干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响
摘要：温度、盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害，导致作物产量降低，品质下降。以小麦幼苗为试验材料，研究了干旱胁迫对其幼苗生理生化指标的影响。试验结果表明：在干旱胁迫下除发芽率下降外，小麦幼苗的脯氨酸、MDA/过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD）、GSH的含量都较正常情况下小麦幼苗的含量多。
关键词：干旱胁迫小麦幼苗生理生化指标
Physiological and biochemical characteristics of drought stress on wheat seedlings Abstract:Adversity, such as temperature, salt and drought stress can cause serious harm to growth and development of higher plants, reduce crop yield and quality decline. Wheat seedlings as experimental material to study the physiological and biochemical characteristics of drought stress on the seedling. Experimental results show that except the germination percentage decreased under drought stress, wheat seedling proline, MDA/hydrogen peroxide, antioxidant enzyme (PPO, POD), content of GSH is normally more than the content of wheat seedlings.
Key words: drought stress, wheat seedling, the standard of physiological and biochemica1.
引言：干旱、盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素, 其中干旱造成的损失最大, 其损失超过其他逆境造成损失的总和。[1]干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一, 干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程, 涉及到许多生物大分子和小分子。[2]研究表明，游离的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫过程中扮演着越来越重要的角色，许多新的生理功能也逐渐被发现，近几年来有关脯氨酸的研究倍受科学工作者的关注。干旱是一种最常见的胁迫，遇此逆境作物除进行气孔调节外，渗透词节也不夹为一种有效方法。原理是通过加强合成代谢，增加细胞内渗透物质浓度，降低渗透势，维持膨压和细胞正常生理功能。脯氨酸作为水溶性最大的氮基酸(162．3g·(100g)。
H 2O，25 o C)具有较强水合能力，是理想的渗透介质。作物遇旱时它的大量积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干早环境的一种保护性适应。已经证明了在逆境条件下脯氨酸的积累来抵抗植物对非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O2-、H2O2、OH-等直接或间接地清除，防止了活性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛（MDA）是由于
植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH 作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。前人研究进展植物在正常生长情况下, 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当植物在逆境条件下( 如干旱胁迫) 生长时, 这种平衡被打破, 体内负责清除活性氧的抗氧化系统能力下降, 从而造成活性氧的大量积累, 并引发或加剧膜脂过氧化作用, 导致生物膜系统受损。过氧化物酶( POD) 、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物GSH(谷胱甘肽)等能够有效地清除这些自由基, 是酶促防御系统的重要组成成分。人们根据这一理论对干旱胁迫下的许多作物如小麦[3 4]、大豆[6]、辣椒[7]、胡杨【7】等逆境生理过程进行了研究。本实验切入点与其它作物相比, 小麦在干旱胁迫下具有独特的生存策略, 是一种公认抗逆性较强的作物, 利用干旱胁迫处理小麦幼苗, 测定其丙二醛( MDA) 含量、GSH含量、脯氨酸含量、H2O2含量及PPO、POD 活性变化, 探讨干旱胁迫对小麦幼苗膜脂过氧化及酶保护系统的影响, 为进一步明确大麦抗旱的生理机理提供一定理论依据。
1材料与方法
1.1材料及处理
将进行过干旱处理和正常生长的小麦幼苗分别作为实验组和对照组进行脯氨酸、MDA、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD）谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（ASA）的含量的测定。
1.2测定方法
1.2.1小麦种子发芽率的测定
各取50粒吸胀的小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴 20 min）另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min）根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。
1.2.2小麦幼苗脯氨酸含量的测定
分别取0.1 g实验组和对照组的小麦幼苗→加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。
测定：上清液各2 mL →分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂→煮沸15 min→冷却后→5000 rpm离心10 min →分别测定A520,
将测得的结果用公式
Pro content =计算出正常和干旱生长小麦的胚芽鞘的脯氨酸含量。
?MDH含量的测定
