微生物学类实验讲义
(适用专业：生物工程、生物技术、生物科学)
北方民族大学生物科学与工程学院
2010年制定
实验目录
微生物学实验规则和安全 (3)
实验一微生物学实验基本知识与准备 (5)
实验二显微镜油镜的使用与细菌染色 (10)
实验三细菌芽孢、荚膜的染色及其认识 (17)
实验四显微镜测微技术及细菌运动性观察 (19)
实验五酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术 (22)
实验六放线菌个体、群体形态观察 (24)
实验七霉菌个体、群体形态观察 (25)
实验八培养基的配制及湿热灭菌，玻璃器皿的干热灭菌 (27)
实验九微生物的分离与纯化 (31)
实验十理化因素对微生物生长的影响，生长谱法测定微生物营养要求 (33)
微生物学实验规则和安全
普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、提出问题、分析问题和解决问题的能力，实事求是、严肃认真的科学态度以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。
微生物学实验室是一个严肃的实验场所，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，与其数量、条件、感染途径等有关，所以在实验操作中，必须将所有的微生物培养物都看成是具有潜在致病性的。
为了上好微生物学实验课，并保证安全，特制定如下规则和安全措施：
1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。
2．在整个实验过程中必须穿上实验服，留长发者，必须将长发挽在背后。实验台上除了记录本和笔(记录笔和记号笔)以外，不准堆放任何个人物品。
3．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
4．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。
5．实验时小心仔细，全部操作应严格按照操作规程进行，禁止用嘴吸取菌液或试剂，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
6．实验过程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。
7．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。显微镜的目镜在使用前后必须用浸有乙醇(酒精)的透镜纸擦净。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处，严禁将药匙交叉使用。
8．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。
9．每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行
培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。
10．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。
11．离开实验室前将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。
2009年9月1日
实验一微生物学实验基本知识与准备
一、目的要求
1．了解微生物学实验基本概念，认识微生物学实验基本材料。
2．熟悉微生物实验所需各种常用器皿的名称和规格。
3．学会正确的清洗玻璃器皿的方法和包扎方法，为实验做准备。
4．熟读与牢记微生物学实验规则和安全。
二、实验原理
为了保证实验顺利进行，要求把实验所用器皿清洗干净，保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎，试管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗净剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎方法也不同。
三、实验器材
1．常用的各种玻璃器皿(三角瓶、移液管、试管、吸管、培养皿、玻片)。
2．洗涤工具和去污粉、肥皂、洗涤液。
3．接种工具、棉花、纱布、棉线等。
四、操作步骤
(一) 玻璃器皿的认识
1．试管：微生物实验室所用的玻璃试管，根据其大小和用途不同，有下列三种型号：
(1) 大试管(约18mm×180mm)：可装倒平板用的培养基，也可作制备斜面用(需要大
量菌体时用)和装液体培养基用于微生物的振荡培养。
(2) 中试管[(13～15)mm×(100～150)mm] ：装液体培养基培养细菌或做斜面用，也
可用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。
(3) 小试管[(10～12)mm×100mm]：一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省
材料的试验。
2．德汉氏小管
观察细菌在糖发酵培养基内是否产气时，在小试管内倒置一小套管(约6mm×36mm)(图1)，此小套管即德汉氏小管，又称发酵小倒管。
3．小塑料离心管
如图2所示，有1.5 mL和0.5 mL二种型号，主要用于小量菌体的离心、DNA(或RNA)分子的检测、提取等。
图1. 德汉氏小管图2. 小塑料离心管
4．玻璃吸管
微生物学实验室通常使用1mL、2mL、5mL、10mL的刻度玻璃吸管。有时需要使用不计量的毛细吸管(又称滴管)来吸取动物的体液、离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。
5．培养皿
又称平皿，由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90mm，高15mm，皿底均为玻璃制成，需要使培养基表面干燥时，可使用陶器皿盖来吸收水分。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。
6．三角瓶与烧杯
