G5操作指南

Please keep text formatting in the document, eg.: text colours, bold/regμlar, and spacing between paragraphs. Do not translate the “tags” = text between “<” and “>”. Keep English.

This makes the layout-work much easier.

Thanks. >

G5操作指南

Recommended use of

G5 Series? by Gardner

Edition 1, May 2007

Vitrolife G5 Series? Manual 1.4

This page is intentionally left blank.

本书版权归Vitrolife AB公司所有

您可以复印，但没有其出版权

Vitrolife AB公司的商标已经在欧洲、美国和其它国家注册。

公司地址：

Vitrolife Sweden AB Faktorvagen

13 SE-434 37 Kungsbacka

Sweden

联系方式：

+46-31-721 80111

或：

3601 South Inca Street

Englewood

Colorado 80110

USA

Tel: +1-866-VITRO US (866-848-7687)

G5, G5系列，G5标语，GIII，GIII系列，GIII标语，G-MM, HSA-solution, G-IVF, G-IVF PLUS, G-1, G-1 PLUS, G-2, G-2 PLUS, G-GAMETE, G-MOPS, G-MOPS PLUS, G-RINSE, G-FreezeKit Blast, G-ThawKit Blast, G-PGD, SpermGrad, HYASE, ICSI, ClearVision and V-Tip全都是Vitrolife AB公司的注册商标。

EmbryoGlue也是Vitrolife AB公司的注册商标。

目录

简介4

概要 5 打开您的Vitrolife产品 5 CO2平衡 6 添加蛋白 6 G-MOPS/ G-MOPS PLUS的建议用法8 如何正确测量PH值10 I V F和培养体系12

精液处理14上游法15 梯度离心法17

体外受精—胚胎移植19取卵19 卵细胞的识别20 卵子培养及受精21 受精21 受精评估21 评分系统22 选择培养体系23 培养系统的准备24 胚胎培养25 胚胎评估27 囊胚评分标准27 评分系统28 囊胚评分表30 囊胚培养操作流程表32 胚胎移植34 放入胚胎34 装载入移植管35

显微操作36 ICSI前卵子脱颗粒36 ICSI操作程序39 ICSI疑难病例分析40 睾丸穿刺活检41 胚胎活检42

胚胎冷冻44仪器及耗材清单44 卵裂期胚胎冷冻46 卵裂期胚胎的冷冻程序举例46 卵裂期胚胎复苏程序48 囊胚冷冻49 囊胚冷冻程序举例49 囊胚复苏51

质量控制程序53

G5系列和相关产品56

G5系列培养液成份58

Swemed器械59

预防和警告61

联系信息63

简介

不断提高成功率

Vitrolife一直致力于提高人类ART成功率，在生殖领域和胚胎领域的长期研究造就了最优秀的IVF培养液。

这本手册叙述的是Dr David K Gardner的Vitrolife G5系列的使用方法。

我们知道ART有很多方法，按我们推荐的方法使用Vitrolife的产品会有更好的结果。

Vitrolife体外授精产品

IVF 培养液

Vitrolife提供最高质量的和最高安全性的产品，每个批号的产品发放到客户之前均经过严格的质量控制测试和鼠胚分析报告，每一批号产品均有相应的质量检测证书。

质量控制遵照现行的ISO 13485：2003和21 CFR Part 820:QSR，认证确保各批号产品之间质量的一致性。所有原料均选自全世界市场上能找到的最佳产品。在用于生产前均通过严格的质量控制程序和鼠胚试验进行检测和独立评测。

Swemed的IVF产品

Vitrolife在IVF治疗上也提供一些器械，例如取卵针、脱颗粒针、ICSI注射针和胚胎活检针、移植管。和培养液一样，这些产品都要进行严格的质量控制，并且以与培养液相同的质量标准来生产。