提取：分别取0.1 g实验组和对照组小麦幼苗→加入3 m L 0.1%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2 mL0.1%TCA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。
测定：分别取上清液各1 mL →加入0.6%TBA（用0.6% TCA 配制） 2 mL→煮沸12 min→冷却后→5000 rpm离心10 min →分别测定OD450和OD532
将测得的D450和OD450的数据带入下列公式
OD450=C1x 85.4 OD450 =C2X15000计算出C1可溶性糖的浓度，C2MDA的浓度。
1.2.4 H2O2测定
分别取0.1 g实验组和对照组→加入3 mL0.3% TCA和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 0.3%TCA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。
测定：分别取上清液各 4 mL →加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制]0. 2 mL→摇匀→OD410将测得的OD410值带入下列公式
H2O2 content = （ mmol.g-1FW）计算出H2O2酶的含量。
1.2.5抗氧化酶的测定
分别取0.1 g实验材料→加入少许石英砂和 3 ml提取液
（50mmol/L PBS, pH5.8,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP）→充分研磨→转入离心管中→用2 ml提取液洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 ml →用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。
POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液100 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A470。
PPO测定：取PPO反应混合液（20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410。
将测得的A470和A410数据带入公式
POD activities=（umol.g-1FW）
PPO activies=(U.g-1FW)
计算出PPO和POD的值
1.2.6 GSH的测定
分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。
测定：上清液各1 mL →分别加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7) →0.5 mL 4 mM DTNB (用0.1M pH6.8PBS现配，空白用此PBS代替) → 25 ℃5 min→测定A412
将测得的A412值带入公式
GSH content= (umol.g-1FW)将GSH的值计算出来
1.2.7抗坏血酸（ ASA）的测定
ASA的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →量上清液体积。
测定：上清液各0.8 mL (空白用5% TCA代替) →分别加入0.8 mL 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸馏水→摇匀→分别加入 0.8 mL 5% TCA、44%磷酸和4%联吡啶→摇匀→加入3%FeCl3 0.8 mL → 37 ℃ 15 min →测定A525
将测得的A412值带入公式
ASA content= (umol.g-1FW)将ASA的值计算出来
2.结果与分析
2.1小麦种子发芽率的测定结果与分析
TTC法结果：48粒具有生命活力。曙红染色法结果：47粒具有生命活力。分别计算两种方法的发芽率：TTC法中，48／
50=96%；曙红染色法中，48／50=96%。
分析：用两种方法测得的种子发芽率是一样的，都为96%，证明这一批种子的生命活力较高。
2.2小麦幼苗脯氨酸含量的测定结果与分析
结果：实验组：A520=2.904A对照组：A520=0.263A，
计算公式：Pro content=(mol.g-1FW)
其中，V显=6ml，V总=5ml，V用=2ml，520=3.24mol-1.cm-
1,L=1cm,W=0.1g.
计算结果：计算结果：实验组脯氨酸含量为134.444 mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为12.176 mol. F g-1W.。如图表一所示：
图表一：脯氨酸含量的测定
分析：可以看出实验组的脯氨酸含量比对照组大很多，增加了有三十六倍左右。BikashC等在对茄子的土壤干旱研究中发现，在干旱条件下，茄子叶片中的脯氨酸合成速度及质量分数明显增加，最高值达到51．6×10-3，比最初值0．45×10-3高出115倍【14】，说明在干旱条件下的植物脯氨酸含量明显增多，结果表明脯氨酸积累是植物为了对抗干旱胁迫而采取的一种保护性措施。
2.3 MDA含量的测定结果与分析
结果：C1实验组为3.185mmol/L 对照组为1.674mmol/L
C2实验组为0.711mmol/L 对照组为0.416 mmol/L
如图表二和三所示：
图表二：MDA含量的测定
图表三：MDA含量的测定
分析：干早胁迫下植物的自由基伤害学说己被支持，自由基进行细胞膜脂过氧化伤害的最终产物之一是丙二醛(MDA)，至今，MDA的含量仍作为反映细胞膜脂过氧化伤害水平的重要指标。由表格可以看出干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘内所含的MDA量比正常生长的小麦所含量高。这一结果与山东农业大学研究生吴耀领再做抗旱性与丰产型小麦对干旱胁迫的响应所得到得结果一致。
2.4 H2O2测定2.5抗氧化酶的测定结果与分析
结果：实验组为194.303mmol.g-1FW对照组为109.056 mmol.g-1FW。如图表四所示：
图表四：过氧化氢含量的测定
分析：植物组织体内积累的H2O2是由一些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶SOD,其它如肌酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醇氧化酶）催化超氧阴离子发生氧化还原反应而形成。实验测得的数据干旱情况下的含量为254.56umol .g-1FW,正常情况下的为49.38 umol .g-1FW，可以看出来干旱胁迫下的量比正常情况下的多，并且干旱下的含量是正常生长的5倍，这一结果与高方胜所作的土壤水分对番茄植物体内过氧化氢酶含量的含量变化相符，在干旱胁迫下植物体内的氧化酶含量升高相一致。
.2.5抗氧化酶的测定结果与分析
结果：POD活性：实验组为69.169 U.g-1FW，对照组为44.068 U.g-1FW.
