中南大学生物科学与技术学院
分子生物学研究中心
教案
授课科目: 医学分子生物学
授课内容:疾病产生的分子基础
授课对象：临床医学七年制、八年制
授课时数：4 学时
授课教师：
授课地点：湘雅医学院新教学区
授课时间：
授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），
胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一
版；
医学分子生物学（卫生部8年制规划教材），冯作化
主编，北京：人民卫生出版社，2005，第一版
第十一章疾病产生的分子基础
一、目的求：
掌握：基因突变的概念、类型及特点。
熟悉：基因突变的发生机制；疾病相关基因的研究策略。
了解：基因突变与疾病发生；血红蛋白病等常见单基因病的发病分子机制。二、讲授重点：
基因突变的类型及特点。
三、讲授难点：
基因突变的分子机制。
四、教学方法：多媒体教学、板书
五、教具：多媒体课件、多媒体设备、电子光标笔、粉笔、黑板、教材
六、讲授内容：
第一节基因结构改变引起疾病
一、基因结构改变:在基因的特定DNA序列中，其碱基组成及排列顺序可因机体内外因素的作用发生改变，导致DNA一级结构发生改变，改变基因结构，形成基因突变（mutation）。如果基因突变使蛋白质发生了质的改变，即理化性质、
生物化学性质、免疫学性质及生物学功能的改变，或使蛋白质量的改变超过了生理范围，就会导致疾病的发生。
基因突变的多种类型：
点突变是单个碱基的改变；可分为转换（transition）和颠换（transversion）两种。转换指同类型碱基之间的取代，即一种嘧啶碱基被另一种嘧啶碱基取代或一种嘌呤碱基被另一种嘌呤碱基取代形成的点突变。颠换指不同类型碱基之间的取代，即一种嘧啶碱基被一种嘌呤碱基取代或一种嘌呤碱基被一种嘧啶碱基取代形成的点突变。
缺失（deletion）是一个或多个核苷酸的丢失；插入（insertion）是一个或多个核苷酸的增加；
倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列可发生重组，使一段DNA序列的方向反置，如由原来的5ˊ→3ˊ方向排列整段倒置为3ˊ→5ˊ方向排列，或一段DNA序列在基因内部位置迁移，使基因结构发生改变，形成的突变称为倒位。
基因突变还分为配子突变与体细胞突变；动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变。
二、基因突变的遗传效应
不同的基因突变引起不同的遗传效应。
(1)碱基置换突变(substitution mutation)
a. 同义突变(consense mutation or silent mutation)
b. 错义突变(missense mutation)
c. 无义突变(nonsense mutation)
d. 终止密码子突变或延长突变
(terminator codon mutation or elongation mutation)
e. 起始密码子突变(initiation codon mutation)
f. 非编码序列点突变(point mutation in noncoding sequence)
例如：无义突变是突变后产生缩短的多肽键使它所编码的蛋白质发生改变；
错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变为
决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活，例如人血红蛋白β链的基因如果将决定第6位氨基酸（谷氨酸）的密码子由CTT变为CAT，就会使它合成出的β链多肽的第6位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸，从而引起镰刀形细胞贫血病。
(2) 缺失或插入突变(deletion or insertion mutation)
a. 密码子缺失或插入(codon deletion or codon insertion)
b. 移码突变(frame-shift mutation)
c. 整基因或大片段缺失
(deletion of a whole gene or a large segment)
(3) 融合突变(fusion mutation)
细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对，
产生两种含不同等位基因的染色体。
(4) 基因突变影响 hnRNA 的剪接
基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。
三、结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病：
血红蛋白病的类型、特点与结构基因的变化关系、珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达。
血红蛋白结构：
1. 血红蛋白是由4条肽链（两个α和两个β链）组成的。每条肽链都类似
于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。
2.血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧的亲和性方面有很大区别。
由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。
3. 人类珠蛋白基因有典型的真核基因结构特点。珠蛋白基因包括已鉴定的8
个功能基因、3个假基因及一个新发现的基因。它们在染色体上成簇排列。珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控。
血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同，正常成年人血红蛋白中的β链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。
(1) 人α-珠蛋白基因簇及α珠蛋白基因结构
(2) 人β-珠蛋白基因簇及β珠蛋白基因结构(按图例讲解)
血红蛋白病类型：
异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。
地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。
镰状红细胞贫血症是一种常染色体退化遗传病。引起镰状红细胞贫血症的原因就是β珠蛋白基因的第6位密码子点突变，即编码血红蛋白β链上一个决定谷氨酸的密码子GAG变成了GTG，使得β链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变（图11-1）。与正常血红蛋白相比，该病患者的红细胞由正常的圆盘形变成了镰刀形。血红蛋白基因上单个核苷酸的替换（A→T），恰好使该基因片段丢失了可被限制性内切酶Mst II酶切开的一个位点CCTNAGG序列（N代表四个碱基中的任意一个）。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，可用Southern印迹杂交分析方法和限制性片段长度多态性(简称RFLP)分析方法，对镰状红细胞贫血症胎儿进行产前诊断，或对发病家族成员的基因型进行分析。
图11-1 镰状红细胞贫血症β珠蛋白基因突变方框内突变的核苷酸
另常见单基因病如囊性纤维化病(cystic fibrosis, CF)举例。
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。
发病频率(0.4 ‰)，常染色体隐性遗传；致病基因CFTR；典型症状：进行性肺损伤及其他。
Gene therapy of CF：将重组CFTCR基因cDNA-病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR 基因的表达，纠正Cl＋转运缺陷，减少黏液分泌。
病理生理变化过程：（如图）
四、调控序列变异导致基因表达水平变化
基因调控序列也称顺式作用元件，是基因的重要组成部分，虽然其遗传信息不会被表达传递到蛋白质的肽链中去，基因调控序列的突变也不会改变蛋白质的一级结构，但调控序列的突变会改变基因的表达强度，引起蛋白质生物合成量的改变。这种量的改变超过一定的范围，同样会导致蛋白质功能的紊乱，引起相应的疾病。
β珠蛋白基因转录起始位点上游30（-30）处有TATA盒、-90及-105处有CACACCC 序列，它们都是β珠蛋白基因的转录调控序列，如TATA盒调控正常的转录起始
及其效率。这些调控序列如果发生基因突变，就会使β珠蛋白基因的转录效率降低，β珠蛋白合成减少，引起β＋-地贫。不仅是调控序列变异能影响基因的表达，使相应蛋白质的合成减少，一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。
第二节细胞间异常信号导致基因表达异常
正常的细胞间信号，能保证基因表达的正常时间特异性、空间特异性以及正常的表达水平。相反，错误的细胞间信号，会破坏基因表达的时间特异性和空间特异性，使胚胎后细胞合成胚胎型蛋白质、或使一种细胞合成另一种细胞特有的蛋白质，还会使基因表达水平过高或过低，这些都会导致疾病的发生。
细胞间信号异常导致基因表达异常从而引起疾病：
人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。
例如AFP接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。甲胎蛋白（AFP）是一种具有胚胎时间表达特异性的蛋白质，胚胎发育过程中，AFP的增强子始终处于激活状态,而沉寂子处于抑制状态,因此增强子的信号可以顺利到达启动子启动AFP基因，AFP基因大量表达。AFP具有免疫抑制作用,可以保护胎儿免受母体的免疫攻击。胎儿出生后,沉寂子活化,阻碍了增强子的启动效应,使AFP表达受到抑制。但在异常细胞增殖信号的作用下，c-myc、c-fos和c-jun 等癌基因表达异常增加，其表达产物与AFP基因顺式作用元件相结合，激活AFP 基因的表达，重新大量合成AFP。大量合成的AFP通过细胞膜上AFP受体介导,影响淋巴细胞或肝癌细胞的肿瘤坏死因子（TNF）家族及其受体的表达,导致肝癌细胞逃避机体免疫监视,同时又能促进癌基因表达,引起肝癌细胞大量生长。可见，由于肝细胞接受了异常的细胞增殖信号，破坏了AFP表达的时间特异性，使AFP在胚胎后肝脏异常表达，在肝癌的发生发展中起着十分重要的作用。
再如粉尘刺激的细胞间信号异常导致基因表达异常引起矽肺发生：粉尘刺激→肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞→分泌TGF-β1→成纤维细胞→促细胞分裂和ECM 蛋白基因表达→ ECM 增加→矽肺发生
