电镜有更形象的认识,对电镜技术有初步的了解。理论课教学与组织胚胎学、病理学等各学科联系起来,采用视频、动画、图片、实例等多种教学方式,加强教学效果,引入工作中已经开展的新技术、新方法,扩充教学内容,最后进行归纳总结,理清各种操作步骤之间的关系,突出重点。

2、实习课程内容和临床、科研工作密切结合

学习电镜课程的学生大多数都是医学临床专业的学生,尤其是研究生,对他们来说,基础医学的内容,包括电镜所学的知识,除了应用于他们将来的科研工作之外,还要为临床工作提供辅助和诊治的理论和相关条件。只有理论和临床完美的结合,才能提高学生学习的兴趣和积极性。随着医学科学的不断发展,目前临床上应用电镜技术获得相关信息也越来越普遍。电镜技术对疾病的病情、病因的鉴定,尤其在肿瘤、血液病、肌肉疾病及肾脏病等的分型诊断上都取得显著成效。我们在电镜实习教学过程中,结合了大量的临床病例,例如肾小球肾炎的分型、低分化肿瘤的鉴别诊断、血液疾病、肌肉疾病、肝脏疾病等的诊断和鉴别诊断,从具体病例的取材方法、诊断情况、超微病理图片等内容,进行示教,加深学生对电镜在病理诊断和临床应用方面的印象,也为以后学生们在实际工作中对电镜技术的推广和应用留下了深刻印象。为以后医学科研深入研究奠定扎实的理论和操作基础。为此,在电镜实习课教学中,要密切联系相关的科研工作。

超微病理标本的质量好坏,直接影响到观察和超微病理诊断的正确性,对标

扫描电镜实验报告

扫描电镜分析实验 一实验目的 1. 了解扫描电子显微镜的原理、结构; 2. 运用扫描电子显微镜进行样品微观形貌观察。 二实验原理 扫描电镜(SEM)是用聚焦电子束在试样表面逐点扫描成像。试样为块状或粉末颗粒,成像信号可以是二次电子、背散射电子或吸收电子。其中二次电子是最主要的成像信号。由电子枪发射的电子,以其交叉斑作为电子源,经二级聚光镜及物镜的缩小形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束,在扫描线圈驱动下,于试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用,产生二次电子发射以及背散射电子等物理信号,二次电子发射量随试样表面形貌而变化。二次电子信号被探测器收集转换成电讯号,经视频放大后输入到显像管栅极,调制与入射电子束同步扫描的显像管亮度,得到反映试样表面形貌的二次电子像。扫描电镜由下列五部分组成,如图1(a)所示。各部分主要作用简介如下: 1.电子光学系统 它由电子枪、电磁透镜、光阑、样品室等部件组成,如图1(b)所示。为了获得较高的信号强度和扫描像,由电子枪发射的扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。常用的电子枪有三种形式:普通热阴极三极电子枪、六硼化镧阴极电子枪和场发射电子枪,

其性能如表2所示。前两种属于热发射电子枪,后一种则属于冷发射电子枪,也叫场发射电子枪。由表可以看出场发射电子枪的亮度最高、电子源直径最小,是高分辨本领扫描电镜的理想电子源。 电磁透镜的功能是把电子枪的束斑逐级聚焦缩小,因照射到样品上的电子束斑越小,其分辨率就越高。扫描电镜通常有三个磁透镜,前两个是强透镜,缩小束斑,第三个透镜是弱透镜,焦距长,便于在样品室和聚光镜之间装入各种信号探测器。为了降低电子束的发散程度,每级磁透镜都装有光阑;为了消除像散,装有消像散器。 六硼化镧阴极电子枪105~1061~10 ≈500 10-4 场发射电子枪107~108 0.01~ 0.1 ≈5000 10-7~10-8 样品室中有样品台和信号探测器,样品台还能使样品做平移运动。 2.扫描系统 扫描系统的作用是提供入射电子束在样品表面上以及阴极射线管电子束在荧光屏上的同步扫描信号。 3.信号检测、放大系统 样品在入射电子作用下会产生各种物理信号、有二次电子、背散射电子、特征X射线、阴极荧光和透射电子。不同的物理信号要用不同类型的检测系统。它大致可分为三大类,即电子检测器、阴极荧光