三角瓶有100 mL、250 mL、500 mL和1000 mL等不同的规格，常用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50 mL、100 mL、250 mL、500 mL和1000 mL等，用来配制培养基与各种溶液等。
7．载玻片与盖玻片
普通载玻片大小为75 mm×25 mm，用于微生物涂片、染色、形态观察等。盖玻片为18 mm×18 mm。如果在较厚的玻片中央制一圆形的凹窝，就形成了凹玻片。可做悬滴观察活细菌以及微室培养用。
8．滴瓶
用来装各种染色液、生理盐水等。
9．接种工具
常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。玻璃涂布棒：用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需使用玻璃涂布棒。它是将玻璃棒弯曲
或将玻璃棒一端烧红后压扁制成的。
(二) 玻璃器皿的洗涤
根据实验目的、器皿的种类、所装的物品、洗涤剂的种类和沾污程度等的不同，洗涤方法也有所不同。
1．洗涤液的配制
(1) 浓配方：重铬酸钾(工业用)50 g，浓H2SO4(工业用)1000 mL。配法：1000 mL工业用浓H2SO4在文火上加热，然后加人50 g重铬酸钾溶解即成。
(2) 稀配方：重铬酸钾(工业用)50 g，自来水850 mL，浓H2SO4(工业用)100 mL。配法：将重铬酸钾溶解在自来水中，慢慢加人浓硫酸，边加边搅拌，配好后，贮存于广口玻璃瓶内，盖紧塞子备用。应用此液时，器皿必须干燥，同时切忌把大量还原物质带入。洗涤液可应用多次，直至溶液变为绿色时，才算失效。
2．新购置玻璃器皿的洗涤
新购置的玻璃器皿一般含较多游离碱，应在2%的盐酸或洗涤液内先浸泡数小时，浸泡后用自来水冲洗干净。洗净后的试管倒置于试管筐内，三角瓶倒置于洗涤架上，培养皿的皿底和皿盖分开，依次压着皿边排列倒扣在桌上。晾干或在70～80℃干燥箱内烘干备用。
3．使用过的玻璃器皿的洗涤方法
(1) 试管、培养皿、三角瓶、烧杯的洗涤。可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水冲洗干净。洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若还挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗。
含有凡士林或石蜡等的玻璃器皿，必须先除去油污，可在5%苏打液内煮2次，再用热的肥皂水洗刷。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液内24 h或煮沸0.5 h，再用上法洗涤。带致病菌的培养物应先高压灭菌，然后倒去培养物，再进行洗涤。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗1次，再用水冲洗。若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗3次，烘干备用。
(2) 玻璃吸管的洗涤
吸过菌液的吸管(滴管的橡皮头应先拔去)应立即投入2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液内，浸泡24h后方可取出冲洗。吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的吸管
应立即投入自来水中，免得干燥后难以冲洗干净。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装人吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。必要时再用蒸馏水淋洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再冲洗。洗净后，搪瓷盘中晾干或100 ℃烘箱内烘干。
(3) 载玻片的洗涤
玻片上如滴有香柏油，要先用纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次以溶解油垢，再在肥皂水中煮沸5～10 min，用软布擦拭后，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0.5～2 h，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水淋洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用，使用时在火焰上烧去乙醇。检查过活菌的玻片应先在2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭溶液中浸泡24 h，然后按上述洗涤，保存。
(三) 玻璃器皿的包扎
1．培养皿的包扎
培养皿常用牛皮纸或旧报纸包紧，一般以5～8套培养皿包成1包。包好后干热或湿热灭菌。或者不用纸包扎，直接放人特制的金属(不锈钢或铁皮)筒内，(图3)，加盖干热灭菌。
图3 装培养皿的金属筒
1.内部框架
2.带盖外筒
2．吸管的包扎
在干燥吸管的上端约0.5 cm处，塞入一小段1～1.5 cm长的棉花(勿用脱脂棉)，目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎将菌液吸出管外。棉花松紧要合适，若过紧，吹吸液体太费力，过松，吹气时棉花则会下滑。
挑取4～5 cm宽的长纸条，将吸管尖端斜放在纸条的一端，与纸约呈30°角，折叠纸条包住尖端，左手握住吸管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包
扎。上端多余的纸条打一小结(图4)。包好的多支吸管可再用一张大报纸包成一捆灭菌。
图4 单支吸管的包扎方法
干热灭菌时，吸管可不用报纸包扎，直接放入不锈钢筒内，只需尖端朝筒底。3．试管和三角瓶的包扎
试管塞上棉花塞，三角瓶塞上棉花塞(图5)或“通气式”纱布塞(用8层纱布代替棉花制成的塞子)，目的是提供通气条件和防止杂菌污染，外用牛皮纸或2层旧报纸与细线扎好。试管可以多支扎成一捆灭菌。
图5 棉塞的做法
五、思考题
能否用橡皮塞、木塞来代替棉塞，为什么?
