蛋白翻译后修饰（齐以涛老师）
上课老师没说重点
1.蛋白的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合
物。
2.蛋白后修饰概念和意义（PPT4-5）
3.蛋白后修饰种类
1. 切除加工
2. 糖基化
3. 羟基化
4. 甲基化
5. 磷酸化
6. 乙酰化
7. 泛素化
8. 类泛素化
9. …
200. …
磷酸化修饰
1.概念：
磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋
白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆
的蛋白磷酸化所调控的，至少有30%的蛋白被磷酸化修饰
2.作用位点：
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸，大多数
磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是
可变的。
3.实例(MAPK途径)：
分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MAPKK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶（MAPKKK）。
在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统（MAPK cascade），通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。
具体过程如下：
?MAPKKK位于级联系统的最上游，能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?MAPKKK磷酸化后变为活化状态，可以使MAPKK磷酸化?MAPKK始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活
?MAPK被磷酸化后有3种可能的去向：
（1）停留在细胞质中，激活一系列其它的蛋白激酶
（2）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化
（3）进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达
4.功能和意义:
一：调节酶蛋白及生理代谢
①糖分解代谢中糖原磷酸化酶活性的调节，被磷酸化的酶具有活
性，去磷酸化的酶无活性
②磷酸化或去磷酸化使胞内已存在酶的活性被激活或失活，调节
胞内活性酶的含量
二:调节转录因子活性
转录因子通常包含DNA结合结构域和转录激活结构域.转录因子在转录激活结构域或调控结构域发生磷酸化，直接影响其转录活性. c-Jun转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化，正调控c-Jun的转录活性.
三：调节转录因子核转位
?TGF-b与其I型、II型受体结合，结合后的TGF-b I型受体识别R-Smad包括Smad2和Smad3，作用于C末端的丝氨酸使其磷酸化而被激活，激活后的R-Smad与Smad4结合转入细胞核内，发挥转录调节活性
?NF-kB与其抑制因子IkB形成复合体时存在于胞质。当IkB磷酸化、
泛素化后，与NF-kB解离后，NF-kB失去其抑制，得以转入核内，间接调节基因转录活性。
四：调节转录因子与DNA结合活性
?ATF/CREB家族成员ATF-1（activating transcription factor 1）和CREB （cAMP response element binging protein）都可以与DNA序列TGACG 结合。ATF-1在Ser残基上磷酸化可以增强其与DNA位点的结合，从而增强转录因子DNA结合活性
?紫外线照射激活p53的DNA结合活性，主要通过p38蛋白激酶磷酸化p53的Ser残基
?c-Jun DNA结合结构域附件的3个氨基酸磷酸化，就不能与DNA 结合。
5.功能和意义总结：
?蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的一种调节方式，几乎涉及所有生理及病理过程
?尤其对细胞因子、生长因子的信号转导及细胞生长、分化和凋亡有重要作用
?包括细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩、细胞增殖、发育和分化，细胞骨架调控和细胞凋亡等。
乙酰化修饰
1.概念：
在乙酰化酶催化下将乙酰基团转移到底物蛋白质赖氨酸残基上的
过程。其逆反应由蛋白质脱乙酰酶催化，称为蛋白质的脱乙酰化。首次发现组蛋白被乙酰化修饰。
2.意义和功能；
一：刺激DNA转录
?组蛋白N端包裹于DNA外使DNA无法暴露，乙酰化后组蛋白与DNA结合减弱，DNA得以暴露，从而刺激DNA的转录
二：调节转录因子与DNA结合活性
?1.刺激转录因子与DNA结合:p53, E2F1, GATA1和EKLF(erythroid kruppel like factor)的乙酰化位点靠近其DNA结合结构域
?2.阻止转录因子与DNA结合: HMG1(high mobility group 1)乙酰化的赖氨酸残基位于DNA结合结构域内。