可见，矽肺发生的重要分子机制是成纤维细胞获得了异常的细胞间信号，使多种ECM蛋白质基因的表达增强，相应的蛋白质合成和分泌增加，造成ECM在肺组织病理性蓄积，最终形成矽肺。
第三节细胞内因素导致基因表达异常引起的疾病
基因的表达不仅受基因本身结构和细胞间信号的影响，也受一些细胞内因素的影响，这些影响达到一定的强度或超过一定的范围，或破坏基因表达的时间特异性和空间特异性，或使基因表达水平过高或过低，均可导致疾病的发生。
细胞内因素导致基因表达异常引起疾病：
①异常的细胞内信号导致基因表达异常引起疾病
高血糖→ DAG↑→激活PKC →激活 ACE → AngⅡ↑
②异常的DNA甲基化导致基因表达异常引起疾病
DNA甲基化导致基因表达变化是肿瘤形成的重要原因。肿瘤细胞与正常细胞比较，DNA 甲基化模式显著不同。不同的DNA甲基化模式，会产生不同的基因表达谱。基因表达谱失去平衡，就会导致疾病发生，如原癌基因过度扩增、表达异常增强，或/和抑癌基因的“沉寂”，相应表达产物减少甚至消失，都会使细胞增殖平衡受到破坏而引起恶性肿瘤的发生。
hCG5' 转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG ↑→受体结合→激活胞内cAMP信号传导途径→调节肿瘤细胞的其他“生长因子、细胞
因子”的产生，Tumor ↑
③病原生物基因的体内表达导致疾病的三种方式
第四节翻译后加工运输障碍引起疾病
在机体细胞内，通过mRNA指导的蛋白质生物合成将基因DNA序列中所含的遗传信息表达于蛋白质中，并通过蛋白质的生物功能体现机体的生命活动。但是，即使没有任何突变、所含遗传信息完全正确，刚刚合成的、未成熟的蛋白质没有生物活性，不能正确地完成其生物学功能。要使新合成的蛋白质具有完整的
生物学活性，还需对其进行翻译后加工，其方式包括：除去信号肽、基团修饰、蛋白质的折叠、亚基聚合、运输至发挥功能的靶部位等。其中任何一个环节的障碍，都会使蛋白质功能紊乱，导致疾病的发生。
酪氨酸酶是黑色素细胞中催化黑色素生成的限速酶,在黑色素的生成过程中起着关键的作用。酪氨酸酶肽链合成后，需先在内质网进行折叠，再从内质网运输至高尔基体进行糖基化加工,然后由运转囊泡将其转运至黑色素体发挥作用。多种蛋白质（包括酶蛋白）参与了酪氨酸酶的这一成熟及转运过程。所以，不仅酪氨酸酶本身的基因变异会使酪氨酸酶功能紊乱，参与酪氨酸酶成熟和转运的蛋白质基因变异，也可以导致酪氨酸酶不能成熟或不能运输至靶部位，使酪氨酸酶功能紊乱，黑色素合成障碍，导致一些色素病的发生。
I型泛发性白化病就是一种色素病,主要表现为眼、毛发、皮肤的色素缺失,易发生皮肤及眼部的肿瘤,由先天性酪氨酸酶基因缺陷引起。变异的酪氨酸酶蛋白在内质网的折叠障碍是I型泛发性白化病的一种重要的分子机制。
在酪氨酸酶的成熟及转运过程中，一种被称为P蛋白的蛋白质起着重要的作用。P蛋白是一种含12跨膜结构域的膜蛋白，参与酪氨酸酶蛋白从高尔基体到黑色素体的运输。P蛋白基因突变，会使P蛋白的功能障碍，酪氨酸酶不能正确地转运至黑色素体，导致酪氨酸酶功能紊乱，黑色素合成障碍，引起Ⅱ型泛发性白化病。
第五节蛋白质降解异常引起疾病
基因表达及蛋白质合成是影响体内蛋白质含量的重要因素，但不是唯一的因素。蛋白质的降解也是调节体内蛋白质含量的一个重要因素，事实上，是蛋白质的合成及降解之间的相对速度大小或量的多少决定体内蛋白质含量。某蛋白质合成大于降解、则该蛋白在体内的含量增加，反之亦然。
一、哺乳动物体内蛋白质降解有两条基本途径：
①一是溶酶体，主要降解细胞吞入的胞外蛋白质。
②另一条是泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway；UPP），主
要降解细胞内泛素化的蛋白质，是细胞质和细胞核内依赖于ATP、非溶
酶体途径的蛋白质降解通路,能高效并高度选择性进行细胞内蛋白质降
解,尤其降解半衰期短的功能蛋白、癌基因产物和变性、变构蛋白等,应
急状态下也降解细胞内结构蛋白。
二、泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、特异性泛素激活酶(ubiquitin-
activating enzyme，E1)、泛素结合酶( ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶( ubiquitin ligase，E3) 、蛋白酶体(proteasome) 组成，泛素-蛋白酶体途径是在这些酶的顺序作用下的底物蛋白泛素化过程及泛素化蛋白最后被降解为小肽。
三、在某些有害的环境，如氧化应激、内质网应激和老化过程中，蛋白质会受到
损害而发生折叠错误；即使新合成的蛋白质，在翻译后修饰加工过程中，会发生异常裂解。
①泛素-蛋白酶体系统受损，蛋白质从细胞内降解清除，就会使其在细胞内
积聚，造成细胞功能障碍、甚至死亡，引起相应的疾病。
②如果该系统功能异常增强，就会使一些正常功能或结构蛋白被降解、导
致蛋白质的功能紊乱或细胞结构破坏，引起疾病。一些蛋白质，特别是
调节蛋白质，它们在完成功能后，需及时被降解清除，以适应机体代谢
或其它功能调节的需要。这些调节蛋白的降解清除，也主要靠泛素-蛋白
酶体系统来完成。如果该系统的功能异常，不能及时地降解清除这些调
节蛋白，就会使这些调节蛋白持续地发挥作用，失去调节意义，导致机
体功能紊乱，引起疾病。
举例1：泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起着重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。Apo B100内源性甘油三酯及胆固醇代谢中起着重要的作用，并直接参与了血浆LDL 的清除，对维持正常的血浆LDL及LDL-胆固醇（LDL-C）水平具有十分重要的意义。用培养的仓鼠原代肝细胞建立肝脂质代谢模型，发现大约40%新合成的apo B被泛素化并降解；在人的脂蛋白代谢模型中，脂质核心再循环受到限制，原因是部分apo B 通过泛素-蛋白酶体系统被迅速降解。给予蛋白酶体抑制剂ALLN或MG132, apo B的多聚泛素化及降解都受到剂量依赖性抑制，提示蛋白酶体抑制剂可能抑制泛素化的apo B
被降解。血浆apo E水平与动脉粥样硬化的敏感性相关,巨噬细胞源性的apo E 可清除动脉壁的胆固醇而发挥抗动脉粥样硬化作用。在RAW264.7单核巨噬细胞及HepG2细胞转入泛素使其过表达，结果发现apo E 明显泛素化并降解, 而蛋白酶体抑制剂乳胱素可使apo E降解速率减慢，导致apo E聚集。
举例2：阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性疾病。其病理特征包括老年斑、神经原纤维缠结、海马锥体细胞中颗粒空泡变性及血管壁淀粉样蛋白沉积。研究发现, AD患者脑组织蛋白酶体活性的下降,尤其是在海马、海马旁回、颞上回、颞中回及顶下小叶,且蛋白酶体活性下降与其表达下降不一致,因此认为AD患者脑细胞蛋白酶体活性可能受到抑制。淀粉样蛋白(amyloid proteinβ，Αβ)是细胞外淀粉样斑的主要成分,并存在于神经元内的神经原纤维缠结内,研究发现，Αβ可选择性地抑制20S蛋白酶体糜蛋白酶样活性,且在病理状态下可通过抑制26S蛋白酶体活性来影响泛素依赖性蛋白的降解。可见，泛素-蛋白酶体系统的功能紊乱在AD的发生发展中起着重要的作用。
第六节病原生物基因引起的疾病
人体疾病可以由外源性基因，也就是病原生物的感染引起。由于不同的外源性基因各有特点，相应病原生物的生活特性也各不相同，不同的病原生物基因引起人类疾病的机理也各有特点。
①外源性基因通过病原生物的感染进入体内，在人体的特定组织器官表
达，病原生物得以生成、繁殖，引起机械或生物学损伤。
②病原生物基因在人体内大量表达，病原生物大量繁殖，与人体争夺营
养物质，造成人体营养物质缺乏，引起疾病。
③病原生物基因在人体表达，可产生生物毒素作用于人体细胞，使细胞
的一些生理功能或代谢异常，引起疾病。
④病原生物的基因还可以整合到人体基因组中，改变一些基因的结构，
或改变机体原有基因表达产物的结构和功能、或改变机体原有基因的
表达水平、或引起新的异常蛋白的表达，引起疾病的发生。
第七节疾病分子机制的研究策略
针对如此复杂的疾病发生分子机制，对不同的疾病就要采取不同的研究策略。
一、通过结构分析确定基因变异在疾病发生中的作用
基因结构改变即基因突变是人类疾病发生的重要原因之一。对于由基因结构改变引起的疾病，弄清其发病机制的基本策略是突变基因的结构分析，并通过对突变基因的结构分析找到致病突变。主要方法有：核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配等。（讲解课件上的图例）
1.核糖核酸酶切分析
①基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA
中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。
② Watterson et al., J Clin Microbiol (1998)
– Mutation scanning ；
③Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A)；Inner promoter primers
– SP6 and T7；
④ Gel detection; could include isotope incorporation
⑤缺点：
?当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；
?分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为 70%；
?需要制备特异性的RNA探针
2.杂合双链分析法（heteroduplex analgsis, HA）
直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。
化学切割错配法（Chemical cleavage of mismatch, CCM）
基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。
特点：
?突变检出率高；
?如使用荧光检测系统，灵敏度较高；
?可检测长度达 2Kb的核酸片段；
?步骤多、费时、有毒；
?碳化二亚胺检测法
3.酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage )
①polymorphisms can be identified by EMC in DNA–DNA heteroduplexes.