实验二显微镜油镜的使用与细菌染色
虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其它的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。
一、目的要求
1．掌握普通光学显微镜油浸系的原理。
2．使用油镜观察几种细菌的基本形态。
3．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色和革兰氏染色方法及无菌操作技术。
二、实验原理
(一) 油镜物镜的基本原理
微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16 mm，10×)高倍物镜(4 mm，
40-45×)和油镜(1.8 mm，95-100×)三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI(oil
immer-sion)字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可
使被检物体放大1000-2000多倍。从图1中可看出油镜的焦距和工作距离(标本在焦点上
看得最清晰时，物镜与样品之间的距离)最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观
察时，镜头离标本十分近，需特别小心。
使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层
油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当
光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的
介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度(图1)。
图1 油浸系的原理
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：
NA＝n·sinα
式中NA=数值孔径；n=介质折射率；α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。
因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时(n=1)，数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0.87，则：
以空气为介质时：
NA=1×0.87=0.87
以水为介质时：
NA=1.33×0.87=1.15
以香柏油为介质时：
NA=1.52×0.87=1.32
显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔
径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜
的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意
味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少
微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可
分辨的最小距离来表示的。
λ（式中λ=光波波长）
能辨别两点之间的最小距离NA
=2
我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55 μm，假如数值孔径为0.65的高倍物镜，
它能辨别两点之间的距离为0.42 μm。而在0.42 μm以下的两点之间的距离就分辨不出，
即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔
径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间
的最小距离为：
因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜(NA=0.65)，和放大率为
24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0.42μm。假如采用放
大率为90倍的油镜(NA=1.25)，和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但
却能分辨出0.22μm间的距离。
(二) 简单染色法
所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子；带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)碱性复红(basicfu-chsin)番红(又称沙黄，safranine)等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
(三) 革兰氏染色法
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是复红。
三、实验器材
1．活材料：培养24h的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
2．染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、香柏油。
3．器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
四、操作步骤
(一) 油镜的使用
1．观察前的准备
(1) 显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将
显微镜搬运到实验桌上。
(2) 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10 cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。
(3) 调节光照：不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。
2．低倍镜观察
镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
3．高倍镜观察
在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察，并准备用油镜观察。4．油镜观察
(1) 用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。
(2) 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
(3) 从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。
(4) 从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。
5．观察完后复原
下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚
乙醇混合液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2-3下即可，(注意向一个方向擦拭)。