三：调节蛋白质间相互作用
?1.TCF(T-cell specific transcription factor)与其共刺激因子armadillo 的结合可被TCF的乙酰化干扰
? 2. 核受体的乙酰化影响其与共刺激因子ACTR(activator of the thyroid and retinoicacid receptor)的结合。
四：影响蛋白质稳定性
?E2F1乙酰化延长其半衰期
?a-微管蛋白乙酰化影响微管稳定性
五．组蛋白乙酰化
?组蛋白低乙酰化，由于组蛋白N末端富含正电荷的氨基酸，与带
负电的DNA靠静电招募结合紧密，因此转录因子很难与DNA的
启动区域结合，基因表达被抑制
?组蛋白乙酰化时，乙酰化中和了组蛋白赖氨酸和精氨酸残基的正电荷，降低了与DNA相互作用的能力，转录因子可以很容易的与DNA 的启动子区域结合，介导基因表达。
六．乙酰化与疾病
?组蛋白乙酰化酶p300/CBP(CREB binding protein)广泛参与涉及白血病的染色体移位，导致多种包含HAT（Histone acetyltransferase）活性的融合蛋白产生，与白血病的发生发展密切相关
?组蛋白去乙酰基酶亦通过多种机制参与癌症进程
?多聚谷氨酰胺疾病是一种神经退行性遗传病，是由致病基因CAG 重复片段的扩大引起的。在扩大的多谷氨酰胺诱导的疾病中，蛋白的乙酰化和去乙酰化的失衡是一个关键的过程。
泛素化修饰
1.概念：
泛素化是一种高度保守的翻译后水平的蛋白质修饰过程，可以将泛素共价结合到目的底物蛋白质的赖氨酸残基上。也是一种可逆性的过程，可由去泛素化酶将泛素从蛋白质上除去。
?泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞内，故名泛素
?共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解，这是细胞内短寿
命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径
?与消化道内进行的蛋白质水解不同，从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段，整个水解过程需要能量参与
?20世纪70年代中期，首次从牛胸腺中分理出泛素
?1977年，H.Busch首次发现泛素可以共价结合在H2A上，形成H2A单泛素化
2.泛素化（泛素化介导的蛋白质降解途径）过程：(图示如下)
?泛素-蛋白酶系统存在于所有真核生物细胞的调控系统，需要三种酶的参与：激活酶E1、结合酶E2和连接酶E3
?在ATP酶作用下，E1在其半胱氨酸（Cys）和泛素羧基端的甘氨酸（Gly）之间形成巯酯键（thiol ester bond），即E1-SH-Ub，激活泛素
?在E2酶作用下，泛素从E1转移到E2，同样以巯酯键的方式结合（E2-SH-Ub）
?E3可特异性识别底物蛋白质，并与之结合。与此同时，E2将激活的泛素直接转移到E3结合的底物上，经过多次重复，多个泛素之间通过K48相互连接，在底物上形成多泛素链（polyubiquitin chain）。?26S蛋白酶体可以特异性识别多泛素化的蛋白质，并将之完全水解为小多肽片段
?去泛素酶可以重新回收泛素
3.功能和意义:
一．介导蛋白质降解
?调节细胞周期：Cdc34是E2酶，cyclinA, cyclinB,cyclinE, p21和p27可被泛素化修饰降解
?与DNA修复、肿瘤和凋亡有关：p53降解受泛素介导的蛋白酶解调节，mdm2是其E3酶。
?与免疫炎症反应有关：
①NF-kB与其抑制蛋白IkB结合，无活性状态存在于胞浆内。感染或收到某种信号，IkB被泛素化降解，NF-kB进入核内激活靶基因
③泛素为MHC-I类分子提供多肽，提呈给T淋巴细胞抗病毒感染?调节基因转录水平：（PPT 33-35）
①影响转录因子在细胞内定位：
②控制转录共刺激因子活性：
③3. 调整转录因子蛋白水平：
二．泛素化的非蛋白酶解功能
?K63泛素化的蛋白质与细胞表面受体的胞吞、DNA损伤后修复、核糖体功能、应激反应及蛋白激酶的激活有关
?组蛋白H2A的单泛素化与基因转录激活有关，并不导致其降4.功能和意义总结：
?Cells are continually building proteins, using them for a
single task, and then discarding them
?Signaling or controlling proteins (eg. transcription regulators and the cyclins) - lead very brief lives, carrying their messages and then being thrown away
?Specialized enzymes - built just when they are needed,allowing cells to keep up with their minute-by-minute synthetic needs
?The approach may seem wasteful, but it allows each cell to respond quickly to constantly changing requirements.
