DOI :10.11895/j.issn.0253-3820.140200
温控离子液体分散液液微萃取结合高效液相色谱法检测脐橙中染色剂残留
张耀海1,3 张雪莲2 赵其阳1,3 陈卫军1,3 王成秋1,3
陈爱华1,3 焦必宁*1,3
1
(农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆),西南大学柑桔研究所,重庆400712)
2
(襄阳市林业科学技术推广站,襄阳441021)
3
(农业部柑桔及苗木质量监督检验测试中心,重庆400712)
摘 要 建立了QuEChERS-温控离子液体分散液液微萃取结合高效液相色谱法快速检测脐橙中5种染色剂残留的分析方法三QuEChERS 前处理步骤:样品用乙腈快速提取,NaCl 和无水MgSO 4除水后,经N -丙基乙二胺净化三温控离子液体分散液液微萃取步骤:QuEChERS 前处理的净化液(1mL)为分散剂,1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体(60μL)为萃取剂,55℃水浴12min,将目标物富集三用高效液相色谱-紫外检测器分析,检出样品用超高效液相色谱-串联质谱确证三在0.01和0.05mg /kg 的添加水平下,5种染色剂的平均回收率为70.3%~93.6%,相对标准偏差为3.5%~9.2%,定量限为1.1~2.8μg /kg三关键词 QuEChERS;分散液液微萃取;离子液体;高效液相色谱;染色剂
2014-05-18收稿;2014-06-19接受
本文系农业部现代农业(柑桔)产业技术体系建设专项(No.CARS-27)二重庆市自然科学基金(Nos.cstc2013jjB80009,cstc2013jcyjA0435)和中央高校基本科研业务费(No.XDJK2012C059)资助项目*E-mail:jiaobining@https://www.doczj.com/doc/6311620998.html,
1 引 言
柑橘红2号和苏丹红(分为1二2二3二4号)均属于常见的人工合成色素(分子结构见图1)三毒理学研
究表明,柑橘红2号有潜在的致癌危险[1],而苏丹红1二2二3二4号均具有致突变性和致癌性,苏丹红1号还可能造成肝脏细胞的DNA 突变三各国对人工合成色素在食品中允许使用的品种二范围和添加量做了严格的规定三多数国家禁止将苏丹红用于食品生产;美国食品药品管理局(FDA)明确规定,柑橘红2号仅限用于鲜食早熟甜橙的果皮增色,全果中最大残留量不得超过2mg /kg;我国GB 2760-2011‘食品添加剂使用标准“明确规定,柑橘红2号和苏丹红在食品中不允许使用
三
图1 5种染色剂的分子结构式
Fig.1 Structure of 5dyes
2004年广东和香港等地水果市场相继发现 染色橙 ,含有柑橘红2号三2013年部分市场出现 染
色脐橙 ,检测出苏丹红2号三近年,政府相关部门加大了食品中柑橘红2号和苏丹红等染色剂的监测
第42卷2014年10月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry
第10期1434~1440
力度三目前,果蔬(以橙二辣椒和番茄为主)中柑橘红2号和苏丹红等染色剂,其检测方法主要包括高效液相色谱法(二极管阵列检测器(HPLC-DAD)[2~6]和紫外检测器(HPLC-UV)[7])和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS /MS
[8~10]
)等,但柑橘红2号和苏丹红同时测定的报道较少三而样品前处理方法多为繁
琐二耗时二成本较高的液液萃取(LLE)[3,6,7]和固相萃取(SPE)技术[2,4,8~10]三
近年来,样品前处理方法正朝着简单化二节约化和微型化发展三2003年,Anastassiades 等首次提出
QuEChERS 前处理方法,与传统的SPE 相比,该方法快速二简单二廉价二可靠,已经广泛应用于果蔬中的农药残留分析[11~13]三但QuEChERS 方法存在富集效率低等缺陷三2006年,Rezaee 等首次提出分散液液微萃取(CDLLME)技术,该技术操作简单二快速二成本低二富集效率高二有机溶剂用量少[14]三传统的DLLME 使用高毒性的卤代烃作为萃取剂,存在一定的环境污染三同卤代烃相比,离子液体具有低蒸气压二良好的热稳定性二可调的理化性质等优点,因此基于离子液体的DLLME 技术已经被逐渐应用于污染物的分析检测[15,16]三但该方法仍存在净化能力差等缺陷,主要用于简单基质(以水体为主),在果蔬上的应用相对较少三2009年,研究者将两种前处理方法结合起来,形成了QuEChERS-DLLME 联用技术,既具有QuEChERS 的快速提取二净化等优点,也发挥了DLLME 的高效富集能力,并逐渐应用到果蔬中污染物的分析检测[17,18],但目前没有染色剂的研究报道三
本研究采用QuEChERS-温控离子液体DLLME 法提取和净化样品,对离子液体的类型和用量二水浴
时间和温度等条件进行了优化,结合HPLC-UV 技术检测脐橙中多种染色剂残留三本方法简便二快速二安全二价格低廉,重现性良好,能够满足脐橙中5种染色剂残留同时快速检测和确证的要求,并为制定染色剂在柑桔中的最大残留限量提供参考和依据三
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与样品
Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent 公司),配有紫外检测器;Quatrro-Premier XE 超高效液相色
谱-串联质谱(美国Waters 公司),配有Acquity UPLC BEH C 18柱;Milli-Q A10超纯水器(美国Millipore 公司);CL31R 离心机(美国ThermoFisher 公司);GENIUS 3涡旋搅拌器(德国IKA 公司)三