细胞培养实验技术大全

细胞培养实验技术大全 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术,而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系,特别是在医药领域的发展,细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养,杂交瘤单克隆抗体,完全是通过细胞培养来实现的,既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现,发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之,细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养(in vitro culture),就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出,放在类似于体内生存环境的体外环境中,让其生长和发育的方法。 组织培养:是指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法。 细胞培养:是指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。 器官培养:是指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异:细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中,日久天长,易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此,培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后,这种差异就开始发生了。 2、分化:体外培养的细胞分化能力并未完全丧失,只是环境的改变,细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件,如Friend细胞(小鼠红白血病细胞)在一定的因素作用下可以合成血红蛋白,血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构,杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体,这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养,则

sem实验报告

电子显微镜 一、实验目的 1、了解并掌握电子显微镜的基本原理; 2、初步学会使用电子显微镜,并能够利用电子显微镜进行基本的材料表面分析。 二、实验仪器 透射电镜一是由电子光学系统(照明系统)、成像放大系统、电源和真空系统三大部分组成。 本实验用S—4800冷场发射扫描电子显微镜。 实验原理 电子显微镜有两类:扫描电子显微镜、透射电子显微镜,该实验主要研究前者。 (一)扫描电子显微镜(SEM) 由电子枪发射的电子束,经会聚镜、物镜聚焦后,在样品表面形成一定能量和极细的(最小直径可以达到1-10nm)电子束。在扫描线圈磁场的作用下,作用在样品表面上的电子束将按一定时间、空间顺序作光栅扫描。电子束从样品中激发出来的二次电子,由二次电子收集极,经加速极加速至闪烁体,转变成光信号,此信号经光导管到达光电倍增管再转变成电信号。该电信号经视屏放大器放大,输送到显像管栅极,调制显像管亮度,使之在屏幕上呈现出亮暗程度不同的反映表面起伏的二次电子像。由于电子束在样品表面上的扫描和显像管中电子束在荧屏上的扫描由同一扫描电路控制,这就保证了它们之

间完全同步,即保证了“物点”和“像点”在时间和空间上的一一对应。 扫描电镜的工作原理如图1。 图1 扫描电镜的工作原理 高能电子束轰击样品表面时,由于电子和样品的相互作用,产生很多信息,如图2所示,主要有以下信息:

图2 电子束与样品表面作用产生的信息示意图 1、二次电子:二次电子是指入射电子束从样品表面10nm左右深度激发出的低能电子(<50eV)。二次电子的产额主要与样品表面的起伏状况有关,当电子束垂直照射表面,二次电子的量最少。因此二次电子象主要反映样品的表面形貌特征。 2、背散射电子象:背散射电子是指被样品散射回来的入射电子,能量接近入射电子能量。背散射电子的产额与样品中元素的原子序数有关,原子序数越大,背散射电子发射量越多(因散射能力强),因此背散射电子象兼具样品表面平均原子序数分布(也包括形貌)特征。 3、X射线显微分析:入射电子束激发样品时,不同元素的受激,发射出不同波长的特征X射线,其波长λ与元素原子序数Z有以下关系(即莫斯莱公式):ν=hc/λ=K(Z-σ)2 SEM主要特点

(完整版)细胞实验技术

(一)干扰引物(shRNA)设计: 1、NCBI上下载基因序列 2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物(上下游) 3、从起始密码(ATG)下游25bp开始; 4、GC含量介于40%~60% 5、干扰引物至少一个在SDS区,一个在3’UTR区 6、选择脱靶率低的 (二)、干扰载体构建 1、引物退火(引物加水看标签X 50,弹匀,瞬离) 退火体系: 上游:5ul 下游:5ul 10X M buffer 5ul H2O 35ul 水浴锅100℃2min,锅里隔夜 (三)、酶切plko.1载体 1、AgeI 酶切,反应体系: plko.1载体4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2O 39ul 37℃水浴2~3h 2、切胶回收AgeI 酶切产物,30ul 水洗脱 3、EcoRI酶切,反应体系: AgeI 酶切产物30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2O 13ul 37℃水浴2~3h 切胶回收,30ul 水洗脱,测浓度 (四)、连接 连接体系:T4连接: 退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ul Solution I 5ul T4连接酶1ul H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连接4h。 (五)、转化 -80℃取感受态细胞于冰上融化,在1.5ml离心管加33ul感受态,将连接产物加入,冰上放置30min,42℃水浴60~90s,冰上放置2min,加入无氨苄培养基,37℃摇床1h,涂布在氨苄平板上,37℃,16h。 (六)、挑菌 用枪头挑取5个菌落(可送测序)扩大培养,加有氨苄的培养基,37℃过夜培养。 (七)、提质粒