SUMOylation（SUMO化修饰）
1.概念：
SUMO（小泛素样修饰）：
是泛素和泛素样的家族成员。SUMO的氨基酸序列和空间结构高度相似，与泛酸具有相同的功能。共有四个成员，分别为SUMO1-4。
2.SUMO化修饰（PPT44）和去SUMO化修饰（PPT 47）过程：
3.SUMO连接酶E3的种类和底物(PPT 45)
4.SENP(SUMO特异性蛋白酶)特征和种类PPT 46
SENP是去SUMO化酶
5.SUMO修饰的蛋白（底物）:PPT 50
6.SUMO 和Ubiquitin异同（PPT 51）：
这两种蛋白质具有非常相似的二级和三级结构。
泛素和SUMO1的比对表明只有18％的氨基酸序列是相同的。
与泛素系统不同，SUMO系统主要针对底物蛋白的蛋白酶，SUMO1缀合有不同的细胞功能。
7.SUMO化的功能（PPT 56 表格）PPT 52-58
8.SENP2的作用
一．SENP2在肌肉的发生中的作用
?SENP2去SUMO化修饰MEF2A，在骨骼肌中促进肌肉生成抑制素的表达并且抑制肌细胞的生成。
?SENP2在调节肌肉生成抑制素以诱导肌细胞生成中发挥关键作用?SENP2是骨骼肌再生的潜在的治疗靶标。
二．SENP2对于神经元的功能至关重要
多种蛋白修饰
?各种翻译后修饰的过程不是孤立存在的，在很多细胞活动中，需要各种翻译后修饰的蛋白共同作用
?同一个蛋白可以拥有一种以上的后修饰过程
?各种翻译后修饰形式相互影响和协调
翻译后修饰的蛋白质组学
?由于蛋白质翻译后修饰并不是直接由基因决定的，研究蛋白质翻译后修饰对蛋白组学的研究具有更重要的意义，因此诞生了翻译后修饰的蛋白质组学
?蛋白质翻译后修饰在体内是一个动态的变化过程，有效探明细胞和组织内蛋白质修饰谱的“翻译后修饰蛋白质组学”成为当今功能蛋白质组学研究的重要内容
?翻译后修饰的蛋白质组学研究，不仅有助于理解翻译后修饰在生命过程中的重要意义，还对未来的药物开发提供了极大的保证。
蛋白质翻译后修饰
?蛋白质的翻译后修饰是蛋白质行使正常生理功能所必需的，蛋白质翻译后修饰过程使蛋白质结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一
?理解调控翻译后修饰过程因素，有利于在分子水平上揭示细胞过程和蛋白质网络的功能，最终可以指导针对分子的更准确的药物控制
蛋白翻译后修饰(齐以涛老师) 上课老师没说重点 1.蛋白的概念:由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合 物。 2.蛋白后修饰概念和意义（ＰＰT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1．切除加工 2. 糖基化 3.羟基化 4.甲基化 5．磷酸化?６．乙酰化?7．泛素化 200. … ８.类泛素化?９.…? 磷酸化修饰 １.概念: 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆 的蛋白磷酸化所调控的,至少有3０%的蛋白被磷酸化修饰 2.作用位点： 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸,大多数 磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是 可变的。
３.实例(MＡＰK途径): 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MＡＰＫK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶(MAＰKＫK)。在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPＫ级联系统(MAＰK casｃade），通过ＭAPＫＫK-MAPＫK－ＭAＰＫ逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。 具体过程如下： ?MＡPKKＫ位于级联系统的最上游,能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?ＭAPKKK磷酸化后变为活化状态,可以使MAＰKK磷酸化 ?ＭAPKＫ始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将ＭAＰK激活 ?MAＰK被磷酸化后有3种可能的去向: (1）停留在细胞质中,激活一系列其它的蛋白激酶 (2)在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 (3)进入细胞核,通过磷酸化转录因子，调控基因的表达
组蛋白翻译后修饰的类型 组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。 染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。 染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白 H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。 ⒈甲基化 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常见位点。研究表明·，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记。例如，H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。此外，H4—K20的甲基化与基因沉默相关，H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。 ⒉乙酰化 组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。组蛋白乙酰化呈多样性，核小体上有多个位点可提供乙酰化位点，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的、位置特异的方式进行。乙酰化可能通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，来调节基因转录。早期对染色质及其特征性组分进行归类划分时就有人总结指出：异染色质结构域组蛋白呈低乙酰化，常染色质结构域组蛋白呈高乙酰化。最近有研究发现，某些HAT复合物含有一些常见的转录因子，某些HDAC复合物含有已被证实的阻遏蛋白。这些发现支持了高乙酰化与激活基因表达、低乙酰化与抑制基因表达有关的看法。 3.磷酸化 组蛋白H3在有丝分裂过程中，两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生了磷酸化作用。Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘，Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现，两个位点的磷酸化在中期到达高峰，并扩展到染色体的所有部分。当细胞有丝分裂进入后期和末期，组蛋白H3Ser28的磷酸化逐渐消退，而组蛋白H3Ser10磷酸化的荧光信号也逐渐从染色体上消失，此时在纺锤体中央部位出现Ser10磷酸化H3.研究结果表明，组蛋白H3Ser10和Ser28的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Ser10和Ser28这两个位点发生磷酸化作用，可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低，改变了组蛋白一DNA间的相互作用，这可能是导致染色质变构凝集的原因之一。根据激光共聚
蛋白翻译后修饰（齐以涛老师） 上课老师没说重点 1.蛋白的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合 物。 2.蛋白后修饰概念和意义（PPT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1. 切除加工 2. 糖基化 3. 羟基化 4. 甲基化 5. 磷酸化 6. 乙酰化 7. 泛素化 8. 类泛素化 9. … 200. … 磷酸化修饰 1.概念： 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆 的蛋白磷酸化所调控的，至少有30%的蛋白被磷酸化修饰
