重庆大学
硕士学位论文
番茄DR8基因启动子转化烟草及其定性研究
姓名：王心宇
申请学位级别：硕士
专业：植物学
指导教师：李正国
20090603
番茄VKOR基因的克隆、生物信息学分析及功能初步研究 维生素K环氧化物还原酶（Vitamin K epoxide reductase，VKOR），是一种广泛存在于高等动物内质网上的整合膜蛋白。该基因的同源物在植物中普遍存在，拟南芥VKOR缺失突变体研究表明，该基因对植物的生长具有非常重要的作用，但有关其它高等植物VKOR的研究尚未见报道。 本研究以番茄作为材料，利用RACE技术克隆了番茄VKOR基因，并在GenBank 上注册（JF951971），命名为LeVKOR。我们对其进行了一系列的生物信息学预测，并对其他植物的VKOR的同源物，进行了生物信息学分析。 此外，还利用原核表达和植物转基因的技术对该基因的功能进行了初步研究。具体结果如下：（1）用RACE技术克隆了番茄VKOR基因的全长。 从NCBI上通过BLAST，查到1个注册的番茄VKOR的cDNA序列，设计上下 游引物，扩增该序列，扩增得到的基因片段与数据库公布的序列不完全相符，在3′末端缺失终止密码子。我们利用RACE技术克隆了该基因的3′端，得到基因全长的cDNA序列，通过序列比对发现该基因定位在番茄的2号染色体上，该基因（LeVKOR）由7段外显子组成，其开放阅读框架包括1122bp，共编码373个 氨基酸残基。 LeVKOR共有10个半胱氨酸残基，其8个是保守的半胱氨酸，而保守的半胱氨酸中有四个半胱氨酸以CXXC基序的形式存在。（2）利用在线软件预测LeVKOR 的信号肽及高级结构。 利用多种软件预测了该基因产物的亚细胞定位，该基因定位于叶绿体上，其 N端有一段包括47个氨基酸残基的信号肽。高级结构预测结果显示，LeVKOR基因，是一个融合蛋白，有两个结构域组成，包括一个跨膜结构域和一个可溶性结
生物技术通报 国外动态 BIOTECHNOLOG Y BU LLETIN 2004年第4期利用生物技术拯救珍稀濒危的药用植物轮冠木 Plant Cell Reports2003年21卷5期415~420页报道:轮冠木(Rotula aquatica)是紫草科芳香药用灌木。分布于印度和斯里兰卡等南亚国家、东南亚热带国家和拉丁美洲国家。 轮冠木是印度传统的药用植物。块根含收敛、苦味和利尿物质。可用于治疗咳嗽、心脏病、排尿困难(尿痛)、血液病、发热、中毒、溃疡和子宫疾患。根含固醇(rhabdiol)和尿囊素。根煎剂有利尿和轻泻作用,可用于治疗膀胱结石和性病。菲律宾常将其茎干煎剂用于利尿和发汗。此外,轮冠木的茎干纤维坚韧,可用于制绳。 轮冠木是一种濒临灭绝的植物。目前只有少数野生于多岩石的河岸。为保证药用的需要和保存物种,亟需为轮冠木建立大规模的快速繁殖系统。鉴于轮冠木种子的活力小,萌发率低,种子繁殖有困难,利用茎干切段进行繁殖又极麻烦,故寄希望于利用生物技术进行微型繁殖。 但迄今对此种有价值的药用植物尚无离体繁殖研究。为此,印度卡利卡特大学生物技术系的科学家K. P.Martin,利用轮冠木的腋芽进行了离体繁殖。表明最有效的腋芽繁殖培养基是加入1.0mg1-1N6-苄氨基嘌呤(BAP)和0.5mg1-1吲哚-3-丁酸(IBA)的M S培养基。生根的再生苗经过温室驯化后,成功地移植于大田,有80%的小植株存活。3个月内可从单一的结节外植体获得约750个小植株。 美启动烟草基因组测序计划 AgBiotech Reporter2003年20卷1期10页报道:据悉,美国Philip Morris公司已同意给北卡罗来纳州立大学拨款17.6百万美元,用于绘制烟草基因图谱。 北卡罗来纳州立大学的农业和生命科学学院在得到这笔款项后,将用4年半的时间来完成烟草基因组测序的创新计划。 北卡罗来纳州立大学的科学家说,有了烟草基因图谱,就可以利用基因工程对烟草的叶片进行改造,使其适合于其他用途。 已知烟草含有25000至50000个基因。烟草基因组测序计划的领导人、植物病理学和遗传学教授Charles Opperman宣称: 我们希望能检测出烟草90%以上的基因序列。将有可能确定某些基因,虽然不是全部基因的功能。 印度发现24种新的植物基因 AgBiotech Reporter2003年20卷2期15~16页报道:在 印度生物多样性图谱和数据库 建成之初,印度科学家已利用这一图谱和数据库,在27种印度本地植物中,鉴定出24种新的基因。出于保密的考虑,没有能够公布这些植物物种的名称。目前,科学家已为这些新基因申请了具有巨大经济效益的专利权。 据称,印度科学家已从喜马拉雅山脉的植物中鉴定出抗胁迫和抗冷基因。还已从沙漠地带的植物和沿海的红树中分离出耐胁迫基因。这些基因都具有重大的研究和应用价值。此外,还已分离出一系列的生物活性化合物和酶。目前,正在将其用于生产。 印度的空间部和生物技术部是利用遥感技术绘制出印度 生物群落图 的。这些图谱在宏观水平上显示了有关生境和生物多样性的信息,为印度科学家发现新的植物基因提供了必要的依据。汪开治
