哺乳动物线粒体中DNA甲基化转移酶1，胞嘧啶甲基化和胞嘧啶羟甲基化
Mitochondrial DNA (mtDNA) has been reported to contain 5-methylcytosine (5mC) at CpG dinucleotides, as in the nuclear genome, but neither the mechanism generating mtDNA methylation nor its functional signi ficance is known. We now report the presence of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) as well as 5mC in mammalian mtDNA, suggesting that previous studies underestimated the level of cytosine modification in this genome. DNA methyltransferase 1 (DNMT1) translocates to the mitochondria,driven by a mitochondrial targeting sequence located immediately upstream of the commonly accepted translational start site.
线粒体DNA（mtDNA）已经报道在核基因组中CpG二核苷酸上包含5甲基化胞嘧啶（5mC），但是mtDNA甲基化产生的机制和它功能的重要性都还不知道。我们现在报道5hmC5羟甲基化胞嘧啶和5mC一样存在于哺乳动物mtDNA中，表明之前的研究低估了胞嘧啶修饰在基因组中的水平。DNA甲基化转移酶1（DNMT1）转移到线粒体，被一个线粒体靶序列？驱动立刻定位到大家公认的转录起始位点？的上游。
This targeting sequence is conserved across mammals, and the encoded peptide directs a heterologous protein to the mitochondria. DNMT1 is the only member of the three known catalytically active DNA methyltransferases targeted to the mitochondrion. Mitochondrial DNMT1 (mtDNMT1) binds to mtDNA, proving the presence of mtDNMT1 in the mitochondrial matrix. mtDNMT1 expression is up-regulated by NRF1 and PGC1α, transcription factors that activate expression of nuclear-encoded mitochondrial genes in response to（响应，反应）hypoxia, and by loss of（失去）p53, a tumor suppressor known to regulate mitochondrial metabolism. Altered mtDNMT1 expression asymmetrically affects expression of transcripts from the heavy and light strands of mtDNA. Hence, mtDNMT1 appears to be（好像是，仿佛）responsible for（是的原因，为负责）mtDNA cytosine methylation, from which 5hmC is presumed to be derived, and its expression is controlled by factors that regulate mitochondrial function.
这个靶序列在哺乳动物中是保守的，编码的多肽引导一个外源蛋白到线粒体上。DNMT1是三个已知催化活性的DNA甲基化转移酶中唯一一个针对线粒体的。线粒体DNMT1（mtDNMT1）结合mtDNA，证明线粒体基质中存在mtDNMT1。NRF1和PGC1α上调mtDNMT1的表达，转录因子激活核编码线粒体基因的表达是对低氧的反应，失去P53，一个肿瘤抑制因子已知可调节线粒体新陈代谢。改变mtDNMT1表达不对称地影响mtDNA重链和轻链的转录表达。因此，mtDNMT1好像是mtDNA胞嘧啶甲基化的原因，推测它衍生出5hmC，调节线粒体功能的因子控制mtDNMT1的表达。
正文
In the nucleus, cytosine methylation cooperates with（合作，协作）N-terminal histone modifications to establish a silenced chromatin structure(1), thus（从而）regulating nuclear gene expression. Methylation patterns are established in the developing embryo by two de novo DNA methyltransferases, DNMT3a and -3b (2). Maintenance of this pattern in somatic cells is believed to be（被认为是）the predominant function of DNMT1, with functional cooperation evident between the two groups of enzymes (3). Cytosine methylation is essential for（是。。必需的）normal development, and deletion of （缺失，删除）DNMT1 results in embryonic lethality in mice and mitotic catastrophe in cultured cells (4).
在细胞核中，胞嘧啶甲基化与N末端组蛋白修饰共同协作去建立一个沉默的染色体结构，从而调节和基因的表达。在发育的胚胎中通过两种从头DNA甲基化转移酶（DNMT3a，3b）建立甲基化模式。人们认为在体细胞中维持这种模式是DNMT1的主要功能，这两组酶间具有明显的功能合作。胞嘧啶甲基化是正常发育必需的，缺乏DNMT1导致小鼠胚胎致死和培
养细胞有丝分裂障碍。
Recently, the presence of significant levels of 5-hydroxymethyl-cytosine (5hmC) was demonstrated in DNA from neurons, brain(5), and embryonic stem cells (6). 5hmC is derived from 5-methylcytosine (5mC) oxidation catalyzed by the TET family of methylcytosine oxygenases, and its functional significance is under intense investigation. This modification is likely to（有可能）have an impact on（对于有影响）local chromatin structure, and it has been proposed that （人们已经提议）5hmC acts as（充当，担任）an intermediate in active or passive demethylation (7). 最近，已经证明在神经、脑和胚胎干细胞DNA中存在显著水平的5hmC。5hmC来源于TET 蛋白家族的甲基胞嘧啶加氧酶催化5mC的氧化，他的功能的重要性是下面积极调查的。这种修饰很可能对局部的染色体结构有影响，人们已经提议5hmC充当了在主动去甲基化和被动去甲基化的中间物。
Cytosine methylation of mitochondrial DNA (mtDNA) has been controversial and, remarkably, infrequently studied. The earliest study, conducted over three decades ago, reported that there was no methylation of mtDNA (8). Subsequently, low levels of methylation restricted to CpG dinucleotides were reported in mitochondria of several species, using methylation-sensitive restriction endonuclease cleavage and nearest-neighbor analysis(9 –11).
引人注目的是，线粒体胞嘧啶甲基化（mtDNA）是引起争论和很少被研究的。大约30年前，最早的研究中报道mtDNA没有甲基化（8）。随后，使用甲基化敏感限制性核酸内切酶分裂和进行最近邻分析，在几个物种的线粒体中报道低水平甲基化限制在CpG二核苷酸（9-10）。Mammalian mtDNA shows a similar level of CpG suppression to that of nuclear DNA (12), suggesting that 5mC is susceptible to（对敏感，易受影响）mutation in mtDNA. To date（迄今为止）, 5mC is the only modified base（修饰碱基）described in mtDNA, but the mechanisms establishing and maintaining mtDNA methylation, and the functional significance of this modification in mtDNA, are not known.
哺乳动物mtDNA与核DNA的CpG抑制显示了一个相似的水平（12），表明mtDNA中5mC 容易突变。迄今为止，5mC在mtDNA中描述的唯一修饰的碱基，但是这个建立和维持mtDNA 甲基化的机制，和这个修饰在mtDNA中功能性意义还是未知的。
Mammalian mtDNA is a 16.5-kb double-stranded, circular molecule, present in multiple copies per mitochondrion (13).The mitochondrial genome encodes 13 of the proteins present in the respiratory chain complexes of mammalian mitochondria, as well as two ribosomal RNAs and 22 transfer RNAs specific to this organelle. All other mitochondrial proteins, including those required for mtDNA replication and transcription, are encoded in the nucleus and translocated to the mitochondria using specialized import systems which often involve N-terminal mitochondrial targeting sequences (MTSs) (14). In contrast to the nuclear genome, mtDNA is not complexed with histones. However, mtDNA is present in protein-containing complexes called nucleoids, each containing multiple copies of mtDNA bound to a complex mixture of proteins (15).
哺乳动物mtDNA是一个16.5kb双链环状分子，每个线粒体中存在多个拷贝（13）。线粒体基因组编码哺乳动物线粒体呼吸链上13个蛋白复合体，两个核糖体RNA和22转运RNA专门针对这个细胞器的。其他所有线粒体蛋白，包括mtDNA复制和转录需要的，在核中编码并使用专门的导入系统转运到线粒体，专门的导入系统经常包括N末端线粒体靶序列（MTSs）（14）。对比核基因组，mtDNA没有与组蛋白形成复合体。然而，mtDNA存在于包含蛋白质的复合物中，称之为拟核，每个包含mtDNA多个拷贝结合到一个复杂的蛋白质混合物上（15）。Transcription of the mitochondrial genome is thought to be（被认为是）coregulated with
nuclear components of the respiratory chain complexes (16). In mammals, oxidative stress results in stabilization of peroxisome proliferator-activated receptor γ-coactivator 1α (PGC1 α ), which activates the transcription of several nuclear-encoded transcription factors, including nuclear respiratory factor 1 (NRF1). PGC1α and NRF1 form a complex that in turn（依次，轮流）up-regulates transcription of transcription factor of activated mitochondria (TFAM) and multiple members of mitochondrial respiratory chain complexes (17).
线粒体基因组的转录被认为是与呼吸链复合物核组成部分共同调节的（16）。哺乳动物中，氧压导致了氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC1α）的稳定性，它激活几个核编码转录因子的转录，包括核呼吸因子（NRF1）。PGC1α和NRF1形成一个复合体依次上调激活了的线粒体转录因子的转录（TFAM）和许多线粒体呼吸链复合物成员（17）。Several nuclear-encoded genes involved in mitochondrial f unction, including PGC1 α (18), are regulated by DNA methylation. Conversely, it has been suggested that（表达观点）mitochondria are able to（能够）influence cytosine methylation levels in the nucleus by modulating the flux of one-carbon units for the generation of S-adenosylmethionine, the methyl donor in DNA methylation (19). Thus, epigenetic regulation of nuclear gene expression appears to have （似乎有）a mitochondrial component. The presence of cytosine methylation in mtDNA led us to question whether this epigenetic modification might play a role in the co-ordinated regulation of mitochondrial gene expression from both nuclear and mitochondrial genomes.