将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形
位置，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清
洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
(二) 细菌的简单染色
1．涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。
2．晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。
3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
4．染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2 min。
5．水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。
6．干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
7．镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
(三) 细菌的革兰氏染色
1．涂片。
2．晾干。
3．固定，与简单染色法相同。
4．结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
5．媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。
6．脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即水洗。
7．复染：滴加复红复染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。
8．晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。
9．镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。10．实验完毕后的处理：
(1) 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：
A．先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
B．用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。
C．再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。
(2) 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。
五、注意事项
1．不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。
2．镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3．观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用
油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
4．革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
5．染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
6．选用幼龄的细菌。G+菌培养12 h-16 h，E.coli培养24 h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
六、实验结果
绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
七、思考题
1．油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？
2．使用油镜时，为什么必须用香柏油？
3．镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？
4．作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？
5．革兰氏染色成败的关键一步是什么？
实验三细菌芽孢、荚膜的染色及其认识
一、目的要求
1．学习掌握芽孢染色法。
2．学习掌握荚膜染色方法。
3．初步了解芽孢、荚膜的形态特征。
二、实验原理
(一) 芽孢染色法
利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。芽孢壁厚，透性低、着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料经水洗脱，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液(如番红)处理，则菌体和芽孢易于区别。
(二) 荚膜染色法
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去，所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以加热固定，避免加热蒸发，影响观察。三、实验器材
1．活材料：培养3-5天的芽胞杆菌，荚膜菌。
2．染色液和试剂：1%结晶紫水溶液、20%CuSO4水溶液、孔雀绿染液，番红水溶液。3．器材：载玻片、擦镜纸、显微镜等。
四、操作步骤
(一) 芽孢染色法
1．取芽孢杆菌涂片、干燥、固定。
2．在涂片上滴加质量浓度5%孔雀绿水溶液，然后把片子放在火焰上方加热，在加热的过程中，勿使染料干掉，需不断向涂片上添加孔雀绿溶液。使载玻片上出现蒸汽约十
min，取下载玻片使之冷却，水洗。
3．用番红染色液复染1min，水洗。
4．吸干，镜检，芽孢呈绿色，细胞呈红色。
(二) 荚膜染色
1．涂片。
2．自然干燥固定。
3．结晶紫染色2min。
4．硫酸铜水溶液冲洗脱色，吸水纸吸干残液。
5．镜检，菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。
五、实验结果
1．绘图表示你观察到的两种芽孢杆菌的芽孢在形状、大小、着生位置上有什么不同？2．绘图表示你观察到的荚膜菌的形态，图示颜色。
六、思考题
1．芽孢染色时，如一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即添加染液？为什么？2．若涂片上观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？
实验四显微测微技术及细菌运动性观察
一、目的要求
1．了解测微尺的构造和使用，学会测量微生物细胞大小的方法。
2．学习悬滴法观察细菌运动性技术
二、实验原理
(一) 显微测微技术
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。其大小的测量需在显微镜下用目镜测微尺来进行，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。