超微病理学

《超微病理学》课程主要内容 超微结构病理学( Ultrastructural pathology),简称超微病理学,它是在超微水平或分子水平上观察研究病理状态下细胞的超微变化,在超微水平和分子水平上揭示疾病的发生机理及疾病的发生、发展和转化的规律。 随着现代化电镜和分子生物学技术的迅猛发展,医学基础理论取得了许多重要进展,利用细胞超微病变方法来认识、观察某些器官和组织的超微结构和超微病变,并根据需要将细胞病理学的理论和方法应用于科学研究之中。电镜技术是打开微观世界大门的一把钥匙,它是当今分子病理学不可缺少的研究手段,因此人们把它喻为超微观世界(或分子世界)的眼睛。超微病理学等新学科的出现,标志着病理学已不仅从细胞和亚细胞水平、而且深入到从分子水平、以及人类遗传基因突变和染色体畸变去认识疾病,发现疾病的起因。超微病理学就是从细胞超微结构水平以至分子水平研究疾病的病因、发病机理、病理变化和探索疾病防治的重要基础课程。 开设此课程的目的,就是使学生通过学习了解掌握人体基本组织和病变,进而了解掌握细胞和重要器官常见病超微病理的基本知识、方法和理论,拓宽学生视野,提高分析问题和解决问题的能力,为今后独立科研推进中医药现代化打好基础。 本课程中的基本教学内容包括:电子显微镜原理、细胞的超微结构及其基本病变、肝脏超微病理学、心血管系统常见疾病的超微病理学、肾脏超微病理学、神经肌肉系统常见疾病的超微病理学、呼吸系统常见疾病的超微病理学、电镜生物样本制作等8个主要的学习内容。 电子显微镜原理是介绍了超微病理学的发展史、电子显微镜与光学显微镜的区别、电子显微镜的常见类型、透射和扫描电子显微镜的成像原理。 细胞的超微结构及其基本病变是讲述细胞膜、细胞核、各种细胞器的基本超微结构和功能及常见的超微病理变化。 心血管系统常见疾病的超微病理学是讲述正常心肌细胞的超微结构、心绞痛、心肌梗死、动脉粥样硬化等疾病的超微结构变化特点。 肝脏超微病理学是介绍肝细胞、肝窦状隙和窦周隙的基本结构及其基本病变;

扫描电镜实验报告

扫描电镜实验报告 姓名:xxx 专业:xxx 学号:xxxxxxxx 一、实验目的 1. 了解扫描电镜的构造及工作原理; 2.学习扫描电镜的样品制备; 3. 学习扫描电镜的操作; 3. 利用扫描电镜对铝粉的形貌进行观察。 二、实验原理 扫描电镜原理是由电子枪发射并经过聚焦的电子束在样品表面扫描,激发样品产生各种物理信号,经过检测、视频放大和信号处理,在荧光屏上获得能反映样品表面各种特征的扫描图像。扫描电镜由下列五部分组成,主要作用简介如下: 1.电子光学系统。其由电子枪、电磁透镜、光阑、样品室等部件组成。为了获得较高的信号强度和扫描像,由电子枪发射的扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。常用的电子枪有三种形式:普通热阴极三极电子枪、六硼化镧阴极电子枪和场发射电子枪。前两种属于热发射电子枪;后一种则属于冷发射电子枪,也叫场发射电子枪,其亮度最高、电子源直径最小,是高分辨本领扫描电镜的理想电子源。电磁透镜的功能是把电子枪的束斑逐级聚焦缩小,因照射到样品上的电子束斑越小,其分辨率就越高。扫描电镜通常有三个磁透镜,前两个是强透镜,缩小束斑,第三个透镜是弱透镜,焦距长,便于在样品室和聚光镜之间装入各种信号探测器。为了降低电子束的发散程度,每级磁透镜都装有光阑;为了消除像散,装有消像散器。样品室中有样品台和信号探测器,样品台还能使样品做平移、倾斜、转动等运动。 2. 扫描系统。扫描系统的作用是提供入射电子束在样品表面上以及阴极射线管电子束在荧光屏上的同步扫描信号。 3. 信号检测、放大系统。样品在入射电子作用下会产生各种物理信号、有二次电子、背散射电子、特征X射线、阴极荧光和透射电子。不同的物理信号要用不同类型的检测系统。它大致可分为三大类,即电子检测器、阴极荧光检测器和X射线检测器。 4. 真空系统。镜筒和样品室处于高真空下,它由机械泵和分子涡轮泵来实现。开机后先由机械泵抽低真空,约20分钟后由分子涡轮泵抽真空,约几分钟后就能达到高真空度。此时才能放试样进行测试,在放试样或更换灯丝时,阀门会将镜筒部分、电子枪室和样品室分别分隔开,这样保持镜筒部分真空不被破坏。 5. 电源系统。其由稳压、稳流及相应的安全保护电路所组成,提供扫描电镜各部分所需要的电源。

动物细胞培养技术实验教程内容

实验1 细胞培养概述 (一)细胞培养室的设置和无菌操作 【实验原理】 细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作,避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立,各自完成培养过程中的不同操作。 【实验目的】 ①了解培养室的设置和设备。 ②学习无菌概念和无菌操作要领。 【操作步骤】 1.实验室设置 (1)配液室 (2)准备室 (3)培养室 培养室内要完全密闭,保持恒定的温度,在设计上要注意以下几点: ①培养室的位置最好设在阴面,阳光不能直接照射的地方,防止室内温度增高。 ②天花板的高度不要超过2米,以保证紫外灯的有效杀菌效应, ③门一般用拉门,以防止空气流动。 ④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角,要镶瓷砖或涂油漆,这样设计,一是便于清洗和消毒,另外也不易在墙角堆积灰尘。 2.实验室常用设备 (1)准备室的设备 ①双蒸馏水蒸馏器:制备双蒸水。 ②酸缸:盛洗液,浸泡玻璃器具。 ③干燥箱:洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。 ④高压锅:玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 ⑤储品柜1:放置未消毒物品。 ⑥储品柜2:放置已消毒物品。 准备室注意事项: ①预防蒸馏器被烤干。 ②勿将酸液溅到衣物或地面。