通过DNA甲基化调节几个核编码的基因包含线粒体的功能，包括PGC1α（18）。相反地，人们认为线粒体能够通过调制S-腺苷甲硫氨酸产生的一碳单位的流出，影响细胞核中胞嘧啶甲基化水平，S-腺苷甲硫氨酸为DNA甲基化的甲基供体（19）。因此，核基因表达的表观调节似乎有线粒体的成分。mtDNA中胞嘧啶甲基化的存在使我们去思考表观修饰可能在从核和线粒体两个基因组对线粒体的基因表达协同调节中扮演着重要的角色。
Results
Human and Mouse DNMT1 Encode Mitochondrial Targeting Sequences.
Early reports of DNA methylation in the mitochondrial genome(9 –11) led us to ask whether one or more of the catalytically active mammalian DNA methyltransferases might be targeted
to mitochondria. Examination of the 5′UTR and 5′flanking genomic DNA upstream of the published transcription start sites(20) for both human and mouse DNMT1 revealed that sequence equivalent to 101 codons in human and 63 codons in mouse DNMT1 was in-frame with the highly conserved amino acid sequence of DNMT1, starting with the ATG reported (20) to be the primary translational start codon (Fig. 1 A and B).
结果
人类和小鼠DNMT1编码线粒体靶序列
早期报道的线粒体基因组DNA甲基化（9-11）引导我们去问是否有一个或者更多催化活性哺乳动物DNA甲基化转移酶可能是针对线粒体的。检查人类和小鼠DNMT1公布的转录起始位点（20）基因组DNA上游5’UTR和5’侧翼区，显示人类101个密码子和小鼠DNMT1 63个密码子序列等效是具有高度保守氨基酸序列的DNMT1编码框，报道的A TG起始（20）是主要的转录起始密码（Fig.1A和B）。
This upstream sequence includes two additional in-frame codons for methionine, each in a moderate context for ribosome binding(21); the upstream ATG codons are denoted ATG1 and ATG2,whereas the published translation start is shown as ATG3. RT-PCR using sense primers located over ATG1 or ATG2 and anti-sense primers crossing the exon 1-2 boundary by 4 nucleotides detected transcripts capable of encoding these N-terminal extensions in human and
mouse cells. Transcripts initiating upstream of ATG1 in mouse and ATG2 (but not ATG1) in human mRNA were easily detected (Fig. 1C), suggesting the utilization of an up-stream transcription start site encoding an N-terminal extension.
这个上游序列包括两个额外的甲硫氨酸编码框密码子，每个都在序列中间于核糖体结合（21）；上游ATG密码子表示A TG1和ATG2，而已发布的转录起始是指ATG3。人类和小鼠细胞中，RT-PCR使用上游引物位于A TG1或ATG2，下游引物横跨外显子1-2边界线通过4个核苷酸检测编码这些N末端的延长的转录能力。mRNA转录起始上游小鼠中A TG1和人类中ATG2（不是ATG1）是容易测定的。
Mouse or human DNMT1 isoforms containing this additional N-terminal sequence were predicted by MitoProt II (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) (22) to be targeted to（针对）the mitochondria with very high probability, compared with proteins beginning at the published start codon, ATG3 ( Table S1 ). The genome databases also contain upstream sequences for chimpanzee, rat,and cow DNMT1; in each species, one or more in-frame potential start codons encode a peptide with a strong probability ( > 90 %) of mitochondrial localization (Table S1 ). All are predicted to form amphiphili c α -helices, although sequence conservation between them is low, as is often the case（情况常常如此，这是常有的事）for miochondrial leader peptides across species.
通过MitoProtⅡ预测小鼠和人类DNMT1亚型包括这个额外的N末端的序列（22）针对线粒体具有很高的可能性，与从公布的起始密码子ATG3（Table S1）开始蛋白相比较。基因组数据库也包括黑猩猩，大鼠和牛DNMT1上游序列；在每个物种中，一个或者更多编码框内潜在的起始密码子编码一个具有定位线粒体很大可能性（﹥90%）的多肽（Table S1）。预测所有形成两性分子α-螺旋，尽管他们之间的序列保守性很低，线粒体引导肽穿越物种这是常有的事。
Immunoblots of purified mitochondria from mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and HCT116 human colon carcinoma cells showed the presence of DNMT1 (Fig. 2A) but not DNMT3a or DNMT3b in this organelle (Fig. 2 B). Full-length DNMT1 and a smaller peptide are detected by an N-terminal DNMT1 antibody, suggesting that proteolytic processing occurs upon entry into the mitochondria. Absence of the nuclear marker H3K4me3 in the mitochondrial fraction indicated purity from contamination by nuclear material, the primary site of localization of DNA methyltransferases.
来自小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和人结肠癌细胞HCT116纯化线粒体的免疫印迹分析显示在这个细胞器中存在DNMT1(Fig.2A)，不存在DNMT3a或DNMT3b（Fig.2B）。用一个N末端DNMT1抗体检测全长DNMT1和较小的多肽，表明蛋白酶加工发生在进入线粒体后。线粒体断片中缺少细胞核标志H3K4me3显示纯化被核物质污染，定位DNA甲基化转移酶的主要位点。
We cloned the mouse and human leader sequences, from ATG1 to upstream of ATG3, in-frame with the C-terminal GFP tag of pcDNA6.2/GFP, and transfected the plasmids into NIH/3T3 fibroblasts. Confocal microscopy showed that both human and mouse leader sequences targeted GFP to the mitochondria,indicated by colocalization of MitoTracker Red with green fluorescence (Fig. 2 C). Mitochondria in untransfected cells within the same visual field remained red in the merged photomicrographs, serving as（作为，充当，担任）negative controls for colocalization, whereas a chloramphenicol acetyl transferase (CAT)-GFP control plasmid remained cytosolic. We also transfected these constructs into HCT116 human colon carcinoma cells for immunoblot analysis of purified mitochondria using anti-GFP antibody ( Fig. S1).
我们克隆小鼠和人类的前导序列，从ATG1到ATG3的上游，编码框内具有C末端具有GFP 标签质粒pcDNA6.2/GFP，转染到NIH/3T3成纤维细胞。共聚焦显微镜表明人和小鼠两者的前导序列将GFP定位到线粒体，通过MitoTracker Red和绿色荧光共定位体现（Fig.2C）。未转染的细胞内的线粒体在合并的显微照片相同视野内保持红色，作为共定位的阴性对照，然而氯霉素乙酰转移酶(CAT)-GFP控制质粒保持细胞质基质。我们也转染这些结构到人结肠癌细胞HCT116用抗GFP抗体免疫印迹分析纯化的线粒体（Fig.S1）。
HCT116 mitochondria clearly accumulated GFP. Thus, human and mouse leader peptides represent bona fide MTSs capable of tracking heterologous proteins to this organelle. Each MTS is able to operate across species, indicating functional conservation.
HCT116线粒体清晰地积累GFP。因此，人类和小鼠引导肽体现这些细胞器MTSs法真实的跟踪外源性蛋白检测能力。每一个MTS能够穿越物种操作，表明功能保守。
mtDNMT1 Expression Is Regulated by Factors That Respond to Oxidative Stress. MatInspector (http:/ /www.genomat ix.de/en/index .html) predicted a binding site for NRF1 in both human and mouse DNMT1.This consensus sequence was located（位于）over one of the upstream in-frame start codons and was conserved in all other mammalian species studied ( Table S1 ;Fig.3 A). Under conditions of oxidative stress, the coactivator PGC1α activates and interacts with NRF1 to up-regulate multiple nuclear-encoded mitochondrial genes (17).Accordingly, we transiently transfected NRF1, PGC1 α , or both together into HCT116 cells and analyzed the levels of mitochondrial DNMT1 (mtDNMT1) by immunoblot (Fig. 3B).
对氧化压力反应的因子调节mtDNMT1表达
MatInspector在人类和小鼠的DNMT1中预测了NRF1一个结合位点。这个共有序列位于越过上游编码框起始密码子之一，在研究的所有其他哺乳类物种中是保守的（Table S1；Fig.3A）。在氧化压力的条件下，共激活剂PGC1α激活并且与NRF1相互作用去上调多个核编码的线粒体基因（17）。因此，我们瞬时转染NRF1，PGC1α或者两者一起转染到HCT116细胞，通过免疫印迹分析线粒体DNMT1的水平（Fig.3B）。
A small increase in mtDNMT1 was seen in cells transfected with NRF1 or PGC1α alone, whereas cotransfection with both PGC1 α and NRF1 resulted in an approximately fivefold increase in mtDNMT1 relative to control. Thus, this locus is sensitive to regulation by activators that respond to oxidative stress.