PPO活性：实验组为7.168×10-4 mmol.g-1FWmin-1，对照组为3.828×10-4 mmol.g-1FWmin-1。如图表五和六所示：
图表五：POD活性的测定
图表六：POP活性的测定
分析：过氧化酶广泛存在于植物体中在存在条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生产茶褐色物质，在分光光度计测定到470nm处的茶褐色物质的生成量，如下表所示：检测到POD含量1.09u.g-1FW比对照组的含量0.63u.g-1FW高。而用PPO反应
混合液邻苯二酚，PBS溶解、酶液测到得ppo含量实验组94.77umol.g-1FWmin-1,对照63.46 umol.g-1FWmin-1,明显的比对照组的升高了。干旱胁迫使过氧化酶含量升高。
2.6 谷胱甘肽（GSH）的测定结果与分析
结果：实验组为128.12 mol.g-1FW对照组为11.61mol.g-1FW。如图表七所示：
图表七：GSH含量的测定
分析：通过测得的结果实验组GSH含量 3.99mmol.g-1FW,对照组含量 1.65mmol.g-1FW，实验组和对照组的含量存在差异，实验组GSH含量远比对照组的高。说明干旱胁迫使GSH含量升高。结合我们的实验数据，说明过氧化物GSH(谷胱甘肽)等能够有效地清除干旱条件下产生的氧自由基, 是酶促防御系统的重要组成成分，能够有效地抵御干旱。
2.7抗坏血酸（ ASA）的测定结果与分析
结果：实验组为0.919mol.g-1FW对照组为0.687mol.g-1FW。如下图：
分析：实验组的含量比对照组的高，说明干旱会使植物体内的ASA增加，但是相对于其它生理指标它的影响比较小。
3 结论与讨论
在干旱胁迫下, 小麦幼苗生长受到一定抑制作用,生理生化
指标发生一系列变化, 表现为干旱胁迫下,小麦幼苗胚芽鞘中脯
氨酸、丙二醛(MDA) 、H2O2、过氧化酶（POD、PPO）、谷胱甘
肽（GSH）含量在干旱胁迫下含量较正常情况下的明显升高。
本试验表明:在正常条件下, 小麦胚芽鞘具有较低的脯氨酸、丙
二醛(MDA) 、H2O2、过氧化酶（POD、PPO）、谷胱甘肽（GSH）
相对含量。
MDA 是反映细胞膜脂过氧化水平的重要指标, 膜脂过氧化作
用愈强, MDA 含量愈高, 膜被伤害程度愈重。本试验表明:在干
旱胁迫下,小麦幼苗胚芽鞘MDA 含量在胁迫程度时上升, 这说明干旱胁迫下金光杏梅叶片膜脂过氧化作用加强, 膜系统
受到破坏, 膜透性增加, 这与前人研究结果相一致[8 9] 。脯氨酸
是植物体内两种重要的渗透调节物质。当受到干旱胁迫时, 植
物体内常积累大量脯氨酸, 使植物保持一定的含水量和膨压, 以
维持细胞正常的功能[10] 。本试验结果表明, 在水分胁迫下, 小
麦胚芽鞘脯氨酸呈上升趋势。POP和POD 均为植物内源自由
基清除剂, 属保护酶系统[11] 。在逆境中保护酶活性增强或维
持较高的水平, 能够清除活性氧自由基使之保持较低的水平, 维
持细胞膜的稳定性和完整性。本试验结果表明,在水分胁迫时,
胚芽鞘PPO 和 POD 活性逐渐增强。这说明在干旱胁迫下, 小麦
胚芽鞘通过增强 PPO 和 POD 活性来抵御干旱逆境对其所造成的
伤害, 从而使小麦胚芽鞘可能获得较高的抗旱性。H2O2是由一
些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶SOD,其它如肌酸氧化酶、葡
萄糖氧化酶、乙二醇氧化酶）催化超氧阴离子发生氧化还原反应而形成。本试验结果表明, 干旱胁迫下H2O2含量升高，这一结果与高方胜所作的土壤水分对番茄植物体内过氧化氢酶含量的含量变化相符，在干旱胁迫下植物体内的氧化酶含量升高相一致。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸组成的天然三肽是一种含硫基的化合物，本试验结果表明干旱胁迫下谷胱甘肽含量升高，说明谷胱甘肽含量的升高使植物抗旱性增强。
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