2.作用位点： 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸，大多数 磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是 可变的。 3.实例(MAPK途径)： 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MAPKK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶（MAPKKK）。 在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统（MAPK cascade），通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。 具体过程如下： ?MAPKKK位于级联系统的最上游，能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?MAPKKK磷酸化后变为活化状态，可以使MAPKK磷酸化?MAPKK始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活
?MAPK被磷酸化后有3种可能的去向： （1）停留在细胞质中，激活一系列其它的蛋白激酶 （2）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 （3）进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达 4.功能和意义: 一：调节酶蛋白及生理代谢 ①糖分解代谢中糖原磷酸化酶活性的调节，被磷酸化的酶具有活 性，去磷酸化的酶无活性 ②磷酸化或去磷酸化使胞内已存在酶的活性被激活或失活，调节 胞内活性酶的含量 二:调节转录因子活性 转录因子通常包含DNA结合结构域和转录激活结构域.转录因子在转录激活结构域或调控结构域发生磷酸化，直接影响其转录活性. c-Jun转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化，正调控c-Jun的转录活性. 三：调节转录因子核转位 ?TGF-b与其I型、II型受体结合，结合后的TGF-b I型受体识别R-Smad包括Smad2和Smad3，作用于C末端的丝氨酸使其磷酸化而被激活，激活后的R-Smad与Smad4结合转入细胞核内，发挥转录调节活性 ?NF-kB与其抑制因子IkB形成复合体时存在于胞质。当IkB磷酸化、
PTMScan? Proteomics Kit Protocol UNPARALLELED PRODUCT QUALITY,VALIDATION,AND TECHNICAL SUPPORT Pharma Services Department ■ptmscan@https://www.doczj.com/doc/77298482.html, Web ■ https://www.doczj.com/doc/77298482.html,/proteomics
S i g n a l i n g T e c h n o l o g y , I n c . o l o g y ? a n d P T M S c a n ? a r e t r a d e m a r k s o f C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y , I n c . R e v . 08/14/14 v e r s i o n 3 PTMScan ? Kit Protocol Cell Lysis and Protein Digestion A. Solutions and Reagents NOTE: Prepare solutions with RODI or equivalent grade water. 1.Urea Lysis Buffer: 20 mM HEPES pH 8.0, 9 M urea, 1 mM sodium orthovanadate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate. NOTE: The Urea Lysis Buffer should be prepared prior to each experiment. Aliquots of the Urea Lysis Buffer can be stored in the -80°C freezer for up to 6 months. NOTE: Dissolving urea is an endothermic reaction. Urea Lysis Buffer preparation can be facilitated by placing a stir bar in the beaker and by using a warm (not hot) water bath on a stir plate. 9 M urea is used so that upon lysis, the ?nal concentration is approximately 8 M. The urea lysis buffer should be used at room temperature. Placing the urea lysis buffer on ice will cause the urea to precipitate out of solution. 2.DTT solution, 1.25 M (see stock solutions for preparation) 3.Iodoacetamide solution: Dissolve 95 mg of iodoacetamide (formula weight = 18 4.96 mg/mmol) in water to a ?nal volume of 5 ml. After weighing the powder, store in the dark and add water only immedi-ately before use. The iodoacetamide solution should be prepared fresh prior to each experiment. B. Preparation of Cell Lysate, Suspension Cells 1.Grow approximately 1-2 x 108 cells for each experimental condition (enough cells to produce approxi- mately 10-20 mg of soluble protein). NOTE: Cells should be washed with 1X PBS before lysis to remove any media containing protein contaminants. Elevated levels of media-related proteins will interfere with the total protein determination. 2.Harvest cells by centrifugation at 130 rcf (g), for 5 min at room temperature. Carefully remove supernatant, wash cells with 20 ml of cold PBS, centrifuge and remove PBS wash and add add 10 ml Urea Lysis Buffer (room temperature) to the cell pellet. Pipet the slurry up and down a few times (do not cool lysate on ice as this may cause precipitation of the urea). NOTE: If desired, the PTMScan ? protocol may be interrupted at this stage. The harvested cells can be frozen and stored at -80°C for several weeks. https://www.doczj.com/doc/77298482.html,ing a microtip, sonicate at 15 W output with 3 bursts of 15 sec each. Cool on ice for 1 min C. Peparation of Cell Lysate, Adherent Cells 1.Grow 1-2 x 108 cells for each experimental condition (enough cells to produce approximately 10-20 mg of soluble protein). The cell number corresponds to approximately TEN 150 mm culture dishes (depending on the cell type), grown to between 70-80% con?uence. NOTE: Cells should be washed with 1X PBS before lysis to remove any media containing protein contaminants. Elevated levels of media-related proteins will interfere with the total protein determination. 