物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0.01 mm，即10 pm，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格的相对长度。目镜测微尺是一个可放人接目镜的直径均为1.75 mm的圆形玻片，其中央有精确的等分刻度(有50格和100格两种)测量时，需将其放人接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。
(二) 细菌运动性
在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。
三、实验器材
1．活材料：培养12-16h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母
2．试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。
3．器材：目镜测微尺，物镜测微尺、凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。
四、操作步骤
(—) 显微测微技术
1．装目镜测微尺：取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插人镜筒内。
2．校正目镜测微尺
(1) 将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上
(2) 先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。利用移动器移动物镜测微尺，使两尺的第一条刻度线相重合，再向右寻找另外两条重合的刻度线，分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。
目镜测微尺每格长度＝( 两测微尺重合线间镜台测微尺格数 10) / 两测微尺重合线间目镜测微尺格数
用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。
(3) 酵母细胞大小的测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母水浸片，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。(5-10个取平均)
(二) 悬滴法观察细菌运动性
1．在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。
2．在盖玻片中央滴一小滴菌液，或用接种环取1-2环菌液置于中央。
3．将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，以接种环柄轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。
4．小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心。
5．先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察。观察时光线要调得暗一些。
用悬滴法分别观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的运动性。细菌的运动有一定的前进方向，并可转弯，极生单鞭毛菌类多为直线运动，周生鞭毛菌类多作波浪式运动。
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
一．名词解释 1．微生物的纯培养物：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。 2．菌落：单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见的、有一定形态的子细胞生长群体。 3. 灭菌：是指物体中包括芽孢在内的所有微生物都被杀死或消除。 4. 消毒：杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的措施，消毒可起到防止感 染或传播的作用。 5.无菌技术：在分离、转接及培养纯种微生物时，防止其被环境中微生物污染或 其自身污染环境的技术。 6. 鉴别培养基：在培养基中加入能与特定微生物的代谢产物发生特征性化学反 应的化学物质，用于鉴别不同类型微生物。 7. 选择培养基：根据不同微生物的营养需求或对某种化学物质敏感性不同，在 培养基中加入相应营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长， 将所需微生物从复杂的微生物群体中选择分离出来。 8. 基础培养基：含有一般微生物生长所需基本营养物质的培养基。 9. 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称为化学限 定培养基。 10. 平板划线法：用接种环在培养平板表面划线接种微生物，使微生物细胞数量 随着划线次数的增加而减少，并逐步分开。保温培养后，在固体培养 基表面得到生长分离的微生物菌落。 11. 稀释倒平板法：将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培 养基混合，摇匀后制成可能含菌的培养平板，保温培养后分离得到的 微生物菌落生长在固体培养基表面和里面。 12．平板菌落计数法：将适当稀释的样品涂布于琼脂培养基表面，培养后活细胞能形成菌落，通过计算菌落数能知道样品中的活菌数，该方法称为平 板计数或菌落计数。 二．填空题（每空1分，共20分） 1. 用培养平板进行微生物纯培养分离的方法包括：、、。
《微生物学》实验教学教案[实验项目] 实验一微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌 [教学时数] 3学时 [实验目的与要求] 1．认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。 2．掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。 [实验原理] 微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。 干热灭菌的原理，空的玻璃器皿一般用干热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 [实验材料与设备] 1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。 2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。 3．棉花、扎绳、包扎纸。 [实验步骤] （一）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围 1. 培养皿 由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90 mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 2. 试管 (1)大试管(约18mm×180mm) : 可装倒平板用的培养基，可作制备斜面用（需要大量菌体时用），装液体培养基用于微生物的振荡培养。 (2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用，用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 (3)小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 3.三角瓶