② T4 Endo nuclease VII
③ Enzymes cleave adjacent to the mismatch and products are resolved
via gel or capillary electrophoresis.
④ the cleavage enzymes often nick complementary regions of DNA as
well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces
the pooling capacity of the assay)
二、基因表达水平分析
基因表达分析的主要方法包括Northern印迹杂交法、消减杂交技术、差异显示法、定量RT-PCR、基因表达芯片、基因表达系列分析技术等，在这里主要讨论差异显示法、消减杂交技术和基因表达系列分析技术。
1. 差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain
reaction, DDRT-PCR) 指在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同
阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同
的，这就是基因的差别表达（differential expression）。原理：利用两组特
殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3’端引物：利用mRNA的poly A
尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有
12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，
这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的
碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M为A、G、C的任一
种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。
5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA 的不同位点上。
用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5’随机引物。
2. 抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization, SSH)
基本原理：SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。
方法：提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别 4 碱基的限制性内切酶切割；实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头；进行2轮差减杂交和抑制性PCR；获得富集的目的基因。
?优点采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至?6％); 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异?表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。?缺点起始材料需要 g 级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取?cDNA全长序列有一定难度。
3. 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)
是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。
三、基因功能研究以确定基因在疾病中的作用
弄清基因的生物学功能，才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能分析策略包括转基因技术、基因敲除技术、反义技术、基因诱导超表达技术和RNA干扰技术等。
（一）转基因技术确定基因在疾病中的作用
转基因技术是将人工分离和修饰过的外源基因导入培养细胞和/或生物体内，通过导入基因的表达改变细胞或生物体的性状，形成性状的可遗传性修饰。通过对这些性状改变的分析，就能了解导入基因的生物学功能。
举例:如有人用大鼠弹力蛋白酶I基因的增强子与激活的H-ras基因重组成融合基因并导入小鼠，制备的转基因小鼠几乎100%都产生胰腺癌。用这种方法直接证明了原癌基因的突变是肿瘤发生的重要原因。
用转基因技术研究基因的功能或确定基因在疾病中的作用可以在细胞水平进行，也可以通过转基因动物在整体水平进行，基本策略都是细胞的基因转染。
转染基因包括质粒DNA、RNA和寡核苷酸。转染分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染将外源基因导入宿主细胞核内但不整合到染色体中；稳定转染不仅将外源基因导入宿主细胞核内，还将其整合到宿主细胞的染色体中或形成附加体。转染的方法有物理方法(如电穿孔法)、化学方法(如磷酸钙法、阳离子脂质体法、非脂质体脂类法)和生物学方法(如逆转录病毒等病毒介导法)。非脂质体脂类转染试剂对一些细胞的毒性比一般阳离子脂质体的要小,可提高转染效率和扩大使用细胞的范围。影响转染效率的因素较多，如培养细胞的密度、核酸（外源基因）的用量、核酸与转染试剂的比例、转染时间、转染后培养时间等；所以，要获得理想的转染效率，通常要对这些转染条件进行优化。
影响转染的因素：
①细胞培养物，如细胞培养代数、培养基种类、培养基中血清的含量等；
②载体，包括载体大小及形式(超螺旋或线性)；
③导入基因，包括其核酸的纯度、杂质的种类及含量；
④转染方法，不同的转染方法在不同的细胞有不同的转染效率。
（二）基因敲除技术确定基因在疾病中的作用
基因敲除(gene knockout)又被称为基因打靶(gene targeting)，是一种通
过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组、精细地定点修饰和改造染色体基因片段的技术。基因敲除是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的一门新兴生物技术,具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点,不仅是一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法，也是研究基因的功能、确定基因在疾病发生中的作用最直接和最有效的方法之一。
基因敲除最常使用的细胞是小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞),因为ES细胞在体外有白血病抑制因子(LIF)的条件下培养,可增殖并维持多潜能未分化状态,具备发育成胚系各种组织的能力。
用转染的方法将重组载体导入ES细胞中，使之与ES细胞染色体上的靶基因发生同源重组,把突变或缺失的外源基因置换到ES细胞中,从而使内源性目的基因的转录子中断,阻断ES细胞中目标基因的表达,从表达的角度讲，这个目标基因就被剔除了。转染ES细胞后，通过外源基因上的筛选标记筛选出发生同源重组的ES细胞并将其在体外扩增，再将带有此ES细胞的囊胚移植到假孕鼠的子宫内,使之发育成一个嵌合体。然后将这些ES细胞植入假孕小鼠的子宫内，产生F1代嵌合鼠，F1代小鼠互相交配就可能产生杂合子和纯合子基因敲除小鼠。研究杂合子和纯合子基因敲除小鼠的表型改变,就能了解敲除的目的基因的功能、确定目的基因在疾病发生中的作用。如小鼠是一种对动脉粥样硬化有抗性的动物，当把小鼠的载脂蛋白（apo E）基因敲除后，纯合子apo E基因敲除小鼠在普通饲料或脂肪含量稍高的饲料喂养2～3月，血浆残粒脂蛋白胆固醇含量大大升高，主动脉和冠状动脉出现明显的动脉粥样硬化板块，从而证实了apo E促进残粒脂蛋白代谢、抗动脉粥样硬化的作用。
基因敲除技术的不足：
①操作复杂,实验周期长,费用昂贵；
②存在基因不完全敲除(incomplete knockout)而导致泄漏突变(leaky mutation)。在基因敲除过程中,被阻断表达的只是染色体中靶基因的某一个或几个外显子而不是该基因的全部编码区,残留的编码序列可能获得新的未知功能,给表型分析带来麻烦；
③基因敲除过程中的染色体片段破坏会导致其它基因的编码区或调控元件破坏,造成多基因删除或死表型；
④基因的冗余和代偿机制也会给表型分析带来很大困难；
