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微生物鉴定指导原则

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微生物鉴定指导原则

9204 微生物鉴定指导原则

本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定,以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。当微生物的鉴定结果有争议时,以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。

微生物鉴定是指借助现有的分类系统,通过对未知微生物的特征测定,对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分,或属、种及菌株水平确定的过程,它是药品微生物检验中的重要环节,药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定,如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” (通则1106)中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定; 对“无菌检查法”(通则1101)的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定,以判定试验是否重试;药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则(通则9203)中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定,以掌握环境微生物污染情况,有助于污染调查。此外,在药品生产中,有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。

微生物鉴定需达到的水平视情况而定,包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中,对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析,一般即可满足需要;非无菌药品产品的控制菌检查应达到种的水平;无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺(如培养基灌装)失败时,对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。

一、微生物的鉴定程序

微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定,鉴定时,一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定,根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法,其局限性与方法和数据库的局限性息息相关,未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准微生物(模式菌株)的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没有此模式菌株,就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中,用户

应明确所采用鉴定系统的局限性及所要达到的鉴定水平(属、种、菌株),选用最适合要求的鉴定技术,必要时采用多种鉴定方法确定。

1、待检菌的分离纯化

微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化,最常用的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线分离纯化,以获取待检菌的纯培养物(单个菌落)必要时可进一步进行纯培养,为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量菌体。从药物原材料、制药用水、及生产环境、中间产物和终产品的样品中检出的受损微生物,经分离纯化程序使其由不利生存易产生变化的状态转变为在营养富集和最佳培养温度条件下生存的稳定状态,以保证鉴定结果准确性。

2、初筛试验

常规的微生物鉴定,一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征,

将待检菌做初步分类。常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。

重要的生化筛选试验包括:

氧化酶试验 用于区分不发酵的革兰阴性杆菌(氧化酶阳性)和肠道菌(氧化酶阴性)。

过氧化氢酶试验 用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性)和链球菌(过氧化氢酶阴性)。

凝固酶试验 用于区分凝固酶阴性葡萄球菌 (可推测为非致病性)和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性)。

初筛试验可将大部分的细菌鉴定到属的水平,这些试验可为某些评估提供充足的信息。对于微生物鉴定方法来说,初筛试验是最关键的一步,若给出了错误的结果,将影响后续试验,包括微生物鉴定试剂盒和引物的选用。

3、表型微生物鉴定

表型微生物鉴定依据表型特征的表达来区分不同微生物间的差异,是经典的微生物分类鉴定法,以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标,通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物细胞的差异的进行鉴别。微生物分类中使用的表型特征见表1。

表1 微生物分类中使用的表型特征

分类 特征

培养物 菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素

形态学 细胞形态、细胞大小、细胞形状、鞭毛类型、内容物、革兰氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式

生理学 氧气耐受性、pH范围、最适温度和范围、耐盐性

生化反应 碳源的利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式

抑制性 胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性

血清学 凝集反应、荧光抗体

化学分类 脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分

生态学 微生物来源

微生物细胞的大小和形态、芽孢、细胞成分、表面抗原、生化反应和对抗菌剂的敏感性等表型的表达,除受其遗传基因的控制外,还与微生物的分离环境、培养基和生长条件等因素有关。表型微生物鉴定通常需要大量的纯培养物,而微生物的恢复、增殖和鉴定易受培养时间影响,事实上许多环境微生物在普通的微生物增殖培养基中是无法恢复的;此外,一些从初始培养物中刚分离出的受损微生物还可能不能完整的表达其表型属性。因此,在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响。目前已有的基于碳源利用和生化反应特征的鉴定方法,如利用气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征,以及利用MALDI-TOF质谱法分析微生物蛋白等微生物鉴定系统,在进行结果判断时需借助于系统自身的鉴别数据库,还依赖特定的培养基和培养方法以确保鉴定结果的一致性。

表型微生物鉴定方法已广泛应用于药品微生物实验室。根据微生物表型鉴定所提供的信息可以判断药品中污染的微生物种类。也可掌握环境微生物群落的变化,并进行产品的风险评估。在许多质量控制调查中,单独的表型鉴定结果就能给出充足的信息帮助调查人员进行深入调查,并按需要推荐适宜的纠正措施。