③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 ④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。 (2)配液室的设备 ①天平(扭力天平和电子天平):称量用 ②pH计。 ③磁力搅拌器。 (3)细胞培养室的设备 ①超净工作台: 超净工作台的种类很多,有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等,其工作原理是利用鼓风机,使通过高效滤气的空气,徐徐通过台面,这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。 根据层流方式的不同,超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种,基本原理大致相同,都是将室内空气经粗过滤器初滤,由离心风机压入静压箱,再经高效空气过滤器,由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌,从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。 使用超净工作台应注意的几点问题: A.净化工作台最好安装在无尘的房间内,最好为隔离好的无菌间内,以免尘土过多易使滤器阻塞,降低净化效果,缩短使用寿命。 B.新安装的或长期未使用的工用台,工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作,再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 C.每次使用工作台时,应先用75%酒精擦洗台面,并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。

超微病理学试卷二(1)‘

一、名词解释:(2×5’) 1、核仁边集:在生长旺盛的细胞,核仁常靠近核膜内侧,称为核仁边集,以有利于核仁 合成的RNA向胞浆运送。 2、HSP:即热休克蛋白,指热应激(或其他应激)时细胞新合成或合成增加的一组蛋白 质,它们主要在细胞内发挥功能,属非分泌型蛋白质 3、缺血—再灌注损伤:在恢复血液灌注时,组织反而出现比再灌注前更明显、更严重的 损伤和功能障碍,这种现象被称为缺血—再灌注损伤。 4、无复流现象:是指缺血的原因解除后,并没使缺血区在再灌注期得到充分血流灌注的 反常现象。 5、凋亡小体:细胞凋亡时,胞膜皱缩内陷、分割包绕胞浆而形成泡状小体称为凋亡小体, 它是细胞凋亡的特征性形态学改变。 二、填空题:(20×0.5’) 1、膜脂中,胆固醇具有(刚性)的特点,其含量越高,细胞膜的流动性越(低) 2、线粒体复制的方式有(芽生)和(分裂) 3、细胞信号转导途径中,不同胞外信号所启动的信号转导过程的共同通路是(蛋白质的磷酸化)和(脱磷酸) 4、机体对感染、组织损伤的保护性反应可大致分为两个时相,一是(急性反应),二是 (迟缓相或免疫时相)。 5、白细胞介导缺血—再灌注损伤的机制主要有(机械阻塞作用)和(炎症反应失控) 6、细胞凋亡信号的转导系统的特点是:多样性、(同一性)和(偶联性) 7、细胞外基质主要由纤维状的胶原蛋白和(弹性蛋白)、非胶原糖蛋白、(蛋白聚糖)和 糖蛋白构成。 8、缺血—再灌注损伤的机制主要有:高能磷酸化合物的缺乏、(钙超载)氧自由基的作用、白细胞浸润和(无复流现象) 9、恶性肿瘤的演化可以分为两个阶段,即(演发)和(演进) 10、缺血—再灌注性心率失常以(室性心动过速)和(室颤)为主 三、单选题: 2、应激时的抵抗期体内起主要的激素是:() A、胰岛素 B、醛固酮 C、胰高血糖素 D、糖皮质激素 E、垂体加压素 3、下面哪项是关于“分子伴娘”的正确描述?( ) A、能提高细胞对多种应激原的耐受能力 B、与受损蛋白质修复或移除有关 C、帮助蛋白质的正确折叠、移位、维持和降解 D、诱生性HSP即是一类重要的“分子伴娘” E、以上都对 5、下述关于黏附分子的说法,哪一点是错误的?() A、可促进细胞及基质的黏附 B、由血浆产生 C、由整合素、选择素等一大类分子组成 D、维持细胞结构 E、参与细胞信号转导 7、关于细胞凋亡与细胞坏死的区别,下列哪项是错误的?() A、细胞凋亡耗能,细胞坏死不耗能 B、细胞凋亡有新蛋白质合成,细胞坏死没有 C、凋亡细胞DNA片段化,坏死细胞DNA弥散性降解

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后,储存于-20℃或-70℃备用。(甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可) 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环,接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上(活化菌种),37℃培养过夜(约16小时);挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(约12~16小时)。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌,接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(约12~16小时)。 1.3小规模制备质粒DNA(QIA miniprep kit ) 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液,离心1000rpm,1分,弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌(P1中已加RNase) ⑶加入250ul P2,颠倒4~6次轻混,约2~3分(轻混以免剪切基因组DNA,并免 长时间消化) ⑷加入350ul N3,迅速颠倒4~6次轻混;离心10分,13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱,离心30~60秒,滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗,离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗,离心30~60秒,弃滤液,再离心1分 ⑻换新管,加入50ul EB,静置1分(EB 37℃预热),离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成(反应体系尽可能小!) pGEM3ZF-huCTLA4-Ig(ul)pAdTrack-CMV(ul)