苏丹红1号(纯度>90.5%)二苏丹红2号(纯度>87%)二苏丹红3号(纯度>96%)和苏丹红4号(纯度>94%),均购于德国Dr.Ehrenstorfer 公司;柑橘红2号(纯度>90%)二1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C 8MIM][PF 6],纯度>98%)二1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C 4MIM][PF 6],纯度>98%)和1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C 6MIM][PF 6],纯度>98%),均购于上海安谱科学仪器有限公司;丙酮(色谱纯,成都市科龙化工试剂厂);乙腈(色谱纯)二甲醇(色谱纯)和N -丙基乙二胺(PSA,40~63μm,6nm),购于德国CNW Technologies GmbH 公司;NaCl 和无水MgSO 4(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,
140℃烘烤4h)三脐橙样品购于当地超市三
2.2 实验方法
2.2.1 液相色谱条件 Agilent C 18液相色谱柱(150mm?4.6mm,5μm);流动相A 为水,B 为乙腈;梯度洗脱程序:0~6min,60%~98%B;6~15min,98%B;15~20min,98%~60%B;20~25min,60%B三流速为1.0mL /min;进样量为10μL;柱温为35℃三
2.2.2 超高效液相色谱-串联质谱条件 条件参考文献[9]三采用电喷雾离子源,正离子(ESI+)采集模式,多反应监测模式下检测三毛细管电压
3.0kV,离子源温度120℃,脱溶剂气温度为350℃,雾化气流速700/h,锥孔气流速50L /h三
2.2.3 标准溶液的配制 (1)标准工作液 准确称取10.00mg(精确至0.01mg)5种染色剂标准品,分别用甲醇溶解并定容至100.00mL,配成100mg /L 标准溶液,于-50℃避光保存三使用时用甲醇逐级稀释至所需浓度三(2)基质空白标准溶液 分别准确吸取100μL 10mg /L 标准工作液,用样品空白提取液稀释,配成100μg /L 基质空白标准溶液三此溶液应现用现配三本实验采用单点定量法测定三2.2.4 样品前处理方法 样品的取样参考相关标准[19]三用干净纱布轻轻擦去柑桔样品表面附着物,5
341第10期张耀海等:QuEChERS-温控离子液体分散液液微萃取结合高效液相色谱法检测脐橙中染色剂残留
采用对角线分割法,取对角部分,将其切碎二混匀,放入食品加工器中彻底粉碎,制成待测样,放入分装容器中备用三
QuEChERS前处理步骤:准确称取样品10.0g,置于50mL离心管中,向其加入10.00mL乙腈,振荡30min;加入4.0g无水MgSO4和1.0g NaCl,振荡1min,离心5min(4000r/min);取2.00mL,转入已加有50mg PSA和150mg无水MgSO4的4mL离心管中,振荡1min,离心5min(4000r/min);取1.00mL上清液作为DLLME步骤的分散剂三
温控离子液体DLLME步骤:将60μL1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和上述1.00mL分散剂混合液涡旋1min,快速注入5.00mL去离子水,于55℃水浴12min,冰水浴10min,形成乳浊液,离心5min (4000r/min),取30μL离心管底部的萃取剂于进样瓶的内插管中,用30μL甲醇稀释,待测三加标实验:加标水平为0.01和0.05mg/kg两个水平,分别向10.0g空白样品中加入100μL的1和5mg/L标准溶液,混匀备用三前处理如上三
脐橙染色实验:常温下,空白脐橙样品分别在不同浓度染色剂(250和500mg/kg)中浸泡,每次浸果时间为1min,浸果1次,捞起自然晾干药液,置于室内常温7天,每一处理重复3次,前处理如上三
3 结果与分析
3.1 仪器条件的优化
柑橘红2号和苏丹红均为中等极性化合物,在C18色谱柱有较好的保留,因此本实验选常用的C18液相色谱柱三由于乙腈的粘度小于甲醇,因此流动相采用乙腈-水体系,并梯度淋洗,优化后的标准色谱图见图2三5种物质在14min内达到基线分离三
3.2 样品前处理的条件优化
3.2.1 离子液体的类型和用量在分散液液微萃取中,萃取剂和分散剂的类型和用量是影响萃取效率的重要因素三而QuEChERS-DLLME联用技术中,通常采用乙腈提取液作为分散剂,因此只需考虑萃取剂的类型和用量三本研究选择3种离子液体:[C8MIM][PF6]二[C4MIM][PF6]和[C6MIM][PF6],考察它们对染色剂的萃取效果三结果表明,[C8MIM][PF6]的萃取效果最好,故选其为萃取剂三分别选取40二50二60二70和80μL的[C8MIM][PF6],考察其用量对染色剂回收率的影响(图3)三结果显示:随着萃取剂用量的增大,5种染色剂的回收率均增大,但富集倍数也随之降低;当用量为60μL时,回收率最
佳;用量高于60μL时,回收率有下降的趋势三因此选用60μL萃取剂
三
图2 5种染色剂标准溶液的色谱图(浓度为0.5mg/L) Fig.2 HPLC of5dyes standards at0.5mg/L
1.Citrus red2;
2.Sudan1;
3.Sudan2;
4.Sudan3;
5.Sudan
4.图3 萃取剂用量对染色剂回收率的影响Fig.3 Effect of extraction dosage on recoveries
脐橙空白添加0.05mg/kg,水浴温度为60℃,水浴时间为12min三
Spiked navel orange at0.05mg/kg,60℃water-bath for12min.
