Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.
原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。 第一节原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下： 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 二、各类组织的取材技术
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
2010年11月重庆师范大学学报(自然科学版)N ov.2010 第27卷第6期Journa l o f Chongqi ng N or m a lU n i versity(N a t ura l Sc i ence)V o.l27N o.6动物科学DO I:10.3969/J.ISS N.1672-6693.2010.06.004草鱼前体脂肪细胞原代、传代培养及鉴定* 曹锴,李影,蔡志华 (重庆师范大学生命科学学院重庆市动物生物学重点实验室,重庆400047) 摘要:建立草鱼(C tenop haryngodon idellus)前体脂肪细胞的培养体系,体外重现草鱼脂肪细胞的增殖分化过程。实验采用油红O染色法对脂肪细胞进行鉴定;采用倒置显微镜(N I KON)和CCD对细胞进行观察摄像;选用的健康草鱼体重为800~900g;利用体外组织培养技术在温度为28e,CO 2 浓度为5%,血清浓度为20%,p H值为7.0~7.2的条件下,以DM E M/F12培养基对来源于草鱼腹腔的脂肪组织进行原代培养;单层的原代培养细胞达到瓶底面积的70%~80%且汇合时,对细胞进行传代培养。研究发现在本实验条件下,培养48h后组织块周围有梭形细胞迁出; 3d后细胞数量增多,多为梭形和多边形;培养8d后大部分细胞融合;细胞内脂滴可被亲脂的油红O着色,证明为脂肪细胞。对融合后的细胞进行传代培养,可传至第4代;传代第3d可形成致密单层;第8d胞质内含有大量脂滴。 研究初步确立了较为适宜的草鱼前体脂肪细胞离体培养体系。 关键词:草鱼;脂肪细胞;原代培养;传代培养 中图分类号:Q813.1文献标识码:A文章编号:1672-6693(2010)06-0020-03 前体脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化细胞,它持续存在和作用于人类和动物的一生[1]。研究脂肪细胞增殖与分化规律,可为了解人及动物诸多脂肪代谢紊乱性疾病奠定生物学基础。当前草鱼(C tenopharyngodon i d ellus)等腹腔脂肪过度蓄积问题比较严重,研究草鱼脂肪细胞增殖、分化过程以及与脂肪沉积有关的因素,无论是从养殖生产的经济利益角度,还是从人健康问题出发,都是一项具有现实意义和经济意义的课题。自上世纪60年代起,国内外已成功构建了人[2](H o m o s paiens)、大鼠(Ratt u s norre g icus)[3-4]、猪(Sus scrota)[5-6]和牛(B os taurus)[7-8]的前体脂肪细胞体外培养模型,国外已研究了虹鳟(Oncor hynchus m ykiss)[9]、大西洋鲑(Sal m o s alar)[10]、红鲷(Pagrus m ajor)[11-12]、鲤鱼(Cyprinus carp io)[13]等鱼类的脂肪细胞培养,本文在对草鱼脂肪细胞的提取方法进行研究的基础上,参考哺乳动物及上述鱼类的相关研究成果和吉红[14]等利用胶原酶消化法对草鱼进行原代培养的结果,对鱼类前体脂肪细胞进行了原代与传代培养,并进行了初步鉴定,以期获得较为成熟的培养体系。1材料与方法 1.1材料 试验用鱼为购自重庆市沙坪坝区超市的健康草鱼,体重800~900g。主要试剂为:DME M/F12培养基(G I BCO);胎牛血清(杭州四季青);牛血清白蛋白(S i g m a);胰蛋白酶(Trypsi n1,GI BCO);EDTA (Am resco);PBS(武汉博士德);油红O;青霉素;链霉素;卡那霉素;苯扎溴铵等。培养液的配制方法为:1.56g D M E M/F12,0.70g N a HCO3,20mL胎牛血清,加入各100I U/mL青、链霉素,50I U/mL卡那霉素,三蒸水定容至100mL。不加入胎牛血清即为无血清培养液。消化液用PBS液配制含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA。细菌过滤器过滤灭菌 (0.45L m和0.22L m微孔滤膜),4e条件下保存。 1.2方法 1.2.1原代培养将鱼在0.1%苯扎溴铵溶液内浸泡30m i n,置于酒精消毒的托盘内并用碘酒和75%酒精棉球擦拭鱼体表,超净工作台内解剖取脂肪组织。获取的脂肪组织以PBS缓冲液(含5%BSA)冲洗2次,无血清培养液洗1次,在小烧杯中用眼科剪 *收稿日期:2010-09-18修回日期:2010-10-19 基金项目:国家自然科学基金(No.30800843);重庆师范大学重庆市动物学重点学科拓展研究项目(2009)作者简介:曹锴,男,硕士研究生,研究方向为细胞生物学;通讯作者:李影,E-ma i:l li y i ngcqnu@s ohu.co m
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
一.细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。 但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二.细胞培养的基本设备与用品 (1)细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 (2)常用的实验用品 1.玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源：PriCells 点击次数：335 关键词：上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法：
自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法： 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法： 酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，是两者分开，达到纯化的目的；另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。
脂肪细胞的基础知识 脂肪细胞的生长全过程及其形态变化 脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。 张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。 张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.
