分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
2014分子遗传学复习 一、名词解释 1、结构基因（Structural gene）：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。 2、调节基因（Regulatory gene）：指某些可调节控制结构基因表达的基因，合成阻遏蛋白和转录激活因子。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。 3、基因组(genome)：基因组（应该）是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA 分子所携带的全部遗传指令。或单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA。 4、C值悖理(C-v a l u e p a r a d o x)：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C——value paradox)。 N值悖理（N-v a l u e p a r a d o x）：物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性，这被称之为N（number of genes）值悖理(N value paradox)或G（number of genes）值悖理。 5、基因家族(gene family)：由同一个祖先基因经过重复(duplication)与变异进化而形成结构与功能相似的一组基因，组成了一个基因家族。 6、孤独基因（orphon）：成簇的多基因家族的偶尔分散的成员称为孤独基因（orphon) 。 7、假基因(pseudogene): 多基因家族经常包含结构保守的基因，它们是通过积累突变产生，来满足不同的功能需要。在一些例子中，突变使基因功能完全丧失，这样的无功能的基因拷贝称为假基因，经常用希腊字母表示 8、①卫星DNA（Satellite DNA）：是高等真核生物基因组重复程度最高的成分，由非常短的串联多次重复DNA序列组成。 ②小卫星DNA(Minisatellite DNA) ：一般位于端粒处，由几百个核苷酸对的单元重复组成。 ③微卫星DNA (Microsatellite DNA)：由2－20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次组成。 ④隐蔽卫星DNA(cryptic satellite DNA)：用密度梯度离心分不出一条卫星带，但仍然存在于DNA主带中的高度重复序列 9、DNA指纹(DNA fingerprints)：小卫星DNA是高度多态性的，不同个体，各自不同。但其中有一段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”，如果把核心序列串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行分子杂交，就会呈现出各自特有的杂交图谱，它们和人的手纹一样，具有专一性和特征性，因个体而异，因而称为“DNA指纹”。 10、超基因(super gene) ：是指真核生物基因组中紧密连锁的若干个基因座，它们作用于同一性状或一系列相关性状。 超基因家族（supergene family）：是DNA序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族的总称。 11、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)：主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。 12、遗传标记（Genetic marker）：可示踪染色体、染色体片段、基因等传递轨
分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原
名词解释： 1)遗传标记：是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基 因。在重组实验中多用于测定重组型和双亲型。 2)基因组学：是研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用 于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。 3)表观遗传学：（由于非基因序列改变所致基因表达水平变化， 如DNA甲基化和染色质结构变化）研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰，即探索从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴科学。 4)微卫星DNA：重复单位序列最短，只有2～6bp，串联成簇，长 度50～100bp，又称为短串联重复序列。 5)遗传缺陷：是由于人体染色体或染色体所携带的遗传物质发生 异常而引起的疾病。 6)体细胞转基因克隆：把体细胞核移入去核卵母细胞中，使其发 生再程序化并发育为新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个 体。 7)数量性状基因座：对数量性状有较大影响的基因座称为数量性 状基因座（quantitative trait locus，QTL)，它是影响数量性状的一个染色体片段，而不一定是一个单基因座。 8)质量性状：是指个体间没有明显的量的区别而表现非连续性变 异的性状，各变异类型间存在明显区别，能够直接加以描述的
性状。 9)表型相关：就是同一个体的两个数量性状度量值间的相关。 10)遗传力：广义遗传力：指数量性状基因型方差占表型方差的比 例，它反映了一个性状受遗传效应影响有多大，受环境效应影响多大。狭义遗传力：指数量性状育种值方差占表型方差的比例。 11)重复力：是衡量一个数量性状在同一个体多次度量值之间的相 关程度的指标。 12)开放阅读框（open reading frame，ORF）：（结构基因的起始 密码子到终止密码子）是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。 13)分子标记辅助选择：是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分 子标记, 对DNA 目标区域进行直接筛选,进行育种。 14)主效基因：对某一性状的表现起主要作用，效应较大的基 因。 15)转录组学：是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及 转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研 究基因表达的情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。 16)数量性状：个体间差异只能用数量来区别，变异是连续的的性 状。
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
遗传标记的发展及其类型 1形态标记 19世纪60年代，Mendel以豌豆为材料，详细研究了豌豆的7对相对性状的遗传规律。由于这些性状都具有典型的外部形态，很容易识别，从而构成了最早的遗传标记，即形态学标记，由此奠定了近代遗传学的基础。形态标记是利用植物外部形态多态性进行的标记技术。自然界中的生物存在着许多非常明显的形态标记，如果形、花色、矮杆、卷叶等。形态标记简单直观且经济方便，但大多数植物中的形态标记数量有限，多态性较差，表型易受环境影响，且形态标记的获得周期长，不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析，故形态标记在作物遗传育种中的作用有限。 2细胞学标记 细胞学标记是利用植物细胞染色体的变异的标记技术。植物细胞染色体的变异包括染色体核型和带型的变异。细胞学标记虽然能进行一些重要基因的染色体定位，但标记材料的培育需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，难以获得标记材料，从而限制了细胞学标记在遗传育种上的应用。 3生化标记 生化标记主要指同工酶标记，是依据植物体内有效成分的化学分析进行标记的技术。同工酶是同种功能的酶的不同形式，由一个以上基因座位编码，其可通过电泳和组织化学染色法分离成肉眼可见的酶谱带型。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记表现近中性，对植物经济性状无大的不良影响，且是基因产物差异的直接反映，受环境影响较小。但由于在植物群体研究中能表现出位点多态性的同工酶种类较少，使其应用也受到限制而不能成为较理想的遗传标记。 4分子标记 分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记主要是指DNA分子标记。DNA分子标记能反映植物个体或种群的基因组DNA 间的差异，如由于碱基易位、倒位、缺失、插入、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列而产生的差异。起步于20世纪70年代的分子标记在近40年间发展迅速，目前已出现了几十种分子标记方法。与前3种标记(形态、细胞学和生化标记)技术相比，分子标记具有巨大的优越性: ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，受季节、环境限制，不存在表达