我们相信您会同意“创造”新生命应该使用最好的环境。为您提供最佳质量的产品是我们的责任。

概要

打开您的Vitrolife产品

当您收到定购的Vitrolife产品时，您可能会注意到它们是采用一种特殊方法包装的，这里有一些特殊的原因：

所有产品都使用特殊封条密封，包装的任何损坏均会被发现。

所有用于包装的原料均为无毒材料，不会对产品产生任何影响。PETG瓶，旋帽，特制标签，培养液封签等均符合上述要求。

G5系列的PLUS培养液，除了G-IVF PLUS之外，均添加了5mg/ml的HSA。G-IVF PLUS添加了10 mg/ml的HSA。除非特别标明，其他的G5培养液都是不含蛋白的，因此需要根据瓶子上的标签添加G-MM（重组白蛋白）或者HSA （血清白蛋白），详见第7页的表格。

要点：

操作产品前先清洗消毒双手。

处理样本时，如血液、卵泡液及精液，必须采取相应的防护措施。

操作：

1.所有产品必须在专用的超净层流工作台（LAF）中打开。

2.在将产品拿入超净台前，确保外瓶清洁，建议使用无纺纱布和酒精擦拭外

瓶。

3.辨识产品并核对有效期，打开封条并丢弃。

4.打开瓶盖并将瓶盖面朝下放在无菌培养皿里；

5.用无菌移液管吸取所需量的液体后，应立即盖好瓶盖并旋紧，注意不要接

触到瓶塞内沿；

6.尽量保持培养液的冷藏温度。在瓶子离开冷藏箱后立即准备好培养皿。培

养液瓶不能置于常温下过长时间（不得超过准备培养皿的时间）。

无菌操作技术不得在可能引起感染或污染的微生物的环境下进行。

注意：一定不要从瓶中倒出液体，因为一旦开瓶后，瓶子的边缘就可能不能保持绝对无菌。

CO2平衡

培养人类胚胎最佳的PH值是在7.2-7.4。

为了获得正确的PH值,全部的G5系列培养液(除了G-MOPS TM/ G-MOPS TM PLUS, G-PGD TM, G-Freezekit Blast TM和G-Thaw Blast TM)都应该在6﹪的二氧化碳中平衡。这个建议值适用于位于或接近0海拔的实验室。对于位于高海拔的实验室, 按照每1000米内增加0.6%的标准调高CO2浓度。

准确的PH值必须要用PH测量设备确认，见第10页

添加蛋白

手册里“添加”这个词会经常用到。这里提到的添加是指是将合适浓度的G-MM TM或

HSA TM加入到本节所述的产品。

G5系列PLUS培养液，G-RINSE TM，G-GAMETE TM和EmbryoGlue?不需要添加蛋白。

除了指明的PLUS外，所有的G5培养液都不含蛋白，培养液中需要加入下表中所列浓度

的G-MM?或者HSA-Solution?。

当选择添加蛋白时应注意HSA是一种来源于血液的物质，有可能含有未知的人类致病源。因此当使用HSA时，这些感染因素的传播风险是不可能完全消除的。G-MM?不使用HSA，取代的是一种人重组白蛋白，有可能会在制造过程中残留极少量发酵抗原（少于0.15ppm）。因为在制造人重组白蛋白的过程中没有使用任何来源于动物或人类的原料，基于产品的生物合成特点，所以不会产生人类或动物来源的感染因素。

除了G-IVF?之外，所有培养液必须加入5%的G-MM?或HSA-solution?（每9.5ml培养液添加0.5ml），G-MM?的最终浓度是2.5mg/ml，而HSA-solution?的则是5mg/ml。

G-IVF?必须加入10%的G-MM?或HSA-solution?（每9.0ml培养液添加

1.0ml）。G-MM?的最终浓度是5 mg/ml，HSA-solution?的最终浓度是10mg/ml。

配制培养液应使用无菌无毒的组织培养级试管或培养瓶。这些容器均应预先经过G-RINSE?清洗，确保容器内没有颗粒物或毒性物质残留。

G-MOPS?，G-1?，G-2?，G-PGD?添加公式

培养液[ml] G-MM? or HSA-solution? [ml] 最终溶液[ml]

9.5 0.5 10.0

19.0 1.0 20.0

28.5 1.5 30.0

38.0 2.0 40.0

47.5 2.5 50.0

57.0 3.0 60.0

66.5 3.5 70.0

76.0 4.0 80.0

85.5 4.5 90.0

95.0 5.0 100.0

G-IVF TM添加公式

培养液[ml] G-MM? or HSA-solution? [ml] 最终溶液[ml]

9.0 1.0 10.0

18.0 2.0 20.0

27.0 3.0 30.0

36.0 4.0 40.0

45.0 5.0 50.0

54.0 6.0 60.0

63.0 7.0 70.0

72.0 8.0 80.0

81.0 9.0 90.0

90.0 10.0 100.0

G-FreezeKit Blast? and G-ThawKit Blast?需要以下面方式添加（请看P49，51）

9.0 ml 冷冻/解冻溶液+ 1.0 ml G-MM?或1.0 ml HSA-solution?

