胃肠病学２００６年第１１卷第２期
Ｔｏｌｌ样受体４在ＣＣｌ４诱导的大鼠
慢性肝损伤过程中的表达
华静邱德凯李继强李恩灵彭延中
上海交通大学医学院跗属仁济医院消化内科上海市消化疾病研究所ｆ２００００１）
背景：Ｔｏｕ样受体４（ＴＬＲ４）在内毒素的信号转导过程中具有重要作用。目的：动态观察在ｃｃｈ诱导的大鼠慢性肝损伤过程中，肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＩ．Ｒ４基因表达的变化，探讨ＴＬＲ４在肝损伤中的作用。方法：眦ＣＣｌ。诱导慢性肝损伤纤维化大鼠模型，分离肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞．斟逆转录聚合酶链反应（ＲＴ，ＰＣＲ）检测肝组织和Ｋｕｐｆｆ—ｒ细胞ＴＬＲ４ｍＲＮＡ的表达；将Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞分别与小同浓度的脂多糖（ＬＰＳ）孵育，以酶联免疫口艇附测定（ＥＬＩＳＡ）检测细胞培养上清的肿瘤坏死冈于（ＴＮＦ）一ｔ３ｔ水平。以基质显色法测定太鼠血浆内毒素水平。结果：正常大鼠肝组织ＴＬＲ４ｒｎＲＮＡ表达水平较低，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞未检测到ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达；ｃｃｈ处理２～６刷大鼠的肝组织和Ｋｕｐｆｆｃｒ细飚ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达水平显著增高（Ｐ＜０．０５）。ＣＯＬ处理４周和６周大鼠Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的ＴＮＦ．ｄ基础分泌水平显著高于正常大鼠（Ｐ＜００５）；
在ＬＰＳ的刺激下，ＴＮＦ－Ⅱ的分泌水平较基础值进一步增高（ＰｔＯ．０５），呈浓度依桢性。大鼠血浆内毒素水平在肝损伤过程中逐渐增高，相关分析显示在慢性肝损伤的早、中期，肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＲ４ｍＲＮＡ的表达与血浆内毒素水平呈正相关。结论：在ＣＣｌ。诱导的慢性肝损伤过程中，大鼠肝脏ＴＬＲ４基因表达上渊，与Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞活化和肝脏的炎症损伤有关。
关键词Ｔ０ｎ样受体４；内毒素类；肿瘤坏死因于；肝损伤；纤维化
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
Ｔｏｌｌ?ｌｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ４ｄｕｒｉｎｇＣＣｈ－ｉｎｄｕｃｅｄＣｈｒｏｍｃＬｉｖｅｒＩｎｊｕｒｙｉｎＲａｔｓＨＵＡＪｉｎｇ，ＱＩＵＤｅｋａｉ，ＬＩＪｉｑｉａｎｇ，ＬＩＥｎｌｉｎｇ，ＰＥＮＧＹａｎｓｈｅｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｅｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｒｅ可；Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＳｈｍｔｇｈａｌＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｗｉｚＭＳ１ｗ．ｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＤｉｇｅｓｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ（２００００１）
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｒｅｐｏｓｅｄｔｈａｔｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４（ｒＬＲ４）ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｆｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｏｘｌｎｓ．Ａｉｍｓ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆＴＬＲ４ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄＫｕｐｆｆｅｒｃｅＵｓｄｕｒｉｎｇＣＣｈ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ－ｉｎｒａｔｓａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｂｖｅｒｉｎｊｕｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙａｎｄｆｉｂｒｏｓｉｓｂｙｃｃｈｉｎｒａｔｍｏｄｅｌ，Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｌｉｐｏｐｏｉｙｓａｃｃｈａｒｌｄｅ（ＬＰＳ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅＴＬＲ４ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄＫｕｐｆｌｅｒｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ…＿。