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
名词、简答（依据ppt） 一、基因表达调控 1.基因(Gene) 遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位； 负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。 2.基因表达(gene expression) 从DNA到蛋白质的过程。 对这个过程的调节即为基因表达调控(regulation of gene expression)。 3.基因表达的特点 时间特异性——发育阶段特异性 空间特异性——组织细胞特异性 4.基因表达调控的概念 机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因)，根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。 5.基因表达的方式 1）组成性表达(constitutive expression):基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。如管家基因 ★管家基因(housekeeping gene)：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达。 2）诱导和阻遏表达 诱导表达(induction expression)——在特定环境信号刺激下，基因表现为开放或增强，表达产物增加。 阻遏表达(repression expression)——在特定环境信号刺激下，基因被抑制，从而使表达产物减少。 6.基因表达调控的意义 1）以适应环境、维持生长和增殖 2）以维持细胞分化与个体发育 7.原核生物基因表达的调控 8、真核生物基因表达的调控——多层次和复杂性 ★转录前水平：染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA的甲基化、 组蛋白修饰、染色质结构
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要： 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长 细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方
法和电泳技术有一定难度 分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。 (1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。 几种主要的ＤＮＡ分子标记
分子标记遗传图谱的构建 检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。 第一节作图群体的建立 要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。 一、亲本的选配 亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学S.D.Tanksley实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA多态性非常丰富。第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。第三，要考虑杂交后代的可育性。亲本间的差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。由于各种原因，仅用一对亲本的分离群体建立的遗传图谱往往不能完全满足基因组研究和各种育种目标的要求，应选用几个不同的亲本组合，分别进行连锁作图，
三代遗传标记 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。 1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
第八章分子标记及其应用 1) 分子标记的种类与特点 1. 遗传标记的种类与特点 遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。Minisatellites：小卫星序列 遗传标记的种类与特点 1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。 2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。 3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。 4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。 2. DNA分子标记 DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。 2.1 分子标记的优点 1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限； 2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制; 3）多态性高，自然存在，无须专门创造； 4）表现为“中性”，即不影响性状的表达； 5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。 2.2 分子标记的类型 分三大类: 1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段长度多态性
2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、 SSR、ISSR、 SCAR、STS等 3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等 第三节分子标记的应用 1. RFLP标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。 基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。 关键因素： 限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。 RFLP标记的优缺点 优点： 1）共显性； 2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座； 缺点： 1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针； 2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。 2. RAPD 标记 RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。 基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitary
SSR标记技术和ISSR 标记技术雷世勇 2.1 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。定义：SSR （全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个多为1～5 个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即 CA n和 TG n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。 SSR分子标记的应用举例 ――鹅掌楸种属及杂种的分子标记北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物引物筛选物种特异性扩增引物特异性验证 SSR 标记技术的特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSR 标记的应用目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、
水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR 即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。几个重要的名词： ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMP-PCR。RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术。 ISSR分子标记的优点 2实验成本低； 3操作简单；4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。 ISSR 标记技术原理：用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的差异。 ISSR的应用举例 ――攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析 PCR扩增及产物检测：从