3.2.2 水浴温度温控离子液体-分散液液微萃取
技术是在一定温度下将离子液体融入水体中,然后
在低温条件下将离子液体冷凝析出,达到富集目标化合物的目的[15]三当温度较低时,离子液体不能很好地分散在水相中;当温度过高时,分析物可能部分挥发,导致萃取效率降低三分别选取40,45,50,55 6341分析化学第42卷
和60℃的水浴温度,考察其对染色剂回收率的影响(图4)三结果表明,随着温度升高,5种染色剂的回收率均有提高,当温度为55℃时,回收率最佳;温度高于55℃时,回收率开始降低三因此水浴温度选用
55℃三
3.2.3 水浴时间 固定水浴温度为55℃,选取4,8,12,16和20min 的水浴时间,考察其对染色剂回收率的影响(图5)三结果表明,随着水浴时间延长,5种染色剂的回收率均有提高,当时间为12min 时,回收率最佳;时间超过12min 时,回收率明显降低三因此水浴时间选用12
min三
图4 水浴温度对染色剂回收率的影响
Fig.4 Effect of water-bath temperature on the recoveries
脐橙空白添加0.05mg /kg,萃取剂用量为60μL三
Spiked navel orange at 0.05mg /kg,60μL of extraction
solvent.
图5 水浴时间对染色剂回收率的影响
Fig.5 Effect of water-bath time on the recoveries
脐橙空白添加0.05mg /kg,萃取剂用量为60μL,水浴温度为55℃三
Spiked navel orange at 0.05mg /kg,60μL of extraction solvent and 55℃of water-bath temperature.
3.3 其它条件
进一步考察了超声辅助二盐效应二冰浴时间和离
心时间对萃取效率的影响三超声辅助的引入,会带来更多的基质干扰,本实验不采用超声;加入盐后会导致回收率明显降低,本实验不加入盐;冰浴时间和离心时间能影响沉淀相的体积,过短或过长的冰浴时间及离心时间都会影响萃取效率三本研究采用文献中较常用时间:冰浴10min,4000r /min 离心5min三
3.3 方法评价
在优化的实验条件下,对系列浓度标准溶液进行检测,结果见表1三柑橘红2号和苏丹红4号在
图6 经QuEChERS-DLLME 方法处理后,脐橙样品的色谱图(a)0.05mg /kg 水平加标;(b)0.05mg /L 标准溶液;(c)空白基质Fig.6 Chromatograms of (a)a spiked navel orange at 0.05mg /kg
after
QuEChERS-dispersive
liquid-liquid
microextraction (DLLME ),(b )a standard mixture at
0.05mg /Land (c)a blank navel orange
1.Citrus red 2;
2.Sudan 1;
3.Sudan 2;
4.Sudan 3;
5.Sudan 4.
10~5000μg /L 范围内呈现较好的线性关系,苏丹红1二2和3号在5~5000μg /L 范围内呈现较好的线性关系,相关系数均达到0.999以上三仪器的检出限(S /N =3)在5~10μg /L 之间,定量限(S /N =10)在10~20μg /L 之间三保留时间和峰面积的日内偏差分别为0.8%~1.6%和1.2%~3.2%;日间偏差分别为1.6%~2.7%和3.8%~6.6%三采用QuEChERS-DLLME 联用技术处理样品,富集倍数达
7.1~9.4,净化效果良好,对目标物质无干扰(脐橙空白基质和0.05mg /kg 水平加标的图谱见图6)三
用空白基质加标方法进行回收率和精密度实验三分别进行0.01和0.05mg /kg 水平的加标回收实验,以2.2.4节的方法对样品进行前处理,平行测定6次,计算回收率和相对标准偏差(表2)三结果表明:2种添加水平的回收率在70.3%~93.6%之间,相对标准偏差在3.5%~9.2%之间,本方法有较好的准确度和精密度,满足染色剂残留定量分析的要求三方法的检出限0.5~1.2μg /kg 之间,定量
限在1.1~2.8μg /kg 之间三
7
341第10期张耀海等:QuEChERS-温控离子液体分散液液微萃取结合高效液相色谱法检测脐橙中染色剂残留
表1 5种染色剂的线性范围二线性方程二检出限二定量限和富集倍数
Table 1 Linearity range,linear equation,limit of detcetion (LOD),limit of quantification (LOQ)and enrichment factor of 5dyes
染色剂Dyes 线性范围Linearity range (μg /L)线性方程Linear equation 相关系数Correlation coefficient (r 2)检出限LOD (μg /L)定量限LOQ (μg /L)富集倍数Enrichment factor 精密度Precision (%)
日内偏差Intra-day
(n =3)保留时间Retention time 峰面积
Peak area 日间偏差Inter-day
(n =3)