组 番茄基因究取得重大突破 2012年5月31日，北京。由来自中国、美国、荷兰、以色列等14个国家的300多位科学家组成的“番茄基因组研究国际协作组”完成了对栽培番茄全基因组的精细序列分析。这项成果于2012年5月31日以封面文章发表在国际权威学术期刊《自然（Nature）》。 番茄是研究果实发育的经典模式植物，其基因组有12条染色体，约9亿个碱基对。协作组坚持采用“克隆连克隆”和“全基因组鸟枪法”相结合的测序策略，历经8年多的艰苦努力，终于获得了高质量的番茄基因组序列。在解码的番茄基因组中共鉴定出约34,727个基因，其中97.4% (33,840个)的基因已经精确定位到染色体上。进化分析表明番茄基因组经历的两次三倍化使基因家族产生了特异控制果实发育及营养品质的新成员。协作组同时绘制了栽培番茄祖先种野生醋栗番茄基因组的框架图，两个基因组仅有0.6％的区别。比较分析发现了番茄果实进化的基因组学基础：经过人工驯化和育种选择，栽培番茄比野生番茄果实更大，品质更好，番茄红素、β-胡萝卜素和维生素C等生物活性物质含量明显提高。同时，基因组序列的获得为在育种中进一步利用野生资源的优异基因提供了有力的工具。 中国科学家在番茄基因组研究中做出了重要贡献。中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友研究员作为中方协调人负责第3号染色体的测序工作。中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄三文研究员和杜永臣研究员作为中方协调人负责第11号染色体的测序工作。中国科学家高质量地完成了番茄基因组测序总任务的1/6。番茄基因组研究取得的成功与多个部委和单位的支持是分不开的。科技部、农业部科教司和国家自然科学基金委等提供了经费支持。番茄基因组研究也是中国科学院遗传与发育生物学研究所和中国农业科学院蔬菜花卉研究所等国内15家单位通力协作完成的，是国内不同科研单位之间协同创新的典型案例之一。 番茄基因组的解读是科学家通过国际合作完成的又一个高质量的模式植物的基因组序列分析，对于不同物种之间的比较基因组学研究具有重要价值。这项工作将极大推动番茄乃至包括马铃薯、辣椒、茄子等在内的茄科植物的功能基因组研究，为培育具有高产、优质、抗病虫害、抗逆等优良性状的番茄新品
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/77466090.html, 烟草重要基因篇：12.烟草叶色相关基因 作者：陈明丽龚达平 来源：《中国烟草科学》2015年第06期 烟草作为一种重要的叶用经济作物，叶色是反映其生长发育、生理状态的标志，尤其是成熟度。烟草中发现许多叶色突变体[1]，其种类主要包括白肋、灰黄、紫色和黄铜色等变异， 其性状可能由一对基因或多对基因共同控制[2-3]。张兴伟等[4]分析认为，叶绿素含量是数量 性状，易受环境影响；第一青果期烤烟叶绿素含量的遗传受一对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因控制。白肋烟的叶绿素含量为正常绿色型的1/3，由两对连锁的隐性核基因控制[5-6]。灰黄型叶色，其叶绿素含量为正常绿色型的1/2，由显性单基因控制。黄绿型叶色由1 对隐性基因控制[7]。紫色叶色突变是由位于B染色体上的显性基因“R”控制的[8]；橘红色叶色的形成受隐性单基因控制，而红铜色叶色由两对隐性重叠基因共同控制[9]。 调控烟草叶色突变的基因分子机制较为复杂，主要分为以下几类途径：叶绿素生物合成及分解途径；蛋白转运和定位相关基因；光呼吸途径；嘧啶从头合成途径。突变基因可直接或间接干扰叶绿素的合成及稳定。 1 四吡咯生物合成途径相关基因 叶绿素和血红素是四吡咯途径的主要终产物，植物中叶绿素合成途径中包含20多个基因编码的16 种酶，目前在烟草中鉴定获得数个基因参与阻断四吡咯生物合成途径。 谷氨酰-tRNA还原酶（GluTR）是其中一个重要的酶，将谷氨酰-tRNA转化成谷氨酸-1-半醛，随后通过谷氨酸-1-半醛氨基转移酶（GSA-AT）形成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），而5-ALA是生物合成叶绿素等四吡咯化合物的前体物和限速点。