在单独转染NRF1或者PGC1α的细胞中看到mtDNMT1有一个很小的增加，然而两者共转染导致相对对照组mtDNMT1有一个大约5倍的增加。因此，这个位点对于氧化压力反应的调节子的调节是敏感的。
The NRF1 binding site is coincident with a p53 consensus binding site (Fig. 1 A and B), which we previously demonstrated to（向说明，向证明）repress DNMT1 transcription (23). Our earlier study showed a three- to sixfold increase in DNMT1 transcription following either activation or genetic deletion of p53 in HCT116 cells and MEFs. Because p53 is known to regulate mitochondrial respiration (24), we asked whether this tumor suppressor protein also affected mtDNMT1 mRNA expression.
NRF1结合位点和P53共识结合位点是一致的（Fig.1A和B），这个我们之前已经证明抑制DNMT1转录（23）。我们之前的研究随着在HCT116细胞和MEFs细胞中P53的激活或者基因缺失DNMT1转录显示了一个3-6倍的增加。因为P53是人们所周知调节线粒体呼吸作用（24），我们思考这个肿瘤抑制蛋白是否也影响mtDNMT1 mRNA表达。
We used RT-quantitative(q)PCR with primers that distinguish the mitochondrial transcript from the total DNMT1 transcript (Fig. 1 C); the mitochondrial transcript comprised 1 –2% of the total
DNMT1 synthesized in log-phase MEFs or HCT116 cells. The relative abundance of mtDNMT1 transcript increased sixfold in p53?/?MEFs compared with WT MEFs, whereas total DNMT1 mRNA increased threefold (Fig. 3C), suggesting a preferential up-regulation of the mitochondrial transcript in cells lacking p53. Immunoblot analysis of these isogenic cells showed a striking increase in mtDNMT1 protein with loss of p53 (Fig. 3D).
我们用从总的DNMT1转录物中区分线粒体的转录物的引物，进行RT-qPCR（Fig.1C）；线粒体转录占对数阶段MEFs或HCT116细胞总合成DNMT1的1-2%。P53-/- MEFs与野生型MEFs 细胞相比mtDNMT1转录物的相对丰都增加了6倍，然而总的DNMT1 mRNA增加了3倍（Fig.3C），表明在缺少P53的细胞中线粒体转录物的一个优先上调。这些等基因细胞的免疫印迹分析在缺乏P53细胞中mtDNMT1蛋白显示了一个显著的增加（Fig.3D）。
Gene-Specific Changes in Mitochondrial Transcription.
We asked whether this mtDNMT1 overexpression was reflected in an alteration in transcription of the mitochondrial genome (Fig.3E).NADH dehydrogenase subunit 6 (ND6), the only protein-coding gene on the light (L) strand, was significantly underexpressed in response to increased mtDNMT1, suggesting a role for mtDNA methylation in repression of L-strand transcription. On the heavy(H) strand, ATPase subunit 6 (ATP6) and cytochrome c oxidase subunit 1 (COX1) were unaltered in their expression levels.However, NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1), the first H-strand protein-coding region following the ribosomal RNA genes,was significantly increased in response to elevated mtDNMT1.These data support a gene-specific effect on mitochondrial gene transcription, as discussed below.
线粒体转录中独特基因的改变
我们询问mtDNMT1过表达是否反应线粒体基因组转录的改变（Fig.3E）。NADH脱氢酶亚基6（ND6），轻链上唯一编码蛋白的基因，在mtDNMT1增加上显著地低表达，表明mtDNA 甲基化在抑制轻链转录中的一个作用。在重链上，ATPase亚基6（A TP6）和细胞色素酶C氧化酶亚基1（COX1）在他们表达水平上是不变的。然而，NADH脱氢酶亚基1（ND1），第一条轻链编码蛋白区域跟随核糖体rRNA基因，在反应提高的mtDNMT1中是显著增加的。这些数据支持了一个独特基因影响线粒体基因转录，正如下面讨论的。
Mitochondrial DNMT1 Is Bound to mtDNA.
We created an HCT116 cell line (25) in which one endogenous allele of DNMT1 carries a C-terminal tandem-affinity purification (TAP) tag (26). TAP-tagged DNMT1 translocated efficiently to mitochondria (Fig.4B). We therefore used these cells to ask whether mtDNMT1 interacted directly with mtDNA. Formaldehyde-crosslinked mitochondrial lysates were immunoprecipitated with IgG beads(26), and qPCR with primers specific for mtDNA (Table S2 ) was used to quantitate the interaction between mtDNMT1 and mtDNA. Immunoprecipitates from TAP-tagged cells were substantially enriched for mtDNA in comparison with immunoprecipitates from untagged cells, except for an amplicon containing no CpG dinucleotides, which gave equally low signal from both cell lines (Fig.4C). These data suggest CpG-dependent interaction of mtDNMT1 with the mitochondrial genome and confirm the localization of this protein to the mitochondrial matrix.
线粒体DNMT1结合到mtDNA
我们建立了一个HCT116细胞系（25），在这个细胞系中一个内源性DNMT1等位基因携带一个C末端串联亲和纯化（TAP）标签（26）。TAP标签的DNMT1高效地转移进入线粒体（Fig.4B）。因此我们用这些细胞去询问mtDNMT1是否与mtDNA直接相互作用。甲醛交联线粒体溶菌产物用IgG小珠子免疫沉淀（26），用mtDNA专门的引物进行qPCR（Table S2）去定量mtDNMT1和mtDNA间的相互作用。TAP标签细胞进行免疫共沉淀相比没有标签的细胞的免疫共沉淀
与mtDNA大量的富集，除了不包含CpG二核苷酸的扩增子，两个细胞系都给了相等的低信号（Fig.4C）。这些数据显示mtDNMT1和线粒体基因组相互作用依赖CpG，证实了这个蛋白定位到线粒体基质中。
Interaction was evident in the D-loop control region,which carries the mitochondrial origin of replication and promoters, as well as in rRNA and protein-coding regions. The level of enrichment was dependent on the target amplicon; five of the six regions probed showed a three- to fivefold enrichment of mtDNA sequences. However, qPCR of the region covering the junction between 12S and 16S rRNA genes (primer 2) showed only twofold enrichment in binding of mtDNMT1-TAP. The density of CpG dinucleotides in this amplicon is <50% that in all other amplicons analyzed, suggesting that interaction of mtDNMT1 with mtDNA is proportional to CpG density, and supporting a functional role for mtDNMT1 in establishment and maintenance of mtDNA methylation.
在D环控制区域相互作用是明显的，这个区域带有线粒体复制原点和启动子，和rRNA中编码蛋白质区域一样。富集水平依赖靶扩增子；6个区域中探测了5个，显示mtDNA序列3-5倍的富集。然而，这个区域的qPCR引物2覆盖12S和16S rRNA基因之间的连接，在结合mtDNMT1-TAP中显示仅2倍富集。这个扩增子中CpG二核苷酸密度＜50%，这个也在所有其他扩增子进行了分析，表明mtDNMT1和mtDNA间的相互作用与CpG密度成比例的，支持了mtDNMT1在建立和维持mtDNA甲基化中的功能作用。
5-Hydroxymethylcytosine Is Present in mtDNA.
We immunoprecipitated randomly sheared mtDNA with an antibody to 5mC or 5hmC and probed the precipitated DNA by qPCR to determine the presence and relative abundance of these two modified bases in mtDNA (Fig. 5A and B). Immunoprecipitated samples were enriched 10- to 20-fold for 5mC relative to IgG control for all regions tested. mtDNA immunoprecipitated using anti-5hmC was highly enriched (85- to 580-fold) relative to IgG controls,except across the D loop (primer 27), which was enriched 38-fold. The specificity of each antibody for its respective modification was confirmed using control DNA in which every cytosine was converted to either 5mC or 5hmC (Fig. S2). The presence of both cytosine modifications in mtDNA suggests that earlier studies underestimated the degree of epigenetic modification of the mitochondrial genome.
mtDNA中存在5羟甲基化。
我们用5mC或者5hmC的抗体免疫共沉淀随机地修剪mtDNA，通过qPCR探测沉淀的DNA 去确定mtDNA中这两个修饰碱基的存在和相对丰度（Fig.5A和5B）。免疫共沉淀的样品富集5mC相对所有区域检测的IgG对照10-20倍。mtDNA免疫共沉淀使用抗5hmC相对IgG对照是高度富集（85-580倍）的，除了穿过D环（引物27），他富集了38倍。针对他们各自的修饰每个抗体的特异性用对照DNA确定，对照DNA中每个胞嘧啶转换为5mC或5hmC （Fig.S2）。mtDNA中两个胞嘧啶修饰的存在表明早期的研究低估了线粒体基因组表观修饰的程度。
We used phage T4 5hmC-β -glucosyltransferase (β-gt) (27) to determine the presence of 5hmC at Gla1 restriction endonuclease cleavage sites (28). Control experiments using defined DNA sequences containing cytosine, 5mC, or 5hmC confirmed that Gla1 cleaved only sites modified by methylation or hydroxymethylation, but not sites containing glucosylated 5hmC (Fig.S3A).