ｓ￡ｔｒａｎｓｃｒｌｐｔａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｆＲＴ－ＰＣＲ）．ｎｅｌｅｖｅｌｓｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｆＴＮＦ）一“ｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆＥＬＩＳＡ）Ｔｈｅｐｌａｓｍａｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌｅｖｅｌｓｗｅｉ－ｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｃｈｍｍｏｇｅｎｌｃｓｕｂｓｔｒａｔｅⅡｍｕｌｕｓａｍｅｂｏｅｙｔｅｌｙｓａｔｅａｓｓａｙ．Ｒｅｓｔｄｔｓ：Ｉｎｎｏｒｍａｌｒａｔｓ．１０ｗｌｅｖｅｌｏｆ’ｒＬＲ４ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓ．ａｎｄｎｏＴＬＲ４
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ＬＰＳｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＴＮＦ删ｉｎｃｒｅａｓｅｄｍａｒｋｅｄｌｙ丑ｓｃｏｍｐａｒｅｄ埘小ｔｈｅｔｍｓｅｌｉｎｅｌｅｖｅｌ歌幔蚴ｉｎａｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｌｌｔｌｅｒ．ＴｈｅｐｌａｓｍａｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａＵｙｄｕｒｉｎｇｔｈｅＣＯＵｌＸ４ｅｏｆｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙＡｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａ—ｔｉｏｎｗａｓｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｐｌａｓｍａｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌｅｖｅｌｓ蛐ｄｔｈｅＴＬＲ４ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄＫｕｐｆｆｅｒｃｅＵｓｉｎｅａｒｌｙａｎｄｍｉｄｄｌｅｓｔａｇｅｏｆｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：７ｆｈｃｈｅｐａｔｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＬＲ４ｉｓｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｕｒｉｎｇＣＣｌ４－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ，ｗｈｉｃｈｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｈｅｐａｔｉｃｌｎｊｉｌｒｙ
ＫｅｙｗｏｒｄｓＴｏｌｌ—ＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ４：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ；ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ；ＬｉｖｅｒＩｎｊｕｒｙ；Ｆｉｂｒｏｓｉｓ
内毒素也称脂多糖（１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ），是革兰阴性杆菌细胞壁外层的结构成分，能活化单核，巨噬细胞释放炎症介质，诱导一系列炎症反应，是慢性肝损伤中重要的共同因子【１１。研究口１发现Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｎ．１ｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）作为内毒素的信号转导分子在单核巨噬细胞系统中广泛表
万方数据