Lein等[10]（2008）发现转基因烟草内源性谷氨酰-tRNA还原酶hemA基因共抑制作用导致烟草叶绿素缺陷、叶片坏死和生长迟缓等现象。 GSA-AT催化谷氨酸酯转化为δ-氨基酮戊酸酯的最后一步。H?fgen等（1994）[11]和Lein 等[10]（2008）分别利用反义RNA和正义cDNA片段抑制实验表明，GSA-AT是四吡咯途径 中合成δ-氨基酮戊酸盐所必需的，GSA-AT表达抑制会导致植株严重受损，转基因烟草发生色素丢失现象，尤其是叶脉部位色素丢失严重。 四吡咯生物合成途径的第四步是在胆色素原脱氨酶（PBDG）作用下，由4分子的胆色素原合成羟甲基胆素。烟草P_1516转基因株系中的一段cDNA序列与拟南芥pbdg基因同源，将该cDNA序列转入烟草中发现，转基因植株表现色素减少，并伴有生长发育迟缓，证明pbdg 基因在烟草生长中同样是必需的基因[10]。
基因组数据库 文章来源：北大生物信息中心 基因组数据库是分子生物信息数据库的重要组成部分。基因组数据库内容丰富、名目繁多、格式不一，分布在世界各地的信息中心、测序中心、以及和医学、生物学、农业等有关的研究机构和大学。基因组数据库的主体是模式生物基因组数据库，其中最主要的是由世界各国的人类基因组研究中心、测序中心构建的各种人类基因组数据库。小鼠、河豚鱼、拟南芥、水稻、线虫、果蝇、酵母、大肠杆菌等各种模式生物基因组数据库或基因组信息资源都可以在网上找到。随着资源基因组计划的普遍实施，几十种动物、植物基因组数据库也纷纷上网，如英国Roslin研究所的ArkDB包括了猪、牛、绵羊、山羊、马等家畜以及鹿、狗、鸡等基因组数据库，美国、英国、日本等国的基因组中心的斑马鱼、罗非鱼(Tilapia)、青鳉鱼(Medaka)、鲑鱼(Salmon)等鱼类基因组数据库。英国谷物网络组织(CropNet)建有玉米、大麦、高粱、菜豆农作物以及苜蓿(Alfalfa)、牧草(Forage)、玫瑰等基因组数据库。除了模式生物基因组数据库外，基因组信息资源还包括染色体、基因突变、遗传疾病、分类学、比较基因组、基因调控和表达、放射杂交、基因图谱等各种数据库。下面介绍两个重要的基因组数据库。 GDB 由美国Johns Hopkins大学于1990年建立的GDB是重要的人类基因组数据库，现由加拿大儿童医院生物信息中心负责管理。GDB数据库用表格方式给出基因组结构数据，包括基因单位、PCR位点、细胞遗传标记、EST、叠连群(Contig)、重复片段等；并可显示基因组图谱，其中包括细胞遗传图、连锁图、放射杂交图、叠连群图、转录图等；并给出等位基因等基因多态性数据库。此外，GDB数据库还包括了与核酸序列数据库GenBank和EMBL、遗传疾病数据库OMIM、文献摘要数据库MedLine等其它网络信息资源的超文本链接。 GDB数据库是用大型商业软件Sybase数据库管理系统开发的，并用Java语言编写基因图谱显示程序，为用户提供了很好的界面，缺点是传输速度受到一定限制。GDB数据库是国际合作的成果，其宗旨是为从事基因组研究的生物学家和医护人员提供人类基因组信息资源。其数据来自于世界各国基因组研究的成果，经过注册的用户可以直接向GDB数据库中添加和编辑数据。
2．材料与方法 2.1实验材料 植物材料：K326烟草种子 药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等； MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0 预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml 分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml. 生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基 2.3实验方法 2.3.1浸染菌液制备 将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。 挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。 活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。 取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。加入100ml的MS0培养基，混匀。 2.3.2烟草转化 按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养