我们用T4噬菌体5hmC-β-葡糖基转移酶（β-gt）（27）去确定在Gla1限制性内切酶切割位点5hmC的存在（28）。对照试验用确定了的DNA序列包括胞嘧啶，5mC或5hmC证明甲基化或羟甲基化修饰的Gla1唯一的切割位点，但是不包括葡糖基修饰的5hmC位点
（Fig.S3A）。
Protection of mtDNA from cleavage by 5hmC glucosylation was assessed by endpoint (Fig. S3B and C) and qPCR (Fig. 5C). 5hmC was present in three different amplicons from human mtDNA and two amplicons from mouse mtDNA or genomic DNA. Amplicons containing two Gla1 restriction sites each (amplicons ATP6, 12S,and 16S-3) showed 50% protection in comparison with amplicons with a single Gla1 site (amplicons 2 and 16S-2), suggesting a similar level of 5hmC at all restriction sites tested. A mouse amplicon devoid of（没有，缺乏）Gla1 sites (ATP6/COX3) was protected from cleavage irrespective of 5hmC glucosylation (Fig. S3 C).
保护5hmC葡糖基化的mtDNA不被切割，通过末端（Fig.S3B和C）和qPCR（Fig.5C）进行评估。5hmC存在与三个不同扩增子中，人类mtDNA和两个小鼠mtDNA或基因组DNA扩增子。扩增子包括两个Gla1限制性位点与带有一个Gla1位点的扩增子（扩增子2和16S-2）相比较每个（扩增子ATP6，12S和16S-3）显示50%保护，表明在检测的所有限制性位点上5hmC具有一个相似的水平。一个小鼠扩增子缺乏Gla1位点（ATP6/COX3）不论5hmC是否葡糖基化都保护不被切割（Fig.S3C）。
Discussion
Cytosine methylation of the mitochondrial genome has remained largely overlooked, in part because early reports using nearest-neighbor analysis indicated that this modification was present at only 2 –5% of CpG dinucleotides (11), well below the level of methylation seen in the nucleus. The data presented here show a 10- to 20-fold enrichment of mtDNA sequences in immunoprecipitates using 5mC antibody, somewhat lower than that usually obtained from genomic DNA (～100-fold for CpG islands).
讨论
线粒体基因组的胞嘧啶甲基化仍然保持一个很大的空缺，部分是因为早期的报道使用最近邻顺序分析显示这种修饰在CpG二核苷酸仅有2-5%（11），细胞核中也甲基化水平也很低。本文这些数据呈现了用5mC抗体的免疫共沉淀中mtDNA序列一个10-20倍的富集，通常比基因组DNA（是CpG岛的~100倍）获得的富集的稍微低一些。
This likely reflects the CpG-sparse nature of the mitochondrial genome, which does not contain CpG islands. We demonstrate here the presence of 5hmC in mtDNA using two independent assays. Thus, epigenetic modification of cytosines in the mitochondrial genome is likely much more frequent than previously believed. In the nucleus, 5hmC is generated from 5mC by the action of the TET family of methylcytosine oxygenases (6).There is not yet evidence regarding the presence or absence of these enzymes in mitochondria, and the TET family proteins or loci do not contain recognizable mitochondrial targeting sequences (14). We therefore cannot rule out（排除，取消）the possibility of a different mechanism for the generation of 5hmC, including covalent addition of 5-hydroxymethyl groups directly to DNA cytosine residues by mtDNMT1 (29) using formaldehyde generated from mitochondrial mixed-function oxidases.
这个很可能反应自然线粒体基因组中CpG稀少，它不包含CpG岛。这里我们用两个独立的实验证明5hmC在mtDNA中存在。因此，线粒体基因组中胞嘧啶的表观修饰很可能比我们之前认为的更加频繁。在细胞核中，5hmC是由5mC通过TET家族的甲基胞嘧啶加氧酶作用产生的（6）。这里还没有证明这些酶在线粒体中的存在或缺失，TET家族蛋白或基因座不包含可认识的线粒体的目标序列（14）。因此我们不能排除5hmC产生的一个不同机制的可能性，包括mtDNMT1用线粒体多功能氧化酶产生的甲醛将5羟甲基集团直接共价增加到DNA 胞嘧啶残基上（29）。
The apparently lower enrichment for 5hmC in the D-loop control region most likely reflects the
less efficient amplification of a longer fragment(833 bp compared with 112 –238 bp) from mtDNA sheared to an average size of 300–400 bp. However, the D loop exists as a stable triple-helical structure containing an RNA primer required for initiation of mtDNA replication (13), and we have found this region to be resistant to in vitro methylation by M.Sss1 cytosine methyltransferase. It is therefore possible that the kinetics of epigenetic modification in this region of the mitochondrial genome might be different from those in coding regions.
在D环对照区域有一个明显较低5hmC富集最可能反应mtDNA较长片段（833bp相比较112-238bp）修剪为平均长度300-400bp扩增效率较低。然而，D环的存在作为一个稳定的三螺旋结构包括mtDNA复制起始所需要的一个RNA引物（13），我们发现这个区域对于通过M.Sss1胞嘧啶甲基转移酶体外甲基化是有抵抗的。因此，线粒体基因组的这个区域的表观修饰动力学可能不同于编码区的动力学。
The function of 5hmC in the nuclear genome is not yet clear. It has been proposed that 5hmC is an intermediate metabolite in active demethylation of the genome by repair enzymes (30), in passive demethylation as a result of lack of recognition by enzymes involved in maintenance methylation (31)句型, or that it alters local chromatin structure because 5hmC is not recognized by 5-methylcytosine-binding proteins (7). The role of 5hmC in the mitochondrial genome likely involves one or more of these processes. Although quantitative measurements of the relative abundance of 5hmC and 5mC can be achieved using methylated DNA immunoprecipitation (Me-DIP), 5hMe-DIP, HPLC, or enzymatic methods, mapping the location and distribution of 5hmC in either the nuclear or mitochondrial genome is not yet technically feasible, because this modified base is indistinguishable from 5mC by bisulfite modification (7).
核基因组中的5hmC的功能还没有很清楚。提出5hmC是通过修复酶对基因组的主动去甲基化一个中间代谢物（30），在被动去甲基化中作为多维持甲基化酶缺乏认识的一个结果（31），或者5hmC改变当地染色体结构因为5hmC是还没有通过5甲基胞嘧啶结合蛋白认识（7）。5hmC在线粒体基因组中的作用很可能涉及这些过程的一个或者多个。尽管5hmC和5mC的相对丰都的定量测量能够通过使用甲基化的DNA免疫共沉淀（Me-DIP），5hMe-DIP，HPLC，或酶催化的方法获得，绘制5hmC在细胞核或者线粒体基因组中的位置和分布还没有技术上的可行性，因为这些修饰碱基通过亚硫酸氢盐与5mC不能区分的（7）。
This study reports a mitochondrial isoform of DNA methyltransferase 1, which is the only member of the catalytically active mammalian DNA methyltransferase family found in this organelle. The conservation of an ORF encoding a mitochondrial targeting sequence upstream of the commonly accepted translational start codon across multiple mammalian species suggests an important role for this enzyme in mitochondrial function.
这个研究报道一个线粒体DNA甲基转移酶1的亚型，它是在这个细胞器中发现的哺乳动物DNA甲基转移酶家族唯一具有催化活性的。保守的一个开放阅读框编码的一个线粒体靶序列普遍公认的转录起始密码子上游穿过多种哺乳动物物种显示这个酶在线粒体功能中的一个重要作用。
Although DNMT1 is generally considered to be（认为是）the maintenance DNA methyltransferase, it is able to methylate completely unmethylated DNA in vitro with an efficiency that exceeds that of the de novo methyltransferases DNMT3a and -3b (32). Thus,DNMT1 appears to be capable of both initiating and maintaining cytosine methylation in the nucleus, and the lack of de novo methyltransferases in mitochondria implicates mtDNMT1 in both processes in this organelle.
尽管DNMT1普遍被认为是维持DNA的甲基转移酶，他能在体外甲基化完全未甲基化的DNA
效率超过了从头甲基转移酶DNMT3a和-3b的效率（32）。因此，DNMT1似乎在细胞核中具有从头和维持胞嘧啶甲基化两种能力。线粒体中缺乏从头甲基转移酶暗示DNMT1在这个细胞器中具有这两个过程。
We show that mtDNMT1 binds to the mitochondrial genome in a manner（在某种意义上，在某种程度上）proportional to the density of CpG dinucleotides. Of particular relevance is the binding of mtDNMT1 to the D-loop control region, which carries the promoters driving transcription initiation of both heavy and light strands, supporting a role for mtDNMT1 in regulation of mitochondrial gene expression. The asymmetric, gene-specific alteration in mitochondrial transcription patterns shown here suggests diverse roles for mtDNMT1 and cytosine modification in this organelle.