溶液可以直接添加到皿中，直接将每900μl的溶液放入单独的孔中+100μl G-MM?或100μl HSA-solution?

建议每次只添加当天使用的培养液用量。

G-MOPS TM/G-MOP TM PLUS的建议用法

G-MOPS?/G-MOPS?PLUS用于在二氧化碳培养箱外处理操作卵子、配子和胚胎。

要点：

为使卵子和胚胎在CO2培养箱外操作时免受不必要的压力，所以需要尽量快速操作，因为在培养皿之间移动卵子和胚胎以及ICSI时，培养皿盖必须被移开，PH值、温度和渗透压在一段时间后会发生改变。该要求适用于所有培养液，包括G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS在内。

PH值的重要性

G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS是MOPS缓冲液，必须在空气环境中，+37℃时使用。不要将培养液放置在CO2环境中，因为PH值会降到正常值以下。

另外，当覆盖G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS时，也不要使用在CO2环境中平衡过的石蜡油。

温度的重要性

卵子和胚胎任何时候都必须处于+37℃。

为保证试管和培养皿中的G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS的温度在+37℃，建议在整个使用过程中，将一个可靠的温度计放在装有G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS样品的试管/培养皿中，使用时试管放在保温块上，培养皿放在加热平台上，需要调温时，应该分别调整每个加热设备，以达到要求的温度。该做法是为了保证在使用G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS之前其温度达+37℃。

渗透压的重要性

为避免渗透压的变化，试管应该尽量装满并盖紧盖子，未操作时，培养皿内必须用油覆盖或用盖子盖好。

取卵使用G-MOPS?—不需添加蛋白

作为取卵用途的G-MOPS?不需添加蛋白，为确保G-MOPS?在使用之前加温至+37℃，将密封的G-MOPS?瓶放入无CO2的培养箱来预热培养液。瓶盖应旋紧以避免渗透压改变。一瓶G-MOPS?达到+37℃最多可能需要4小时。每次瓶子从加热的培养箱中移走用过以后，都要确保瓶盖紧盖。已经加温并在推荐时间内未使用的G-MOPS?应该废弃，例如，如果在使用前一直是被储存在一个盖紧的试管中，则可以当天使用；如果在培养皿中有至少1ml但是没有覆油，则只能在60分钟内使用；如果用油覆盖保存在恒温台上的皿中，则可以在2个小时内使用。

G-MOPS?用于配子及胚胎操作—需添加蛋白

G-MOPS?用于配子及胚胎操作需要添加蛋白。在超净层流工作台中将G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS用移液管转移至无毒灭菌试管内。应该添加相应容量的G-MM?或HSA-solution?。试管必须装满密封，防止渗透压改变。将试管放入无CO2培养箱内或准确校准的恒温块中。用移液管将预热好的G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS转移至预热好的培养皿内。为避免渗透压改变，配制好以后应尽快使用。例如，如果没有覆油在60分钟（最少1ml液体量）内应尽快使用培养液，如果覆了油请在2个小时内使用。

吸取预热好的G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS到无CO2的培养箱中或加热块上的培养皿，并盖上盖子。为避免渗透压改变，在配制好后的60分钟内使用完，这种情况适合1ml或更大容量的液体。确保培养皿中的温度在+37℃。建议使用可靠的温度计放在恒温台上的G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS培养皿中。调节恒温台的温度设置，保持培养皿内的培养液温度为+37℃。