2.Take all 150 mm culture dishes for one sample, remove media from the ?rst dish by decanting, and let stand in a tilted position for 30 seconds so the remaining medium ?ows to the bottom edge. Remove the remainder of the medium at the bottom edge with a P-1000 micropipettor. Wash each dish with 5 ml of cold PBS. Remove PBS as described above. 3.Add 10 ml of Urea Lysis Buffer (at room temperature) to the ?rst dish, scrape the cells into the buffer, let the dish stand in tilted position after scraping the buffer to the bottom edge of the tilted dish. Remove the medium from the second dish as above. Transfer the lysis buffer from the ?rst dish to the second dish using a 10 ml pipette, then tilt the ?rst dish with the lid on for 30 sec and remove remaining buffer from the dish and collect. Scrape cells from the second dish and repeat the process until the cells from all the dishes have been scraped into the lysis buffer. Collect all lysate in a 50 ml conical tube. NOTE: DO NOT place Urea Lysis Buffer or culture dishes on ice during harvesting. Harvest cells using Urea Lysis Buffer at room temperature. During lysis, the buffer becomes viscous due to DNA released from the cells. 4.The yield will be approximately 9-12 ml lysate after harvesting all the culture plates. NOTE: If desired, the PTMScan ? protocol may be interrupted at this stage. The cell lysate can be frozen and stored at -80°C for several weeks. https://www.doczj.com/doc/77298482.html,ing a microtip, sonicate at 15 W output with 3 bursts of 15 sec each. Cool on ice for 1 min between each burst. Clear the lysate by centrifugation at 20,000 rcf (g) for 15 min at 15oC or room temperature and transfer the protein extract (supernatant) into a new tube. NOTE: Lysate sonication fragments DNA and reduces sample viscosity. Ensure that the sonicator tip is submerged in the lysate. If the sonicator tip is not submerged properly, it may induce foaming and degradation of your sample (refer to the manufacturer’s instruction manual for the sonication apparatus). D. Reduction and Alkylation of Proteins 1.Add 1/278 volume of 1.25 M DTT to the cleared cell supernatant (e.g. 36 μl of 1.25 M DTT for 10 ml of protein extract), mix well and place the tube into a 55oC incubator for 30 min.2.Cool the solution on ice brie?y until it has reached room temperature (tube should feel neither warm nor ice-cold by hand). 3.Add 1/10 volume of iodoacetamide solution to the cleared cell supernatant, mix well, and incubate for 15 min at room temperature in the dark. E. Protease Digestion Protease Digestion Reference Table: ?Recommended Motif [pSQ] Kit 12235PTMScan ? Mono-Methyl Arginine [mme-RG] Kit Trypsin*5565 PTMScan ? Phospho-PKA Substrate Motif (RRXS*/T*) LysC* ?Recommended * For LysC-digested material, there is a second digestion performed after the StageTip puri?cation of enriched peptides (see the protocol after StageTip Puri?cation). A secondary trypsin digest is also recommended for enriched methylated tryptic peptides. Please visit https://www.doczj.com/doc/77298482.html,/services/ptmscan_kits.html for an updated version of the table. NOTE: Alternative proteases such as GluC, chymotrypsin, and others can be used in addition to the protease treatments outlined above to expand the coverage of modi?ed peptides from each Motif Antibody. When considering the use of additional protease treatments it should be compatible with the respective Motif Antibody by not cleaving residues within the designated sequence motif. Protease treatments that generate larger proteolytic peptides may not be ideal if the resulting peptides do not ionize well in the mass spectrometer. 