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免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法永诺生物

免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法永诺生物
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法永诺生物

免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法

实验原理:

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白(抗体)FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G(Agrose-proteinA/G),使之与抗体结合,再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物,利用Agarose beads的重量,通过离心即可特异分离富集目的抗原。

实验步骤:

1.处理细胞:依据实验目的,设计实验,处理好细胞模型。一般3×106细胞/处理(即六孔

板一个孔,约200ug总蛋白)。

2.配IP 裂解液:200ul/孔(6孔板),并加入蛋白酶抑制剂,如果蛋白磷酸化水平影响实

验结果则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的要现加现用。

3.收集细胞:冰上操作,裂解细胞前用1×PBS(4度)洗1遍,每孔加入200ul IP裂解

液,冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。

4.超声:强度37%,5秒×4次(程序07)。目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,

但可能会影响蛋白质之间的相互作用,进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。

5.离心细胞裂解液:4度10000rpm 10 分钟。

6.Agrose-proteinA/G清洗:一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G(不同公司产品可能

不同,注意结合说明书及实验结果考虑),预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中(剪枪头)并用500ul1×PBS(4度)洗两遍,5000rpm×2分钟,吸掉上清备用。

7.细胞裂解液预清洗:为去除非特异作用,细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。

转移步骤5离心好的细胞裂解液上清至步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中,4度翻转1小时。

8.抗体和Agrose-proteinA/G预孵育:为减少游离抗体消耗抗原造成IP效率下降,将抗体

和Agrose-proteinA/G进行预孵育。在步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中加入200ul含

0.1%BSA 的IP 裂解液及相应量的抗体,4度翻转1小时。不同抗体时间可能有不同。

9.抗原抗体孵育:步骤7和8后进行离心(5000rpm 2分钟),将预清洗好的细胞裂解液

转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G 的EP管中,4度孵育过夜。

10.洗IP复合物:步骤9后离心(5000rpm 2分钟),吸掉上清,加入IP裂解液(一般不用

加抑制剂)500 ul,弹匀后4度摇转5分钟,重复6次。最后一次离心后加入3×SDS 60ul。

11.WB检测。

附注:

IP lysis buffer

Tris 50 m M PH 7.4

NaCl: 150m M

EGTA 2m M

EDTA 1 m M

Triton X-100 1%

磷酸酶抑制剂:Pyrophosphate 2.5m M

Glycerol phosphate 1m M

Na3VO4 1m M

蛋白酶抑制剂:PMSF 1m M

Leupeptin 1ug/ml

Aprotinin 5ug/ml

IP lysis buffer

concentration

Quantity

Reagent Final

Tris-base (FW 121.1) 50mM 0.6055g

NaCl (FW 58.44) 150mM 0.8766g

0.2ml

EDTA(0.5M) 1mM

1ml Triton 1%

HCl (FW 36.46) adjust to pH7.4

ddH2O Make up to 100ml

NaF(FW:42g/mol) 50mM*50 0.105g/ml

焦磷酸钠(265.9g/mol) 2.5mM *100 0.067g/ml

免疫共沉淀实验原理与方法

免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀(CoIP)概述及原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法,属于免疫沉淀技术的一类,常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来(常说的“pull-down”),进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点,第一是天然状态,第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势: 与其他研究蛋白质相互作用技术(如GST-Pull down、酵母双杂交等)相比,免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合,避免了人为的影响,因此符合体内实际情况,得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项: 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上,意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到; 2. 由于蛋白质形成复合物以后,某些表位就会被掩盖,因此可能导致使用某一种pull-down抗体,无论怎么增加抗体浓度,也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来,如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP;

3. 由于检测的是天然状态,因此在不同的时间和不同的处理下,CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的,当然随着实验次数的增加,得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大; 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白,则需要在试验前进行预测,具有一定的冒险性;当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题,但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事,并且成本较高; 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用,进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测; 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性,需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验,并且结果应该能够彼此验证,因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程(中英文对照):