我们显示mtDNMT1结合线粒体基因组在某种程度上与CpG二核苷酸密度成比例。特别相关的是mtDNMT1与D环对照区结合，D环对照区携带驱动重链和轻链两者转录起始的启动子，支持mtDNMT1在调节线粒体基因表达中的功能。不对称地，本文表明在线粒体转录模式中独特基因的改变，暗示在这个细胞器中mtDNMT和胞嘧啶修饰具有很多作用。Decreased expression of ND6 on the L strand implies that cytosine methylation in mtDNA represses gene expression from the light-strand promoter, as it does in the nucleus. However, increased transcription of ND1 with no change in transcription of ATP6 or COX1 raises the possibility of a different mode of action on the H strand. A binding site for mitochondrial terminator factor 1 (MTERF1) is located between the end of the 16S rRNA gene and the translation start of ND1 (33). MTERF1 binds to both H-strand promoter 1(HSP1) and the terminator binding site (Fig.4A), forming a transcription loop that maintains high-level production of rRNA. Transcripts initiating at HSP2 produce polycistronic messages encoding the entire H strand (13).
L链ND6表达减少表明mtDNA胞嘧啶甲基化抑制从轻链启动子开始的基因表达，和在细胞核中的一样。然而，ND1转录的增加没有改变ATP6和COX1的转录增加重链上不同作用模式的可能性。线粒体终止子因子（MTERF1）结合位点位于16S rRNA基因末尾和ND1转录起始之间（33）。MTERF1结合到H链启动子1（HSP1）和终止子结合位点上（Fig.4A），形成一个转录环，它维持rRNA高水平产物。在HSP2转录起始产生多顺反子的信息编码整个H 链（13）。
Our data raise the possibility that mtDNMT1, either through modification of CpG dinucleotides or by direct protein–protein interaction, interferes with MTERF-dependent transcription termination, allowing read-through from HSP1 to the next transcriptional unit (ND1) without impacting polycistronic mRNA synthesis from HSP2.
我们的数据提高了mtDNMT1的可能性，不管是通过CpG二核苷酸的修饰还是通过蛋白和蛋白质间的直接相互作用，阻碍了依赖MTERF转录的终止，允许从HSP1到下一个转录单元（ND1）的通读不影响从HSP2多顺反子的mRNA合成。
We show here that DNMT1 is present in the mitochondrial matrix, bound to mtDNA, and modifies transcription of the mitochondrial genome in what appears to be a gene-specific fashion. We report the presence of both 5hmC and 5mC in mtDNA , suggesting that earlier studies may have underestimated the proportion of modified cytosines in this genome. Hence,mtDNMT1 appears to be responsible for（是。。的原因）the establishment and maintenance of cytosine methylation in mtDNA, from which 5hmC is presumably derived. Our data support a role for epigenetic modification of the mitochondrial genome in regulation of mitochondrial transcription.
这里我们表明DNMT1存在于线粒体基质中，结合mtDNA，修饰线粒体基因组的转录，这个似乎独特的基因方式是什么。我们报道了mtDNA中存在5mC和5hmC，表明之前的研究很可能低估了胞嘧啶修饰在这基因组中的比例。因此，mtDNMT1似乎是在mtDNA中建立和维持胞嘧啶甲基化的原因，这很可能是由5hmC衍生来的。我们的数据支持了线粒体基因组的表观修饰在调节线粒体转录中的作用。
Materials and Methods
材料和方法
Cell Lines. HCT116 p53+/+ and HCT116 p53?/?were obtained from Bert Vogelstein, Johns Hopkins University (Balti more, MD). Primary MEFs were prepared from E12.5 –E13.5 embryos.
细胞系。HCT116 p53+/+和P53?/?从Johns Hopkins University大学的Bert Vogelstein博士获得(Balti more, MD)。主要的MEFs细胞来自E12.5-E13.5胚胎。
Plasmids and Transfections. Primers used are listed in Table S2. Mitochondrial targeting sequences were amplified from random-primed human and mouse cDNAs. Murine NRF1 cDNA was obtained from the American Type Culture Collection and recloned into pDEST26/C-FLAG. PGC1α plasmid was a gift from Gregorio Gil, Virginia Commonwealth University. Cells were transfected using Polyjet liposomes (ProSci) (HCT116) or nucleofection (Amaxa) (MEF and NIH/3T3) according to the manuf acturers’specifications, and were harvested 48h after transfection.
质粒和转染。使用表S2中列举的引物。使用随机引物扩增小鼠和人类cDNAs线粒体目标序列。小鼠NRF1 cDNA获得于美国标准菌库然后重新克隆到pDEST26/C-FLAG。PGC1α质粒由Virginia Commonwealth University大学的Gregorio Gil馈赠。使用Polyjet 脂质体(ProSci) (HCT116) 或核转染(Amaxa) (MEF and NIH/3T3)按照制造商说明书转染细胞，转染48h后收获。Mitochondrial Purification and Immunoblot Analysis . Mitochondria were purified by dounce homogenization and differential centrifugation in the presence of complete protease inhibitors (Roche) (34). Proteins were resolved on 4 – 15% gradient SDS/PAGE gels. Antibodies used were anti-DNM T1 amino acids 1–10 (Abcam), anti-tubulin and anti –voltage-dependent anion carrier (VDAC) (Pierce), anti-H3K4me3 (Upstate Biotechnology), anti-DNMT3a and anti-DNMT3b (Imgenex), anti-GFP (Invitrogen), and anti-TAP (Open Biosystems). Protein was loaded onto SDS/PAGE gels to approximate equal cell equivalents, so that an equal signal for each compartment-specific antibody was obtained (whole-cell lysate, 75μg;cytosol, 25μg; mitochondria, 18μg).
线粒体纯化和免疫印迹分析。通过dounce均质化和差速离心在完整的蛋白酶抑制剂（Roche）存在时纯化线粒体（34）。蛋白在4-15%梯度SDS/PAGE凝胶分离。抗体用的是抗DNMT1氨基酸1-10（Abcam），抗微管蛋白和抗电压依赖性阴离子载体（VDAC）（Pierce），抗H3K4me3（Upstate Biotechnology），抗DNMT3a和抗DNMT3b（Imgenex），抗GFP（Invitrogen），和抗TAP（Open Biosystems）。向SDS/PAGE凝胶上样大致相等的细胞等量蛋白，以便获得特定分隔抗体的一个相等的信号（whole-cell lysate, 75μg;cytosol, 25μg; mitochondria, 18μg）。Confocal Microscopy. NIH/3T3 cells were plated onto poly-L-lysine-coated coverslips and fixed with 4% paraformaldehyde 48h after transfection . Cells were stained with 1nM MitoTracker Red (Molecular Probes) for 15 min washed three times with PBS, and mounted onto glass slides with ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen). Microscopy was carried out using a Leica TCS-SP2 AOBS confocal scanning microscope.
共聚焦显微镜。转染48h后的NIH/3T3细胞接种到涂有多聚L赖氨酸的玻片上，用4%多聚甲醛固定。细胞用1nM MitoTracker Red (Molecular Probes)染色15min后用PBS洗3遍，然
后用DAIP ProLong Gold antifade reagent安装在载玻片上（Invitrogen）。显微镜检查使用Leica TCS-SP2 AOBS 共聚焦显微镜。
Gene Expression. Total RNA was isolated using TRIzol (Invitrogen), DNase I-treated, and reverse-transcribed with SuperScript III (Invitrogen ) and random hexamers. Gene expression was determined using qPCR with Quantitect SYBR Green PCR Mastermix (Qiagen). Values were normalized to 18S rRNA for mitochondrial transcription or to β-actin for mtDNMT1 quantitation. 基因表达。用TRLzoL（Invitrogen）提取总RNA，DNaseⅠ处理，用SuperScript III （Invitrogen）反转录和随机引物。Quantitect SYBR Green PCR Mastermix （Qiagen）进行qPCR检测基因的表达。线粒体转录的值被18SrRNA标准化或mtDNMT1定量被β-actin标准化。Statistics. Statistical analyses of differential mitochondrial gene expression profiles were performed using a random-effects ANOVA随机方差分析using the statistical package JMP version 7.0 (SAS). The least-squares mean for each gene for WT and p53?/ ?MEFs was obtained along with standard errors, and each dataset was normalized to 18S rRNA expression. Three independent sets of biological samples were analyzed for each gene, with triplicate technical replicates in each sample. The ANOVA model included technical replicates as nested effects and biological replicates as random effects. The corresponding 95% confidence intervals (C.I.) were obtained using statistical methods for transformations(Delta method). All other qPCR experiments include multiple replicates from two or more independent experiments, normalized to relevant controls or to input DNA. SDs were computed using the formulation.