⑤同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除获得的表型会有很大差异。
（三）反义技术确定基因在疾病中的作用
反义技术(antisense technique)是根据碱基互补原理,用人工或生物合成特异的互补DNA或RNA片段(反义核酸)，使之能特异地与目的核酸片段互补结合，从而特异地抑制甚至阻断目的基因的表达的一种技术。根据所采用的反义核酸的不同，反义技术又可分为反义寡核苷酸技术、反义RNA 技术和核酶技术等。
1.用反义寡核苷酸技术确定基因在疾病中的作用
反义寡核苷酸(antisense oligonuleotides，ASON)技术根据碱基互补结合原理、人工或生物合成与目的DNA或RNA互补的寡核苷酸,将其导入细胞后与胞内目的DNA或RNA特异地结合，从而抑制甚至阻断目的基因的表达或目的RNA 的翻译,达到人工调控表达基因的目的。目的基因被抑制后会发生表型的变化，通过表型改变的分析，就能了解被抑制基因的功能、确定其在相关疾病发生中的作用。
ASON主要通过以下几种机理抑制或阻断目的基因的表达：
①通过与染色体DNA的互补结合，ASON掺入基因组特异区域并形成三股螺旋DNA(triplex DNA)或D环(D-loop)结构、或通过对转录因子的套圈作用,封闭目的基因，使目的基因不能被复制，也不能被转录成RNA。
②ASON进入细胞后，与细胞内目的mRNA互补结合，形成DNA·RNA具有双链结构的异源杂交体。
③ASON能与核内不均一RNA（hnRNA）互补结合，使其不能被正确地被剪切，阻断mRNA的成熟，相应的基因在转录后不能被翻译成蛋白质，基因的表达被阻断。
④ASON能与核糖体rRNA的mRNA结合位点互补结合，阻止mRNA与rRNA 结合，进而阻止蛋白质翻译的正确启动，相应基因的表达就会被阻断。
⑤真核细胞RNA转录完成后需经过转录后修饰并移至胞浆的特定部位才能被翻译。特异的ASON与mRNA互补结合后能阻止其进入正确的翻译部位，mRNA 不能被翻译成蛋白质，相应基因的表达被阻断。
由于ASON进入机体或细胞后很容易被降解,为提高其稳定性、延长其半寿期，在实际运用过程中往往要对ASON进行修饰。如将ASON磷酸骨架上的氧用硫原子或乙基、甲基代替，形成硫化、乙基化、甲基化的反义寡核苷酸，是第一代修饰方式，其中以硫代修饰使用最多。修饰后的ASON虽然增加了稳定性、延长了其半寿期，但也同时增加了其细胞毒性、还降低了其细胞吸收率。
近年来发现，以2-氨基乙基甘氨酸为基本骨架的多肽链是一种核酸类似物，每个氨基酸残基间由酰胺键连接到多肽骨架上,碱基通过亚甲基羰基连接到多肽骨架上。与核酸不同的是,这种多肽链不含任何戊糖或磷酸成分,而是以酰胺键连接骨架取代核酸中以磷酸二酯键连接骨架。由于这种多肽链能与RNA或DNA互补结合形成稳定的多肽链:DNA或RNA杂合链，所以这种多肽链被称为肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)。PNA具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性，在机体内或细胞中具有较强的稳定性，当它与DNA或RNA结合后，能阻止其转录或翻译，从而阻断相应基因的表达，是较好的反义抑制剂,被称为第三代反义核酸。
2．反义RNA技术确定基因在疾病中的作用
反义RNA（antisense RNA）是一类自身没有编码功能,但能通过配对碱基间氢键与目的RNA、特别是mRNA的特定区域互补结合，抑制目的RNA功能、调控相应基因表达的小分子RNA。
反义RNA技术就是采用反义RNA抑制目的基因表达，然后通过表型改变的分析，探讨目的基因的功能及其在疾病发生中的作用的一种研究手段。反义RNA 的作用机理比较复杂，它对基因表达在多水平、多作用点发挥抑制作用。
在反义RNA技术中，针对目的mRNA设计并合成人工反义RNA是其关键环节之一，选择目的mRNA特异靶序列是设计高效、特异反义RNA的第一步。一般认为，在原核细胞中，反义RNA针对目的mRNA的SD序列和AUG区域比针对编码区有更强的抑制作用；而针对编码序列不同区域的反义RNA，其抑制程度的差别比较大。在真核系统中，靶序列的选择较复杂，可根据目的mRNA的特点，选择针对其不同区域的反义RNA。针对mRNA前体5ˊ末端的反义RNA 能阻止加“帽”反应及翻译；针对外显子-内含子交界区域的反义RNA能阻止剪接；针对3ˊ末端的反义RNA能阻止mRNA的加尾作用，并阻止mRNA由胞核内向胞浆转运；针对编码区的反义RNA能直接阻止核糖体与mRNA的结合与
翻译的延伸过程。通过这些反义RNA能抑制目的mRNA的基因表达、翻译成蛋白质。蛋白质合成被阻断后，就会产生相应的表型改变。分析这些表型改变，就能确定被抑制基因在疾病发生中的作用。
3．核酶技术确定基因在疾病中的作用
核酶就是具有生物催化活性的RNA，能按碱基互补原理识别特定核苷酸序列并特异地剪切底物RNA分子。
根据分子大小可以分成大分子核酶和小分子核酶两类。大分子核酶包括第一型内含子(group I intron), 第二型内含子(group II intron)和核糖核酸酶P 的RNA亚基,它们都是由几百到几千个核苷酸组成的结构复杂的大分子。小分子核酶可按结构分为多种,其中包括锤头型 (hammerhead)、发夹型(hairpin)、肝炎病毒D (hepatitis delta virus)和VS核酶(V arkud satellite ribozyme)，其大小多在35～155个核苷酸之间。
由于核酶能识别目的RNA的特定序列并使RNA降解而无法进行转录和翻译, 所以核酶是一种具有催化活性的特殊反义RNA,用核酶抑制基因表达的核酶技术是研究基因的功能及其在疾病发生中作用的一种有效手段。
在核酶技术的应用过程中，一般都采用小分子核酶。由于锤头核酶的结构最为简单,易于人工设计,对其进行的研究也最多；所以应用最广；其次是发夹核酶,因为其催化效率较高,受金属离子和pH值变动的影响也较小。在实际应用过程中，现根据核酶的结构特点和目的RNA的特异序列特征，设计并合成针对目的RNA特异序列核酶的基因，构建表达载体，然后将其导入细胞。核酶基因就会表达产生核酶，通过特异序列识别并降解目的RNA,使其不能翻译成蛋白质，相应基因的表达被抑制。
（四）RNA干扰技术确定基因在疾病中的作用
RNA干扰（RNA interference，RNAi）的概念:是指由双链RNA分子介导的、特异的mRNA降解，导致转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象，广泛存在大肠杆菌、真菌、线虫、果蝇、植物、动物卵和哺乳动物等细胞中，是生物在长期进化过程中形成的抵御外来核酸入侵和抑制转座子诱导基因组DNA突变的重要途径。基因沉默使宿主将外源核酸作为对自身有害的序列而将其降解,阻止外源核酸在宿主细胞内发挥毒性作用。这种降解
作用具有很强的序列特异性，能有效地保持宿主细胞基因组的完整性。
RNAi过程:分为起始和效应两个阶段。
①起始阶段，dsRNA被dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA-specific
endonuclease)Dicer切割为21～25个核苷酸的小分子干扰RNA片段
(small interfering RNAs，siRNA)。
②效应阶段，siRNA与螺旋酶、特定的核酸内切酶等结合在一起形成
RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。该
复合物形成以后，会使RISC中的siRNA变性，双链解开，卸下正
义链，反义链仍保留在RISC上并按碱基互补原则识别目的mRNA
的互补序列，通过反义链与目的mRNA互补序列的结合，将RISC
与目的mRNA结合在一起。这时，RISC中的核酸内切酶就会在与
siRNA中点对应的位置将目的mRNA裂解，使目的mRNA失去指导
蛋白质合成的活性，从翻译水平上阻断相应基因的表达。
RNAi用于研究基因的功能及其在疾病发生中的作用。
先根据目的基因（mRNA）的结构特点，设计siRNA，并将其导入细胞。进入细胞的siRNA就会启动RNAi，目的基因的mRNA被降解，相应基因的表达被阻断并产生相应的表型改变。分析表达阻断前后的表型变化，就能了解目的基因的功能、确定目的基因在疾病发生中的作用。
向细胞内引入siRNA的方法有两种，一种是设计并合成目的mRNA特异的siRNA并将其直接引入细胞，或用一种具有发夹结构的小分子RNA(small hairpin RNA，shRNA)转染到细胞，shRNA在细胞中会自动被加工成为siRNA。另一种是构建特定的siRNA表达载体，通过质粒在体内表达产生siRNA。
（五）基因诱导超表达技术确定基因在疾病中的作用
将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。
七、思考题：
1. 什么是基因突变? 它的形成有何意义?