1.Dilute 3-fold with 20 mM HEPES pH 8.0 to a ?nal concentration of 2 M urea, 20 mM HEPES, pH 8.0. For example, for 10 ml of lysate add 30 ml 20 mM HEPES pH 8.0. F. Trypsin Digestion 1.Add 1/100 volume of 1 mg/ml trypsin-TPCK (Worthington) stock in 1 mM HCl and digest overnight at room temperature with mixing. 2.Analyze the lysate before and after digest by SDS-PAGE to check for complete digestion. 3.Continue through the Sep-Pak, IAP , and StageTip protocols prior to LC-MS analysis of enriched peptides. G. LysC Digestion A. Solutions and Reagents Reagents Not Included: 1.HEPES (Sigma, H-4034) 2.Sodium pyrophosphate (Sigma, S-6422) 3.β-glycerophosphate (Sigma, G-9891) 4.Urea, Sequanal Grade (Thermo Scienti?c, 29700) 5.Sodium orthovanadate (Sigma, S-6508) 6.Iodoacetamide (Sigma, I-6125) 7.Dithiothreitol (American Bioanalytical, AB-00490)8.Trypsin-TPCK (Worthington, LS-003744) 9.Trypsin (Promega, V5113) 10.Lysyl Endopeptidase, LysC (Wako, 129-02541)11.Tri?uoroacetic acid, Sequanal Grade (Thermo Scienti?c, 28903)12.Acetonitrile (Thermo Scienti?c, 51101)13.Sep-Pak ? Classic C18 columns, 0.7 ml (Waters, WAT051910)14.Burdick and Jackson Water (Honeywell, AH365-4) NOTE: Prepare solutions for cell lysis, Sep-Pak puri?cation, and IAP enrichment with RODI or equivalent grade water. Prepare solutions for subsequent steps with HPLC grade water (Burdick and Jackson water). Stock Solutions: 1.200 mM HEPES/NaOH, pH 8.0: Dissolve 23.8 g HEPES in approximately 450 ml water, adjust pH with 5 M NaOH to 8.0, and bring to a ?nal volume of 500 ml. Filter through a 0.22 μM ?lter (as used for cell culture), use for up to 6 months.2.Sodium pyrophosphate: Make 50X stock (125 mM, MW = 446): 1.1 g/20 ml. Store at 4°C, use for up to one month. 3.β-glycerophosphate: Make 1000X stock (1 M, MW = 216): 2.2 g/10 ml. Divide into 100 μl aliquots and store at -20oC. 4.Sodium orthovanadate (Na 3VO 4): Make 100X stock (100 mM, MW = 184): 1.84 g/100 ml. Sodium orthovanadate must be depolymerized (activated) according to the following protocol: a. F or a 100 ml solution, ?ll up with water to approximately 90 ml. Adjust the pH to 10.0 using 1 M NaOH with stirring. At this pH, the solution will be yellow. b. B oil the solution until it turns colorless and cool to room temperature (put on ice for cooling). c. R eadjust the pH to 10.0 and repeat step 2 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0 (usually it takes two rounds). Adjust the ?nal volume with water. d. S tore the activated sodium orthovanadate in 1 ml aliquots at -20°C. Thaw one aliquot for each experiment; do not refreeze thawed vial. 5.Dithiothreitol (DTT): Make 1.25 M stock (MW = 154): 19.25 g/100 ml. Divide into 200 μl aliquots, store at -20oC for up to one year. Thaw one aliquot for each experiment. 6.Trypsin-TPCK: Store dry powder for up to 2 years at -80oC. Para?lm cap of trypsin container (Worthington) to avoid collecting moisture, which can lead to degradation of the reagent. Prepare 1 mg/ml stock in 1 mM HCl. Divide into 1 ml aliquots, store at -80oC for up to one year. 7.Lysyl Endopeptidase (LysC): Store dry powder up to 2 years at -80oC. Para?lm cap of LysC con- tainer to avoid collecting moisture, which can lead to degradation of the reagent. Prepare 5 mg/ml stock in 20 mM HEPES pH 8.0. Divide into single use aliquots, store at -80oC for up to one year.