4、基因型微生物鉴定

与表型特征不同,微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响,只需分离到纯菌落便可用于分析。由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的,所以DNA–DNA杂交、聚合酶链反应、16S rRNA序列 和 18S rRNA序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、DNA探针和核糖体分型分析等基因型微生物鉴定方法理论上更值得信赖。基因鉴定法不但技术水平需要保证,还需要昂贵的分析设备和材料,通常仅在关键微生物调查中使用,如产品不合格调查。若使用,方法必须经过确认。

目前《伯杰氏系统细菌学手册》中对细菌分类的描述是通过遗传物质的分析比较来实现的。通过未知微生物的DNA与已知微生物的DNA比较,能够确定亲缘关系的远近。基因型的鉴定可通过DNA杂交、限制性酶切片段图谱的比较和/或DNA探针完成,若DNA–DNA的杂交亲缘关系大于70%时,表明微生物是同一种属;

表2系统发育典型的分析方法是通过比较细菌16S rRNA或真菌18S rRNA基因的部分碱基序列来实现,即经过聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增、电泳分离扩增产物、以双脱氧链终止法进行碱基测序,然后与经验证过的专用数据库或利用公共的数据库(不一定经过验证)进行比对。

表2 微生物分类学的基因型/系统发育的特征

类别 特征

基因型 DNA-DNA杂交、DNA碱基比例 (如G + C)、限制性酶切片段图谱和DNA探针

系统发育结构 16S rRNA序列 和18S rRNA 序列

基于核酸的方法可以用来筛选处于过渡期受损的微生物。将存在于过渡期与菌株生存能力相关的rRNA,通过逆转录的方法转换为可用于PCR扩增的DNA。解决了不能存活的细菌细胞中DNA的扩增问题。该方法经过样品收集、核酸提取、目的片段扩增、杂交和检测等步骤,涉及了变异微生物的检测、检测限、基质效应、正向截点的核查、仪器设备和系统携带污染、分析的精确性和试验的重现性等内容。

rRNAs记录了微生物的进化历史,对这些序列进行分析可以对微生物进行系统分类和鉴定。

二、微生物鉴定方法的确认

微生物鉴定系统的确认试验按下述方法之一进行:(1) 采用现有方法和待确认方法对日常检验中分离的微生物约50株进行平行鉴定试验,鉴定结果的差异可使用仲裁方法判定。(2)使用12

~

15种已知的能代表常规分离到的微生物的储

备菌种, 共进行50次鉴定试验。(3)待确认方法对20

~50株微生物(包括15

~

20

个不同的种)进行鉴定,结果应与参照实验室的鉴定结果一致。确认试验所用的菌株应包括鉴定方法供应商和药典推荐的适宜质控菌株。

对所用的微生物鉴定系统的鉴定结果应进行评估,同时还应考虑其一致性水平,合适的微生物鉴定系统,试验菌株与模式微生物的一致性水平通常应大于90%。若可能,微生物鉴定方法确认所用的挑战微生物应包括非发酵型细菌、棒状杆菌和凝固酶阴性的葡萄球菌等,但其一致性水平可能比较低。

微生物鉴定系统不能鉴定所有的微生物,因为数据库中未包含此微生物,或

系统参数无法充分识别该微生物,或该微生物在系统中无反应、或该微生物尚未被分类描述。确定错误的鉴定结果是比较难的,任何微生物鉴定都应从微生物形态学、生理要求和微生物来源等方面判断鉴定结果是否合理。错误的鉴定会导致不恰当的纠正和预防措施及产品处置。

微生物鉴定方法的确认应包括准确度、专属性、重现性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值。

确认试验最重要的是准确性和重现性。这些测量值按下述定义:

准确性% =(结果正确的数量/总的结果数量)× 100

重现性% =(结果正确且达到一致性的数量/总的结果数量)× 100

用户应该考虑鉴定方法的适用性,建立准确性和重现性的接受标准。

其它测定值如灵敏性、专属性、阳性或阴性预测值。通过以下例子能很好的说明这些测定值。例,临床微生物实验室,分别用DNA杂交探针和传统培养物方法处理了100个临床样本,前者阳性结果比后者高10%,结果列于表3。