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时,必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后,取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol) ⑴胶,尽可能去除多余的胶,称重; ⑵加入适量buff QG(300ul QG /100mg胶);>2%的胶,应加大QG用量(600ul QG /100mg); ⑶水浴50℃,10min,每2-3min混匀一次,使胶完全溶解!必要时延长水浴时间, 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色,与buff QG 相似; ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时,应加入异戊醇100ul/100mg胶,以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时,加入异戊醇并不能提高产量; ⑸结合:将混合物转入QIAquick柱,离心13000rpm,1min;(柱容量800ul/次); ⑹洗:0.75ml buff PE,离心13000rpm,1min;(DNA用于盐敏感操作时,如平 端连接、直接测序,加入PE后静置2-5min);弃离心液,再离心13000rpm, 1min,以去除剩余的乙醇; ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管,加入30~50ul buff EB或H2O (滴 于QIAquick 膜上!),静置1min,离心15000rpm,1min; ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

扫描电镜实验报告

扫描电镜实验报告 一实验目的 1 了解扫描电镜的发展,原理,应用范围。 2 初步掌握扫描电镜的使用及其注意事项。 二实验仪器及样品 JEOL扫描电镜;硫酸钙晶须。 三实验原理 扫描电镜,全称为扫描电子显微镜,英文为scanning electron microscope(SEM),是一种用于观察物体表面结构的电子光学仪器。 1 扫描电镜的原理 扫描电子显微镜的制造是依据电子与物质的相互作用。当一束高能的人射电子轰击物质表面时,被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征x射线和连续谱X射线、背散射电子、透射电子,以及在可见、紫外、红外光区域产生的电磁辐射。同时,也可产生电子-空穴对、晶格振动(声子)、电子振荡(等离子体)。如对二次电子、背散射电子的采集,可得到有关物质微观形貌的信息;对X射线的采集,可得到物质化学成分的信息。扫描电镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子的多少与电子束入射角有关,也就是说与样品的表面结构有关,次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本的表面结构。 2扫描电镜的结构 (1)镜筒镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm),并且使该电子束在样品表面扫描,同时激发出各种信号。 (2)电子信号的收集与处理系统在样品室中,扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号,其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。在上述信号中,最主要的是二次电子,它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子,产生于样品表面以下几纳米至几十纳米的区域,其产生率主要取决于样品的形貌和成分。通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像,它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。检测二次电子的检测器的探头是一个闪烁体,当电子打到闪烁体上时,就在其中产生光,这种光被光导管传送到光电倍增管,光信号即被转变成电流信号,再经前置放大及视频放大,电流信号转变成电压信号,最后被送到显像管的栅极。 (3)电子信号的显示与记录系统扫描电镜的图象显示在阴极射线管(显像管)上,并由照相机拍照记录。显像管有两个,一个用来观察,分辨率较低,是长余辉的管子;另一个用来照相记录,分辨率较高,是短余辉的管子。 (4)真空系统及电源系统扫描电镜的真空系统由机械泵与油扩散泵组成。电源系统供给各部件所需的特定的电源。 3扫描电镜的用途 扫描电镜最基本的功能是对各种固体样品表面进行高分辨形貌观察。大景深图像是扫描电镜观察的特色,例如:生物学,植物学,地质学,冶金学等等。观察可以是一个样品的表

2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养(cell culture):细胞在体外条件下生长,细胞不再形成组织。 动物细胞培养(animal cell culture)就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞(使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶)然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力,为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养(primary culture)即直接从动物机体分离、获得组织细胞,在无菌条件下,用胰蛋白酶消化或机械分散等方法,将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养(subculture)当细胞生长增值达到一定密度,用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞,将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体,在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的,但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究,则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料,对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制,也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性,因此,动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段,被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区:只限于细胞培养及其它无菌操作,与外界隔离。 孵育区:培养箱设定的条件为37℃,5%CO2。 制备区:培养液及有关培养用液体的制备,液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区:包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区:清洗区为相对污染区,消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施: 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿:培养瓶、培养板、培养皿,玻璃瓶、吸管,离心管、冻存管,注射器,烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡,以中和其表面碱性物质:刷洗: 硫酸清洁液浸泡:浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水; 冲洗:流水冲洗15-20次,蒸馏水冲洗3次,三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装,防止灭菌后污染。使用时放入超净工