免疫共沉淀实验流程--chip

染色体免疫共沉淀(Chip)实验报告 步骤一:样品准备 试剂和仪器: Biopulverizer(biospec) 37% formaldehyde 甘氨酸(Glycine) PBS protease inhibitors 步骤二:细胞交联 1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基,混匀细胞后转移到15ml离心管中。 2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液,使得甲醛的终浓度为1%,室温温育10min。 3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM,室温温育5min以终止交联反应。 4. 135x g,4°C离心10min,去上清,并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。 5. 吸净PBS后,加入1ml PBS+protease inhibitors混合液,并转移到1.5ml离心管中。800Xg,4°C离心 5min,小心去掉上清。 步骤三:细胞裂解 试剂: 裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%; Tritonx -100 0.25%。 裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。 步骤: 1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。 2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品,4°C旋转混合10min后,800g,4°C离心5min,弃上清。 3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品,冰上放置30min。 步骤四:超声破碎DNA 仪器: Bioruptor(Diagenode) 步骤: (1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。 (2)、在超声池中注入一定量的冰水。 (3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。 (4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中,超声10分钟。(30 seconds “ON” & 30 seconds “OFF”。) (5)、超声完成后,各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。超声后电泳图附件1。

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 (一)糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 (一)α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 莫氏试剂:5%α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g,溶于95%酒精中,总体积达100 mL,贮于棕色瓶内。用前配制。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 1%淀粉溶液100 mL %糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、%糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂,充分混合。倾斜试管,小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。 观察记录各管颜色。 (二)间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下,酮醣脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时,才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 塞氏试剂:%间苯二酚-盐酸溶液1000 mL,称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀至1000 mL。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤 一、原理: 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。 二、准备工作: 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶, 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上) 4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减 掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插 冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景 7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月) 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白 在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl) 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h 室温孵育

免疫共沉淀与Western Blot

免疫共沉淀与Western Blot 实验步骤: 1.以60mm细胞培养皿为例,细胞转染后24-36小时后,吸净培养液(可用PBS 小心漂洗一次)。 2.加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。 3.将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内,于冷冻离心机4℃,13000g离心30分钟。 4.将离心后的上清液分为两份:一份35μl,加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟,做为总细胞裂解液(total cell lysate,TCL)于-20℃保存,或取6-10μl进行SDS-PAGE电泳,Western blot检测目的蛋白的表达水平(接第5步)。另一份用于免疫沉淀,具体操作如下: 1)分A/G beads:按每管(一个免疫沉淀样品)加入5μl Agrose A/G beads 及5μl(1μg)抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量,将抗体和beads混合,补充lysis buffer(补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物),将beads及抗体的混合物按每管50μl(含5μl beads及5μl抗体)分配到1.5ml Eppendorf管中,再加入400μl1×lysis buffer,备用; 2)从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步(步骤1))已分好的beads中,使终体积达到850μl,将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转(15rpm)免疫沉淀3小时; 3)将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟,去上清,加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads,于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟,弃上清,共洗涤三次。 4)最后一次洗涤完毕,弃上清,管中只剩Beads,加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合,于100℃煮沸10分钟,稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶,进行电泳,或-20℃冻存。 5.电泳完毕,取下PAGE胶,与PVDF膜做成"三明治"形状,用湿转法进行电转1小时。 6.电转完毕,取下PVDF膜,加入5%脱脂奶粉,于脱色摇床摇荡(75rpm)封闭1小时以消除非特异背景。

生物化学实验内容

《生物化学》实验教学大纲 课程类别:专业基础 适用专业:本科临床学专业 课程总学时:实验学时:32 实验指导书:生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称:生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科,也是一门重要的实验性较强的基础医学课程.随着医学的发展,该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分,它与理论教学既有联系,又是相对独立的组成部分,有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求,开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化,使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念,培养学生的基本技能和科学思维的形成,提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识,加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察,逐步培养学生学会观察,比较,分析和综合各种现象的科学方法,培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结,培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练,使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书: 1.揭克敏主编:生物化学与分子生物学实验教程(第2版)。科学出版社,2010 参考资料: 1..袁道强主编:生物化学实验(第1版)。化学工业出版社,2011 五、实验项目数据表

2)要求:0:必修1选修 3)类型:0:演示1:验证2:综合3:设计 4)每组人数:指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识; 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 (一)蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后,可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同,用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性,加水稀释降低盐浓度,能使沉淀的蛋白质重新溶解,并保持其生物活性。因此,利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5%鸡蛋清溶液20滴,饱和硫酸铵溶液20滴,充分摇匀后静置5min,记录结果。

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子(transcription factor, TF)与启动子(promoter)的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter 的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞——收集细胞,超声破碎——加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合——洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA 复合物——解交联,纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天: (一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。(培养基共有9ml) 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起,共800ul。 7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。当然,如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 (二)、除杂及抗体哺育。