保留时间Retention time 峰面积Peak area 柑橘红2号Citrus red 210~5000y =24.269x +0.15890.999910209.4 1.6 1.7 1.8 4.3苏丹红1号Sudan 15~5000y =31.117x +0.22740.99985108.9 1.8 1.2 2.1 5.9苏丹红2号Sudan 25~5000y =32.177x +0.06990.99995108.60.8 2.8 2.7 3.8苏丹红3号Sudan 35~5000y =50.397x +0.14410.99985107.90.9 2.1 1.6 6.6苏丹红4号Sudan 4
10~5000
y =53.782x +0.2534
0.9998
10
20
7.1
0.9
3.2
2.3
4.4
表2 5种染色剂的平均回收率二相对标准偏差二检出限和定量限
Table 2 Mean recovery,relative standard deviation (RSD),limit of detection (LOD)and limit of quantification (LOQ)of 5dyes
染色剂Dyes
添加水平Added (mg /kg)
平均回收率Mean recovery (%)
相对标准偏差RSD (%,n =6)
检出限LOD (μg /kg)
定量限LOQ (μg /kg)
柑橘红2号Citrus red 2苏丹红1号Sudan 1苏丹红2号Sudan 2苏丹红3号Sudan 3苏丹红4号Sudan 4
0.0189.27.50.0593.6 4.30.0187.59.20.0589.27.00.0181.3 6.20.0585.5 3.90.0176.4 4.60.0579.1 3.50.0170.3 6.30.05
71.0
4.7
1.0
2.10.5 1.10.6 1.20.6 1.31.2
2.8
3.4 实际样品测定
市场抽取脐橙样品各20份,采用上述方法,检出1例疑似样品,并用UPLC-MS /MS 进行确证三图7为 图7 实际样品的色谱图Fig.7 Chromatogram of real sample
检出柑橘红2号的脐橙样品色谱图(含量为0.14mg /kg),图
8为该样品多反应监测模式下的色谱图三
空白脐橙分别用250和500mg /kg 的染色剂药液浸泡
后,室温下放置7天,最终残留测定结果见表3三在
250mg /kg 下,果皮中染色剂含量范围为421.2~
867.4μg /kg,果肉中为2.0~22.1μg /kg,全果中为101.6~198.8μg /kg;在500mg /kg 下,果皮中染色剂含量范围为604.4~1384μg /kg,果肉中为5.2~24.4μg /kg,全果中为156.4~370.7μg /kg三结果表明,浸泡后,染色剂可以通过果皮缓慢进入果肉内部,但含量较低;苏丹红3号和
4号的渗透能力较强,超过10μg /kg;柑橘红2号二苏丹红1号和2号的渗透能力较低,低于10μg /kg;全果中柑橘红2号的最大含量低于FDA 规定的最大限量三
8341 分析化学第42卷
图8 多反应监测模式下实际样品的色谱图Fig.8 UPLC-MS /MS chromatogram of real sample using MRM mode
a.m /z 309.3>278.3;
b.m /z 309.3>153.3.
表3 脐橙染色后果皮二果肉和全果中染色剂残留的含量
Table 3 Contents of dyes in peel,pulp and whole fruit of navel orange after dyeing treatment
染色剂Dyes
含量Contents (μg /kg)
浸泡浓度Soaking concentration (250mg /kg)果皮Peel 果肉Pulp 全果Whole fruit
浸泡浓度Soaking concentration (500mg /kg)果皮Peel 果肉Pulp 全果Whole fruit
柑橘红2号Citrus red 2867.4 2.1198.81272 5.4347.7苏丹红1号Sudan 1818.0 2.2186.11384 5.2361.3苏丹红2号Sudan 2870.3 2.0195.81381 6.0370.7苏丹红3号Sudan 3421.214.0101.660417.1156.4苏丹红4号Sudan 4544.8
22.1
134.1
711
24.4
194.6
未检出(Not detected)三
4 结 论
运用改进的QuEChERS 和TA-IL-DLLME 联用前处理技术,结合高效液相色谱法,建立了脐橙中多种染色剂残留的检测方法三该方法操作简单二快速准确二灵敏度高二重现性良好,检测成本低廉;避免了有机溶剂的大量使用,减少对环境的污染,可作为一般实验室多种染色剂残留的常规检测方法三References
1 FAO Nutrition Meetings Report Series No.46A WHO /FOODADD /70.36/World Health Organization and International Programme on Chemical Safety.[2012-03-01].https://www.doczj.com/doc/6311620998.html, /documents /jecfa /jecmono /v46aje10.htm