第４２卷第２期２０１９年６月一一一一一辽宁师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fL i a o n i n g N o r m a lU n i v e r s i t y ( N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )一一一一一V o l ．４２一N o ．２J u n ．一２０１９一一收稿日期:２０１８Ｇ１２Ｇ２５基金项目:国家自然科学基金资助青年项目(３１３０１８８０);辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(L J Q ２０１５０５７);大连市高层次人才创新支持计划项目(２０１５R ０６７)作者简介:李庆伟(１９５５Ｇ),男,辽宁大连人,辽宁师范大学教授,博士,．E Ｇm a i l :l i q w＠２６３．c o m 一一文章编号:１０００Ｇ１７３５(２０１９)０２Ｇ０２１５Ｇ０８一一D O I :１０．１１６７９/l s x b l k ２０１９０２０２１５ G P I 锚 一种复杂的蛋白质翻译后修饰李庆伟１,２,一宋一涛１,２,一勾一萌１,２,一滕洪明１,２,一卢佳丽１,２ (１．辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连一１１６０８１;２．辽宁师范大学七鳃鳗研究中心,辽宁大连一１１６０８１ )摘一要:糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇa n c h o r e d p r o t e i n s ,G P I ＧA P s )是一种在真核生物细胞膜表面普遍存在的蛋白质,最大特点是没有跨膜结构域和胞质尾区,通过翻译后修饰产生的G P I 结构锚定在细胞膜上．G P I 锚结构复杂, 由磷酸氨基乙醇联结部二核心糖链和磷酸肌醇尾组成．核心糖链中的甘露糖二葡萄糖胺二磷 酸肌醇残基可不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰．尽管被精确解析出的G P I 锚结构还较少,但已在分子水平上证明G P I 锚具有非常多样的生物学功能, 如信号传导二细胞黏附二蛋白质转运和免疫反应等等．近年来,由于实验技术的进步,G P I 锚的相关 研究也在逐步深入．对G P I 锚独特的翻译后修饰及其功能的最新研究进行分析归纳．关键词:糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白;G P I 锚结构;G P I 锚功能; 信号传导中图分类号:Q ５３９一一一文献标识码:A 自１９８５年被发现以来,糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇa n c h o r e d p r o Ｇt e i n s ,G P I ＧA P s )是在真核动物中独有的蛋白质翻译后修饰,越来越受到人们的重视[１Ｇ７]．独特而复杂的翻译后修饰可通过糖基化磷脂酰肌醇结构[８Ｇ９],连接在某些缺乏跨膜结构域和胞质尾区的蛋白质羧基末端,从而将此类蛋白质定位在细胞质膜的胞外侧,最终在信号传导二细胞黏附二蛋白质转运和免疫反 应等方面发挥作用．不同于一般的翻译后修饰,G P I 锚结构复杂, 由磷酸氨基乙醇联结部二核心糖链和磷酸肌醇组成(图１),而核心糖链中的甘露糖二葡萄糖胺二磷酸肌醇残基还可以不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰[１０Ｇ１１]．这种复杂结构决定了G P I 锚的功能并不局限于细胞质膜插入． 本文对近年来G P I 锚结构和功能的研究进行分析归纳． １一G P I 锚的发现２０世纪７０年代,从蜡状芽孢杆菌中分离出了一种磷脂酶,该酶可以从组织中释放碱性磷脂酶(A l k a l i n e p h o s p h o l i p a s e ,A P a s e )[１２],因此,这种酶被命名为磷脂酰肌醇Ｇ磷脂酶(P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇs p e c i f i c p h o s p h o l i p a s eC ,P I ＧP L C )．在之后的几年里,陆续有研究者发现,经过P I ＧP L C 处理后的小鼠组织,还可释放出５?Ｇ核苷酸酶[１３]和红细胞乙酰胆碱酯酶[１４]．人们开始意识到,某些蛋白是以共价键形式,通过磷脂酰肌醇结合在细胞膜表面的．直到１９８５年,G P I 锚定蛋白的基本结构才被发现[１５]．起初,受限于复杂的分离纯化过程,G P I 锚定蛋白鉴定的通量一直很低． 随着纳升液相二高分辨质谱等分析仪器的发展,以及蛋白序列数据库的完善,批量鉴定G P I 锚定蛋白也成了可能[９]．２００３年,J e n s e n 等[１ ６]