达，是介导内毒素信号转导、激活单核／巨噬细胞的重要受体。ＴＩ．Ｒ４的丧达变化是机体对内毒素反应敏感惟的基础．已有研究㈣初步娃示肝损伤时ＴＬＲ４表达增加，但其在疾病演变过程中的变化尚小清楚。本研究旨在动态观察在ｃｃｈ诱导的大鼠慢性肝损伤过程巾．肝组织和肝内巨噬细胞Ｋｕｐｆｌｅｒ细胞ＴＬＲ４基凶表达的变化．并探讨其在盯损伤中的作用。，
材料与方法
一、实验动物和材料
清浩级Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１８０～２００ｇ，由中科院上海实验动物巾心提供。ＬＰＳ（大肠杆菌Ｏｌｌｌ：Ｂ４）、Ⅳ型胶原酶、链酶蛋白酶Ｅ、Ｎｙｃｏｄｅｎｚｏ和乳胶微粒购自Ｓｉｇｍａ公司：ＲＰＭｌｌ６４０培养基为Ｇｉｂｃｏ公刮产品：逆转录聚合酶链反应（ＲＴ．ＰＣＲ）试剂盒为Ｐｒｏｎｌｅｇａ公司产品：肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一Ⅸ酶联免疫口发附测定（ＥＬＩＳＡ）试剂盒购自ｄ６美生物工程有限公司；基质届色法试剂盒购自上海伊华临床医学科技公司。
二、实验方法
１．ｃｃｈ诱导慢性肝损伤纤维化大鼠模型：予大鼠皮Ｆ注射４０％ＣＣｌ。花生油溶液，首剂量为５ｍｌ／ｋｇ，以后３ｍｌ／ｋｇ，每周两次，直至８周实验结束。在造模的不同阶段。即０、２、４、６、８周时分别取６只大鼠进行实验。肝组织分别以液氮冷冻保存和中性甲醛固定。取外周血分离｜ｆ『Ｌ浆．一２０℃保存待测。
２．肝组织病理学检查：常规石蜡切片，ＨＥ染色，光学显微镜下观察肝组织病理学改变。
３．Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的分离、培养和鉴定：分离正常和不同时相ＣＣＩ。处理大鼠的肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞。采用联合酶原位循环灌注消化、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ＠不连续密度梯度离心和选择性贴壁法分离Ｋｕｐｆｌｅｒ细胞。主要步骤：１０％氯胺酬腹腔麻醉，分离门静脉，插管，注入无钙的Ｄ．Ｈａｎｋｓ液，流速为１５ｍｌ／ｍｉｎ，再经门静脉循环灌注含０．０５％Ⅳ型胶原酶和０．０２％链酶蛋白酶Ｅ的Ｈａｎｋｓ液１００ｍｌ２０ｍｉｎ：分离肝脏，剪碎肝组织．加入１００ｍｌ含Ｏ．０２％Ⅳ型胶原酶和０．０３％链酶蛋白酶Ｅ的消化液振荡消化３０ｒａｉｎ：１００日不锈钢滤网滤过后获得肝非实质细胞混恳液；１８％羽１１１％Ｎｙｅｏｄｅｎｚｏ不连续密度梯度离心．取两密度问
ＣｈｉｎＪＧａｓｔｍｅｎｌｅｒｏｌ，２００６，Ｖｎｌ．１１，Ｎｏ２
的细胞层．ＲＰＭｌｌ６４０清洗，台盼蓝排除法检测细胞活性。凋整细胞浓度为５ｘ１０Ｓ／ｍｌ，接种于２４孔培养板，每孔１ｍ１．昔３７ｏＣ５％ＣＯ：培养箱内培养２ｈ，吸去上清液除去未贴壁细胞。收集细胞重新凋整浓度为５ｘｌＯＶｍｌ，于纯化细胞中加人含１５％小牛血清的ＲＰＭＩｌ６４０，置３７ｏＣ５％Ｃ０２培养箱内培养２０—２４ｈ。贴壁细胞的鉴定：细胞接种２ｈ后，取一｝Ｌ换液，加入ｌｒｎｌ无血清ＲＰＭｌｌ６４０，然后加入乳胶微粒溶液ｌ“ｌ，１ｈ后洗去未吞噬的乳胶微粒．观察细胞择噬情况。可见乳胶微粒被吞噬人细胞质的细胞为Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞。
４．肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达测定：以Ｔｒｌｚｏｌ试剂提取肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞总ＲＮＡ．逆转录反应Ｉｈ．以２１１１逆转录产物为模板行ＰＣＲ扩增。ＴＬＲ４和Ｂ—ａｃｔｉｎ引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ＴＬＲ４序列：上游５’．ＴＣＡＴＣＡＧＴＧＴＡＴＣＧＧＴＧＧＴＣ一３’．下游５’一１Ｔ丌ＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＧＧＣＴ。３’，扩增产物长度为５６０ｈｐ。Ｂ．ａｃｔｉｎ序列：上游５’．ＧＡＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡ一３’．下游５’一ＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴ．３’，扩增产物长度为６３０ｂｐ。１．５％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。应用生物电泳图像分析系统（附ＳｍａｒｔＶｉｅｗ２００１软件，上海复日科技有限公司），以Ｂ．ａｅｔｉｎ作为内参照，测定ＴＬＲ４ｔｕＲＮＡ的相对表达量。