2 Hope C,Connors R.J.AOAC International ,1989,72(5):705-707
3 CHEN Yu-Fang,LIN Hai-Dan,LI Wei-Peng,XIE Yu-Shan,ZOU Zhi-Fei.PTCA Part B :Chem.Anal.,2011,47(5):536-538
陈毓芳,林海丹,李为鹏,谢玉珊,邹志飞.理化检测:化学分册,2011,47(5):536-538
4 HU Li,ZHONG Ling-Li,GUO Ling-An,YANG Xiao-Feng,MAO Jian-Fei,LI Xi,FU Cheng-Ping,ZHAO Hong-Yang.
J.Food Safety and Quality ,2013,4(5):1473-1477胡莉,仲伶俐,郭灵安,杨晓凤,毛建霏,李曦,付成平,赵泓洋.食品安全质量检测学报,2013,4(5):1473-1477
5 Sun S,Wang Y,Yu W Z,Zhao T Q,Gao S Q,Kang M Q,Zhang Y P,Zhang H Q,Yu Y.J.Sep.Sci.,2011,34(14):1730-1737
6 Daood H G,Biacs M A.J.Chromatogr.Sci.,2005,43(9):461-465
7 Ertas E,Oezer H,Alasalvar C.Food Chem.,2007,105(2):756-760
8 ZHANG Yun,LI Jin-Zhong,ZHENG Jing-Feng,LI Yao-Ping,LüYuan-Yuan,ZHANG Xin-Ren,LI Xiao-Jie.Chinese J.
https://www.doczj.com/doc/6311620998.html,b.,2012,31(12):78-81
张云,李今中,郑敬峰,李耀平,吕园园,张信仁,李晓捷.分析试验室,2012,31(12):78-81
9
341第10期张耀海等:QuEChERS-温控离子液体分散液液微萃取结合高效液相色谱法检测脐橙中染色剂残留
0441分析化学第42卷9 HU Li,LEI Shao-Rong,GUO Ling-An.Chinese Journal of Chromatography,2012,30(8):832-835
胡莉,雷绍荣,郭灵安.色谱,2012,30(8):832-835
10 Han C,Liu B,Zhu Z O,Huang F Z,Chen X Z,Shen Yan.J.Food Sci.,2012,77(12):C1269-C1272
11 Anastassiades M,Lehotay S J,Stajnbaher D,Schenck F J.J.AOAC International,2003,86(2):412-431
12 GUO Meng-Meng,WU Hai-Yan,LI Zhao-Xin,TAN Zhi-Jun,ZHAI Yu-Xiu.Chinese J.Anal.Chem.,2013,41(9): 1322-1327
郭萌萌,吴海燕,李兆新,谭志军,翟毓秀.分析化学,2013,41(9):1322-1327
13 Lehotay S J,Kok A D,Hiemstra M,Bodegraven P V.J.AOAC International,2005,88(2):595-614
14 Rezaee M,Assadi Y,Hosseini M R M,Aghaee E,Ahmadi F,Berijani S.J.Chromatogr.A,2006,1116(1-2):1-9
15 Zhou Q,Bai H,Xie G,Xiao J.J.Chromatogr.A,2008,1188(2):148-153
16 Baghdadi M,Shemirani F.Anal.Chim.Acta,2008,613(1):56-63
17 Zhao E,Zhao W,Han L,Jiang S,Zhou Z.J.Chromatogr.A,2007,1175(1):137-140
18 Cunha S C,Fernandes J O.J.Chromatogr.A,2011,1218(43):7748-7757
19 GB/T8855-2008,Fresh Fruits and Vegetables-Sampling.National Standards of the People′s Republic of China
新鲜水果和蔬菜-取样方法.中华人民共和国国家标准.GB/T8855-2008
Analysis of5Dyes Residues in Navel Orange with Temperature-
assisted Ionic Liquid Dispersive Liquid-liquid Microextraction
and High Performance Liquid Chromatography Detection
ZHANG Yao-Hai1,3,ZHANG Xue-Lian2,ZHAO Qi-Yang1,3,CHEN Wei-Jun1,3,
WANG Cheng-Qiu1,3,CHEN Ai-Hua1,3,JIAO Bi-Ning*1,3
1(Citrus Research Institute,Southwest University/Laboratory of Citrus Quality and Safety Risk Assessment,
Ministry of Agriculture,Chongqing400712,China)
2(Extending Stations of Forestry Science and Technology,Xiangyang441021,China)
3(Quality Supervision and Testing Centre for Citrus and Seedling,Ministry of Agriculture,Chongqing4007123,China) Abstract A fast method composed of the quick,easy,cheap,effective,rugged and safe(QuEChERS)and temperature-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction(TA-IL-DLLME)sample preparation coupled with high performance liquid chromatography(HPLC)for the analysis of5dyes residues in navel orange was developed.The QuEChERS sample preparation involved the quick extraction with acetonitrile in the presence of anhydrous MgSO4and NaCl and the purification with primary secondary amine(PSA) sorbent.The TA-IL-DLLME sample preparation was processed using1mL of the extract obtained by QuEChERS as dispersive solvent and60μL of1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate as extractive solvent under55℃of water-bath temperature and12min of water-bath time.The ultimate solution was detected by HPLC-UV and the contaminated sample was further confirmed by UPLC-MS/MS under multiple reactions monitoring(MRM)mode.The recoveries of five dyes were in the range from70.3%to93.6%at two spike levels of0.01and0.05mg/kg,the relative standard deviations(RSDs)were between3.5%and 9.2%and the limits of quantification(LOQs)were between1.1and2.8μg/kg.
Keywords Quick-easy-cheap-effective-rugged and safe method;Dispersive liquid-liquid microextraction; Ionic liquid;High performance liquid chromatography;Dyes
(Received18May2014;accepted19June2014) This work was supported by the China Agriculture Research System(No.CARS-27),the Natural Science Foundation of Chongqing (Nos.cstc2013jjB80009,cstc2013jcyjA0435),and the Fundamental Research Fund for the Central Universities(No.XDJK2012C059).