超微结构检查

生物电镜技术在生物医学领域中的应用 摘要: 随着现代医学细胞超微结构及分子生物学等学科的迅速发展,电子显微镜技术并未像某些人预测的那样随着免疫组化技术的发展而进入了末日。相反,电子显微镜技术也正向超,高分辨率、生物分子及原子水平发展。口述(近年来越来越多的事实证明电镜在人体各种疾病的诊断中仍然发挥着重要的作用。)生物电镜技术在生物和临床医学疾病诊断中作出了巨大的贡献, 并不断开辟着生物医学研究的新领域, 主要从细胞、亚细胞的形态结构上阐明疾病的发生、发展及转归规律, 丰富了传统病理学的知识。口述比如:1.通过对亚细胞结构和病原体的观察, 在生物医学领域利用高性能的电子显微镜观察细胞中各种细胞器正常的和病理的超微结构, 诸如内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体、细胞骨架系统等, 对探明病因和治疗疾病有很大帮助。2.通过研究细胞结构和功能的关系, 也可以研究细胞的通讯与运输、分裂与分化、增殖与调控等生命活动的规律, 电子显微镜也可结合各种制样技术观察病毒、细菌、支原体、生物大分子等的超微结构, 是现代生物医学研究不可替代的工具。口述(随着电镜技术的不断改进以及与多种研究手段相结合, 电子显微镜将在生物医学领域应用会更加广泛。) 口述:引言:首先,我们需要知道的是生物电镜技术是医学生物学工作者深入研究机体的超微结构及其功能的有利手段之一。所谓超微结构,一般指光学显微镜所不能分辨的组织、细胞的细微形态结构(亚显微结构)以及生物大分子的结构。在形态学科,如解剖学、组织学、胚胎学、细胞学、病理学、微生物学、寄生虫学等等之中,电子显微镜技术已成为研究结构的常规方法。在某些机能学科,如生理、生物化学、病理生理、药理等。此外,在临床医学、环境保护科学以及中草药的研究等,电镜技术也做出了重要的贡献,并不断开辟着生物医学研究的新领域,主要从细胞,亚细胞的形态结构上阐明疾病的发生,发展及其病理转归规律。而随着电镜技术的不断改进以及与多种研究手段相结合,电镜技术在生物医学的应用将更加广泛。下面,我们小组将对生物电镜技术在生物医学领域中的应用稍作讲解。分为两个部分。 正文: 一.生物电镜技术在生物和医学中的研究历史 电子显微镜诞生于二十世纪30年代,德国的 Bruche和 Johannson根据电子光学原理,以电子束为介质用电子柬和电子透镜代替传统的光束和光学透镜,

材料分析(SEM)实验报告

材料专业实验报告 题目:扫描电镜(SEM)物相分析实验学院:先进材料与纳米科技学院专业:材料物理与化学 姓名: 学号:1514122986 2016年6月30日

扫描电镜(SEM)物相分析实验 一.实验目的 1.了解扫描电镜的基本结构与原理 2.掌握扫描电镜样品的准备与制备方法 3.掌握扫描电镜的基本操作并上机操作拍摄二次电子像 4.了解扫描电镜图片的分析与描述方法 二.实验原理 1.扫描电镜的工作原理 扫描电镜(SEM)是用聚焦电子束在试样表面逐点扫描成像。试样为块状或粉末颗粒,成像信号可以是二次电子、背散射电子或吸收电子。其中二次电子是最主要的成像信号。由电子枪发射的电子,以其交叉斑作为电子源,经二级聚光镜及物镜的缩小形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束,在扫描线圈驱动下,于试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用,产生二次电子发射以及背散射电子等物理信号,二次电子发射量随试样表面形貌而变化。二次电子信号被探测器收集转换成电讯号,经视频放大后输入到显像管栅极,调制与入射电子束同步扫描的显像管亮度,得到反映试样表面形貌的二次电子像。 本次实验中主要通过观察背散射电子像及二次电子像对样品进行分析表征。 1)背散射电子 背散射电子是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子,其中包括弹性背反射电子和非弹性背反射电子。弹性背反射电子是指被样品中原子和反弹回来的,散射角大于90度的那些入射电子,其能量基本上没有变化(能量为数千到数万电子伏)。非弹性背反射电子是入射电子和核外电子撞击后产生非弹性散射,不仅能量变化,而且方向也发生变化。非弹性背反射电子的能量范围很宽,从数十电子伏到数千电子伏。背反射电子的产生范围在100nm-1mm深度。背反射电子产额和二次电子产额与原子序数的关系背反射电子束成像分辨率一般为50-200nm(与电子束斑直径相当)。背反射电子的产额随原子序数的增加而增加,所以,利用背反射电子作为成像信号不仅能分析形貌特征,也可以用来显示原子序数衬