５．ＬＰＳ对Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＮＦ—ｄ分泌的影响：Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞分离培养２４ｈ后换液，２４孔培养板中每孔加入含不同浓度ＬＰＳ（０、０．１、ｌ、１０ｐ，ｇ／ｍ１）的ＲＰＭｌｌ６４０１ｍｌ，每一浓度设３７Ｌ。蚩３７℃５％ＣＯ：培养箱内培养６ｈ，元菌吸取培养细胞上清，离心后一７０℃保存待测。以ＥＬＩＳＡ方法检测Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞培养上清的ＴＮＦ—ｄ水平，具体操作按试剂盒说明书进行。
６．血浆内毒素水平测定：采用基质显色法，具体操作按试剂盒说明书进行。
三、统计学分析
所有指标均以ｉ∞表示，应１Ｌ｝ｊＳＡＳ６．０统汁软件，组间均数的比较采用Ｓｔｕｄｅｎｔｔ检验．Ｐ＜Ｏ．０５为差异有显著性。
结果
、肝组织病理学改变
万方数据
胃肠病学２００６年第１１卷第２期
正常大鼠光学显微镜下肝组织未见明显病理学变化。经ＣＣＩ。处理的大鼠肝组织出现不同形态学改变：２周叫肝细胞出现脂肪变性，未见坏死和炎症：４周和６周时肝细胞脂肪变性明显增加，Ｈ｛现坏死灶和炎性细胞浸润：８周时仍有明显肝细胞脂肪变性，并有纤维组纵增生。
二、肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＩｌ４ｒａｉｌＮＡ的表达
正常大鼠肝组织ＴＬＩ／４ｍＲＮＡ表达水平较低．Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞未榆测到ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达。ＣＣＩ。处理２—６周（慢性肝损伤早、中期）大鼠的肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＩ／４ｍＲＮＡ表达水平明显增高，４周和６周时最为显著，８周时（慢性肝损伤晚期）ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达水半有所Ｆ降（见表１）。
表１慢性肝损伤过程中肝组织和ＫｕｌＪｆｆｅｒ细胞ＴＬＲ４ｍＦｔＮＡ的相对表达（ｉｂ．ＴＬＲ４ｍＲＮＮｌ３－ａｃｔｉｎｍＲＮＡ
与正常组比较，?Ｐ＜Ｏ０５．料ＲＯＯｌ
三、Ｕ】Ｓ对Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＮＦ一“分泌的影响
正常和不同时相ＣＣＩ。处理大鼠分离Ｋｕｐｔｔｊｒ细胞的ＴＮＦ—ｎ基础分泌水平均较低，但ｃｃｌ４处理４周和６周大鼠Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的１’ＮＦ．ｄ基础分泌水平已显著高于正常大鼠，处理２周和８周组的ＴＮＦ一“基础分泌水平与正常组无显著差异。
与不同浓度ＬＰＳ孵育６ｈ后．Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞培养上清的ＴＮＦ．ａ水平随ＬＰＳ浓度的增加而增高。ＣＣｌ。处理０、２、４、６周大鼠Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞在不同浓度ＬＰＳ刺激下分泌的ＴＮＦ—ｏ【水平均显著高于基础分泌水平，旱浓度依赖性，其中ＣＣｌ。处理４周大鼠Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞分泌的ＴＮＦ—ｄ水平最高，而ＣＣＩ。处理８周大鼠的Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞仅在高浓度ＬＰＳ（１０¨∥ｎｄ）刺激Ｆ，ＴＮＦ一“分泌水平才显著增高（见表２）。
四、血浆内毒素水平
正常大鼠ｍ浆内毒素水平较低（Ｏ．０８Ｅｕ＾Ｉｌｌ±Ｏ．０３Ｅｕ／Ⅱｄ１．ＣＣｌ。处理２周大鼠内毒素水平较正常大鼠略有增高（Ｏ．１５ＥＵ／ｍＩ＿＋Ｏ．０６Ｅｕ／ｍ１），但差异元统计学显著性（Ｐ＞Ｏ．０５），ｃｃｋ处理４周起大鼠血浆内毒素水平较正常大鼠显著增高（４周：０．１８ＥＵ／ｍｌ＿＋０．０３ＥＵ／ｍ１．６周：０．２１ＥＵ／ｍｌ±Ｏ．０４－ＥＵ／ｍｌ，８周：０．２２ＥＬ１／ｌ＂ｌ±０．０３ＥＵ／ｍｌ；Ｐ＜Ｏ．０５）。
五、肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＲ４ｔｕＲＮＡ的丧达与血浆内毒素水平的相关性
正常肝脏和慢性肝损伤早、中期（０～６周），肝组织和Ｋ“ｐｆｆｅ．ｒ细胞ＴＬＲ４ｍＲＮＡ的表达与血浆内毒素水平呈正相关（肝组织：ｒ＝Ｏ８７７３，Ｐ＝Ｏ．０００２；Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞：ｒ＝０．８５２９，Ｐ＝０．Ｏ００２）；此后ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达水平下降。与血浆内毒素水平无线性相关性。
肠源性内毒素Ｊｆｆ【症是慢性肝病时的常见现象『６１。内毒素不仅可以直接损伤肝细胞，更为重要的是能激活肝内巨噬细胞Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞释放各种炎症介质，引起肝损伤和纤维化形成ｍ。而ＴＬＲ４作为内毒素受体，在单核巨噬细胞系统中广泛表达．在介导内毒素信号转导、激活单核，ｌ』噬细胞诱导炎症反应中具有重要作用。