表3 DNA探针和培养物方法的阴阳性结果分布对照

培养方法结果

阳性 阴性

DNA探针结果 阳性 9 2

阴性 1 88

准确度=(9+88)/100 × 100 = 97%

灵敏度=[9/(9 + 1)] × 100 = 90%

专属性=[88/(88 + 2)] × 100 = 97.7%

阳性预测值(PPV)= [9/(9 + 2)] × 100 = 81.8%

阴性预测值(NPV)= [88/(88 + 1)] × 100 = 98.9%

应注意到试验的阳性预测值不是固定的,它取决于临床样本中微生物的普遍程度。阳性预测值与流行疾病和条件成正比。如果在一组人群试验中感染人数比例较高,则阳性预测值较高,阴性预测值较低。如果组中所有人都被感染,则阳性预测值为100%,阴性预测值为0%。这些函数引出的数字列于表4中。

表4 关于培养物方法和替代方法PCR法的两行两列表

聚合酶链反应

培养方法 阳性 阴性 总数 阳性 a 真阳性 b 假阴性 a + b

阴性 C 假阳性 d 真阴性 c + d

总数 a + c b + d

包容性(灵敏度) (%) = [a/(a + b)] × 100

排除性(专属性) (%) = [d/(c + d)] × 100

阳性预测值 (%) = [a/(a + c)] × 100

阴性预测值 (%) = [d/(b + d)] × 100

分析准确度 (%) = [(a + d)/(a + b + c + d)] × 100

Kappa Index系数 = 2(ad bc)/[(a + c) × (c + d) + (a + b) × (b +

d)]

三、系统发育的相关内容

第二版伯杰手册内容是依据核糖体小亚基16S RNA的核苷酸序列分析按照系统发育为框架编写的,而不是按照表型结构编写的。

系统发育树或树状图显示了遗传关系最接近的微生物,这项技术的应用导致了分类的修正和一些已知微生物的重命名,如真菌黑曲霉ATCC16404被重名为巴西曲霉。一般而言,微生物亲缘关系小于或等于97%被认定为不同的属,那些亲缘关系小于或等于99%被认定为不同的种,但是这种普遍性有很多的例外情况。

基因型鉴定与表型鉴定的结果差异的情况相对比较少见,例如,具有相同或非常相似基因的微生物具有不同的表型、具有相似表型的却具有不同的基因以及基因型距离很远的微生物不能被归为同种或同属。多相分类学的概念是汇集和吸收了分子生物学、生理学、形态学、血清学或生态学资源的多层信息进行微生物分类,例如,微生物特征描述、表型和基因数据及微生物来源等,都可被成功的应用于微生物鉴定中,以避免因使用单一鉴定方法做出毫无意义的结论。

四、溯源分析

菌株水平的鉴定在污染调查过程中非常有用,当产品中的微生物数量高于建议水平或出现异常高的微生物检出率时尤其适用。菌株水平的鉴定在无菌工艺中也很重要,在无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工艺失败时,必须对检出的微生物进行评估。

同一地点的同种菌不仅表型特征是基本一致的,同时基因型特征也是基本一致的。不同地点的同种菌表型特征可能是基本一致的,但保守及可变区域的基因特征会有一定的差异性。因此污染调查等应以基因型特征鉴定为主,表型特征鉴定辅助。

细菌16S rDNA 和真菌的18S rDNA为各自的保守序列区域,对种水平的鉴定是非常有用的,但不足以区分亲缘关系近的不同种或同种中的不同株。与此相反,限制性核酸内切酶进行酶解的Southern杂交是能有效地显示两个株之间的差异 。如果带型表现的完全相同则仅能说明限制性核酸内切酶在两株菌基因组的那个区域具有相似的酶切位点,要证明两株菌是同一株时应该包括两个或更多不同限制性核酸内切酶的酶解物,每个内切酶都可得到一定的DNA区域的谱带,所有来自两株菌的谱带都必须完全一致。如脉冲场电泳等,就是利用此原理进行菌株区分的。

实际工作中无菌试验阳性结果中分离出的微生物,经对其溯源分析,确认污染归因于无菌试验过程中所使用的材料或无菌技术的差错,该试验可判无效,否

则判该产品不符合要求。对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行适当比率的鉴定,掌握环境微生物污染情况,有助于污染调查。