细胞培养实验技术手册

实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×(with L-glutamine)类培养基组分:RPMI ,10%FBS(胎牛血清),双抗生素(penicillin,盘尼西林(青霉素),streptomycin,链霉素); 配制方法:500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分:DEMI,10% FBS,双抗生素; 配制方法:500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板(每孔培养2 ml),吸出培养液; 2.PBS清洗;用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中(枪头不要触碰培养板,防止交叉污染),用1 ml枪吹匀清洗(把培养板倾斜,吸溶液指最高处打出)。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ,吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板(每孔培养2 ml),吸出培养液; 2.PBS清洗;用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中(枪头不要触碰培养板,防止交叉污染),用1 ml枪吹匀清洗(把培养板倾斜,吸溶液至最高处打出)。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化(时间较长,放进培养箱,看到有白色悬浮后取出),取出加DMEM类培养基; 4. 吸出至1.5 ml 离心管,3600 rpm,4 min离心; 5. 吸出上清(不要触及沉淀),加PBS 1ml清洗,3600 rpm,4 min离心; 四、常用细胞系(人) 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体(76,XX)DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体(81-83,XX)MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体(55,XY)MEM+NEAA 10%FBS MEM:极限必需培养液(Eagle);NEAA:非必需氨基酸;DMEM:Dulbecco’s MEM改良培养液;RPMI:Roswell Park Memorial 研究所;BrdU:5-溴脱氧尿苷;APRI:腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基,其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中,用PBS或培养液漂洗2-3次,去除血污; 2.加少量培养液,用剪子把组织剪碎,1 平方mm左右,再用吸管吹打; 3.加含10%小牛血清的1640培养液,制成均匀的细胞悬液,移入培养瓶,将组织块放在培养瓶底部,采用薄层营养液培养法,盖上瓶盖。 4.换液,只将旧的培养液吸弃,换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好:上清液清亮,无悬浮物,折光性好,均质而透明,胞膜完整,胞内颗粒少,无空泡和脂滴。细胞生长不良:悬浮物多,发差增大,胞膜不完整,胞质中颗粒多,出现空泡和脂滴。

扫描电镜实验报告

HUNAN UNIVERSITY 姓名:扫描电镜实验报告 姓名:高子琪 学号: 2

一.实验目的 1.了解扫描电镜的基本结构与原理; 2.掌握扫描电镜样品的准备与制备方法; 3.掌握扫描电镜的基本操作并上机操作拍摄二次电子像; 4.了解扫描电镜图片的分析与描述方法。 二.实验设备及样品 1.实验仪器:D5000-X衍射仪 基本组成:1)电子光学系统:电子枪、聚光镜、物镜光阑、样品室等 2)偏转系统:扫描信号发生器、扫描放大控制器、扫描偏转线圈 3)信号探测放大系统 4)图象显示和记录系统 5)真空系统 2.样品:块状铝合金 三.实验原理 1.扫描电镜成像原理 从电子枪阴极发出的电子束,经聚光镜及物镜会聚成极细的电子束(0.00025微米-25微米),在扫描线圈的作用下,电子束在样品表面作扫描,激发出二次电子和背散射电子等信号,被二次电子检测器或背散射电子检测器接收处理后在显象管上形成衬度图象。二次电子像和背反射电子反映样品表面微观形貌特征。而利用特征X射线则可以分析样品微区化学成分。 扫描电镜成像原理与闭路电视非常相似,显像管上图像的形成是靠信息的传送完成的。电子束在样品表面逐点逐行扫描,依次记录每个点的二次电子、背散射电子或X射线等信号强度,经放大后调制显像管上对应位置的光点亮度,扫描发生器所产生的同一信号又被用于驱动显像管电子束实现同步扫描,样品表面与显像管上图像保持逐点逐行一一对应的几何关系。因此,扫描电子图像所包含的信息能很好地反映样品的表面形貌。 2.X射线能谱分析原理 X射线能谱定性分析的理论基础是Moseley定律,即各元素的特征X射线频率ν的平方根与原子序数Z成线性关系。同种元素,不论其所处的物理状态或化学状态如何,所发射的特征X射线均应具有相同的能量。

细胞培养技术

细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长,在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中,由于环境的改变,细胞的移动或受一些其他因素的影响,培养时间加长,传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术:相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象,也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中,虽然模拟体内环境,仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时,不应视为体内细胞完全相同,把实验结果推测体内,轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性,分为: 贴附型悬浮型(一)贴附型 细胞贴附在支持物表面生长,只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞:(fibroblast) 来自中胚层 特点:与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2~3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源:细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。

《超微结构病理学》一些知识(第一次修订版)