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
微生物学实验复习提纲 1.研究微生物学的基本技术有哪些（显微镜技术、无菌技术、纯种分离技术和纯种培养技术） 2.细菌培养基的配制过程？ 答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面 3.制造接种环、接种针的金属常用铂或镍,原因是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却. 4.灭菌吸管的包装的注意事项：（1）吸管必须干燥;(2)在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm 长的棉花（不能用脱脂棉）。作用是避免外界及口中杂菌吸入管内，并防止菌液等吸入口中。 5.空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌。则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。 6.接种环在用前必须烧灼灭菌，用后也应立即烧灼。 7.酵母的死细胞和活细胞可通过哪些方式鉴别？ 答：1.、用美蓝液对酵母菌染色后，活细胞为无色，死细胞为蓝色2、平板菌落计数法 8.细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物的菌落各有何特点？ 答：细菌：湿润、光滑、透明、粘稠、易挑起、质地均匀、菌落各部位的颜色一致等。 放线菌：质地致密、丝绒状或有皱折、干燥，不透明，上覆盖有不同颜色的干粉（孢子），菌落正反面的颜色常不一致，基内菌丝与培养基结合较紧，难以挑起。 酵母菌：菌落与细菌的相仿，比细菌菌落大而且厚，菌落表面湿润、粘稠、易被挑起，其颜色多为乳白色，少数为红色。同时会散发出悦人的酒香味。 霉菌：菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致等。 9.培养基按化学成分、物理状态、用途划分可分为哪几种类型？ 答：化学成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基物理状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基用途：基础培养基、鉴别培养基、选择培养基 10.实验常用的凝固剂是哪一种？固体培养基、半固体培养基及液体培养基加凝固剂琼脂的量为多少？琼脂在什么温度下溶化？什么温度下凝固？ 答：常用凝固剂是琼脂，分别为1—2%，0.5% 96°C下融化，40°C凝固 11.配制培养基时应遵循哪些原则？配制培养基的一般方法和步骤是什么？配制培养基时不可用铜锅或铁锅，原因是什么？调pH一般用什么试剂调？配制pH低的琼脂培养基时，应怎样配制？ 答：原则：目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约方法：生态模拟、参阅文献、精心设计、试验比较 用磷酸缓冲液和碳酸钙做调节剂 12.培养基分装时，液体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？固体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？半固体分装高度以试管的多少为宜？ 答：液体：试管高度的1\4,三角瓶的试管高度的1\2,固体：试管高度的1\5，三角瓶的1\2，半固体：试管高度的1\3 13.培养基灭菌时外用牛皮纸包扎的目的是什么？ 答：防止灭菌时冷凝水润湿棉塞 14.摆斜面的正确方法是什么？ 答：试管口搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 15.棉塞的作用是什么？正确的棉塞要求是什么？棉塞的长度多少在管口外，多少在管内为
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
《微生物学》课程教学大纲 课程名称：微生物学 课程类型: 必修课 总学时： 108 讲课学时： 54 实验学时：54 学分：3 适用对象: 生物工程专业 先修课程：普通生物学，生物化学 一、课程性质、目的和任务 微生物学是生命科学的一个重要分支，是生物工程专业的一个重要的学科基础必修课。通过本课程的学习，使学生掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；病毒的结构、复制、防治；了解微生物学的研究方法和手段；培养学生“综合”生物学的科学思想，从而使学生能够运用“综合”思想解决生物学中的问题，为学生学习有关后续课程提供必要的理论基础。 二、教学基本要求 通过本课程的学习，要求学生系统掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；了解微生物学的研究方法和手段。 三、教学内容及要求 （一）绪论 1.教学基本内容： （1）微生物与人类； （2）微生物的发现和微生物学的建立与发展； （3）微生物的类群及特点； （4）微生物学研究对象与任务； （5）本课程的目的、要求及范围。 2.要求：通过教学，引导学生走进微生物世界，了解微生物的概念和作用以及它们与人类的特殊关系；明确微生物学作为一门独立学科在生命科学发展中的重要作用和地位；展望未来，激发学生的学习兴趣和明确肩负的重任。 （二）微生物细胞的结构和功能——原核微生物 1.教学基本内容： （1）细菌的形态、结构和繁殖，细菌的群体形态； （2）放线菌的形态、结构和繁殖，放线菌的群体形态； （3）蓝细菌的形态、结构和繁殖；（3～5部分用图表形式概要描述）
（4）支原体、立克次氏体和衣原体的形态、结构、功能和繁殖； （5）古生菌的概念、细胞形态和细胞结构。 2.要求：掌握细菌、放线菌的个体形态、细胞结构、化学组成、群体形态特征、繁殖方式。了解蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体及古生菌的基本结构特点和生活特性。 （三）微生物细胞的结构和功能——真核微生物 1.教学基本内容： （1）真核微生物的概述； （2）酵母菌的形态、结构和繁殖，酵母菌的群体形态； （3）霉菌的形态、结构和繁殖方式，重点以青霉和曲霉为主，霉菌的群体形态； 2.要求：掌握酵母菌、霉菌的个体形态、结构、群体形态特征、繁殖方式。 （四）病毒 1.教学基本内容： （1）病毒的定义和特点； （2）病毒的形态、种类、结构和化学组成与功能；（重点） （3）病毒的复制和感染；（重点） （4）病毒与宿主的相互作用；（重点与难点） （5）亚病毒因子； （6）病毒与实践：危害人类健康的病毒。 2.要求：了解病毒类群的划分，掌握病毒的形态、结构、化学组成，重点掌握病毒的复制及病毒与宿主的相互作用。 （五）微生物的营养 1.教学基本内容： （1）微生物细胞的化学组成和营养物质及其生理功能； （2）微生物的营养类型（光能营养型微生物和化能营养型微生物）； （3）微生物吸收营养的方式（单纯扩散、促进扩散、主动运送和膜泡运输）； （4）选用和设计培养基的原则和方法、培养基的类型及应用。（重点与难点） 2.要求：掌握微生物所需营养素、微生物营养类型、吸收营养的方式，学会培养微生物的各类型的培养基配制原则及其应用。 （六）微生物的代谢 1.教学基本内容： （1）微生物产能代谢 异养微生物的生物氧化，自养微生物的生物氧化，光能营养微生物的能量转换过程，能量转换方式（2）微生物特有的耗能代谢——二氧化碳的固定，固氮作用，肽聚糖的合成及其它