确证微生物为同种中的两个相同株,实现既鉴定又溯源目的、同时保证结果的准确性,需比对更多的基因序列和特征基因片段,甚至是全基因的比对。此外,有些微生物的溯源还需结合表型特征鉴定,如沙门菌属(血清型的鉴定)。

最新微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后,首先判定是原核微生物还是真核微生物,这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属,从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后,如是原核微生物,便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定,如条件允许,可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法,可把它们分成四个不同的水平:①细胞形态和行为水平,②细胞组分水平,③蛋白质水平,④基因组水平; 在微生物分类学发展的早期,主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主,可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的,称为化学分类和遗传学分类法,这些方法再加上数值分类鉴定法,可称为现代的分类鉴定方法。 (一)、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类,并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后,采用双歧法整理实验结果,排列一个个的分类单元,形成双歧检索表(图14-4 )。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大,宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )

BB. 细胞小,宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌 属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位,近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔,其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液,1 孔为无碳源的缓冲液对照,各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物,定温培养,每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况,一般为时1 周,BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 (二)、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类,一般为50 ~60 个,多者可达100 个以上,在分类上,每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征,对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后,将所测菌株两两进行比较,并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值,列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察,应将矩阵重新安排,使相似度高的菌株列在一起,然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ,再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 %者为同种,大于65 %者为同属等) ,排列出—个个分类群。 图14-5 显示 6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

微生物常规鉴定技术

微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色步骤: (1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。 (2)晾干:与简单染色法相同。 (3)固定,与简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗。 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。 (8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色,立即水洗。 (9)复染:滴加蕃红复染5min。 (10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。 (11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 (12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。 (13)实验完毕后的处理: ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干

微生物检验常规鉴定技术

第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划(1学时) 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术

一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 1、接种工具和方法 接种和分离工具 1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种: 1)划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动,就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环,接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 2)三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上,成等边三角形的三点,让它各自独立形成菌落后,来观察、研究它们的形态。除三点外,也有一点或多点进行接种的。 3)穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时,用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是:用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。 4)浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中,然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基,迅速轻轻摇匀,这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后,置合适温度下培养,就可长出单个的微生物菌落。 5)涂布接种与浇混接种略有不同,就是先倒好平板,让其凝固,然后再将菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布,让菌液均匀分布,就可长出单个的微生物的菌落。 6)液体接种从固体培养基中将菌洗下,倒入液体培养基中,或者从液体培养物中,用移液管将菌液接至液体培养基中,或从液体培养物中将菌液移至

2020年(生物科技行业)微生物常规鉴定技术

(生物科技行业)微生物常 规鉴定技术

微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同壹种的细菌在壹定条件下,培养特征却有壹定稳定性。,以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性仍是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如

青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)俩大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色步骤: (1)涂片:涂片方法和简单染色涂片相同。 (2)晾干:和简单染色法相同。 (3)固定,和简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗。 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。

微生物的分类与鉴定

第十章微生物的分类与鉴定 一、选择题 1.真菌的分类单元-门的词尾为(A ) 2.A、–mycota B、–mycetes C、–mycotina D、-mycetidae 3.下列传统分类指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是(A ) 4.A、形态学特征 B、生理特征 C、生态学特征 D、分子生物学特征 5.下列拉丁文哪个书写格式正确( C ) 6.A、Fusarium oxysporium B、Aspergillus japonicus Saito 7. C、Bacillus amyloliquefaciens D、Clostridium Kluyveri 8.1978年,根据16S rRNA和18S rRNA的碱基序列将生物分为“三域”的科 学家是(D ) 9.A、Ainsworth B、Bergey C、Leedale D、Woese 10.1995年,Ainsworth分类系统把菌物列入真核生物域,将其分为3个界, 下面哪项不属于其中( D ) 11.A、原生动物界 B、假菌界 C、真菌界 D、菌物界 12.有关菌株的说法,下列哪项说法不对( B ) 13.A、菌株强调的是遗传型纯的谱系 B、菌株的名称不可随意确定 14.C、菌株与克隆相同,为一个物种内遗传多态性的客观反映 15.D、菌株实际上是某一微生物达到遗传型纯的标志, 二、是非题 1.微生物的种是微生物分类的基本单元,但是目前还没有一个公认的、明确的定义。(√) 2.两个微生物菌株具有相同G+C含量表明它们之间的亲缘关系一定很相近。(×)