基于质谱分析的蛋白质组学 在21世纪，生命科学的研究进入了后基因组时代，蛋白质组学作为其中的一个重要分支于20世纪90年代中期应运而生。由于蛋白质的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法如末端测序等已无法满足蛋白质组学研究中的一系列需要。因此，质谱技术作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟，并作为样品制备和数据分析的信息学工具被广泛地应用。质谱技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的优点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量，氨基酸序列及翻译后修饰、蛋白质间相互作用的检测[1]，因此质谱分析无可争议地成为蛋白质组学研究的必然选择。 1.蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。 蛋白质组学研究的核心就是能够系地的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择。 2.生物质谱技术 质谱是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。质谱仪是一类能使物质离子化并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或轨道稳定与否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由
Chapter V Chapter V Post‐translational Modification Of Proteins
One gene more proteins One gene, more proteins https://www.doczj.com/doc/77298482.html,
?蛋白质翻译后修饰（PTM）是指蛋白质在翻译中或翻译后经历的个共价加工过程，即通过1个或几个氨基酸残基加上修饰的一个 基团或通过蛋白质水解剪去基团而改变蛋白质的性质。 ?从定义的角度，可以如下理解蛋白质翻译后修饰： 1. 对某氨基酸的修饰包括共价连接简单的官能团（如乙酰基或磷酸基） 1对某一氨基酸的修饰包括 和引入一些复杂结构，如脂类和糖类。 2. 将已经结束翻译的转录本产物切割成成熟的形式，如信号肽或活性肽的 加 工等。 3. 氨基酸的交联，如丝氨酸和酪氨酸。
?可以说，蛋白质组中任一蛋白质都能在翻译时或翻译后进行修饰。不同类型的修饰都会影响蛋白质的电荷状态、疏水性、构饰不同类型的修饰都会影响蛋白质的 象和（或）稳定性，最终影响其功能。 ?诸多实例表明蛋白质的修饰都采取一种可逆模式‐“开”或“关” 的状态行或者调节蛋白质的功能或者作为个真实的分的状态进行，或者调节蛋白质的功能，或者作为一个真实的分子开关。 ?目前已发现300多种不同的翻译后修饰，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、羧基化、核糖基化以及二硫键的配对等。 等
?加入官能团 乙酰化—通常于蛋白质的N末端加入乙酰。 磷酸化—加入磷酸根至Ser、Tyr、Thr或His。 糖化—将糖基加入Asn、羟离氨酸、Ser或Thr，形成糖蛋白。 烷基化加入如甲基或乙基等烷基。 — 甲基化—烷基化中常见的一种，在Lys、Arg等的侧链氨基上加入甲基。 生物素化—主要有组蛋白的生物素酰化修饰，由羧化全酶合成酶与组蛋白直接相互作用完成，以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化。 以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化 谷氨酸化—谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。 甘氨酸化—一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。 异戊二烯化—加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。 硫辛酸化—附着硫辛酸的功能性。 磷酸泛酰巯基乙胺基化—像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合 聚酮 成中，从乙酰辅酶A加入4‘磷酸泛酰巯基乙胺基。 硫酸化—将硫酸根加入至酪氨酸。 硒化 C末端酰胺化 ‐‐‐‐‐‐‐‐
组蛋白翻译后修饰的 类型
组蛋白翻译后修饰的类型 组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。 染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有 1.75圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。 染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。 ⒈甲基化 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、