注意：

确保在清洗步骤时，没有G-MOPS?/ G-MOPS?PLUS带入到培养的皿中。清洗步骤应该有1ml培养液体清洗至少两次。清洗皿应在操作5个卵子或胚胎后更换。

如何正确测量PH值

简介

使用玻璃膜电极和现代设备测量PH值是一种直接的方法。但为尽可能测出最准确的值，有几点易犯的错误必须避免。尤其是在测量含有溶解气体或高蛋白成分的溶液的PH值时。

要点

使用内建参考电极和温度测量的半微量或微量电极来进行。

将设备设置成自动温度补偿。

使用至少一个新鲜的缓冲液，此缓冲液的PH值接近被测溶液的PH值。每次测试请更换缓冲液。

日常测试斜率、偏移等建立函数。

电极出现损耗后尽快更换，一般PH电极使用时间最多12个月，如果使用频繁，应一个月或两个月更换一次。

将PH电极存放在中性的缓冲液或专门的存储液内。

每次测试前请校准。

推荐测量程序

（根据设备及样品特点，可以适当调整下列的具体操作过程）

1.从存储液中取出PH电极，清洗然后放置到PH值为7.00的缓冲液内，取掉用

于隔离电极和空气的塞子或管子。

2.将PH电极放在PH值为7.00的缓冲液内一至两个小时。如果PH电极本来是放

置在PH值为7.00的缓冲液内过夜，这个时间可以适当减少。

3.使用两个干净的缓冲液校准PH电极，一个PH值接近7.00，另一个可以是其

他值，比如10.0。

4.确认PH电极的斜率、偏移在厂家规定范围内。我们建议斜率的理论值在95

至102%之间，PH值为7.00时的偏移和前次校准时，差值在±4mV内。

5.测试PH值大约为8.00（已知值）的缓冲液，确定校准程序正确进行。在实际

的测量温度下比较测量出PH值和已知的PH值。测量的PH值和已知的PH值的差值不能超过±0.05PH单位。

6.将PH电极放在与将要测试的样品同样温度的蒸馏水中。

7.在规定的温度条件下及气体成分中平衡样品，在CO2中平衡可能会需要16个

小时。

8.从蒸馏水中取出PH电极，用干净柔软的纸巾稍微擦去PH电极顶端的水分。

立即将PH电极放入平衡过的培养液里。玻璃泡和参考PH电极的接触点必须被培养液覆盖，如下图a）b）

a) 触点 b)连接套筒

9.PH值一稳定就立即读取。如果测试的培养液是在CO2中平衡的，整个测试过

程必须在培养液离开培养箱的30秒内完成。如果时间超过30秒，样品内的CO2会挥发，培养液的PH值会升高。

10.作为一种控制手段，现成已知PH值的培养液可以与未知PH值的样品平行测

量，这样可以确保整个测试过程正确进行。

11.将所有测试数据、包括校准数据，记录在案。

IVF和培养体系

IVF实验室选择培养体系时，有很多选择。本指南所推荐的是已被多家生殖中心所证实的非常有效的方法。

要点

选择有效、简单和具有可重复性的培养体系。

提前做好组织工作及操作准备。

只使用无毒无菌，专为胚胎培养质控的一次性产品，并把所有项目和操作程序即时记录下来。

严格按照操作规程操作确保每次操作一致。

确保所有的仪器物品功能正常稳定，定期检查和调校。

所有操作必须在专用的洁净工作环境中进行（如超净层流工作台）。

使用无菌技术。

操作人员持证上岗，并且持续进行操作训练操作流程。

处理生物体液时必须戴无毒手套。

操作前必须核对患者身份并在所有使用物品上标注。

精液处理

在IUI、IVF及ICSI之前，活动精子应该从精浆、死精子及其它细胞中分离出来，可以用不同的方法来洗精。

精液处理方法的选择要根据患者病史、以前的精液分析报告以及当前的精液检查结果。另外还要仔细评估是否适用于IVF和ICSI。IVF中需要的精子数量较多。选择精子的处理方法时，基于活力，从理想的角度上考虑只选择活动精子。基于密度，从理想的角度上考虑，只选择成熟精子。如果精子数量及活力均比较好，上游法比较合适。假如精液质量较差而且其中含有很多其他细胞，那么密度梯度离心更好。从精子回收总量的角度来看，密度梯度离心法比上游法更有效。但是，在某些情况下，上游法获得的精子活动率好一些。