仪器分析练习题（二）——高效液相色谱法部分 一、选择题 1. 分离一组高聚物（分子量>2000）时最宜采用的色谱方法是（D ） A. 气固色谱 B. 反相键合相色谱 C. 离子交换色谱 D. 凝胶色谱 2. Si-O-Si-C型的18烷基固定相可用于（ B ） A. 正相色谱 B. 反相色谱 C．离子交换色谱 D. 空间排阻色谱 3. 反相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（A ）。 A. 增大 B. 减小 C. 不变 D. 不能确定 4. 下列试剂中可作为正相色谱流动相的是（C D ）。 A. 水 B. 甲醇 C．乙腈 D. 正已烷 5. 在惰性担体表面健合上基团－SO3ˉ后的离子交换树脂称为（ B ）。 A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂 C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂 6. 分离一组高沸点的物质时最宜而是采用的色谱方法是（D ）。 A. 气液色谱 B. 气固色谱 C. 毛细管气相色谱 D. 液相色谱 7. 应用正相色谱法分析一组组分时，组分的出峰顺序为（A ）。 A. 极性小的组分先出峰 B. 极性大的组分先出峰 C. 分子量小的先出峰 D. 分子量大的先出峰 8. 火焰光度检测器是（ C ）检测器。 A. 通用型、质量型 B. 通用型、浓度型 C. 选择型、质量型 D. 选择型、浓度型 9. 梯度洗脱适用于下列哪种色谱分析方法是（ C ）。 A. 气液色谱 B. 液液分配色谱 C. 凝胶色谱 D. 反相键合相色谱 10. 下列试剂中最适宜作为反相色谱流动相的是（ A ）。 A. 甲醇水 B. 环已烷 C．四氯化碳 D. 正已烷 11. 在惰性担体表面健合上基团－NR3＋后的离子交换树脂称为（ C ）。 A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂 C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂 12. 分离一组难挥性、可离解的物质时最宜而是采用的色谱方法是（ C ）。 A. 气液色谱 B. 正相色谱 C. 离子交换色谱 D. 气固色谱 13. 应用反相键合相色谱分离R-CH3、R-COOH及R-COCH3（R为一长碳链）时出峰顺序为（ A ）。 A. R-COOH、R-COCH3 、R-CH3 B. R-CH3 、R-COCH3 、R-COOH、 C. R-COCH3 、R-COOH、R-CH3 D. R-CH3 、R-COOH、R-COCH3
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 不同点： 2．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？ 离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。 反相离子对色谱法(IPC或PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和t R，以改善分离。适用于较强的有机酸、碱。 反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和t R，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物） 3．速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何指导HPLC实验条件的选择？ 解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。 在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。 在高效液相色谱中，对液液分配色谱，Van Deemter方程的完整表达形式为 由此，HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。 4．试讨论影响HPLC分离度的各种因素，如何提高分离度？ (1) 色谱填充性能 液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径和填充状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的保留时间，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素k有关，还直接与决定柱效与分离度的柱性能参数及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离过程动力学的重要因素。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。 (2) 流动相及流动相的极性 液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。流动相选择在液相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况。 (3) 流速 流速大于0.5 cm/s时， H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 5．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。 三者极性顺序从大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色谱中的洗脱顺序为苯、萘、蒽，苯最先出峰。 6．宜用何种HPLC方法分离下列物质？ （1）乙醇和丁醇；（2）Ba2+和Sr2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）相对分子质量的的葡糖苷。 1
2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法
2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸
高效液相色谱分析原理及流程 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等
Screen and evaluate the results within a certain period, analyze the deficiencies, learn from them and form Countermeasures. 姓名：___________________ 单位：___________________ 时间：___________________ 萃取和分液实验报告