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
一、解释下列名词 1．伴胞晶体：少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁边形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ内毒素,称为伴胞晶体（59） 2．菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，成为菌落。 3．选择培养基：用来将某种或某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，一直不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。（91） 4．革兰氏阳性菌：在革兰氏染色法里，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。革兰氏阳性菌由于其细胞壁厚度大和肽聚糖网层次多和交联致密，故遇乙醇或丙酮酸脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，在加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能吧结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。（49）革兰氏阳性菌细胞壁特点是厚度大、化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸，从而与层次多、厚度地、成分复杂的革兰氏阴性菌的细胞壁有明显的差别。革兰氏阴性菌因含有LPS外膜，故比革兰氏阳性菌更能抵抗毒物和抗生素对其毒害。（40） 5．LPS:脂多糖，位于革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，由类脂、可信多糖和O-特异侧脸三部分组成。（43） 6．营养缺陷型：某些菌株发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株成为营养缺陷性（85）(218) 7．氨基酸异养型生物：不能合成某些必须的氨基酸，必须从外源提供这些氨基酸才能成长，动物和部分异养微生物为氨基酸异养型生物。如乳酸细菌需要谷氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸和脯氨酸等外源氨基酸才能生长。（baidu) （氨基酸自养型：能以无机氮为唯一氮源，合成氨基酸，进而转化为蛋白质及其他含氮有机物。 8．芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或团圆性、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体（55） 9．鉴别培养基：用于鉴别微生物。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种带些产物，而这种带些产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可讲该种微生物与其他微生物区分开来（91） 10．PHB：聚-B-羟丁酸，直径为0.2~0.7um的小颗粒，是存在于许多细菌细胞质内属于类脂兴致的碳源类贮藏无。不溶于水，可溶于氯仿，可用尼罗蓝或苏丹黑染色。具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。（53） 11．糖被：包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。（60）
《微生物学》学习指南 一、课程的基本情况 本课程总学时：104 学时，其中理论教学：40学时，实验教学40学时，实习周教学1周（24学时），一个学期内完成全部授课内容。 《微生物学》课程是我校微生物技术及应用、生物技术及应用、食品加工技术、饲料与动物营养、食品安全与质量管理等9个专业的必修课程。《微生物学》是建立在学生学完《化学应用技术》、《生物化学》等课程之后开设的课程，是一门实践性较强的专业基础课。是微生物技术及应用专业、生物技术及应用专业和酿酒技术专业的核心主干课程。 本课程的主要内容：微生物形态观察、微生物培养、微生物生长测定、微生物分离纯化及鉴定、微生物检测、微生物育种和微生物的保藏。本课程的主要任务是使学生掌握微生物的形态构造、营养代谢、生长控制、遗传变异等方面的基本理论知识，掌握无菌操作技术、微生物的分离和培养技术、微生物鉴定技术、工业微生物菌种选育及保藏技术等关键技能，学习无菌操作室、微生物菌种室的建设，并掌握微生物技术常用仪器和设备的运行与维护，并培养学生之间的团结协作及沟通能力。学完该课程，为学生今后的学习及工作奠定坚实的基础。二、基本学习方法 《微生物学》课程理论、实践性均强，内容丰富，知识点琐碎，技能训练要求严格，许多学生反映该学科难学。因此，如何教与学好这门学科是很值得探讨的问题。这需要师生共同努力，教与学相辅相承。 1.明确目的是前提 要学好一门课程，首先要充分认识学科的性质及其重要性，才会有学习的动力，由“要我学”变为“我要学”，这样，你才能认真地、刻苦地去钻研它。这就要求你要听好第一堂即“认识微生物和微生物学”的讲解，明确学习的目的，激发学习的兴趣。明确微生物学与人们的生产生活联系非常紧密，与多学科联系紧密，有“桥梁”学科之称。如后续的发酵工艺课中的酶制剂、微生态制剂、酒
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
实验一水中细菌的分离、培养、鉴定及菌落总数的测定 1 培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、NaOH溶液（1mol/L）、pH试纸。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 （2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 【思考题】 1.制作平板培养基的注意事项是什么？ 2.培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？ 3.如何检查灭菌后的培养基是否无菌？ 2 细菌的分离和培养 【目的要求】 1．掌握细菌稀释分离技术。
微生物学实验复习汇总 1.细菌培养基的配制过程？ 答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面（搁置斜面的长度不超过试管总长的1/2） 2.空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌。则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。 3.接种环在用前必须烧灼灭菌，用后也应立即烧灼。 4、培养基的种类及用途： 5、培养基中的营养物质：