要点

精子处理应当在洁净无菌区域进行，而且在处理精液时，应使用无毒无粉手套和防护眼镜。

所有精液样本要收集到无菌无毒的容器中。而且精液处理要尽可能在样本取出后1小时内进行。另外要避免精液样本过冷或过热。

遵守实验室流程，尤其是：获得精液样本后必须马上注明患者详细身份。 用于处理精液的无菌、无毒的试管、针和吸管在使用之前必须用G-RINSE TM 清洗。

上游法

操作

精子上游法主要适用于精子数量与活动力比较好的精液。

1．取出后的精液首先要液化20分钟。如果精液不液化，可以用23G针头或细的巴斯德吸管吹打。

液化20分钟

2．显微镜下评估并决定精液处理方法。

3．在试管上标明患者编号。如果担心精子质量，也可以多做几个试管。

4．用吸管在每个清洗过的试管中添加1.0ml精液，根据精液量做2-4个试管。在上面小心加入2.0ml平衡过并已添加蛋白的G-IVF?/G-IVF? PLUS。将上游管斜放入37°C 6%CO2的培养箱中30到60分钟。

在37°C 6%CO2条件下孵育30–60分钟

a：G-IVF TM/G-IVF TM PLUS b：精子

5．将上层培养液吸出并转移到另一洁净的试管中，不要接触到底层精子，添加5ml平衡好已添加蛋白的G-IVF?/ G-IVF? PLUS，混匀，300－600g离心10分钟。

转移上层培养液。添加G-IVF?/ G-IVF? PLUS稀释离心

6．吸除上清液,加5ml平衡好已添加蛋白的G-IVF?/ G-IVF? PLUS并重新悬浮，重复离心，300到600g需10分钟.

吸除上层液体，重复洗涤

7．吸除上层液体，混匀。根据样品的质量，在0.5-1.0ml平衡好已添加蛋白的G-IVF?/G-IVF? PLUS中重新悬浮。

在少量G-IVF?/ G-IVF? PLUS中重新悬浮

8．检测上游后精子的活力和浓度。

9．用平衡好已添加蛋白的G-IVF?/ G-IVF? PLUS稀释精子，最终密度应为75,000－200,000个活动精子/ml。

10．用0.5-1ml精子准备授精皿（清洗过的），在使用之前至少在37°C 6 %CO2条件下平衡2小时.

另一种方法:加入平衡好的精子悬浮液到已经平衡好的卵母细胞皿中.

建议授精时，在0.5到1.0ml的容量，不覆油（必须确保培养箱的湿度）。如果已经覆盖了油,液滴大小建议至少是100μl.

梯度离心法

密度梯度离心法适用于所有精液样本。

SpermGrad?是含有用硅烷表面处理的硅胶颗粒的等渗平衡盐溶液。通过不同的稀释倍数能够获得不同浓度的SpermGrad?。小心地加入不同浓度的液体会建立这种梯度。具有不同悬浮密度的细胞及其他颗粒会慢慢沉淀至密度较高的梯度溶液，离心将会加速沉淀速度。通用的方法是90%－45%两步梯度法，因为外部紧密包裹的DNA的成熟精子密度高于90%的SpermGrad?，因而可以通过这层液体并达到离心管底部，而其他类型的细胞包括未成熟精子和死精会在90%

或45%的液表面上终止沉淀。我们推荐用添加了蛋白的G-IVF?或G-IVF? PLUS将SpermGrad?稀释成90%和45%的浓度梯度。G-IVF?应该添加G-MM?或是HSA?.