编号：FS-DY-30009 萃取和分液实验报告 一、实验目的： （1）了解萃取分液的基本原理。 （2）熟练掌握分液漏斗的选择及各项操作。 二、实验原理： 利用某溶质在互不相溶的溶剂中的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂组成的溶液中提取出来，在利用分液的原理和方法将它们分离开来。 三、实验仪器和药品： 药品：碘水、CCl4 器材：分液漏斗、100ml烧杯、带铁圈的铁架台、20ml 四、实验步骤： 1、分液漏斗的选择和检验：验分液漏斗是否漏水，检查完毕将分液漏斗置于铁架台上； 2、振荡萃取：用量筒量取10 ml碘水，倒入分液漏斗，
再量取5 ml萃取剂CCl4加入分液漏斗，盖好玻璃塞，振荡、放气；需要重复几次振荡放气。 3、静置分层：将振荡后的分液漏斗放于铁架台上，漏斗下端管口紧靠烧怀内壁； 4、分液：调整瓶塞凹槽对着瓶颈小孔，使漏斗内外空气相通，轻轻旋动活塞，按“上走上，下走下”的原则分离液体； 五、实验室制备图： 六、实验总结（注意事项）： 1、分液漏斗一般选择梨形漏斗，需要查漏。方法为：关闭活塞，在漏斗中加少量水，盖好盖子，用右手压住分液漏斗口部，左手握住活塞部分，把分液漏斗倒转过来用力振荡，看是否漏水。 2、将溶液注入分液漏斗中，溶液总量不超过其容积的 3/4； 3、振荡操作要领：右手顶住玻璃塞，左手握住活塞，倒置振荡；振荡过程中要放气2—3次，让分液漏斗仍保持倾斜状态，旋开旋塞，放出蒸气或产生的气体，使内外压力平衡； 4、要及时记录萃取前后的液面情况及颜色变化；振荡前，
高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用） ，高纯水，样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)
第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点： 分析对象及范围流动相的选择操作条件 GC 能气化、热稳定性好、且沸 点较低的样品，占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰 性”气体，只起运载作用，对 组分作用小 加温常压操作 HPLC 溶解后能制成溶液的样品， 高沸点、高分子量、难气化、离 子型的稳定或不稳定化合物，占 有机物的80% 流动相为液体或各种液 体的混合。它除了起运载作用 外，还可通过溶剂来控制和改 进分离。 室温、高压下进行 2．何谓化学键合相常用的化学键合相有哪几种类型分别用于哪些液相色谱法中 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱什么叫反相色谱各适用于分离哪些化合物 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别
For the things that have been done in a certain period, the general inspection of the system is also a specific general analysis to find out the shortcomings and deficiencies 萃取和分液实验报告正式 版
萃取和分液实验报告正式版 下载提示：此报告资料适用于某一时期已经做过的事情，进行一次全面系统的总检查、总评价，同时 也是一次具体的总分析、总研究,找出成绩、缺点和不足，并找出可提升点和教训记录成文，为以后遇到同类事项提供借鉴的经验。文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用。 一、实验目的： （1）了解萃取分液的基本原理。 （2）熟练掌握分液漏斗的选择及各项操作。 二、实验原理： 利用某溶质在互不相溶的溶剂中的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂组成的溶液中提取出来，在利用分液的原理和方法将它们分离开来。 三、实验仪器和药品： 药品：碘水、CCl4 器材：分液漏斗、100ml烧杯、带铁圈
的铁架台、20ml 四、实验步骤： 1、分液漏斗的选择和检验：验分液漏斗是否漏水，检查完毕将分液漏斗置于铁架台上； 2、振荡萃取：用量筒量取10 ml碘水，倒入分液漏斗，再量取5 ml萃取剂CCl4加入分液漏斗，盖好玻璃塞，振荡、放气；需要重复几次振荡放气。 3、静置分层：将振荡后的分液漏斗放于铁架台上，漏斗下端管口紧靠烧怀内壁； 4、分液：调整瓶塞凹槽对着瓶颈小孔，使漏斗内外空气相通，轻轻旋动活塞，按“上走上，下走下”的原则分离液
离子类高效液相色谱法 1308102-19 彭陈 摘要：离子色谱是高效液相色谱的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。 离子色谱的分离机理主要是离子交换。分离方式有3种：离子交换色谱，离子排斥色谱和离子对色谱。其中离子交换色谱用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换;离子排斥色谱用高容量的树脂，分离机理主要是离子排斥；离子对色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。 一，离子对色谱 离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。 在色谱分离过程中，流动相中待分离的有机离子A+（也可以是带负电子的离子）与固定相或流动相中带相反电荷的对离子B-结合，形成离子对化合物A+B-，然后在两相间进行分配： 若固定相为有机相，流动相为水溶液，就构成反相离子对色谱，此时A= 的分布系数B-为： 当流动相的pH值、离子强度、有机改性剂的类型、浓度及温度保持恒定时，k'与对离子的浓度［B- ］w成正比。因此通过调节对离子的浓度，就可改变被分离样品离子的保留时间Tr。
离子对色谱法，特别是反相离子对色谱法解决了以往难以分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外，还可以借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，以提高检测的灵敏度。 二，离子交换色谱法以及离子色谱法 （1）离子交换色谱法 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配，固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。 离子交换色谱的固定相是交换剂，根据交换剂性质可分为： 阳离子交换剂和阴离子交换剂。 交换剂由固定的离子基团和可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与交换剂上可交换的平衡离子进行可逆交换，最后达到交换平衡，阴阳离子的交换平衡可表示为： 阳离子交换：R+Y-+ X-= R+X-+ Y- 阴离子交换：R-Y++ X+= R-X++ Y+ R+、R-—为交换剂上的固定离子基团，如RSO3-或RNH3+； Y+、Y-—为可交换的平衡离子，可以是H+、Na+或OH-、Cl-等 X+、X-—为组分离子。 组分离子对固定离子基团的亲和力强，分配系数大，其保留时间长；反之，分配系数小，其保留时间短；因此：离子交换色谱：是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。