微生物检验的基本操作技术

微生物检验的基本操作技术 一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中,防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法; 无菌操作技术是微生物实验的基本技术,是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。 2、内容 无菌操作技术主要包括两方面: 1)创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等; 2)在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。 3、无菌操作原则 1)在执行无菌操作时,必须明确物品的无菌区和非无菌区,接种时必须穿工作服、戴工作帽,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球将手擦干净; 2)在操作前20~30分钟要先启动超净台和紫外灯,进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品,如瓶塞等,而必须用消毒的钳、镊子等; 3)从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及外露部位,使用吸管接种于试管或平皿时,吸管尖不能触及试管或平皿边; 4)接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌或样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒; 5)接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必须时还要烧到环和针与杆的连接处; 6)吸管吸取菌液或样品时,应用相应的橡皮头吸取,不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作,并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。 二、无菌操作的环境要求 1、无菌室 (1)无菌室的结构:更衣间、缓冲间、操作间;

实验1-常规生化实验仪器的使用及基本操作

生物化学与分子生物学实验技术 实验安全与实验基本操作 2实验室安全规则 3实验室安全事故案例 ●1995年9月香港科技大学化学系大四学生梁同学因吸入别的同学泼洒的酸 酐而不治身亡。 ●1997年香港科技大学物理系访问学者因未按规定使用通风橱造成他人肺部 伤害而永不被香港各大学录用。 4推行实验室安全规则的目的 1.为了达到研究所研究学习安全之目的。 2.为了满足人性安全感的基本需要。 3.为了人性的尊严─生命是无价的。 4.减少工作中产生灾害,确保全教职工和学生之安全及健康。 5. 保护大家共同的环境。 5安全事故原因分类分析 天灾 占2% 凡不知、不顾、不理、不能、粗心、迟钝、疲劳、失检、情绪各种内在外在的行为 不安全行为 人为因素 占98% 工作场所中,工作环境、设备设施对人所产生之危险因素 不安全环境 6专业性实验室安全工作守则 ●化学药品的操作 ●放射性物质(另有专门培训) ●废料处理 ●紫外线的接触 ●化学药品溢泼的处理 7实验室常用化学试剂的使用安全 8二甲苯 ●无色液体,有芳香气味,易挥发。用来制造、染料、塑料和药物。属低毒类, 对皮肤和黏膜有刺激作用,高浓度有麻醉作用。神经系统会受损害,还会使肾和肝受时性损伤。

●眼毒性:蒸气会刺激眼睛,液体导致严重刺激,发红肿胀和灼伤。通常影响 是暂时性的。皮肤毒性:产生灼伤感、干燥。可以用微温的缓慢流水冲洗至少20分钟,用无摩擦性的肥皂从皮肤上洗去二甲苯。 ●易燃,有爆炸危险。属于甲类防火危险物质。用二氧化碳或干粉或泡沫灭火 剂,不宜用水。 9三氯甲烷 ●无色透明易挥发液体,有特殊的香甜气味。沸点:61.2℃,医药上用作麻醉 剂。也用作萃取剂和溶剂。 ●有很强的麻醉作用,在光的作用下,能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒 的光气。通常加入1—2%乙醇,使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯,以消除其毒性。 ●吸入高浓度蒸汽时,开始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸,发生流泪、感觉麻醉、 呕吐、痉挛、直到昏睡、不省人事。 ●在空气、水分和光的作用下,酸度增加,因而对金属有强烈的腐蚀性 10乙醚 ●透明、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体。沸点:34.6℃;对人体有麻 醉性能。当吸入含量为3.5%时,30~40分钟就可失去知觉。 ●人体过量吸入,会引起严重的急性中毒。呼气中带醚味,并出现呕吐、出汗、 喷嚏、咳嗽、头痛、记忆力减退、无力、兴奋。 ●微溶于水,易溶于盐酸,能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混溶。 应储存于阴凉、干燥、通风的低温库房内,库温最好控制在25℃以下。远离热源、火种,避免阳光直射。 ●本品易燃。与强氧化剂反应能起火爆炸。在空气中与氧长期接触或受光照会 生成不稳定的过氧化物,受热能自行着火爆炸。着火时,可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土灭火。用水灭火无效,但可用水保持火场容器冷却。 11乙醇 ●无色有酒味,易挥发的澄清液体。沸点78.5℃:用于溶剂、清洗剂、分析 试剂等。属微毒类,对眼睛黏膜有轻微刺激作用。 ●乙醇可使皮肤发干,长期受大剂量作用时,可使神经系统、消化器官等发生 严重的器质性疾病。 ●易燃,手热或遇明火有燃烧爆炸危险,燃烧时,发出兰色火焰。蒸气能与空 气形成爆炸性混合物,在火场中,受热的容器有爆炸的危险。着火时,用二氧化碳、雾状水、干粉、1211或抗泡沫灭火。用水冷却火场中的容器,驱散蒸气,赶出溢出液体,使其稀释成为不燃性混合物