间充质干细胞 概念： 不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。 李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。 庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种 具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间 充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于 其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多 种抗原标志。 李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外， 它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。 张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。 脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。 免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
实验四乳鼠肺细胞原代培养 一、实验目的 1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。 2.学习细胞消化、细胞计数方法。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。 三、实验用品 1.设备 培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离心机等。 CO 2 2.器材 眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养皿等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，15磅灭菌30min。此外，还需显微镜、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球等。 3.试剂 （1）D-Hanks平衡盐溶液：即无钙、镁离子的Hanks液。 （2）细胞消化液：％胰蛋白酶液（胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL，溶解后过滤除菌，调pH值） 溶液。 （3）％NaHCO 3 （4）RPMI1640培养液。 以上溶液均经适当包装，除菌后备用。此外，还需胎牛血清和1000U/mL的青、链霉素液（双抗）。在RPMI1640培养液中加入10%胎牛血清，1%双抗，即成细胞培养液。 4.仪器药品 以3-5人为一个小组，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镊各两把；90mm玻璃培养皿3个，用以清洗组织块；50mL离心管1个；5mL、10mL移液管各5支；35mm培养皿1个。 四、材料 出生后2-3天的乳鼠。 五、实验步骤 1.清洗与消毒 操作者首先进行手的清洗与消毒。 2.处死动物 新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟，置平皿中。 3.取肺 左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科聂取出肺，置于盛有Hanks液（含有200U/ml青链霉素）的玻璃平皿中，冲洗去血。 4.剪肺 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的Hanks液冲洗1遍。用弯头眼科剪，将肾剪成1mm3大小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2-3次，直到液体澄清为止。 5.消化及分散组织块 将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5-6倍量加入消化液。转入50mL离心管，置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20-40min左右。每隔10min摇动一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化1 朱惠娟，史轶蘩，邓洁英，龚凤英 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院内分泌科（100730） E-mail：huijuanzhu@https://www.doczj.com/doc/6d16414661.html, 摘 要：采用胶原酶消化法从人皮下脂肪中分离并原代培养人前脂肪细胞，通过对细胞形态学的观察、油红O对细胞内脂质染色，以及脂肪细胞标志性酶G-3-PDH活性的测定对细胞进行鉴定。摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。 关键词：无血清培养，原代培养，前脂肪细胞，增殖，分化 1．引言 随着全球经济的迅猛发展和物质的高度丰富，肥胖症正在以惊人的速度取代感染性和营养不良性疾病威胁人类的健康。导致机体肥胖的脂肪组织是由脂肪细胞、前脂肪细胞、微血管内皮细胞和细胞外的基质成分组成的（1），过多热量以甘油三脂的形式存储在脂肪细胞内，脂肪细胞是在不同的转录因子诱导一系列特异基因表达下由前脂肪细胞分化而来的，而前脂肪细胞起源于胚胎中胚层的多能干细胞（2-4）。目前认为在胚胎期就存在分化的脂肪细胞，在胚胎发育的后期和出生后的儿童期脂肪细胞迅速分化，到了成人期，虽然主要以脂肪细胞的体积增加为主，但前脂肪细胞仍然保留了分化能力，在适当的生理条件诱导下能够不断地分化成为脂肪细胞。目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。12）以C3H10T1/2、NIH3T3为代表的多潜能（multipotent）干细胞系；3）以3T3-L1、3T3-F442和Ob17为主的前脂肪细胞系是目前应用最广泛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞研究的细胞系。此外2001年， Wabitsch M和他的同事报道了用一例Simpson- Golabi-Behmel syndrome (SGBS)的患者脂肪组织分离出前脂肪细胞首次建立的人前脂肪细胞系（6）。但是非整倍体的前脂肪细胞系在诱导成为永生细胞的过程中细胞的分化能力会受到影响，甚至丧失了其体内的固有生理环境，尤其是前脂肪细胞系不能反映不同年龄、不同部位的脂肪细胞的生物学特点。而原代培养的细胞刚刚离体， 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助（20020023051） - 1 -
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。