G-IVF?/G-IVF? PLUS使用前都需要在37°C 6%CO2条件下平衡。

操作

1．用添加了蛋白的G-IVF?或G-IVF? PLUS将SpermGrad?稀释成90%和45%两种梯度的液体，如制备90%梯度需要9.0ml SpermGrad?和1.0ml添加了蛋白的G-IVF?，制备45%梯度需要4.5ml SpermGrad?和5.5ml添加了蛋白的G-IVF?，充分混匀。并存储于无菌无毒试管或无菌组织培养瓶内。贴上标签冷藏储存备用。每次为精液准备用无菌无毒吸管吸取配好的溶液。储存容器表面要标上配置日期及报废时间（见瓶上包装标志）。使用前恢复至室温。

2．根据患者的精液样本量用2-4个锥形无菌离心管进行铺层并标记患者编号。首先用吸管在离心管中加入90%溶液1.5ml，然后在其上层缓慢加入1.5ml的45%溶液。最后，在顶层缓慢加入1.0ml精液，见图A。编制2-4个梯度管。最多只能加2ml精液在梯度表面。如果精液样本质量正常可减少加入的精液量。

添加过多的精液将会影响分离效果。

A加梯度液和精液样本到锥形离心管300g-600g离心20分钟

a)精液b)45% c)90%

3．300–600g离心10-20分钟。

4．小心除去上面两层液体，不要在管壁残留任何残渣（B图）。

用吸管移出沉淀的精液微滴，尽量少携带90%的梯度液，转移到加好5ml G-IVF?/G-IVF? PLUS的锥形离心管中。

5．300–600g离心10分钟。

6．吸除表面液体，重复冲洗（C）。第二次冲洗后，用平衡好的1ml G-IVF?/G-IVF? PLUS将离心沉淀物重新悬浮（D）。然后检查精子的活动力及其浓度。

B除去上层液体，将沉淀物转移到干净试管。

a:精子C 用G-IVF?/ G-IVF?PLUS冲洗沉

淀物，重复冲洗。

D用少量G-IVF?/ G-IVF?PLUS将离心

沉淀物重新悬浮。

7．用平衡好已添加蛋白的G-IVF?/G-IVF? PLUS稀释清洗过的精子，最终精子密度应为75,000－200,000个活动精子/ml。

8．用0.5-1.0ml精子准备授精皿，在使用之前至少在37°C 6%CO2条件下平衡2小时。

另一种方法:加精子悬浮液到已经准备好的平衡好的卵细胞皿中.

建议在0.5到1.0ml内不覆油授精（但须确保培养箱湿度）。如果覆油,建议使用单个体积至少是100μl的液滴。

体外受精－胚胎移植

Vitrolife针对胚胎发育的各个时期研制了单独的培养液。

受精过程要用G-IVF?/G-IVF? PLUS。而卵裂期胚胎和早期胚胎培养要用G-1?/G-1? PLUS。从第3天至囊胚期培养用G-2?/G-2? PLUS。ICSI后的胚胎可以直接放入G-1?/G-1? PLUS进行培养。不管哪个时期的胚胎移植，都需要添加EmbryoGlue?或G2?/G2? PLUS。

取卵

卵细胞收集的目标是尽可能快地获得大量卵子，尽量减少在非生理环境下暴露的时间。重要的参数是：温度、渗透压、PH值。任何与生理环境间产生的偏差都会不利于卵细胞的正常受精和植入前的发育。

要点

Day0是指卵细胞收集的时间。

在取卵前要确认病人身份，并检查培养皿和吸管的编号标签。

确保所有与卵细胞接触的物品是复温的并无菌、无毒，达到组织培养级。

尽量使用通过鼠胚测试的产品。

取卵过程在超声引导下使用单腔或双腔针，推荐使用的取卵针类型，参见59页的Swemed器械：卵泡取卵针，V-Tip TM 等。使用时，通常通过可以精细控制的负压泵对针进行负压操作。

过高或不受控制的负压可能会损伤卵子。

预热好的G-MOPS?操作过程中是作为清洗液来使用的。

G-MOPS?是修正G1后的培养液，通过MOPS和重碳酸钠缓冲，在室温下维持PH值稳定。

由于卵泡液内蛋白质含量较高，不含蛋白质的G-MOPS?用于卵泡收集和冲洗。

在卵细胞放入添加了蛋白的G-IVF?/G-IVF? PLUS培养前，应该使用预热好的、添加了蛋白的G-MOPS?/G-MOPS? PLUS清洗。

通过G-GAMETE TM在37°C 6%CO2条件下平衡，可以作为上述方案的替代方案（即代替用添加了蛋白的G-MOPS?/G-MOPS? PLUS清洗）。

建议一个冲洗皿最多用于五个卵泡。