2. 简述研究疾病相关基因的主要策略。
3. 什么是无义突变、错义突变、移码突变？
八、参考文献：
1. Robert F. Weaver编著. 《Molecular Biology》(第二版). 北京：科学出
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2. Sambrook and Ruussell编著. 《Molecular Cloning》(第三版). 西安：世
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《植物营养分子生物学基础》教学大纲 一、基本信息 课程名称植物营养分子生物学基础 课程编 号 ARGE4208 英文名称 Molecular biology for plant nutrition 课程类 型 专业选修课 总学时36 其中：理论学 时36 实验学 时 实践学 时 学分 2 预修课 程生物化学，植物营养学 适用对 象 农业资源与环境 专业 课程简介（200字左 右） 《植物营养分子生物学基础》课程内容（1）讲解植物分子生物学基本理论和基础知识（2）讲解植物分子生物学领域的基本研究方法和技术，其中包括植物转基因所需的植物组织培养技术（3）介绍植物分子生物学基础知识和基本技能在植物养分吸收利用机理研究的应用，包括其必要性、研究现状以及取得的研究成果。目的是为学生进一步利用分子生物学手段深入研究植物养分吸收利用机理打下坚实基础。 二、教学目标及任务 通过本课程的教学，使学生掌握植物分子生物学的基础知识和基本理论，了解植物分子生物学的基本研究方法与手段，为学生进一步利用分子生物学手段深入研究植物养分吸收利用机理打下坚实基础。 三、学时分配 教学课时分配
章节章节内容讲课实验实践合计绪论一、引言 二、植物分子生物学与植物营养分 子生物学简史 三、植物营养分子生物学基础课程 内容及特点 四、植物营养分子生物学展望 2 2 第一章基础分子生物学知识 第一节植物基因组的特点及多 样性 (2学时) 2 2 第二节 DNA的复制、转录、修复 和重组（6学时） 一、染色体与DNA的结构 二、DNA的复制 三、DNA的重组 四、RNA的转录 五、启动子与转录起始 六、原核生物与真核生物mRNA的 特征比较 七、终止与终止子 八、内含子的剪接、编辑及化学 修饰 6 6 第三节蛋白质的生物合成（4学 时） 一、mRNA及遗传密码---三联子 二、tRNA 三、核糖体 四、蛋白质的合成 五、蛋白质的运转 4 4 第四节基因表达的调控（4学 时） 一、原核基因表达调控 二、真核细胞的基因结构 三、顺式作用元件与基因调控 四、反式作用因子对转录调控 五、其他水平的基因调控 4 4 第二章植物分子生物学研究方法第一节重组DNA技术发展史上的 重大事件 第二节 DNA操作技术 第三节基因克隆的主要载体系统 第四节基因的分离与鉴定 第五节植物组培及转基因技术。 8 8
分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；
（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度 3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大
植物钾离子通道的分子生物学研究进展 闵水珠 (浙江大学生命科学学院，浙江杭州，310029) 摘 要：钾离子通道是植物钾离子吸收的重要途径之一。近年来，已从多种植物或同种植物的不同组织器官 中分离到多种钾离子通道基因，包括内向整流型钾离子通道基因( 如OsAKT1，DKT1，Ktrrl ，KIl l ，KZM1，ZMK2 等) 和外向整流型钾离子通道基因(如CORK ，PTOR K ，STOR K 等) 。文章分别从结构、功能以及相关基因等三 方面综述了关于植物钾离子通道的分子生物学研究进展，并对应用生物工程技术改良植物的钾营养性状进 行了讨论。 关键词：钾离子通道；结构；基因 中图分类号：Q945；Q735 文献标识码：A 文章编号：1 004 —1 524(2005)03—01 63—07 T he progress on the m olecular biology of t h e K channels in plants M G Shui— zhu ( Co／e ge o f Li fe Science ， 慨 Un ive rsity ，Ha．~ hou 310029 ，China ) A bstract ：Tif s review summar i zed recent progresses on molecular biology of K channels in plants ，including structure and their elevant genes in specialty．The latter is d i v i ded into inward-rectifying K channel(K in) genes(OsAKT 1，DKT1， KFrl ，KDC1，KZM1，ZMK2，etc．) and o utward-~ tifyin g K channel(K out) gene s (C O R K ，FIDR K ，STOR K ，etc．) ．The possibilit y of impr o v i n g potassium nutr i tion of pla n t by bioengineerin g is also d i scussed in this paper． K ey words ：K channel；structure ；gene 离子通道(ion channe1) 是跨膜蛋白，每个蛋 白分子能以高达l08个／秒的速度进行离子的被 动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下 进行的运输，不需要加入任何的自由能。一般来 讲，离子通道具有两个显著特征：一是离子通道 是门控的，即离子通道的活性由通道开或关两种 构象所调节，并通过开关应答相应的信号。根据 门控机制，离子通道可分为电压门控、配体门控、
基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释 5’Cap 5’-末端帽：有时简称帽，是在许多真核生物mRNA5`-末端发现的一种由7-甲基-鸟嘌呤核苷-5`-ppp –末端核苷构成的特殊构成的特殊结构。它是在转录后不久经酶催反应加入到TATA （Hogness）序列的附近，具有保护mRNA稳定性的功能。在原核生物的mRNA分子中不存在 5`-末端帽结构。 A protein A蛋白：他参与λDNA插入噬菌体头部和在粘性末端（cos）位点上裂解多联体DNA 的过程。 abortive lysgeny 流产溶原性：温和噬菌体感染敏感的宿主菌后，既不整合进宿主染色体中，也不进行复制，从而使每一个带有噬菌体的宿主菌分裂产生的两个细胞中，只有一个是溶原性的。abortive transduction 流产转导：这是得到不稳定转导子的一类转导，区别于得到稳定转导子的完全转导。在流产转导中，转导子分裂产生两个细胞时，只有其中的一个获得供体基因，另一 个细胞则仍属受体基因型。 Abundance of an mRNA mRNA丰度：是指每个细胞平均拥有的某一种特定mRNA的分子数,跟据丰度的差异可将分为两种不同的等级：其一是富裕型的，每个细胞拥有的平均考贝数为1000——10000，属于此型的mRNA约有100种；其二是稀少型的，每个细胞拥有平均考贝数仅有1——10个上下，属于这一类行的mRNA达10000多种。 Abzymes 抗体酶: 应用单克隆抗体技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。 Acceptor splicing site 受体拼接位点: 间隔子的右端和与其相连的表达子的左端之间的接合点。Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS 获得性免疫缺损综合征: 由人类免疫缺损病毒（HIV）引起的一种疾病，他最早于1980年在美国洛杉叽发现。HIV病毒通过血液和精液在人群中传播，感染了这种病毒之后，会使人体出现严重的免疫抑制和淋巴结病（lymphadenopathy）,并增加对机会病原体（opportunistic pathogen）的敏感性。这种综合征是由于HIV病毒的感染以及cd4类T细胞功能破坏所致。T细胞表面CD抗原CDS4是HIV病毒的受体。HIV病毒的感染使T细胞发生融合形成大的合胞体(syncytia)并最终裂解。AIDS是致命的，目前尚无法有效治 疗也无有效疫苗可用。 activator 活化物：1，在分子生物学中，活化物是一种蛋质，结合在某个基因上游DNA的一个位置上，激活从该基因开始的转录。2，在酶学中，活化物是一种小分子，与酶相结合从 而提高酶的催化活性。 Activator 激活物: 能够通过与结合在启动子上的RNA聚合酶发生相互作用，从而促使RNA聚合酶起动操纵子进行转录反应的一种正调节蛋白质。 Adaptor 接头：即DNA接头，是一类人工合成的非自我互补单链寡核苷酸短片段，当其同街接物(linker)自行退火时，就会形成具有一个平末端和一个粘性末端的双链的接头/衔接物结构。因此，同平端DNA分子连接之后，无需用核酸内切限制酶切割，就会提供符合预先设计要求的 粘性末端。 Adenovirus 腺病毒：一种具双链DNA的动物病毒，大小约为36kb。次种病毒在分子生物学研究中占有突出的位置，许多重要的分子生物学事件，诸如RNA剪辑，DNA复制及转录等，，都是腺病毒研究中发现的。现在腺病毒以被改造用作分离哺乳动物基因的克隆载体。Affinity chromatography 亲和层析：一种根据配体与特异蛋白质结合作用原理建立的层析技 术，该法主要应用于分离与纯化特异的蛋白质。 Agarose 琼脂糖：是从红色海藻的琼脂中提取的一种线性多糖聚合物，可用于配置核酸电泳凝胶。当琼脂糖溶液加热至沸点后冷确凝固，便会形成一种基质，其密度石油琼脂糖浓度决定的。可以被琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段的大小范围为0.2——50kb。经过化学上修饰的低熔点
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【课 题】专题一——基因工程——第 1．3 基因工程的应用第 1。4 蛋白质工程的崛起
【教学目标】1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。 3.认
同基因工程的应用促进生产力的提高。 4.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 5.简述蛋白质
工程的原理。 6.尝试运用逆向思维分析和解决问题。
【教学流程】
一、知识预习：
1、植物基因工程技术主要用于提高农作物的