免疫共沉淀详细步骤

免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。 实验试剂 1. RIPA Buffer配制:

基础成分: Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性) NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集) NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存) 注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4) 亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂 激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco) NaF(200mM的储存液,室温保存)

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤 在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天) 1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。 7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育(第一天) 1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。 3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

生物化学实验的基本操作

一、玻璃仪器的使用及清洁 (一)玻璃仪器的洗涤及干燥 1、一般仪器:烧杯、试管、离心管等普通玻璃仪器,可直接用毛刷蘸餐洗净刷洗,然后用自来水冲洗,直至容器内不挂水珠即可。最后用少量蒸馏水冲洗内壁2-3次,倒置晾干即可。 2、容量分析仪器:容量瓶、滴定管及吸管等容量仪器,用后用自来水多次冲洗,如能清洁(壁不挂水珠),再用蒸馏水少量冲洗2~3次晾干即可备用。若仍不干净附有油污等,则须于干后放入铬酸洗液内浸泡数小时,然后倒净(或捞出)洗液,用自来水充分冲洗至水不显黄色后再冲几次,最后用少量蒸馏水冲洗2~3次晾干备用。 在做酶学实验时,对仪器的清洁要求更高,因如有极微量的污物(如重金属离子)即可导致整个实验失败。因此,必要时仪器经上述方法洗涤后,还需用稀盐酸或稀硝酸洗涤,以除去铬及其它金属离子,然后再用自来水、蒸馏水冲洗。生化实验室常用的洗液有以下几种:(1)铬酸洗液:为最常用的洗液,由重铬酸钾、粗硫酸及水配制而成,去污力强,清洗效果好。其配制方法有多种,可根据需要进行选择,常用的配方如下表。 重铬酸钾(g)100 60 100 水(ml)750 300 200 粗硫酸(ml)250 460 800 清洁性能较弱较强(常用)最强 配制方法为:先将重铬酸钾溶于水,再慢慢加入浓硫酸。因配制过程产生大量热,容器需放入冷水中,边加硫酸边搅动混合。由于产热量很大,使用玻璃容器有破裂的危险,所以最好用耐高温的陶瓷或耐酸的搪瓷容器。洗液可多次反复使用,如效力变弱,可加入少量重铬酸钾及浓硫酸继续使用,但如果变为绿色,则不宜再用。 (2)10%尿素液:为蛋白质良好溶剂,帮适用于洗涤盛血的容器。 (3)草酸盐液:用于清洗过锰酸钾的痕迹。 (4)硝酸液:用1:1的硝酸水溶液,用于清洗CO2测定器及微量滴定管。 (5)乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)液:5~10%的EDTA-Na2液可用于洗涤器皿内无机盐类。 玻璃仪器的干燥方法可根据不同仪器的种类而定。一般地说洗净后的玻璃仪器,如不急用应倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中烤干,但容量玻璃仪器,如容量瓶、吸量管、滴定管以及烧结、结构复杂的玻璃仪器等,严禁烘烤。此类仪器,如急用可采用水泵抽气法干燥。 (二)常用玻璃仪器的使用 1、吸量管:吸量管是用来测量一定容积的液体,并把它从一个器皿转移至另一个器皿中的量器。常用的吸量管有以下几种: (1)刻度吸量管:刻度吸量管是多刻度吸量管,有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等规格。吸量管刻度所标的数字有自上而下和自下而上两种,使用之前应仔细分辨。实验室所用之刻度吸管多属于刻度到尖端的吸管,所以要吹出尖端留存的液体。 (2)奥氏吸管:在量取粘度较大的液体如血液、血清等时,应当使用奥氏吸管。这种吸管也是单标的,并且在其下端有一个膨大部分。所以液体与吸管表面接触面积较小,当量取血液时,较他种吸管准确。奥氏吸管的容量包括遗留在尖端的液体,故在缓缓使液体流出后,再停留数秒钟,吹出最后一滴。在学生实验中常用的有1、2、5毫升等规格。