生物五界：动物、植物、真菌、原生生物和原核生物；生物三界：真细菌、古细菌、真核生物 具有催化活性的RNA分子称为核酶（ribozyme）核酶催化的生化反应有：自我剪接、催化切断其它RNA、合成多肽键、催化核苷酸的合成 新基因的产生：基因与基因组加倍1）整个基因组加倍；2）单条或部分染色体加倍；3）单个或成群基因加倍。DNA水平转移：原核生物中的DNA水平转移可通过接合转移，噬菌体转染，外源DNA的摄取等不同途径发生，水平转移的基因大多为非必须基因。动物中由于种间隔离不易进行种间杂交，但其主要来源于真核细胞与原核细胞的内共生。动物种间基因转移主要集中在逆转录病毒及其转座成分。 外显子洗牌与蛋白质创新：产生全新功能蛋白质的方式有二种：功能域加倍，功能域或外显子洗牌 基因冗余：一条染色体上出现一个基因的很多复份(复本）当人们分离到某一新基因时，为了鉴定其生物学功能，常常使其失活，然后观察它们对表型的影响。许多场合，由于第二个重复的功能基因可取代失活的基因而使突变型表型保持正常。这意味着，基因组中有冗余基因存在。看家基因很少重复，它们之间必需保持剂量平衡，因此重复的拷贝很快被淘汰。与个体发育调控相关的基因表达为转录因子，具有多功能域的结构。这类基因重复拷贝变异可使其获得不同的表达控制模式，促使细胞的分化与多样性的产生，并导致复杂形态的建成，具有许多冗余基因。 非编码序列扩张方式：滑序复制、转座因子 模式生物海胆、果蝇、斑马鱼、线虫、蟾蜍、小鼠、酵母、水稻、拟南芥等。模式生物基因组中G+C%含量高, 同时CpG 岛的比例也高。进化程度越高, G+C 含量和CpG 岛的比例就比较低 如果基因之间不存在重叠顺序，也无基因内基因（gene-within-gene），那么ORF阅读出现差错的可能只会发生在非编码区。细菌基因组中缺少内含子，非编码序列仅占11%, 对阅读框的排查干扰较少。细菌基因组的ORF阅读相对比较简单，错误的机率较少。高等真核生物DNA的ORF阅读比较复杂：基因间存在大量非编码序列（人类占70%）；绝大多数基因内含有非编码的内含子。高等真核生物多数外显子的长度少于100个密码子 内含子和外显子序列上的差异：内含子的碱基代换很少受自然选择的压力，保留了较多突变。由于碱基突变趋势大多为C-T,故A/T的含量内含子高于外显子。由于终止密码子为TAA\TAG\TGA，如果以内含子作为编码序列，3种读码框有很高比例的终止密码子。 基因注释程序编写的依据：1）信号指令，包括起始密码子，终止密码子，终止信号，剪接受体位和供体位，多聚嘧啶序列，分支点保守序列2）内容指令，密码子偏好，内含子和外显子长短 基因功能的检测：基因失活、基因过表达、RNAi干涉 双链DNA的测序可从一端开始，亦可从两端进行，前者称单向测序，后者称双向测序。 要获得大于50 kb的DNA限制性片段必需采用稀有切点限制酶。 酵母人工染色体（YAC）1）着丝粒在细胞分裂时负责染色体均等分配。2）端粒位于染色体端部的特异DNA序列，保持人工染色体的稳定性3）自主复制起始点（ARS）在细胞中启动染色体的复制 合格的STS要满足2个条件：它应是一段序列已知的片段，可据此设计PCR反应来检测不同的DNA片段中是否存在这一顺序；STS必需在染色体上有独一无二的位置。如果某一STS在基因组中多个位点出现，那么由此得出的作图数据将是含混不清的。 遗传图绘制主要依据由孟德尔描述的遗传学原理，第一条定律为等位基因随机分离，第二条定律为非等位基因自由组合，显隐性规律/不完全显性、共显性、连锁 衡量遗传图谱的水平覆盖程度饱和程度 基因类型：transcribed, translatable gene (蛋白基因) ；transcribed but non-translatable gene ( RNA基因)Non- transcribed, non-translatablegene ( promoter, operator ) rRNA基因，tRNA基因, scRNA基因, snRNA基因, snoRNA基因, microRNA基因 基因组(genome)：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质总和。 基因组学（genomic）：用于概括涉及基因作图、测序和整个基因功能分析的遗传学分支。 染色体组（chromosome set）：不同真核生物核基因组均由一定数目的染色体组成，单倍体细胞所含有的全套染色体。 比较基因组学（comparative genomics）：比较基因组学是基因组学与生物信息学的一个重要分支。通过模式生物基因组与人类基因组之间的比较与鉴别，为分离重要的候选基因，预测新的基因功能，研究生物进化提供依据。（目标）