答：①、用美蓝液对酵母菌染色后，活细胞为无色，死细胞为蓝色②、平板菌落计数法 8、实验常用的凝固剂是哪一种？固体培养基、半固体培养基及液体培养基加凝固剂琼脂的量为多少？琼脂在什么温度下溶化？什么温度下凝固？ 答：常用凝固剂是琼脂，分别为1—2%，0.5% 96°C下融化，40°C凝固 9.配制培养基时应遵循哪些原则？配制培养基的一般方法和步骤是什么？配制培养基时不可用铜锅或铁锅，原因是什么？答：原则：目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约。铜或铁锅成份会对培养基成份造成干扰。 10、培养基分装时，液体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？固体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？半固体分装高度以试管的多少为宜？ 答：液体：试管高度的1\4,三角瓶的试管高度的1\2,固体：试管高度的1\5，三角瓶的1\2，半固体：试管高度的1\3。高度不适宜易造成搁置斜面时污染棉塞及瓶口。 11.培养基灭菌时外用牛皮纸包扎的目的是什么？ 答：防止灭菌时冷凝水润湿棉塞
12.摆斜面的正确方法是什么？ 答：试管口搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 13.棉塞的作用是什么？正确的棉塞要求是什么？棉塞的长度多少在管口外，多少在管内为宜？作棉塞的棉花要求是什么？能否用脱脂棉？为什么？ 答：作用：阻止外界微生物进入培养基内造成污染和能通气。 14.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如果来不及灭菌应如何处理？ 答：很明显，培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。如果不立即灭菌，那么，就会长菌。 15.采用什么方法能分离到能分解并利用苯作为碳源和能源物质的细菌纯培养？（以苯作为唯一碳源的选择培养基） 答：①从苯含量较高的环境中采集土样或水样；②配制培养基，倒平板，一般仅以苯作为唯一碳源（A），另一种不含任何碳源作为对照（B）；③将样品适当稀释（十倍稀释法），涂布A平板；④将平板置于温度适当的条件下（37℃）培养，观察是否有菌落产生；⑤将A平板上的菌落编号并分别转接至B平板，置于相同温度条件下培养（在B平板上生长的菌落可利用空气中的CO2的自养型微生物）；⑥挑取在A平板上生长而不在B平板上生长的菌落，在一个新的A平板上划线、培养，获得单菌落，初步确定为可利用苯作为碳源和能源的微生物纯培养物；⑦将初步确定的目标菌株转接至以苯作为唯一碳源的液体培养基中进行摇瓶发酵实验，利用相应的化学分析方法定量分析该菌株分解苯的情况。 16.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？ 答：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。 17.在干热灭菌过程中应注意哪些问题,为什么？ 答：1 干热过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。电热干燥箱具有可以观察的窗口，灭菌过程中玻璃温度较高，注意避免烫伤。 2 电热干燥箱内温度未降到70°C以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 3 物品不要摆的太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 18.高压蒸汽灭菌的关键技术是什么？（使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅的压力(100 kPa)、温度(121 ℃)和灭菌时间(20 min)。 19.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 答：①灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀。②否则就会因为锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至烫伤操作者。 20.对含糖（如葡萄糖或乳糖等）培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用大多压力、多长时间灭菌为宜？
微生物学教程期末复习文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
一、名词解释：微生物:微生物是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构，用肉眼看不见或看不清的低等生物的总称。 微生物学:微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动基本规 律，并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等实践 领域的科学，其根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物，控 制、消灭或改造有害微生物，为人类社会的进步服务。 原核生物：即广义的细菌，指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露DNA的原始 细菌：是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。 病毒：是超显微的，无细胞结构，专性活细胞内寄生，在活细胞外具一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。 烈性噬菌体：凡在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、成熟、裂解这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体。 C/N比：所谓C/N是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。 生长因子：一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。
培养基：是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且其间比例合适。 基因：是生物体内一切具有复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。 纯培养：微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。 次生代谢产物：指某些微生物的生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢作前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂化学物。 发酵：无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力不经呼吸链而直接传递给某一中间代谢物的低效产能反应。 抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。 最小抑制浓度:表示抗生素的抗菌活性，单位是g/ml。 抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）； 窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素） 生态学（ecology）：是一门研究生命系统结构，及其与环境系统间相互作用规律的科学。 微生物生态学：是生态学的一个分支，它的研究对象是微生物与其周围生物和非生物环境条件相互作用的规律。