统计分析。不同线粒体基因表达图谱的数据分析用JMP version 7.0 (SAS)统计软件包进行随机方差分析。WT和p53?/ ?MEFs细胞每个基因的最小二乘法伴随着标准误差获得，每个数据按照18SrRNA表达进行标准化。三个独立生物样本集进行每个基因的分析，每个样本进行三个技术重复。方差分析模式包括技术重复作为嵌套阈和随机生物学重复。用转换(Delta method)统计学方法获得相当于95%可信区间（C.I.）。所有其他的qPCR实验包括2到更多个独立实验的多个重复，按照相关对照或输入的DNA进行标准化。SDs是用下面公式计算的。Mitochondrial Immunoprecipitation. Purified mitochondria from DNMT1-TAP and nontagged HCT116 cells were formaldehyde-cross-linked, lysed, and immunoprecipitated as described (35). Mitochondrial DNA was sheared using a Diagenode Bioruptor water bath sonicator to an average length of 400bp.We used 750μg mitochondrial extract in each mitochondri al immunoprecipitation (mtIP) . IgG beads were equilibrated in lysis buffer and added to mitochondrial lysates for overnight incubation at 4°C to isolate DNMT1-TAP/DNA complexes.
线粒体免疫共沉淀。DNMT1-TAP和没有标签HCT116细胞中纯化的线粒体被甲醛交联，细胞溶解和按照文献中免疫共沉淀（35）。线粒体DNA用Diagenode Bioruptor水浴超音波样品震碎仪修剪为平均长度为400bp的片段。每个线粒体免疫共沉淀中（mtIP）我们使用750ug 的线粒体提取物。IgG小珠子平衡到细胞溶解buffer中，加入线粒体溶解产物4℃孵育过夜分离DNMT1-TAP/DNA复合物。
Immunoprecipitated samples were processed as described (35) and purified DNA was analyzed by qPCR wit h 1μL mtIP DNA and Quantitect SYBR Green Mastermix. The a bundance of mtDNA was determined from a standard curve of purified mtDNA and is expressed as ng mtDNA immunoprecipitated. Values obtained for non-TAP-tagged HCT116 cells represent nonspecific
background. Primers used were from Lu et al. (35)(fragments of 800 – 900 bp, primers 1, 2, 3, and 27) or as listed in Table S2(fragments < 200bp).
免疫共沉淀样本按照文献中一样处理（35），用1μL mtIP DNA和Quantitect SYBR Green Mastermix对纯化的DNA进行qPCR分析。mt DNA的丰度通过纯化mtDNA的一个标准曲线确定，mtDNA免疫共沉淀用ng表示。non-TAP-tagged HCT116 cells代表非特异性背景获得值。引物使用Lu et al. (35)(fragments of 800 – 900 bp, primers 1, 2, 3, and 27) or as listed in Table S2(fragments < 200bp)。
Mitochondrial 5mC and 5hmC Immunoprecipitation. Purified mtDNA (4 μg) was sheared to an average length of 400bp and rotated overnight at 4°C with 2ug IgG, anti-5mC, or anti-5hmC (Active Motif). The specificity of both antibodies for their respective cytosine modifications in DNA was verified using defined DNA substrates synthesized in the presence of dCTP, 5m-dCTP, or
5hm-dCTP (Active Motif). Precleared protein-G beads (Amersham) were used as previously described (23) to immunoprecipitate the antibody/DNA complexes, and DNA was purified from immunoprecipitates using proteinase K,organic extraction, and precipitation(23). The abundance of mtDNA was determined from a standard curve of purified mtDNA and is expressed as ng mtDNA immunoprecipitated relative to input values.
线粒体5mC和5hmC免疫共沉淀。纯化的mtDNA（4ug）被修剪为平均长度400bp与2ug IgG，抗5mC或抗5hmC（Active Motif）4℃旋转过夜。使用已经确定的DNA物质dCTP, 5m-dCTP, 或
5hm-dCTP (Active Motif)合成，进行证明两个抗体对DNA中他们各自的胞嘧啶修饰是特异性的。已经证明蛋白G小珠子(Amersham)使用按照之前抗体/DNA复合物免疫共沉淀的描述（23）进行，使用蛋白酶K，有机萃取和沉淀的方法从免疫共沉淀中纯化DNA（23）。从一个纯化的mtDNA标准曲线中确定mtDNA丰度，用ng表示mtDNA免疫共沉淀相对于输入的值。Sequence-Specific Detection of 5hmC.The presence of 5hmC at Gla1 restriction sites was determined using a Quest 5hmC Detection Kit (Zymo Research) as described by the manufacturer using 80ng mtDNA or total cellular DNA. Gla1 cleaves DNA only when restriction-site cytosines are methylated or hydroxymethylated; glucosylation of 5hmC residues results in protection from Gla1 cleavage. Control DNAs used to validate the assay were from Active Motif.
5hm特意序列的检测。5hmC在Gla1限制性位点上的存在是Quest 5hmC Detection Kit (Zymo Research)确定的，用80ng mtDNA或总细胞DNA按照说明书操作。Gla1分割DNA仅当限制性位点胞嘧啶是甲基化或者羟甲基化时；葡糖基化5hmC残基导致Gla1不被分割。使用对照DNAs去证实试剂盒的检测。
基础研究 非小细胞肺癌患者O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的表达及意义 金文波,郑梦利,祁彦君,马连君,周乃康 (解放军第309医院胸外科,北京 100091) 【摘要】目的:探讨非小细胞肺癌MGMT 表达的临床病理意义。方法:应用免疫组化方法检测90例非小细胞肺癌癌组织中MGMT 的表达,并以60例肺癌周围正常组织作为对照。 结果:在90例非小细胞肺癌患者肿瘤组织中MGMT 的表达率为53.33% (48/90),明显低于肺癌周围正常组织的76.67% (46/60) (P =0.0065);非小细胞肺癌患者肿瘤组织中, MGMT 的阳性表达率在吸烟组为72.73% (40/55),明显高于不吸烟组的22.86% (8/35) (P =0.0000);在低分化组为35.0%(14/40),明显低于高、中分化组的68.0%(34/50) (P =0.0037);但与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移及TNM 分期均无明显相关性(P >0.05)。结论:非小细胞肺癌中,MGMT 的阳性表达与肺癌的发生、发展相关,其监控有助于肺癌的预防及早期诊断。 【关键词】非小细胞肺癌;O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶;免疫组化 【中图分类号】 R73 【文献标识码】 A 【文章编号】1009-0959(2012)04-0657-02 Expression and Clinical Signi? cance of O6-methylguanine-DNA Methyltransferase in NSCLC Patients Jin Wen-bo, Zheng Meng-li, Qi Yan-jun, et al. (Department of Thoracic Surgery, The 309th Hospital of PLA, Beijing 100091, China) 【ABSTRACT 】Objective: To investigate the clinical value of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) expression in non small cell lung cancer(NSCLC). Methods: The MGMT gene expression in 90 cases of NSCLC and 60 cases of tissue adjacent to the tumor were detected by immunohistochemical method and the correlation between the expression and clinical factors was analyzed. Results: The positive rates of MGMT in NSCLC (53.33%) was signi ? cantly lower (P =0.0065) than the tissue adjacent to the tumor (76.67%). In lung carcinomas, the positive rate of MGMT in the groups with smoking history (72.73%) was signi ? cantly higher (P = 0.0000) than the group without smoking history (22.86%). The expression rate of MGMT in the groups of poor differentiation (35.0%) was signi ? cantly lower (P =0.0037) than the groups of well or media differentiation (68.0%). But the positive rate of MGMT had no relationship with gender, age, tumor dimension size, lymph node metastasis ,histology and TNM stage (P >0.05). Conclusion: MGMT gene is related in the occurrence, development of NSCLC, and it can be as a marker to diagnose and predict NSCLC. 【KEY WORDS 】 NSCLC; MGMT; Immunohistochemistry 肺癌是我国高发的恶性肿瘤,其发病率逐年上升,死亡 率位于我国恶性肿瘤的首位。国内外研究显示,DNA 损伤 是肺癌发生的重要原因之一。O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转 移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT )是 一种 DNA 修复酶,其主要作用是保护DNA 免受烷化剂的损 伤,从而阻止肿瘤的发生。本研究采用免疫组织化学方法 检测90例非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC) 和 60例肿瘤周围肺组织的MGMT 表达,探讨MGMT 表达与 NSCLC 发生及其生物学行为的关系。 1 材料与方法 1.1 材料来源 90例 NSCLC 组织蜡块取自我院2007年～2010年肺 叶切除标本。男56例,女34例;年龄31～76岁,中位年龄56 岁;鳞癌52例,腺癌38例;Ⅰ～Ⅱ 期 34 例(37.78%),Ⅲ期56例 (62.22%)。选取60例肿瘤周围正常肺组织作为对照。90 例 均行根治性肺切除术,我们对其手术切除的肿瘤标本进行 MGMT 检测。 1.2 MGMT 检测 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化法(S-P 法)检测 MGMT 表达,免疫组化染色标准按阳性细胞百分比 记分。MGMT 阳性信号位于肿瘤细胞的胞核或胞质,呈棕 色颗粒(见图1、图2)。光镜下每张切片选择5个高倍视野 计数500个癌细胞,对细胞核或胞质着色的细胞进行分析。判断标准: ≤ 10 %为阴性(MGMT －), ＞10 % 为阳性(MGMT +)。图1.MGMT 在肺鳞癌组织中的阳性表达情况(SP 法 ×100)图2.MGMT 在肺腺癌组织中的阳性表达情况(SP 法 ×100)