Pull down与免疫共沉淀实验

重要。该方法比较简便,避免了使用同位素等危险物质,在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。 除了GST以外,类似的融合蛋白很多,如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化;与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+ 的色谱柱进行纯化;与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲蝶呤的色谱柱进行纯化等等。 Pull down实验一般用于体外转录或翻译体系,如酵母双杂交系统中检测蛋白质之间的相互作用。但并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用,因为在体内它们不一定空间上有碰到,所以并不意味着在生理条件下一定结合。 免疫共沉淀技术的基本原理是:在非变性条件下裂解细胞,蛋白质之间的相互作用还可以保持。在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose微珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA),若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样的一种复合物:目的蛋白-兴趣蛋白-抗兴趣蛋白抗体-SPA/Agarose,因为SPA/Agarose比较大,这样复合物在离心时就被分离出来。经蛋白上样缓冲液变性煮沸,复合物四组分又被分开。然后经WB试验,用抗体检测目的蛋白是什么,是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的,符合体内实际情况,得到的蛋白可信度高。 免疫共沉淀既可以用于检测已知的两个蛋白质在体内的相互作用,也可以找出未知的蛋白质相互作用,不管是两者的哪个,其原则都是一样的,都需要用特

异性的抗体与其中的一种蛋白质结合,之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来,然后用WB鉴定。 免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要,因为该方法可能出现假阳性的概率比较高,设置的对照包括:在对照组中使用对照抗体,以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。但这种方法也有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

免疫共沉淀实验方案

免疫共沉淀实验方案 一、实验试剂和材料 Dynabeads? Protein G(novex by life technologies) PBS pH7.4(含0.01%Tween-20) 0.1M Na-phosphate(Washing Buffer) 50mM Glycine pH2.8(Elution Buffer) 二、实验步骤 (一)准备磁珠 1.将瓶子倾斜旋转5min左右,使瓶中磁珠悬浮; 2.吸取50ul磁珠液于离心管中; 3.将离心管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清; 4.从磁铁架上取下离心管; (二)结合抗体 1.加入200ul用PBS(含0.01%Tween-20)稀释的抗体; 2.室温旋转孵育10min; 3.将离心管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清; 4.从磁铁架上取下离心管,用200ul PBS(含0.01%Tween-20)温和吹吸并重悬磁珠-抗体复合体; (三)免疫沉淀抗原 1.将离心管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清; 2.从磁铁架上取下离心管,加入抗原样品并温和吹吸,重悬磁珠-抗体复合物; 3.室温旋转孵育10min,使抗原结合到磁珠-抗体复合物上; 4.将离心管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清;

5.用washing buffer 3次洗涤磁珠-抗体-抗原复合物,弃上清; 6.用100ul washing buffer重悬磁珠-抗体-抗原复合物,并将磁珠悬浮液转移到干净的离心管中,以避免蛋白抗原粘附在管壁上。 (四)洗脱抗原 1.将离心管置于磁铁架上,磁珠吸附到管壁上,弃上清; 2.加入200ul Elution Buffer至离心管中,温和吹吸并重悬磁珠-抗体-抗原复合物;(不要吹打出气泡) 3.室温旋转孵育2min; 4.将离心管置于磁铁架上,并将洗脱液(含有洗脱的抗原、抗体)转移到干净的离心管中,用于后续的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析。

生物化学实验考题及答案[1]