园艺学报 2014，41（10）：2012–2020 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@https://www.doczj.com/doc/77466090.html, 番茄抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1的SNP 标记检测 苏晓梅*，高建昌*，王孝宣，国艳梅，杜永臣，胡鸿** （中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 10081） 摘 要：针对番茄4个抗病基因Tm-2、Pto、Sw-5和Ve1，根据其序列的碱基差异设计引物，经过引物特异性检测和PCR产物克隆测序比对之后，采用高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM） 技术进行多态性检测，共开发了5个SNP标记。经过验证，所开发的标记均能将抗病基因型不同的番茄 材料分型，并且分型结果与已知材料的抗病性状完全一致。这些标记可以作为功能标记在番茄抗病育种 中应用。 关键词：番茄；抗病基因；功能标记；HRM 中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2012-09 Detection of SNP Markers of the Important Disease Resistance Genes in Tomato SU Xiao-mei*，GAO Jian-chang*，WANG Xiao-xuan，GUO Yan-mei，DU Yong-chen，and HU Hong**（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China） Abstract：According to the gene sequence differences，primers were designed for 4 disease resistance genes in tomato，Tm-2，Pto，Sw-5 and Ve1. After checking of primer specificity and aligning of the clone sequences of the PCR products，the HRM（High resolution melting）technology was used for polymorphism detection. In this study，5 SNPs were developed，all of which could distinguish the materials with different genotypes. What’s more，the genotype was completely consistent with the known gene. So they can be used as functional markers in tomato disease resistance breeding. Key words：tomato；disease resistance gene；functional marker；HRM 分子标记辅助选择技术已成为番茄抗病育种的常规手段，但连锁分子标记选择的准确性取决于标记与抗病基因的连锁程度，即便是紧密连锁的分子标记，也会由于在分离后代中出现标记与抗病基因的交换而导致假阳性，降低选择效率。抗病基因的功能标记（基因内部标记）是其特异性标记，其选择准确率为100%（Arens et al.，2010），能够克服连锁标记的缺点。 收稿日期：2014–05–20；修回日期：2014–07–24 基金项目：国家‘863’计划项目（2012AA100103）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25-A-09）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 同等贡献作者 ** 通信作者Author for correspondence（E-mail：huhong@https://www.doczj.com/doc/77466090.html,）