高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。
广州大学化学化工学院 本科学生综合性、设计性实验报 告 实验课程化学工程与工艺专业实验 实验项目肉桂油的提取 专业化学工程与工艺班级12化工2 学号1205200018 姓名朱志豪 指导教师及职称梁红、陈姚 开课学期2014 至2015 学年 2 学期时间2014 年12 月 3 日
一、实验方案设计 实验序号实验项目植物中天然香料的提取及香料成分分析 实验时间12月3日实验室324 小组成员 朱志豪、曾洁 诗、林晓胜、 王华权 1．实验目的 通过学习香料的基本知识和提取天然香料的一般方法，掌握采取水蒸气蒸馏提取天然植物香料及其分离的方法；了解香料产品的关键技术指标的检测方法，掌握阿贝折光仪的使用方法，掌握红外光谱仪的原理及在香料产品结构分析中的应用。 2．实验原理、实验流程或装置示意图 （1）实验原理 肉桂树皮也称桂皮, 出油率为2.15%, 高于桂枝、桂叶、桂子的出油率, 是提取肉桂油的主要原料。肉桂油中的主要成分为肉桂醛。肉桂醛，分子式：C9H8O。结构简式：C6H5CHCHCHO。密度：1.046-1.052 熔点（℃）：-7.5℃。折光率（20℃）：1.619-1.623 比重（25/25℃）：1.046-1.050 酸值：≤1.0% 沸点（℃）：253(常压）。外观：无色或淡黄色液体。肉桂醛易被氧化，长期放置，经空气中的氧慢慢氧化成肉桂酸，肉桂醛能随水蒸气蒸发，因此本实验将用水蒸气蒸馏的方法提取出肉桂油。用红外光谱仪测定所得油的红外光谱来进行肉桂醛官能团的定性。 （2）实验流程 （3）实验装置示意图
3．实验设备及材料 仪器：水蒸气蒸馏装置、三口烧瓶（500mL ）、锥形瓶（250mL ）、分液漏斗（250mL ）、玻璃棒、蒸发皿、微波炉、电热套、阿贝折射仪、红外光谱仪、压片机、分析天平 药品：肉桂皮、二氯甲烷、乙醇、氯化钠 4．实验方法步骤及注意事项 （1）肉桂油的提取 先搭配好水蒸气蒸馏装置，然后称取60g 肉桂皮的粉末加入蒸发皿中，再用72g 的浓度为75%的乙醇水溶液使其充分湿润。然后把湿润的物料均匀平铺成一定厚度，至于微波炉中加热一段时间，然后将肉桂粉放置三口烧瓶中，加入150ml 的热蒸馏水，再加入32g 氯化钠做助剂，加热使体系保持沸腾状态，进行速率稳定的蒸馏，提取时间为一个小时。 然后往收集的馏出物中加入氯化钠至水层呈饱和。将馏出液转移到250ml 分液漏斗中，用40ml22ClCH 分两次萃取，待分层后，弃去水层，从漏斗中倒出有机层，置于已称重的50ml 蒸馏烧瓶中，装上蒸馏装置用电加热套加热，蒸去22ClCH ，冷却后称重，以原料肉桂皮为基准，计算精油的收率。 (2) 肉桂油的分析测定 1) 测定折光率（20℃），指标：1.600－1.6140，用阿贝折射仪测定 2) 红外光谱测定。用红外光谱仪测定所得精油的红外光谱，并解释图谱中主要峰的意义。 5．实验数据处理方法 (1) 收率 %100-?= 肉桂皮 烧杯 总收率m m m (2) 折光率 用阿贝折射仪测量肉桂油折射率。 (3) 红外特征峰 用红外光谱仪测定所得精油的红外光谱。
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
萃取和分液实验报告 一、实验目的： （1）了解萃取分液的基本原理。 （2）熟练掌握分液漏斗的选择及各项操作。 二、实验原理： 利用某溶质在互不相溶的溶剂中的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂组成的溶液中提取出来，在利用分液的原理和方法将它们分离开来。 三、实验仪器和药品： 药品：碘水、CCl4 器材：分液漏斗、100ml烧杯、带铁圈的铁架台、20ml 四、实验步骤： 1、分液漏斗的选择和检验：验分液漏斗是否漏水，检查完毕将分液漏斗置于铁架台上； 2、振荡萃取：用量筒量取10 ml碘水，倒入分液漏斗，再量取5 ml萃取剂CCl4加入分液漏斗，盖好玻璃塞，振荡、放气；需要重复几次振荡放气。 3、静置分层：将振荡后的分液漏斗放于铁架台上，漏斗下端管口紧靠烧怀内壁； 4、分液：调整瓶塞凹槽对着瓶颈小孔，使漏斗内外空 气相通，轻轻旋动活塞，按“上走上，下走下”的原则分 离液体； 五、实验室制备图：（见右图） 六、实验总结（注意事项）: 1、分液漏斗一般选择梨形漏斗，需要查漏。方法为： 关闭活塞，在漏斗中加少量水，盖好盖子，用右手压住分 液漏斗口部，左手握住活塞部分，把分液漏斗倒转过来用 力振荡，看是否漏水。 2、将溶液注入分液漏斗中，溶液总量不超过其容积的3/4； 3、振荡操作要领：右手顶住玻璃塞，左手握住活塞，倒置振荡；振荡过程中要放气2-3次，让分液漏斗仍保持倾斜状态，旋开旋塞，放出蒸气或产生的气体，使内外压力平衡； 4、要及时记录萃取前后的液面情况及颜色变化；振荡前，上层为黄色，下层为无色；振荡静置后，上层为无色（或淡黄色），下层为紫色；
5、萃取剂的选择 a.溶质在萃取剂的溶解度要比在原溶剂（水）大。 b.萃取剂与原溶剂（水）不互溶。 c.萃取剂与溶液不发生发应。 6、按“上走上，下走下”的原则分离液体是为了防止上层液体混带有下层液体。 七、问题： 1、如果将萃取剂换成苯，实验现象是否相同？使用哪种有机溶剂做萃取剂更好些？为什么？
高效液相色谱法测定维生素C的含量 【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。 【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量 1、引言 维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。 溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。 2、HPLC测定维生素C的含量 2.1、仪器试剂 2.1.1、仪器 高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)；平头进样器。 2.1.2、试剂 乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。