（如
、
、
、
和
等），以及
和
利用植物生产
等方面。
2、目前防治作物虫害的发展趋势是从某些生物中分离出
，将其导
入
中，使其具有
。用于杀虫的基因主要是
、
、
、
等。
3、引起植物生病的微生物称为
，主要有
、
和
等。抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是
和
；抗真菌转基因植物中可使用的基因有
和
。
4、目前科学家利用一些可以调节
的基因，来提高农作物的抗盐碱和
能力；将鱼的
导入烟草和番茄，提高其耐寒能力；将
导入
作物，使作物抗除草剂。
5、利用转基因技术可以提高生物中的
的含量、延长贮存时间、改变花色等，
从而提高作物品质。
6、动物基因工程可用于
，
，
，
。
7、基因工程药物包括
、
、
、
、
等。
8、治疗遗传病的最有效手段是
，这种方法是把
导入病人体
内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到
的目的，可分为
和
两条途径。
9、基因工程的实质是将一种生物的
转移到另一种生物体内，使后者产生本不能
产生的
，进而表现出
。其缺点是在原则上只能生产
，而天然蛋白质的
符合
的需要，
却不一定完全符合
的需要。
10、蛋白质工程是指以蛋白质分子的
及其与
的关系作为基
础，通过
或
，对
进行改造，或制造
，以满足
的需求。
11、蛋白质工程的途径是：预测蛋白质功能→设计预期的
→推测应有的
→找到相对应的
。
12、蛋白质工程具有
的前景，但
。
-1
中科院研究生院硕士研究生入学考试 《生物化学与分子生物学》考试大纲 一、考试内容 1.蛋白质化学 考试内容 ●蛋白质的化学组成，20种氨基酸的简写符号 ●氨基酸的理化性质及化学反应 ●蛋白质分子的结构（一级、二级、高级结构的概念及形式） ●蛋白质一级结构测定的一般步骤 ●蛋白质的理化性质及分离纯化和纯度鉴定的方法 ●蛋白质的变性作用 ●蛋白质结构与功能的关系 考试要求 ●了解氨基酸、肽的分类 ●掌握氨基酸与蛋白质的物理性质和化学性质 ●了解蛋白质一级结构的测定方法（目前关于蛋白质一级结构测定的新方法和新思路很多，而教科书和教学中 涉及的可能不够广泛，建议只让学生了解即可） ●理解氨基酸的通式与结构 ●理解蛋白质二级和三级结构的类型及特点，四级结构的概念及亚基 ●掌握肽键的特点 ●掌握蛋白质的变性作用 ●掌握蛋白质结构与功能的关系 2.核酸化学 考试内容 ●核酸的基本化学组成及分类 ●核苷酸的结构 ●DNA和RNA一级结构的概念和二级结构要特点；DNA的三级结构 ●RNA的分类及各类RNA的生物学功能 ●核酸的主要理化特性 ●核酸的研究方法 考试要求 ●全面了解核酸的组成、结构、结构单位以及掌握核酸的性质 ●全面了解核苷酸组成、结构、结构单位以及掌握核苷酸的性质 ●掌握DNA的二级结构模型和核酸杂交技术 ●了解microRNA的序列和结构特点（近年来针对非编码RNA的研究越来越深入，建议增加相关考核） 3. 糖类结构与功能 考试内容 ●糖的主要分类及其各自的代表 ●糖聚合物及其代表和它们的生物学功能 ●糖链和糖蛋白的生物活性 考试要求 ●掌握糖的概念及其分类 ●掌握糖类的元素组成、化学本质及生物学功用 ●理解旋光异构 ●掌握单糖、二糖、寡糖和多糖的结构和性质 ●掌握糖的鉴定原理 4. 脂质与生物膜 考试内容
一、植物组织培养：狭义指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。广义：无菌操作分离植物体一部分(即外植体)接种到培养基，在人工条件下培养直至生成完整植株。生物技术中的一个基本技术。 MS：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其营养丰富，养分的数量和比例合适，不需要添加更多的有机附加物，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 愈伤组织愈伤组织callus在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 cDNA文库：包含细胞全部的mRNA信息的反转录所得到的cDNA的集合体。 胚状体：是指植物在离体培养条件下，非合子细胞经过胚胎发生和发育的过程形成的胚状结构，又称体细胞胚。 体细胞杂交：体细胞杂交又称体细胞融合，指将两个GT不同的体细胞融合成一个体细胞的过程。融合形成的杂种细胞，兼有两个细胞的染色体。 分子标记：是指在分子水平上DNA序列的差异所能够明确显示遗传多态性的一类遗传标记。 基因工程原称遗传工程，亦称重组DNA技术，是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导人受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 细胞培养指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。过程：①取材和除菌；②培养基的配制；③接种与培养。 生物反应器是适用于林木细胞规模化培养的装置。 生物技术biotechmlogy：也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。 外植体explant：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞的全能性：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。 再分化：脱分化的分生细胞（愈伤组织）在一定的条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株的过程。 器官发生organogenesis：亦称器官形成，一般指脊椎动物个体发育中，由器官原基进而演变为器官的过程。各种器官形成的时间有早有晚，通过器官发生阶段，各种器官经过形态发生和组织分化，逐渐获得了特定的形态并执行一定的生理功能 体细胞胚胎发生：单细胞或一群细胞被诱导，不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的过程。 PCR：聚合酶链式反应是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。Recombinant DNA重组DNA：是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导人受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。 悬浮培养：悬浮培养是细胞培养的基本方法，不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个
一、名词解释 1、分子生物学 2、基因工程 3、DNA的变性与复性 4、细胞学说 5、遗传密码的简并性 6、DNA半保留复制、半不连续复制 7、SD序列 8、开放阅读框（ORF） 9、多顺反子 10、蓝白斑筛选 11、中心法则 12、限制修饰系统 13、断裂基因 14、单链结合蛋白 15、核酶 16、密码子家族 17、TA克隆 18、PCR 19、SNP 20、操纵子学说 21、DNA重组技术 22、减色效应-增色效应 23、可变剪接 24、反转录 25、同尾酶 26、加帽反应 27、蓝白斑筛选 28、表观基因组学 29、DNA的溶解温度 30、DNA的大C值 31、重叠基因 32、引物酶 33、逆转录 34、限制性内切酶 35、载体的选择标记 36、DNA甲基化
37、端粒 38、端粒酶 39、前导链 40、启动子 41、反式作用因子 42、同义密码子 43、多克隆位点（MCS） 44、基因组计划 45、C值悖论 46、顺式作用元件 47、胸腺嘧啶二聚体 48、寄主的限制修饰现象 49、拓扑异构酶 50、DNA的溶解 51、拓扑异构体 52、间隔基因 53、假基因 54、同源异型蛋白 55、翻译 56、多重PCR 57、抗终止作用 58、SD序列 59、空载tRNA 60、cDNA RACE 61、分子杂交 62、cDNA文库 63、载体 64、RT-PCR 65、反义RNA 66、延伸tRNA 67、起始tRNA 68、探针 69、反式剪接 70、增强子 71、动物基因工程 72、基因组 73、限制性内切酶 74、单顺反子
75、密码子 76、转录 77、RNA干扰 78、中心法则 79、回环模型 80、TATA box 81、前导链 82、目的基因 83、RFLP 84、RACE 二、判断 1、大肠杆菌DNA生物合成中，DNA聚合酶I主要起聚合作用。( ) 2、DNA半保留复制时，后随链的总体延伸方向与先导链的延伸方向相反。( ) 3、原核生物DNA的合成是单点起始，真核生物为多点起始。（） 4、以一条亲代DNA(3’→ 5’)为模板时，子代链合成方向5’→ 3’，以另一条亲代DNA链 5’→ 3’为模板时，子代链合成方向3’→ 5’。（） 5、RNA的生物合成不需要引物。（） 6、大肠杆菌RNA聚合酶全酶由4个亚基（α2ββ’）组成。( ) 7、大肠杆菌在多种碳源同时存在的条件下，优先利用乳糖。 ( ) 8、在DNA生物合成中，半保留复制与半不连续复制指相同概念。（） 9、逆转录同转录类似，二者均不需要引物。（） 10、真核生物染色体核心组蛋白的乙酰化、组蛋白H1的磷酸化，都会使基因得以失活。（） 11、在原核细胞中，起始密码子AUG可以在mRNA上的任何位置，但一个mRNA上只有一个起 始位点。( ) 12、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别mRNA上的密码子。( ) 13、表观遗传效应是不可遗传的。( ) 14、cAMP与CAP结合、CAP介导正性调节发生在有葡萄糖及cAMP较高时。( ) 15、DNA甲基化永久关闭了某些基因的活性，这些基因在去甲基化后，仍不能表达。 （） 16、RNA聚合酶催化的反应无需引物，也无校对功能。( ) 17、基因是存在于所有生命体中的最小遗传单位 18、人类基因组中大部分DNA不编码蛋白质 19、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别 mRNA上的密码子。 ( )