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。 3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：
植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以霸占杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。但是，以往的工作重点多在容易做的模式植物上，从而使烟草、马铃薯、番茄、矮牵牛、拟南芥菜等植物的分子生物学和转基因技术发展很快。近年内以实用为目标的研究数目大大增加，在国外，主要的种子公司和一些小公司竞相开发重组 D NA技术，用于重要作物的商业应用，将研究机构和大学首创的原理和科技用于开发，导致植物基因工程向重要粮食和豆科作物遗传改良的实用化目标迈进。在1988年以前，重要谷类作物和豆科作物的转化十分困难，只是在一种生物技术的新工具——“基因枪”研制成功以后，才使得这些作物的转基因不但成为可能，而且常常可以做到不依赖于品种或基因型。基因枪是用火药爆炸、电容放电或高压气体作为加速的动力，发射直径仅1微米左右的金属颗粒。微粒表面用优选的基因包覆，高速射入植物细胞，并在细胞内表达产生有活性的基因产物，从而达到改良品种的目的。最初大豆基因工程的重点放在原生质体和胚性悬浮细胞的再生上，但进展很慢，获得转基因大豆是一个很大的难题。基因枪的出现，使大豆转基因成为现实，实际上目前大豆已成为许多难转化作物的模式作物。在1988至1990年仅两年时，建立了可实用的大豆转化体系，这是目前唯一的不依赖于基因型的大豆转化方法。抗除草剂 B astar和Roundup的基因也已转入大豆，并在过去三年中连续进行了田间试验，预期不久将可商业化，这将是豆科作物基因工程商业化应用的一个里程碑。大豆基因工程今后的目标可包括蛋白质和油脂成分的修饰、抗虫、抗病毒及其他病害抗性等。水稻为世界第二大谷类作物，但在我国则为最大的粮食作物，年产18992万吨（中国农业年鉴1993）。我国和印度的水稻产量占世界总产量的60％，全球几乎一半人口以稻米为主要热量的来源。水稻和爪洼稻、籼稻占栽培水稻的80％，供世界20多亿人食用。水稻得到转基因植始于1988年，最初均以原生质体为受体，采用 D NA直接转移法，再生出了可育的转基因植株。但是，原生质体再生体系的限制很大，粳稻上只有少数品种如台北309等，可由原生质体再生植株，大多数优良的粳稻品种和绝大多数籼稻品种都难以由原生质体再生。可由原生质体再生植株的籼稻品种迄今尚未获得转基因植株。由于水稻未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，几乎所有水稻栽培品种均能由未成熟幼胚再生。因此，一些科学家认为，原生质体转化在水稻上应用前景有限，最好是用基因枪转化水稻幼胚。最近
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
药物基因组学数据库 1、Drugbank 2、dgidb 3、pharmGKB 4、cancercommon 5、ChEMBL 6、mycancergenome 7、TTD 8、guidetopharmcology 9、clearityfoundation 10、CIViC https://https://www.doczj.com/doc/77466090.html,/#/home 11、DoCM https://www.doczj.com/doc/77466090.html,/ 1 Drugbank 药物和药物靶标资源库。DrugBank是一个独特的生物信息学/化学信息学资源，它结合了详细的药物（例如化学制品）数据和综合的药物靶点（即：蛋白质）信息。该数据库包含了超过4100个药物条目，包括超过800个FDA认可的小分子和生物技术药物，以及超过3200个试验性药物。此外，超过1.4万条蛋白质或药物靶序列被链接到这些药物条目。每个DrugCard条目包含超过80个数据域，其中一半信息致力于药物/化学制品数据，另一半致力于药物靶点和蛋白质数据。许多数据域超链接到其他数据库（KEGG、PubChem、ChEBI、Swiss-Prot和GenBank）和各种结构查看小应用程序。该数据库是完全可搜索的，支持大量的文本、序列、化学结构和关系查询搜索。DrugBank的潜在应用包括模拟药物靶点发现、药物设计、药物对接或筛选、药物代谢预测、药物