ＴＬＲ是最近发现的病原模式识别受体，在急性炎症反应的细胞吞噬凋节、细胞信号转导和细胞凋亡方面起重要作用。其中ＴＬＲ４是ＬＰＳ的特异性受体，与内毒素结合受体ＣＤｌ４共同作用，促使细胞对多种病原微生物特别是ＬＰＳ发生反应，在机体的天然免疫反应巾起重要作用Ⅲｏｌ。一系列研究汪实了ＴＬＲ４作为ＬＰＳ受体在细胞活化中的作用。ＴＬＲ４基因敲除小鼠和｜ｒＩＪＲ４基因自发突变小鼠（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ和Ｃ５７ＢＵｌＯＳｅＣｒ）对ＬＰＳ低应答．由其分离出的巨噬细胞对Ｉ．ＰＳ刺激无反应Ｉｎ，ｌｚｌ。将Ｃ３Ｈ／ｔｔｅＪ小鼠的巨噬细胞转染人或止常小鼠的ＴＬＲ４基因后，细胞
表２不同浓度ＬＰ￥刺激下Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的ＴＮＦ－ａ分泌水平（ｉ蜘，ｐｇ／ｍｌ
ＬＰＳ浓度
０刷（币常组）２周４周６周８例０ｐ∥ｌｎｌ４５０２±９５４６３２１＿＋１５．５２１３５．３４＿＋２５．７９’８１６７±１１．９３。３５１２＋８７２０．１Ｏ．ｇｈｎｌ１４４３３＿＋２２．５９＋１４９．６７＿＋３４２３。２１３．３３±３９Ｏｌ＋２０００１＋３１７５４６５０３＋２４７５ｌｐ曲ｎｌ２０２０３±３７９７＋２２５３３±４１２＋４４９３５±５６５８４３１０６７＿＋６０．５８８７５０４±１８５２１０ｕｄｍ２１４２３－＋４５７９＊３１５２６±６０５＊６４５０４＋９０７２＊４２５．３６±６５４３４１００６８±３１０１＂＋与同时相基础分泌（１２Ｓ０ｐ∥一）水平比较，Ｐ＜Ｏ０５；。与正常组基础讣泌（ｆ。Ｐｓｏ斗一时）水平比较，Ｐ＜Ｏ．０５
万方数据
即获得对ＬＰＳ的反应能力。体内研究１１３，１ｍ发现ＴＬＲ４基因突变与机体对革兰阴性细菌感染和感染性休克的易感性密切相关，全身性感染、创伤患者ＴＬＲ４基因表达水平异常。最近又有学者发现ＴＬＲ４拮抗剂在炎症性肠病动物模型中具有抗炎效应旧。
本研究发现正常大鼠肝组织ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达水平较低，在ＣＣｌ。诱导的慢性肝损伤早、中期，肝组织ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达水平显著增高，但在晚期肝纤维组织形成时。其表达又明显下降，呈波动表达。近年研究№１９１显示肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞、窦内皮细胞、肝细胞甚至活化的肝星状细胞均能表达ＴＬＲ４．因此在肝损伤过程中，肝组织ＴＬＲ４表达增加并非单一细胞来源．而是在疾病的不同阶段以某种细胞来源为主。慢性肝损伤晚期肝组织ＴＬＲ４表达下降与纤维组织明显增生、表达ＴＬＲ４的细胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞、肝细胞）明显减少有关。已有学者发现在肝损伤时，野生型小鼠Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ的肝损伤组织学程度咀及血清转氨酶和‘ｌ’ＮＦ．ｄ水平明显高于ＴＬＲ４基因突变的ｃ３Ｈ／ＨｅＪ小鼠目。提示肝组织ＴＬＲ４表达上调与肝脏炎症损伤相一致。
Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞是定居于肝脏的巨噬细胞．肝损伤时，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞被激括释放多种炎症介质和细胞因子㈣，因此其活化涉及肝损伤的发生机制。由于Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞位于肝窦内．其对来自肠道的少量内毒素的反复刺激已产生耐受，不会引起肝脏局部炎症反应。在体外，内毒素介导的Ｋｕｐｆ｛ｂｒ细胞活化需要有功能性受体ＴＬＲ４参与［１６１。本研究发现正常大鼠分离的Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞基本不表达ＴＬＲ４ｍＲＮＡ，ＣＣｌ。诱导的慢性肝损伤早、中期．大鼠Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表达显著增高，但晚期又下降。从ｃｃｈ处理４周和６周大鼠分离的Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞，其ＴＮＦ－ａ基础分泌水平已显著高于正常大鼠。在ＬＰＳ的刺激下，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的ＴＮＦ．Ⅱ分泌水平较基础值进一步增高，于ＣＣｌ。处理４周时达到最高峰，８周时分离的Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞仅在高浓度ＬＰＳ刺激下．ＴＮＦ．ｎ分泌水平才’显著增高。提示在ＣＣｌ。诱导的慢性肝损伤早期．Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞功能活化．对内毒素刺激的敏感性增加，分泌细胞因子的能力明显增强．但随着慢性肝损伤的进展，这种能力逐渐下降。Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的功能状态与其Ⅱ皿４基因的表达相～致。网外研究ＩｕＩ【乜发现乙醇喂养大鼠的Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞显著表达ＴＬＲ４基因．且乙醇组血浆ＴＮＦ一Ⅱ和白细胞介素（ＴＩ．）一６水平明显高于列照组。因此，ＴＬＲ４基因表
ＣｈｉｎＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｍｌ，２００６，Ｖ０１．１１，Ｎｏ２
达与Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞的功能状态密切相关。
在ＣＣｌ。诱导的慢性肝损伤过程中．肝脏ＴＬＲ４基因表达上调的机制尚不完全清楚。体外研究Ｉ“Ｉ发现内毒素和细胞因子能明显上调细胞内毒素受体的表达。本研究亦发现在ＣＣｌ４诱导的慢性肝损伤过程中，大鼠血浆内毒素水平逐渐增高．相关分析发现肝损伤早、中期肝组织和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞ＴＬＲ４ｍＲＮＡ的表达与血浆内毒素水平存在明显相关性。因此肠源性内毒素在肝组织吼Ｒ４表达上调和Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞活化中具有重要作用。
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（２００５—０９—０１收稿；２００５．１ｌ一０１修回） 万方数据
Toll样受体4在CCI4诱导的大鼠慢性肝损伤过程中的表达
作者：华静， 邱德凯， 李继强， 李恩灵， 彭延申， HUA Jing， QIU Dekai， LI Jiqiang，LI Enling， PENG Yanshen
作者单位：上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科,上海市消化疾病研究所,200001
刊名：
胃肠病学
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY
年，卷(期)：2006，11(2)
引用次数：1次
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1.期刊论文傅颖珺.谢勇.石俊强.郭光华.FU Ying-jun.XIE Yong.SHI Jun-qiang.GUO Guang-hua严重烧伤早期大
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(r=0.811,0.462).结论:严重烧伤可导致血中ET升高,并上调脾脏组织TLR4的基因以及早期炎症因子TNF-α的基因表达,TLR4的上调可能参与了严重烧伤后失控性炎症反应的病理生理过程.
2.期刊论文包俊炜.吴河水.张进祥.徐颖.张景辉.田元.王春友.BAO Jun-wei.WU He-shui.ZHANG Jin-xiang.XU Ying.ZHANG Jing-hui.TIAN Yuan.WANG Chun-you细胞表面Toll样受体4在小鼠急性坏死性胰腺炎中的作用-中华
胰腺病杂志2009,9(1)
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3.期刊论文熊建琼.朱佩芳.王正国.蒋建新.XIONG Jian-qiong.ZHU Pei-fang.WANG Zheng-guo.JIANG Jian-xin
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4.期刊论文晏春根.谢青.周霞秋.徐玉敏.俞红.郭清Toll样受体4在D-氨基半乳糖/内毒素介导的急性肝损伤中的
表达-中华传染病杂志2004,22(3)
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2.0软件分析不同时间点肝组织中TLR4 mRNA表达,并与血浆TNF-α含量进行相关分析;免疫组织化学观察肝组织TLR4蛋白的表达.实验数据用SAS软件分析.结果给药后4 h,血清转氨酶明显升高(与0h比较,P＜0.05);血浆TNF-α含量逐步上升,在2 h、5 h有两个分泌高峰;7 h小鼠开始死亡,10 h致死率达80%.正常小鼠肝组织少量表达TLR4 mRNA,给药后表达明显增强(与0 h比较,P＜0.05);免疫组织化学也显示TLR4蛋白有类似的变化,尤其肝窦内皮细胞、库普弗细胞表达更为显著.血浆TNF-α含量与肝组织TLR4 mRNA表达呈正相关.结论肝内细胞膜上表达的TLR4可能通过启动下游的炎性应答基因表达及细胞因子释放而诱导出肝组织对LPS的炎性应答.因此,调控TLR4表达可能是感染性疾病防治的一种新策略.