机体是如何维持血糖平衡的（说明血糖的来源、去路及调节过程）？ 血液中的葡萄糖称为血糖，机体血糖平衡是糖、脂肪、氨基酸代谢协调的结果，也是肝、肌、脂肪组织等器官代谢协调的结果（由于血糖的来源与去路保持动态平衡，血糖是组织、中枢神经、脑能量来源的主要保证）。 A.血糖来源（3分） 糖类消化吸收：食物中的糖类经消化吸收入血，这是血糖最主要的来源；肝糖原分解：短期饥饿后，肝中储存的糖原分解成葡萄糖进入血液；糖异生作用：在较长时间饥饿后，氨基酸、甘油等非糖物质在肝内异生合成葡萄糖；其他单糖转化成葡萄糖。 B.血糖去路（4分） 氧化供能：葡萄糖在组织细胞中通过有氧氧化和无氧酵解产生ATP，为细胞供给能量，此为血糖的主要去路。合成糖原：进食后，肝和肌肉等组织将葡萄糖合成糖原以储存。转化成非糖物质：可转化为甘油、脂肪酸以合成脂肪；可转化为氨基酸、合成蛋白质。转变成其他糖或糖衍生物（戊糖磷酸途径），如核糖、脱氧核糖、氨基多糖等。血糖浓度高于肾阈时可随尿排出一部分。 C.血糖的调节（2分） 胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，但胰岛素分泌受机体血糖的控制（机体血糖升高胰岛素分泌减少）。胰岛素分泌增加，糖原合酶活性提高、糖原磷酸化酶活性降低，糖原分解降低、糖原合成提高，血糖降低。否则相反（胰岛素分泌减少，糖原合酶活性降低、糖原磷酸化酶活性提高，糖原分解提高、糖原合成降低，血糖提高）。胰高血糖素、肾上腺素作用是升高机体血糖。胰高血糖素、肾上腺素分泌增加，糖原合酶活性降低、糖原磷酸化酶活性提高，糖原分解提高、糖原合成降低，血糖提高。否则相反。 老师，丙酮酸被还原为乳酸后，乳酸的去路是什么 这个问题很重要。 肌组织产生的乳酸的去向包括：大量乳酸透过肌细胞膜进入血液，在肝脏进行糖异生转变为葡萄糖。大量乳酸进入血液，在心肌中经LDH1催化生成丙酮酸氧化供能；部分乳酸在肌肉内脱氢生成丙酮酸而进入到有氧氧化供能。大量乳酸透过肌细胞膜进入血液，在肾脏异生为糖或经尿排出体外。 下面问题你能回答出来不 1说明脂肪氧化供能的过程 （1）脂肪动员：脂肪组织中的甘油三酯在HSL的作用下水解释放脂酸和甘油。 （2）脂酸氧化：经脂肪酸活化、脂酰CoA进入线粒体、β-氧化、乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化成H2O 和CO2并释放能量。 （3）甘油氧化：经磷酸化、脱氢、异构转变成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛循糖氧化分解途径彻底分解生成H2O 和CO2并释放能量。 1．丙氨酸异生形成葡萄糖的过程 答：（1）丙氨酸经GPT催化生成丙酮酸。（2）丙酮酸在线粒体内经丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，后者经苹果酸脱氢酶催化生成苹果酸出线粒体，在胞液中经苹果酸脱氢酶催化生成草酰乙酸，后者在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸。（3）磷酸烯醇式丙酮酸循糖酵解途径至1，6-双磷酸果糖。1，6-双磷酸果糖经果糖双磷酸酶催化生成6-磷酸果糖，再异构成6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖在葡萄糖-6-磷酸酶作用下生成葡萄糖。
分子生物学与基因工程原理复习资料 一、名词解释 1. 分子生物学:是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。 2. 染色体：是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。 3. DNA 多态性：是指DNA 序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包 括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism , SNP)和串联重复序列多态性 ( tandem repeats polymorphism )两类。 4. DNA 的半保留复制：DNA 复制过程中，由亲代DNA 生成子代DNA 时，每个新形成的子代DNA 中，一条链来自亲代DNA ，另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 5. 冈崎片段：在DNA 复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成5 3 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。 6.SNP：single nucleotide polymorphism ，单核苷酸多样性，是基因组DNA 序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。 7. “基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核甘酸序列。 8. 获得性遗传：是有机体在生长发育过程中由于环境的影响而不是基因突变所形成的新的遗传性状。 9. DNA 甲基化：是基因的表观修饰方式之一，指生物体在(DNA methyltransferase ，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。 10. CDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，体外合成cDNA，与适当的载体 (常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖 扩增。这样包含着细胞全部mRNA 信息的cDNA 克隆集合称为该组织细胞cDNA 文库。11. 基因组：是指一个细胞或者生物体所携带的全部遗传信息。生物个体的所有细胞的基因组是固定的。 12. 蛋白质组学：指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 13. 转录组：广义上指某一生理条件或环境下，一个细胞、组织或生物体内所有转录产 物的总和，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA ;狭义上指细胞中转录出来的所有mRNA 的总和。 14. 基因定点突变技术：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列的一
“生物化学与分子生物学” 题库 第二军医大学基础医学部 生物化学与分子生物学教研室编制 2004年7月
第一篇生物大分子的结构与功能 第一章蛋白质的结构与功能 一、单项选择题（A型题） 1.蛋白质的一级结构是指下面的哪一种情况？( ) A、氨基酸种类的数量 B、分子中的各种化学键 C、氨基酸残基的排列顺序 D、多肽链的形态和大小 E、氨基酸的连接方式 2.关于蛋白质分子三级结构的描述，其中错误的是:( ) A、天然蛋白质分子均有这种结构 B、具有三级结构的多肽链都有生物学活性 C、三级结构的稳定性主要是次级键维系 D、亲水基团多聚集在三级结构的表面 E、骨架链原子的空间排布 3、学习“蛋白质结构与功能”的理论后，我们认识到错误概念是（）。 A、蛋白质变性是肽键断裂所致 B、蛋白质的一级结构决定其空间结构 C、肽键的键长较单键短，但较双键长 D、四级结构蛋白质必定由二条或二条以上多肽链组成 E、蛋白质活性不仅取决于其一级结构，还依赖于高级结构的正确 4、通过“蛋白质、核酸的结构与功能”的学习，认为错误的概念是（）。 A、氢键是维系多肽链β-折叠的主要化学键 B、DNA分子的二级结构是双螺旋，维系其稳定的重要因素是碱基堆积力 C、蛋白质变性后可以恢复，但DNA变性后则不能恢复 D、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三者组成GSH E、蛋白质亚基具有三级结构，而tRNA三级结构呈倒L形 5、“蛋白质分子结构与功能”一章学习，告之我们以下概念不对的是（）。 A、氢键不仅是维系β-折叠的作用力，也是稳定β-转角结构的化学键 B、活性蛋白质均具有四级结构 C、α-螺旋的每一圈包含3.6个氨基酸残基 D、亚基独立存在时，不呈现生物学活性的 E、肽键是不可以自由旋转的 6、关于蛋白质分子中α-螺旋的下列描述，哪一项是错误的？（） A、蛋白质的一种二级结构 B、呈右手螺旋
基因工程与分子生物学重点 1．限制性核酸内切酶：凡是识别切割双链的DNA分子内特定核苷酸序列的酶称为限制性核酸内切酶，简称为限制性酶。 2．限制性核酸内切酶的一般性质：37℃，pH为7.2~7.6，用Tris—HCl，Gly—NaOH两种缓冲液，Mg2+Buffer，5mM，盐浓度，巯基试剂：β-ME，DTT，BSA（牛血清白蛋白，稳定酶的作用）；决定生产的特定的DNA片段的大小，识别顺序具有180°的旋转对称，识别顺序一般是4~6个碱基，也有6个以上的，但是没有4个以下的，产生三种不同的切口:形成平头末端（SmalⅠ）：连接困难，效率较低；形成5’粘性末端（EcoRⅠ）：相对而言，5’突出尾，3’凹末端；形成3’粘性末端（PstⅠ）相对而言，3’突出尾，5’凹末端。 3．星活性：在非标准条件下（低盐和高pH，高甘油浓度>5%），限制酶识别顺序与切割顺序发生改变的现象。 4．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：将Pol1切下一个小片段失去5’到3’外切酶活性。补平限制酶切割DNA产生3’凹槽（5’到3’合成），用[32p]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记，对带3’突出端的DNA进行末端标记（利用置换活性），在cDNA 克隆中，用对和陈那个cDNA的第二条链，在体外诱变中用于从单链模版合成双链DNA，应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序，消化限制酶产生的3’突出端，应用于PCR 技术。 5．基因工程的工具酶：T7噬菌体DNA聚合酶，修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，TaqDNA 聚合酶（没有校正功能），大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段，T4噬菌体DNA聚合酶。 6．末端转移酶：将相同的核苷酸依次连接到3’末端，然后两条DNA通过同源多聚尾巴连接在一起，在表达前将ploy(G)切除，否则影响蛋白质的生物活性。 7．T4噬菌体多核苷酸激酶：使DNA的5’端磷酸化，也可以使DNA的5’端去磷酸化。可以发生正向反应，也可发生交换反应。正向反应：5’CTGCAG在酶和ATP（ATP具有α，β，γ磷酸基团，其中γ可给出）的作用下，生成5’pCTGCAG；交换反应：5’pCTGACG在酶和ADP的共同作用下，去磷酸化，将DNA链上的磷酸基团给出，生成5’CTGCAG和ATP，在酶和被标记的A TP作用下使得DNA再次被磷酸化同时被标记，生成ADP和5’*pCTGCAG。 8．基因工程载体种类：质粒，噬菌体的衍生物，科斯质粒或粘粒，噬菌体质粒，单链DNA 噬菌体M13，真核病毒载体，酵母质粒载体，杆状病毒。 9．质粒：在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制，并且在细胞分裂时能恒定传递给子代细胞的独立遗传因子。 10．质粒作为基因工程载体所必备的条件：1）具有较小的分子量和松弛的复制子，2）基因组上有1~2个筛选标记，便于在平板中区分重组体和非重组体，3）DNA链上有1到几个限制酶的单一识别与切割位点，便于外源DNA的插入，4）具有插入失活（或是插入表达）的筛选标记，便于从平板中直接筛选阳性重组体。 11．Ti质粒：引起植物形成肿瘤—冠瘿瘤的质粒称为诱导肿瘤的质粒。 12．Ti质粒的优点：宿主范围广泛，Ti质粒能过转化所有的双子叶植物，并将外源基因导入植物细胞；整合到宿主细胞ch—DNA上的T—DNA成了染色体的正常遗传成分，永远居留，代代相传；T—DNA上的Opine合成酶基因有一个强大的启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达。 13．分子杂交（杂交，hybrdization）：核酸研究中一项最基本的实验技术，它是指在一定条件下互补核酸链复性形成双链的过程。 14．分子杂交的原理：(一)DNA的变性：指分子有稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结