相互作用预测和普通药学教育。DrugBank可以在http://www.drugbank.ca 使用。广泛应用于计算机辅助的药物靶标的发现、药物设计、药物分子对接或筛选、药物活性和作用预测等。 在查询中，每一种药物对应1个DrugCard，即我们所得到的检索结果。每一个DrugCard都包含的数据信息分为药物、靶标和酶三部分。 药物信息包括了该药物的CAS号、商品名、分子式、分子量、SMILES、2D 和3D结构、logP、logS、pKa、熔点、吸收性、Caco-2细胞穿透性、药物类别和临床使用、性质描述、剂型与给药途径、半衰期、体内的生物转化、毒性、作用于哪些生物体、食物对服用的影响、与其它药物的相互作用、作用机理、代谢途径、药理学特征、与蛋白质的结合情况、溶解度、物质形态、同义词、关于合成的相关文献等，还与ChEBI、GenBank、PubChem等外部数据库有链接。 靶标的信息包括ID、名称、靶标基因的名称、蛋白质序列、残基数目、分子量、等电点、功能和活性、参与的代谢途径和反应、体内分布、靶标信号、跨膜区域、靶标基因序列及其在GenBank、HGNC等外部数据库中的ID和链接、参考文献，以及在GenBank和Swiss-Prot中的链接。 酶的信息包括名称、蛋白质序列、基因名称、在Swiss-Prot 等数据库中的链接。 在DrugBank的主界面上，在Browse菜单下可以浏览数据库的内容，其中PharmaBrowse为用户提供了分类浏览的功能。这为药剂师、医生以及寻找潜在药物的研究人员提供了方便。在Search下拉菜单下，就是Drug Bank的4类检索方式。ChemQuery允许用户通过绘制结构图或书写SMILES、分子式进行结构搜索。在检索过程中还可以对搜索药物类型、分子量范围、搜索结果相似度、结果数量最大值等进行设置。TextQuery则为文本检索功能。文本检索支持逻辑运算符连接及在特定领域内搜索。例如，在“dextromethorphan”中检索混合物，可以键入“mixtures：dextromethorphan”，即用分号在后面输入领域，同时可以加入逻辑运算符，例如，在“dextrome thorphan”和“doxylamine”2个领域进行检索，可以键入“mixtures:dextromethorphan AND mixtures:doxylamine”。SeqSearch为用户提供了通过序列检索蛋白质的功能。Data Extractor是1
烟草转基因操作细则 烟草无菌苗准备: 将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。 转基因步骤： 1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）； 2 离心收集菌液； 3 用25 mL激活培养基(液)悬浮； 4 在28o C摇3- 5 h； 5 转入到培养皿； 6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）； 7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方； 8 在激活培养基中浸泡10 min 左右； 9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液； 10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）； 11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养； 12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。 培养基配方 激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)； 共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8); 筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L； 潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**； 生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。 注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。