5.期刊论文包俊炜.吴河水.王春友.张进祥.张景辉.田元.徐颖.BAO Jun-wei.WU He-shui.WANG Chun-you.ZHANG
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作用-中华普通外科杂志2008,23(10)
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疫功能的影响-胃肠病学2007,12(11)
背景:肝硬化患者易发生多种感染,与免疫功能下降、肠道菌群紊乱有关.目的:观察口服微生态制剂对肝硬化患者细胞免疫功能、外周血单核细胞内毒素受体表达以及血清细胞因子和血浆内毒素水平的影响.方法:选取连续入院的肝硬化患者,予常规保肝治疗和口服微生态制剂4周,应用流式细胞术检测患者治疗前后外周血T细胞及其亚群和自然杀伤细胞、外周血单核细胞内毒素受体Toll样受体(TLR)4和CD14的表达,分别以酶联免疫吸附测定法和偶氮基质显色法检测细胞因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-10水平和血浆内毒素水平.结果:治疗前肝硬化患者外周血总T细胞(CD3)和
CD4细胞数明显低于正常对照组(P＜0.05),微生态制剂治疗后CD3和CD4亚群显著升高(P＜0.05).治疗前肝硬化患者外周血单核细胞内毒素受体TLR4和
CD14的表达显著高于正常对照组(P＜0.01),微生态制剂治疗后CD14表达显著降低(P＜0.01),TLR4表达也呈下降的趋势,但差异无统计学意义.治疗前肝硬化患者血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平显著高于正常对照组(P＜0.05),微生态制剂治疗后血清细胞因子和血浆内毒素水平均无明显改变.结论:肝硬化患者存在细胞免疫功能下降和慢性炎症状态,微生态制剂可改善患者免疫功能的紊乱,因此可将其作为一种慢性肝病的辅助治疗.
7.期刊论文华静.邱德凯.沈冠凤.李恩灵.HUA Jing.QIU Dekai.SHEN Guanfeng.LI Enling肝硬化患者外周血单核
细胞内毒素受体表达与慢性炎症反应关系的临床意义-胃肠病学2007,12(7)
背景:内毒素受体在内毒素、细胞因子等介导的炎性信号转导过程中具有重要作用.目的:了解肝硬化患者外周血单核细胞(PBMC)内毒素受体的表达变化与慢性炎症反应关系的临床意义.方法:应用荧光素标记的抗人Toll样受体(TLR)4/抗人CD14单抗,以流式细胞术检测40例肝硬化患者和15名健康志愿者PBMC内毒素受体TLR4和CD14蛋白的表达;以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内毒素受体TLR4 mRNA、CD14 mRNA和信号转导分子MyD88 mRNA的表达;以酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;以偶氮基质显色法测定血浆内毒素水平.结果:肝硬化患者PBMC内毒素受体TLR4和CD14蛋白的表达水平显著高于对照组(P＜0.05),但不同Child-Pugh分级组间差异无统计学意义;与对照组相比,PBMC内毒素受体TLR4mRNA、CD14 mRNA和信号转导分子MyD88 mRNA的表达水平也有增高的趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);肝硬化患者血清细胞因子IL-1β、IL-10和TNF-α水平,以及血浆内毒素水平均较对照组显著升高(P＜0.05),且高内毒素水平患者内毒素受体的表达显著高于低内毒素水平患者(P＜0.05),细胞因子水平也较低内毒素水平者增高.结论:肝硬化患者PBMC内毒素受体的表达明显上调,与患者的慢性炎症反应状态一致.
8.期刊论文郭毅斌.郑庆亦.陈锦河.蔡少甫.曹红卫.郑江.肖光夏.GUO Yi-bin.ZHENG Qing-yi.CHEN Jin-he.CAI
Shao-fa.CAO Hong-wei.ZHENG Jiang.XIAO Guang-xia黄蜂毒素1对内毒素/脂多糖所致小鼠急性肝损伤的影响-中
华烧伤杂志2009,25(1)
目的 了解黄蜂毒素1(MP-1)对LPS所致小鼠急性肝损伤的影响,探讨其作用机制.方法 将104只BALB/c小鼠按随机数字表法分为健康对照组(8只,不作任何处理)、LPS组(48只,尾静脉注射LPS 5 mg/kg)和MP-1组(48只,尾静脉注射LPS 5 mg/kg和MP-1 3 mg/kg).后2组小鼠于注射后2、6、12、24、48、72 h处死,每组每时相点8只,采集血和肝组织标本.动态比浊法鲎试验检测2组小鼠各时相点血浆LPS水平,酶联免疫吸附测定法检测血浆TNF-α和IL-6水平,全自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平,实时荧光定量RT-PCR检测肝组织Toll样受体4(TLR4)、TNF-α和IL-6 mRNA表达,观察注射药物后各时相点肝组织病理变化.另取健康对照组小鼠相同样本进行以上检测.结果 与健康对照组比较,LPS组小鼠血浆LPS和TNF-α水平在注射药物后2 h迅速升高,各为(18 320.50±2782.50)EU/mL和(988±130)ng/L,此后逐渐下降,72 h降至(1.80±0.80)EU/mL和(150±44)ng/L,接近健康对照组水平;IL-6、ALT和AST逐渐升高,12 h达峰值,随后下降,72 h接近健康对照组水平;LPS组小鼠肝组织TLR4、TNF-α和IL-6mRNA表达也在注射后明显增强
,12～48 h时肝组织炎性反应性病理改变最为显著.与LPS组比较,MP-1组小鼠LPS、细胞因子和转氨酶水平在注射后不同程度地降低(P<0.05或P<0.01),肝组织相关基因表达受到抑制(P<0.05或P<0.01),病理改变较轻.结论 MP-1可能通过中和LPS,减少其诱导的炎性介质合成与释放,进而减轻小鼠肝组织的损伤.