“基因工程与蛋白质工程”知识归纳及试题例析 一、知识归纳 1．与DNA分子相关的酶 名称作用参与的生理过程应用限制性核酸内切 酶 切割某种特定的脱氧核苷酸序列基因工程DNA连接酶连接两个DNA片段基因工程 DNA聚合酶在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧 酸 DNA复制 RNA聚合酶在核苷酸链上添加单个核糖核苷 酸 转录 解旋酶使碱基间氢键断裂DNA复制及转录 逆转录酶以RNA为模板合成DNA逆转录及基因工程 特别注意： （1）限制性核酸内切酶的来源：多数来自原核生物；作用特点：主要切割外源DNA，对自身的DNA不起作用从而达到保护自身的目的；作用结果：形成DNA片断末端。 （2）各种酶都具有专一性，特别是限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开。 2．基因工程的基本操作程序 （1）获取目的基因 ①基因文库：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过 克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ②基因组文库：基因文库中含有一种生物所有的基因就叫做基因组文库。 ③部分基因文库：含有一种生物的部分基因，就叫做部分基因文库，如cDNA文库。 PCR技术与DNA复制的比较 比较项目PCR技术DNA复制 相 同 点 原理DNA双链复制（（碱基互补配对） 原料四种游离的脱氧核苷酸 条件模板、ATP、酶等 不 同 解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化 场所体外复制主要在细胞核内
点 酶 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶） 细胞内含有的DNA聚合酶结果 在短时间内形成大量的DNA 片段 形成整个DNA分子 （2）基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目 的基因能够表达和发挥作用。 ②一个基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。 ③构建方法 生物 种类 植物细胞动物细胞微生物细胞常用 方法 农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体 细胞 体细胞受精卵原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒 的TDNA上→农杆菌→导 入植物细胞→整合到受体细 胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达 载体提纯→取卵（受精卵） →显微注射→受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态 细胞→重组表达载体与感受 态细胞混合→感受态细胞吸 收DNA分子特别注意：受体细胞中常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物──大肠杆菌、酵母菌等，但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必 需用真核生物酵母菌──需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体，原因是它营 寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟红细胞，原因是它无细胞核和众多的细胞器，不能合成 蛋白质。
分子生物学与基因工程 绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA 的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由上个世纪50 年 代，Watson 和Crick 提出了的DNA 双螺旋模型； 60 年代，法国科学家Jacob 和Monod 提出了的乳糖操纵子模型； 70 年代，Berg 首先发现了DNA 连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA 分子； 80 年代，Mullis 发明了聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction , PCR)技术； 90 年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代” 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用。 核酸概述 1、核酸的化学组成 2、核酸的种类与特点：DNA 和RNA 的区别 1) DNA 含的糖分子是脱氧核糖，RNA 含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）, RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代
替； （3）DNA 通常是双链，而RNA 主要为单链； （4）DNA 的分子链一般较长，而RNA 分子链较短。 3、DNA 作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA 含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA 含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA 含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA 在代谢上较稳定。 （3）DNA 是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。 （4）DNA 通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA 。 （5）在各类生物中能引起DNA 结构改变的化学物质都可引起基因突变。直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA 的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100OC）时，它就失去生理活性。这时DNA 双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。 简而言之，就是DNA 从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA 的变性过程中，它在260 nm 的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA 如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复
分子生物学与基因工程试题库（19） 一、选择题（单选或多选）（每题2分，共计20分） 1.核糖体肽链的合成因( )终止 (a)可读框内编码C末端氨基酸的密码子 (b)可读框内存在不对应氨酰tRNA的密码子 (c)浓度太低或缺少特定的氨酰tRNA (d)释放因子(RF)的GTP依赖性作用，防止A位点中终止密码子与氨酰tRNA的错配结合 (e)末端氨酰转移酶的活性，这个酶蛋白通过将一个赖氨酸或精氨酸残基加到新生多肽 C 末端将肽酰tRNA脱乙酰化 2. 因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( ) (a)J．Lederberg (b)W.Arber (c)H．Smith (d)F.Sanger 3. EDTA是一种螯合剂，可以抑制大多数酶的活性，但在下列酶中，( )不受它的 影响 (a)外切酶Ⅲ (b)EcoRI (c)Bal31核酸酶 (d)Pstl 4. 关于质粒的相容性，下面哪一种说法不正确? ( ) (a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞 (b)质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群 (c)如果a、b两种质粒不相容，说明它们的复制机制相同 (d)属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，而且拷贝数和分子量也相同 5. 用SDS-酚来抽提DNA时，SDS的浓度是十分重要的，当SDS的浓度为0．1％时，( ) (a)只能将DNA抽提到水相 (b)只能将RNA抽提到水相 (c)可将DNA、RNA一起抽提到水相 (d)DNA和RNA都不能进入水相 6. 在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型 (a)r+m+rec’ (b)r-m-rec- (C)r-m-rec+ (d)r+m+rec- 7. 微细胞是一种大肠杆菌突变体，( ) (a)它不带任何DNA (b)它的体积为正常细胞的1／10 (c)它带有染色体DNA，但不能表达 (d)它带有质粒DNA，可以表达 8. DNA在中期染色体中压缩多少倍?( ) (a)6倍 (b)10倍 (c)40倍 (d)240倍 (e)1000倍 10000倍 9. 在原核生物复制子中以下哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核苷酸?( ) (a)DNA聚合酶Ⅲ (b)DNA聚合酶Ⅱ (c)DNA聚合酶I (d)外切核酸酶MFl (e)DNA连接酶