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他 peter a. jones 摘要 DNA甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。 两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA结合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。 在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）。据报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化，包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。 理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动物的基因组包含短（约1 kb）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS），其余的基因组因为CpGs而耗尽。当5mC通过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI存在是因为他们可能是从来没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI是什么的讨论，虽然在
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。 DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction landmarkgenomescanning，RLGS)；后者包括3H—SAM掺人后液闪检测法和高压液相色谱法。 对单基因序列特异性甲基化分析包括传统的甲基化敏感的限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonucleases，MSREs)分析、比较简洁的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、全面反映甲基化情况的亚硫酸氢钠变性后测序(bisulfitegenomic sequencing)、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增(methylation sensitive single nucleotide primer extension，Ms—SnuPE)、较新颖的甲基化荧光检测(methylight)、结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析(combined bisulfite restrictionan alysis，COBRA)、酶的区域性甲基化特异性分析(enzymatic regional methylation assay，ERMA)和变性高压液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)。 甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms—SnuPE) Ms—SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms—SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms—SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C／T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。 甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法 methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有一个甲基化碱基，则它们中的绝大多数就不能切割DNA。MSRE法是基于甲基化敏感Ⅱ型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理。用甲基敏感Ⅱ型内切酶及其同工酶(对甲基化不敏感)切割含有一个或多个甲基化CpG序列的片段，然后用DNA印迹法分析。此法
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
中文摘要 目的： 自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK细胞）作为一种固有免疫细胞，在免疫系统中发挥着重要作用。目前关于NK细胞的研究主要集中于NK细胞表面受体以及相关信号通路对其发育和功能的影响等方面，我们研究发现NK细胞在发挥功能时，会伴随着染色质及其组蛋白修饰状态的变化，而组蛋白甲基化转移酶G9a 在组蛋白修饰中具有重要的作用，并且组蛋白甲基化转移酶G9a对造血干细胞以及T细胞发育有着重要的影响，另外组蛋白甲基化转移酶G9a是否会影响NK 细胞的发育及其功能尚未报道，因此探讨组蛋白甲基化转移酶G9a在NK细胞的作用具有重要意义，本研究主要从表观遗传学的角度探讨G9a如何影响NK 细胞的功能及其作用机制。 方法： 第一部分：从GEO数据库中分析相关数据，在NK细胞免疫信号通路被激活的情况下，寻找表达水平变化最显著的组蛋白甲基化酶和去甲基化酶，发现G9a 在NK细胞激活之后显著下调，并用qPCR实验验证G9a的变化。从外周血中分选获得原代NK细胞，加入抑制G9a酶活性的小分子抑制剂，采用western blot 方法检测加入小分子抑制剂后，G9a修饰的NK细胞中IFN-γ启动子区域H3K9me2的修饰水平；并用流式细胞术分析NK细胞在被激活的情况下，抑制G9a的酶活性后IFN-γ的表达变化。 第二部分：采用qPCR在转录水平检测不同条件激活的NK细胞系的IFN-γ的表达变化，并用流式细胞术和ELISA等技术检测IFN-γ在蛋白水平的表达变化；ChIP-qPCR检测在抑制G9a酶活性前后，NK细胞系中IFN-γ启动子区域H3K9me2的修饰水平变化。 结果： 第一部分：高通量分析结果显示，NK细胞在被激活的情况下，G9a的表达量下调；在抑制NK细胞中G9a甲基转移酶活性后，可以增强NK细胞分泌IFN-γ的能力。 第二部分：通过在转录水平和蛋白水平两个层次上的检测发现，抑制NK细胞G9a甲基转移酶活性后，NK细胞分泌IFN-γ的能力增强；ChIP-qPCR实验结果 I
分子生物学实验论文题目：酵母辅酶Q生物合成甲基转移酶的分离 及SDS-PAGE分析 姓名: 学号: 专业： 年级班级： 指导教师：
目录 分子生物学实验论文 (1) 摘要 (3) 引言 (3) 一、材料方法 (3) 1、1仪器 (3) 1、2方法 (3) 1、3培养基 (3) 二、酵母的生长 (4) 2、1 酵母的活化 (4) 2、2 纯化 (4) 2、3氯化铜对酵母的影响 (4) 2、4 液培 (5) 2、5吸光度的测定 (5) 三、SDS-PAGE电泳 (6) 3、1电泳前准备 (6) 3、2 SDS-PAGE电泳操作步骤 (6) 四、结果分析 (7) 4、1酵母的分离结果 (7) 4、2液体培养基中的结果分析 (8) 4、3 SDS-PAGE电泳结果分析 (8) 五、结论 (8)
氧化应激条件下酵母辅酶Q生物合成甲基转移酶 摘要 甲基转移酶是生物有机体内普遍存在的一种重要酶类，它能催化遗传物质ＤＮＡ的甲基化，在基因表达及动物生长、发育中起着重要的调控作用；同时，又能催化多种生理过程中间产物的甲基化进而合成或降解生理活性物质。研究发现，人类的情绪和许多疾病的发生及植物的抗逆性都与甲基转移酶基因的表达有关。 本试验以安琪酵母为实验材料，测定不同浓度的氯化铜对安琪酵分子生物学母的生长的影响，通过分光光度计测定不同氯化铜浓度下的液体培养基的吸光值来反映酵母菌的生长状况。结果表明不同浓度氯化铜对酵母的影响是不同的。 关键字：酵母菌、YPD固体培养基、YPD液体培养基、氯化铜、凝胶电泳 引言 酵母菌是人类直接食用量最大的一种微生物。酵母菌体含有丰富的蛋白质、脂肪、糖分和B 族维生素等,以及酶、辅酶、核糖核酸、甾醇和一些新陈代谢的中间产物。有些酵母菌如酿酒酵母在嫌气条件下具有将糖转化为乙醇和二氧化碳的能力。 一、材料方法 1、1仪器 250mL三角瓶、500mL三角瓶、电子天平、玻璃棒、大小烧杯、100mL量筒、高压蒸汽灭菌锅、药匙、培养皿、分光光度计（带比色皿两只）、高速离心机容量瓶垂直平板电泳槽 1、2方法 吸光值的测定、超声波破碎、高速离心、聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、3培养基 Ypd固体培养基（100mL） 取1g酵母膏2g蛋白胨2g琼脂粉溶于90mL蒸馏水震荡摇匀放入灭菌锅121℃高温蒸汽灭菌20分钟； 20g葡萄糖加到100mL蒸馏水溶解后放入灭菌锅，115℃高温蒸汽灭菌20分钟； 将上述药品灭菌完成后，在超净工作台内，用移液枪取葡萄糖溶液10mL加入到培养液中混匀倒平板 Ypd液体培养基（100mL）: 取1g酵母膏2g蛋白胨溶于90mL蒸馏震荡摇匀后放入灭菌锅121℃高温蒸汽灭菌20分钟； 20g葡萄糖加到100mL蒸馏水溶解后放入灭菌锅，115℃高温蒸汽灭菌20分钟； 将上述药品灭菌完成后，在超净工作台内，用移液枪取葡萄糖溶液10mL加入到未凝固
m6A甲基化酶的种类及功能盘点| m6A专题 图1 m6A甲基化加工过程 m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的，包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等共同参与。其中甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A 修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。 表1 RNA甲基化酶类型总结
1．m6A甲基化转移酶 甲基化转移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一类重要的催化酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物（complex）共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。 图2 METTL3-METTL14蛋白复合物晶体结构示意图 结构生物学研究表明，METTL3和METTL14这两种蛋白有关键的催化结构域，两者之间会形成杂络物（hetero complex）。其中METTL3是具有催化活性的亚基，而METTL14会在底物识别上起到关键作用。另外WTAP、Vir以及其他类型的factors也是杂络物的重要组成部分。其中WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。这些蛋白无论在体内（in vivo）还是体外（in vitro）都会一起对腺苷酸进行甲基化修饰。除了人和小鼠等哺乳动物，果蝇、酵母甚至拟南芥中也发现了类似的同源蛋白（homologous protein）。 2．m6A去甲基化酶 在真核生物中，已发现的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。1999年，FTO基因首次在小鼠中被克隆。2007年，三项独立的队列研究分别证实当FTO基因产生突变时，会增加肥胖的风险。同样在小鼠模型中，FTO被敲除或过表