9.期刊论文王丽杰.孙梅炎症反应与小儿胃肠功能障碍-国外医学（儿科学分册）2005,32(4)
胃肠功能障碍在危重病发展过程中有着重要作用.炎症反应与胃肠功能障碍密切相关.肠黏膜通透性增高,可造成肠源性内毒素血症和细菌移位.内毒素可直接或间接破坏肠黏膜的完整性,进一步导致肠屏障功能损伤.血小板活化因子可引起胃肠黏膜缺血、缺氧,损伤细胞旁路径通道,从而使屏障功能损伤.血小板活化因子受体拮抗剂可减轻血小板活化因子对肠道的损伤作用.核因子-κB可促进细胞因子等基因转录,其活化可介导肠上皮细胞紧密连接及通透性增高,并可使结肠环状平滑肌细胞收缩性降低.Toll样受体4在肠道炎症时表达升高,其可活化内毒素介导的核因子-κB途径.
10.期刊论文郭毅斌.郑江.吕根法.卫国.王良喜.肖光夏.GUO Yi-bin.ZHENG Jiang.LV Gen-fa.WEI Guo.WANG
Liang-xi.XIAO Guang-xia阳离子多肽MP-1拮抗内毒素/脂多糖活性的实验研究-中华烧伤杂志2005,21(3)
目的探讨阳离子多肽MP-1对内毒素/脂多糖(LPS)攻击小鼠的作用及机制.方法将30只昆明小鼠随机分为MP-1组(尾静脉注射3 mg/kg MP-1)、致伤组(尾静脉注射20 mg/kg LPS)、保护组(先注射20 mg/kg LPS,20 s内再注射3 mg/kg MP-1),每组10只.观察3组小鼠注射后3 d内的存活情况.应用生物传感器及FASTfit作图,比较MP-1、多黏菌素(PMB)与LPS的亲和力,以Kd 值表示.通过动态比浊法和鲎试验定量,比较5、10、20、40 μmol/L MP-1、PMB对2
μg/L LPS的中和作用,以LPS 中和0 μmol/L MP-1、PMB为对照.采用逆转录聚合酶链反应法,观察MP-1对LPS刺激的10只昆明小鼠腹腔巨噬细胞
(PM)Toll样受体4(TLR4)mRNA、肿瘤坏死因子(TNF)α mRNA、白细胞介素(IL)6 mRNA表达的影响. 结果致伤组小鼠注射LPS后48 h全部死亡.保护组小鼠精神状态一度萎靡但恢复较快,食欲、活动度在短时间内改善,存活率为90%.MP-1组小鼠存活率为100%.MP-1对LPS具有高亲和力(Kd 值为484.0 nmol/L)但弱于对LPS有极高亲和力的PMB(Kd 值为18.9 nmol/L). MP-1具有中和LPS的能力但弱于PMB;20、40 μmol/L MP-1中和LPS的能力明显高于0 μmol/L MP-
1(P<0.01).MP-1对LPS刺激的小鼠PM TLR4 mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表达均有显著的抑制作用. 结论 MP-1对LPS攻击的小鼠有显著的保护作用
,其机制可能与MP-1对LPS具有亲和力及中和作用,阻断了LPS与其受体的结合,从而抑制了LPS介导的PM活化有关.
引证文献(1条)
1.何征宇.朱也森Toll样受体4与人体纤维化疾病的关系[期刊论文]-上海交通大学学报（医学版） 2009(7)
本文链接：https://www.doczj.com/doc/6210941928.html,/Periodical_wcbx200602006.aspx
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