生物化学实验考核试题库 要求:参加考核的每位学生须从1-6号题中随机抽1题,从7-12号题中随机抽1题,从13-37号题中随机抽1题,从38-46号题中随机抽1题,共计4道考核题进行考核,总分为60分。 一、理论考核题 1盐析和盐溶(3分)2电泳(3分)3层析(色谱)(3分)4酶的活力单位(3分)5比活力(3分)6分子筛效应(3分)7电泳的原理(4分) 8离子交换层析的原理(4分)9亲和层析的原理(4分) 10凝胶过滤层析的原理(4分) 11吸附层析的原理(4分) 12透析技术的基本原理及其应用(4分) 13聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要优点及用途(6分) 14按层析过程的机理,层析法分哪四类?按操作形式不同又分哪三类?(7分) 15普通离心机的使用注意事项?(6分) 16可见分光光度计的使用注意事项?(6分) 17蛋白质含量测定的常用方法有那些?(6分) 18粗脂肪的提取和含量测定的基本原理(6分) 19索氏提取器是由哪几部分组成的?(6分) 20粗脂肪的提取和含量测定的简要操作步骤(6分) 21粗脂肪的提取实验中如何减少误差?(6分) 22凯氏定氮法测定总氮量的基本原理(6分) 23凯氏定氮实验中用到的主要器材有哪些?(6分) 24核酸的含量测定常用的方法有哪些?(6分) 25双倒数法测定米氏常数的基本原理(6分) 26双倒数法测定米氏常数的实验中,决定实验成败的因素有哪些?关键因素是什么?(7分) 27生物细胞的破碎的常用方法有哪些?(6分) 28酶的制备及提取过程中常注意哪些事项?(6分) 29蛋白质的分离常用的方法有哪些?(6分) 30甲醛滴定法测定氨基酸的基本原理(6分) 31为什么SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定未知蛋白质的相对分子质量?(6分)32连续聚丙烯酰胺凝胶电泳与不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么不同?(6分) 33聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点?(6分) 34琼脂糖凝胶电泳的优点?(6分) 35提取某种植物组织中的总DNA时,使用的细胞提取液中的主要试剂成分是什么?各有什么作用?(7分) 36如何证明提取到的某种核酸是DNA还是RNA?(6分) 37聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时,使用的电泳缓冲液PH=8.3,那么样品应点在哪端?为什么?(6分) 二、技能或实验操作考核题 38说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质? 列出纸层析和柱层析的一般操作步骤。(10分) 39凝胶电泳的一般操作步骤(11分) 40普通离心机的使用操作(示范)(10分)

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。 IP实验步骤 基本实验步骤 (1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g 离心30 min后取上清; (2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜; (3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟; (4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、样品处理: 免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) 一原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互 作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险

性。 二、准备工作: 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS; 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上) 4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS 配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),

微生物基本操作规范样本

培养基制备 培养基概念: 是指以液体、半固体或固体形式,包括天然或合成成分,用于增进微生物繁殖或保持其活力物质构成。由于各类微生物对营养规定不同,培养目和检测需要不同,因而培养基种类诸多。咱们可依照某种原则,将种类繁多培养基划分为若干类型。 培养基分类: 按功能分类:基本培养基、营养培养基、鉴别培养基、选取培养基、特殊培养基。 按物理性状分类:液体培养基、固体培养基、半固体培养基。 液体培养基:所配制培养基是液态,这种培养基被用来微生物增菌和生长状态观测。 固体培养基和半固体培养基:在液体培养基中加入适量凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基。惯用作凝固剂物质有琼脂。固体培养基琼脂用量1.5-2%,半固体培养基琼脂用量在0.5~1%之间。固体培养基用作微生物分离、鉴定、计数、保藏等。半固体培养基被用来观测微生物动力和保藏菌种。 今天给人们展示一下各种培养基制备。 培养基制备基本过程: 调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查和保存 所需物品:试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。

(1)调配成分: 在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml,1%蛋白胨,0.5%NaCL,0.3%牛肉膏(g/v),精确称取各种成分,使其充分混合。[注意事项] 培养基调配溶解: 先在锥形瓶底加入少量蒸馏水,再加入培养基成分,以防其粘在锥形瓶底部烧结。制备培养基时,除玻璃容器时,还可用铝锅,搪瓷桶,但不可用铁,铜等容器,以免铁和铜离子进入培养基(培养基中铁离子含量超过0.14mg/L时抑制细菌毒素产生,含铜量超过0.3mg/L时抑制细菌生长)。培养基中若需加入染料,胆盐,批示剂等,应在校正pH后加入。 (2)溶解: 将配制好混合物微波炉加热8min,使其完全溶解,补足失水。(3)校正PH: 不同细菌需要在含不同pH培养基上生长,普通将培养基pH调至7.2~7.6。商品化试剂配制后可省略该环节,无需校正PH。依照所需培养基用途不同分别加入不同含量琼脂,制成半固体培养基和固体培养基。 (4)分装:(液体培养基、半固体培养基和某些固体培养基分装可在灭菌钱也可在灭菌后) ①基本培养基:普通分装于容量为500ml锥形瓶灭菌后备用,以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等;

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