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/6411869276.html, DNA甲基转移酶在肿瘤中的研究进展 作者：裴嘉瑶李洪艳 来源：《科学与财富》2017年第18期 摘要：DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容，DNA甲基化参与了生物体的染色体稳定、遗传印记的维持等正常的生理活动过程。DNA甲基转移酶是负责将甲基转移到DNA上的酶。DNMT1，DNMT3A，DNMT3B是哺乳动物体内发挥作用的三种主要DNA甲基转移酶，它们在细胞内单独或联合起来发挥着功能。本文对DNA甲基转移酶在肿瘤发生发展中的作用加以概述。 关键词：DNA甲基化，DNA甲基转移酶，CpG岛，肿瘤 引言 基因组表观遗传学是相对于传统的遗传学而提出的一个概念，其研究的不是基因序列的改变，而是研究基因组的修饰变化所引起的基因表达改变。这种修饰是可遗传的，可对生物体产生长期效应[1]。DNA甲基化是表观遗传学的一个重要研究内容，是由DNA甲基转移酶催化 完成的，主要包括DNMT 1，DNMT 2和DNMT 3。研究表明，DNA甲基转移酶（DNMTs）缺陷而引起的基因表观遗传改变往往伴随着肿瘤的发生和发展。本文综述了近年DNMTs在肿瘤中的研究进展。 1 DNA甲基化现象 DNA甲基化是哺乳动物基因组最常见的修饰方式。它是在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化下，以甲硫氨酸为供体，将甲基转移到胞嘧啶的第五个碳原子上。DNA甲基化是一个可逆的过程，在体内同时存在着主动或被动的去甲基化过程。 2 DNA甲基转移酶（DNMTs） DNA甲基化修饰是由DNA甲基转移酶催化完成的。目前为止，在哺乳动物体内主要存在三种DNA甲基转移酶，分别命名为DNMT 1，DNMT 2和DNMT 3。其中，DNMT 3又分为DNMT 3A和DNMT 3B两个亚型。DNMT 2，虽然具有与其他的DNMT同源的序列，并且能够甲基化小的tRNAs，但是目前通常认为它不是DNA甲基化酶。 2.1 DNMT 1 DNMT 1是第一个被克隆出来的DNA甲基转移酶。它由N-端的调节区，C-端的催化区组成，该酶的催化能力需要N-端和C-端的相互作用。但也有研究表明，DNMT1的半胱氨酸富 集区可与未甲基化的CpG岛作用。这说明除了催化区域外，DNMT1的其他结构域与酶的活性有重要关系。DNMT 1可以维持基因组中的全部甲基化。一般认为，它主要负责在DNA复制
DNA甲基化及其在食用菌中的研究潜力 前言 DNA甲基化是在DNA上添加甲基基团的一种化学修饰作用，作为一种表观遗传行为，DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能异常，进而引起生物体表型的变化。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，其对遗传物质的影响主要是通过抑制基因表达来起作用。同时，有研究表明，亲代遗传、激素、miRNA、年龄等内源性因素以及温度、湿度、盐离子浓度、重金属等环境因素都对生物体DNA甲基化水平及模式有影响。目前，DNA 甲基化的检测方法种类较多，如甲基化特异性PCR、亚硫酸测序法、限制性内切酶PCR、变性液相高效色谱法等。然而，目前DNA甲基化的研究主要集中在动、植物领域，在应用前景广泛并处于方兴未艾阶段的食用菌领域研究较少。同时，食用菌生长发育容易受到内源性物质以及环境因素的影响，并有研究报道DNA甲基化对蕈菌生长发育有影响。所以，对DNA甲基化在食用菌领域进行深入地研究是十分有必要和有意义的。 什么是DNA甲基化 DNA甲基化是指，在甲基转移酶的作用下，甲基基团从供体转移到DNA的碱基上。在动物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，而几乎所有的5-甲基胞嘧啶都发现与CG 二核苷酸序列中，这种CG二核苷酸序列经常成串存在，俗称CG岛，并
且大约70–80%的CG二核苷酸序列都被甲基化；在植物中，甲基化的胞嘧啶主要出现在B型DNA的沟内,而该部位正是DNA结合蛋白相互作用的部位。 DNA甲基化是被属于一个基因家族的一系列甲基转移酶所催化，这些酶中常见的有Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b等。Dnmt1是一种维持性甲基化酶，它只作用于只有一条链发生甲基化的DNA链，主要通过对亲本甲基化模式进行复制。在减数分裂时，Dnmt1识别DNA双链中只有亲代链发生甲基化的半甲基化位点，并催化甲基基团从供体转移到未甲基化的胞嘧啶上，使该位点双链全甲基化；Dnmt3a和Dnmt3b属于从头甲基化酶，它们则能够使之前没发生甲基化的区域进行甲基化，从而对细胞分化起调控作用。 甲基化的生物学效应及其作用机理 DNA甲基化精确的功能有待进一步研究，目前学术界公认的两类功能是：宿主防御模型和基因调控模型。 宿主防御模型是指，生物体基因组内转座子的甲基化和外源DNA 的甲基化。由于转座子大量地存在于基因组中，并且转座效应对生物体大部分是有害的，而转座子发生甲基化能抑制其转座活性，因此转座子甲基化能够保护生物体免受转座效应带来的威胁；同时，生物体在遭受外源DNA侵袭时，例如病毒基因组和基因片段整合到宿主基因组中，容易产生对机体有害的蛋白质或造成基因结构紊乱。而宿主细胞内甲基转移酶能通过对外源DNA序列进行甲基化，以抑制其对宿主基因组造成伤害。
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
Dam、Dcm和CpG甲基化 原文地址:https://www.doczj.com/doc/6411869276.html,/biotech/exp/TechArticle/2010/c819172778.html DNA 甲基转移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，能将S-腺苷甲硫氨 酸上的甲基转移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。 当使用限制性内切酶消化DNA 时，要考虑是否有甲基化的问题，这是因为如果识别序列中某个特定碱基被甲基化后，切割就会被完全或者不完全阻断。 原核生物甲基化 在原核生物中，DNA 甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌包括三种位点特异性的DNA 甲基化酶。 ?由dam 基因（Dam 甲基化酶）编码的甲基化酶能将甲基转移到GATC 序列中的腺嘌呤N6 位点上（1，2）。 ?由dcm 基因编码的Dcm 甲基化酶，能在CCAGG 和CCTGG （1，3）序列内部的胞嘧啶C5 位置上甲基化。 ?EcoKI 甲基化酶，即M.EcoKI 可将AAC（N6A）GTGC 和GCAC（N6A）GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。 如果限制性内切酶的识别位点是从表达Dam或Dcm 甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。例如，从dam+ E.coli 中分离的质粒DNA 完全不能被识别序列为GATC 的MboI 所切割。 E.coli 菌株中的DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全修饰（因此完全不能被MboI 切割），而λDNA 只有大约50% 的Dam 位点被甲基化，这是因为在λDNA 被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶还没来得及将DNA 完全甲基化。因此，被Dam 或Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些λDNA 进行部分切割。 被Dam 或Dcm 甲基化的限制性位点可以通过克隆DNA 至dam- /dcm- 菌株【如dam- /dcm- E.coli 感受态细胞（NEB #C2925）】进行去甲基化。 如果出现重叠位点，内切酶酶切也会被阻断。在这种情况下，Dam 或者Dcm 序列一部分来自内切酶识别序列，另一部分为识别序列左右旁侧的序列。在设计限制酶酶切时也应考虑到这种情况。 真核生物甲基化 在高等真核生物（如Dnmt1）中发现的CpG 甲基转移酶（CpG MTases），将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的C5 位点。 CpG 甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测CpG 甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用（4）。 注意：在消化真核基因组DNA 时尤其要关注CpG甲基化的影响。需要注意的是，一旦DNA 被克隆到宿主菌中，将不存在CpG 甲基化形式。 甲基化敏感性
Dam、Dcm和CpG甲基化 DNA 甲基转移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。 当使用限制性内切酶消化 DNA 时，要考虑是否有甲基化的问题，这是因为如果识别序列中某个特定碱基被甲基化后，切割就会被完全或者不完全阻断。 原核生物甲基化 在原核生物中，DNA 甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌包括三种位点特异性的 DNA 甲基化酶。 ?由 dam 基因（Dam 甲基化酶）编码的甲基化酶能将甲基转移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位点上（1，2）。 ?由 dcm 基因编码的 Dcm 甲基化酶，能在CCAGG 和 CCTGG （1，3）序列内部的胞嘧啶C5 位置上甲基化。 ? EcoKI 甲基化酶，即 M.EcoKI 可将 AAC（N6A）GTGC 和 GCAC（N6A）GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。 如果限制性内切酶的识别位点是从表达 Dam或 Dcm 甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。例如，从 dam+ E.coli 中分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC 的MboI 所切割。 E.coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全修饰（因此完全不能被 MboI 切割），而λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在λDNA 被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些λDNA 进行部分切割。 被 Dam 或 Dcm 甲基化的限制性位点可以通过克隆 DNA 至 dam- /dcm- 菌株【如 dam- /dcm- E.coli 感受态细胞（NEB #C2925）】进行去甲基化。 如果出现重叠位点，内切酶酶切也会被阻断。在这种情况下，Dam 或者 Dcm 序列一部分来自内切酶识别序列，另一部分为识别序列左右旁侧的序列。在设计限制酶酶切时也应考虑到这种情况。 真核生物甲基化 在高等真核生物（如 Dnmt1）中发现的 CpG 甲基转移酶（CpG MTases），将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的 C5 位点。
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC 区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
分子生物学综述 题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号：
摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法 1 导言 早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的 表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。 1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。