读图术语:嗜锇性板层小体、酶原颗粒、腺腔、毛细血管、粗面内质网、肾小囊腔、基底膜、足细胞胞体、毛细血管、肾小囊壁层 1、脱水:固定后的组织块含有游离水,不能与包埋剂混合,必须用中间介质(脱水剂)驱除水分,以利于包埋剂浸透渗入。常用脱水剂为酒精或丙酮。市售无水酒精和丙酮往往含有少量水分而纯度不够,可事先加入无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。脱水的时间可根据样品的不同而适当延长或缩短。 2、基膜:上皮细胞基底面与深部编译组织之间的细胞间质形成的薄膜,包括透明层、基板、网版。功能:支持、连接、固定。 3、质膜:亦称为细胞膜。它是细胞与周围环境、细胞与细胞间进行物质交换和信息传递的重要通道。细胞膜的厚度约为7-10nm ,在低倍tem 下观察质膜时,它呈一条致密的细线。在高倍TEM 下,质膜呈现出“两暗一明”的三夹板式结构,称为单位膜。 4、景深:景深不是一种固定的数值,而是与放大倍数和分辨率有关的,用以表达纵深方向层次细节程度的度量。扫描电镜景深大,图像立体感强。扫描电镜的景深比光学显微镜大几百倍,比投射电镜大10 倍左右。 ★线粒体:线粒体的形状多种多样,一般呈线状、粒状或短杆状。光镜下,线粒体直径为0.5-1.0um ,长短不一。电子显微镜下,线粒体由内外两层膜组成。内、外膜之间的腔隙称线粒体外室,内膜围成的腔称线粒体内室。线粒体内膜向内折叠形成[ 山脊] 膜之间的间隙称“[ 山脊] 间隙”,与外室想通。 ★主要功能:是进行氧化磷酸化,合成ATP ,为细胞生命活动提供能量。 ★病理:线粒体对有害因素敏感,易出现超微结构上的异常改变,且在一定范围内又是可逆的,故线粒体是电镜下观察细胞受损的重要形态指标,有人称之为“细胞病变指示器”,是分子细胞病理学检查的重要依据。1. 肿胀,有室内肿胀和室外肿胀;2. 肥大及增生;3. 巨大线粒体及环形、杯形线粒体;4. 线粒体间疝形成;5. 包含物;6 线粒体固缩;7. 急支颗粒增多、增大。 ★高尔基体:在电镜下,不同细胞中高尔基复合体的形态、大小和分布均有很大差异。但其最基本的成分主要包括扁平囊泡、小囊泡和大囊泡三个基本部分组成。扁平囊泡是高尔基复合体的主体部分,一般由3-8 层堆成,表面光滑,囊腔宽约15-20nm ,囊间距约为15-30nm 。小囊泡直径约为40-80nm ,界膜厚约为6nm (和ER 膜接近)。数量较多,与一般吞饮小泡类似,散布于扁平囊泡周围,常见于形成面附近。大囊泡直径为0.1~0.5um ,其界膜约8nm ,其厚度和质膜相近,在一般切面上多见于扁平囊泡扩大的末端,有时可见与之项链,或见于分泌面,所以也称之为分泌泡或浓缩泡。 ★主要功能:1.形成和包装分泌物;2.蛋白质和脂类的糖基化;3.蛋白质的加工改造;4.膜的转化。 ★病理:1. 高尔基复合体肥大;2 猥琐、破坏、消失;3高尔基复合体扩张;4. 内容物的改变。 电镜的类型:超高压电、高压电经、高分辨电镜、普及型电镜、简易型电镜。 样品制备:# 取材、# 固定、脱水(固定后的组织块含有游离水,不能与包埋剂混合,必须用中间介质(脱水剂)驱除水分,以包埋剂浸透渗入。常用脱水剂为酒精或丙酮)、浸透和包埋(一般是石蜡包埋后再用普通的石蜡切片机切片,或是不经石蜡包埋,直接将组织作冷冻切片)、超薄切片术(是应用超薄切片机制备出供投射电镜观察的超薄切片的专门技术。要切除可供透射电镜观察的超薄切片是很不容易的。它取决于浸透包埋的成功与否、切片机的质量和玻璃刀的正确选用,以及操作者的经验等多种因素。 取材: 取材正确与否直接关系到制备出的标本能不能符合观察的要求,取材的要点是:

动物细胞培养实验设计

动物细胞培养技术 实验报告 生物技术1004班第四组

实验一仪器的清洗与灭菌及培养基的配制 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒,掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量最大,也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿,不仅要求干净透明,无油迹,而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质,哪怕残留0.1个,也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要,对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对,即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。常用的消毒灭菌方法有:(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿,如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 (2)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌,是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。(3)滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器,配上可以更换的微孔滤膜,极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。以0.22 μm除菌最为保险,但对于较粘稠难滤过的液体,仍需选用孔径较大的滤膜。(4)化学消毒法70%(或75%)酒精:超净台里常备70%酒精棉球(卫生级酒精),用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。 三、实验材料、用品 1.材料: PH试纸、三蒸水、量筒烧杯(1000ml 2个250ml 4个100ml2个10ml 3个)、玻璃棒(3个)、250ml盐水瓶(8个)10ml盐水瓶(10个) 250ml玻璃螺口培养瓶(27支)1.5ml离心管一瓶微量可调移液器3个(1000ul配套枪头2盒)注射滤器(0.22微米微孔滤膜)(4只)带旋盖离心管10ml (3个)、离心管架一个1把小镊子,3把剪刀,3把弯镊3个100目钢丝筛网牛皮纸橡胶皮筋标签纸记号笔若干 2.药品:75%酒精,DMEM培养基试剂干粉一包、胰蛋白酶250mg,青霉素、链霉素(双抗液0.3g) KH2PO4,NaCl,NaHCO3,KCl ,葡萄糖Na2HPO4.H2O 3.仪器:超净台,高压蒸气灭菌锅,磁力搅拌器、电子天平。 四、实验步骤 (一)仪器的清洗与灭菌

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