3.亚种是进一步细分种时所用的单元,一般指除某一明显而稳定的特征外,其余鉴定特征都与模式种相同的种,其命名方法按“三名法”处 理。(√) 4.变种是亚种的同义词,在《国际细菌命名法规》中不主张使用。(√)5.在微生物分类中,DNA(G+C)mol%的比较只能做否定判断。(√)6.微生物DNA之间的同源性越高,说明它们之间亲缘关系就越近,反之亦然。(×) 7.菌株是一个物种内遗传多态性的客观反应,是遗传型纯的谱系,其名称可以随意确定。(√) 8.模式菌株是一个种的具体活标本。(√) 9.据科学家1992年估计,地球上生存的菌物约有150万种。(√)10.微生物自动化鉴定技术一般都是利用微生物的生理生化反应特性而设计的。(√) 11.细菌分子鉴定常用16S rRNA序列分析,而真菌分子鉴定常用ITS序列分析。(√) 12.所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内最具代表性的菌株。(×)13.对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较,加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多,因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。(√) 14.现代微生物分类中,任何能稳定地反映微生物种类特征的资料,都有分类学意义,都可以作为分类鉴定的依据。(×) 15.DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究,而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较,则需进行DNA-rRNA杂交。(√)

微生物的分类鉴定方法

微生物的分类鉴定方法 1. 内容 微生物分类鉴定:经典方法、现代方法。 2. 练习 一、填空题 1.不论鉴定哪一累微生物,其工作步骤都离不开一下3项________,________,________。 答案:获得该微生物的纯培养,测定一系列必要的鉴定指标,查找权威性的菌种鉴定手册。 2.DNA碱基比是指________值,简称GC值。 答案:(G+C)mol% 3. 测验 一、填空题 1.按碱基的互补配对原理,用人工方法对两条不同来源的单链核酸进行________,以重 新构建一条新的________技术,称为核酸杂交。 一、简答题 1.现代微生物鉴定的经典指标有哪些? 2.核酸分子杂交在微生物的分类鉴别中有何应用? 4. 案例 5. 资源下载 课程讲义资源(Word文档)、教学课件资源(PPT)、视频录像资源(视频录像)。6. 扩展学习 使用教材: 微生物学教程第3版周德庆主编高等教育出版社2011 参考书目:

1.沈萍主编,《微生物学》,高等教育出版社,2000; 2.沈萍、范秀容、李广武编,《微生物学实验》第3版,高等教育出版社,1999; 3.Prescott LM, Harley JP, and Klein DA. Microbiology (5th ed.), Higher education press and McGraw-Hill Companies, 2002. 4. 闵航(2005):微生物学. 浙江大学出版社 参考期刊: 微生物学报中国科学院微生物研究所;中国微生物学会主办 微生物学通报中国微生物学会;中国科学院微生物研究所主办 参考网址: 中国微生物信息网络hppt://159.226.80.1/chinese.html 中国微生物资源信息共享https://www.doczj.com/doc/6913298874.html,/sdinfo 中国微生物信息网络https://www.doczj.com/doc/6913298874.html,/

9204 微生物鉴定指导原则

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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定, 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时,以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统,通过对未知微生物的特征测定,对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分,或属、种及菌株水平确定的过程,它是药 品微生物检验中的重要环节, 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定,如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” (通则 1106)中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定; 对“无菌检查法” (通则 1101) 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定,以判定试验是否重试;药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则(通则 9203)建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定,以掌握环境微生物污染情况,有助于污染调查。此外,在 药品生产中,有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定,包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中, 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法,某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析,一般即可满足需要;非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平;无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺(如培养基灌装) 失败时,对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定,鉴定时,一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定,根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法,其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关, 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物(模式菌株)的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株,就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中,用户
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微生物的分类与鉴定答案

一、填空: 1.微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2.来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3.1969年将生物界分成了五界,分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4.细菌的分类单元分为七个基本的分类等级,由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5.生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6.形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一,其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7.分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分,目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8.微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_,其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用,而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9.核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10.1978年,Woese等提出新的生物分类概念,根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界,即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11.对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12.在生物的界级分类学说研究中,1978年由R.H.whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13.填写以下10个数据:(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度;(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃;(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃:(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150~170 ℃;(5)的代时一般为 17 min;(6)典型的酵母菌S.cerevisiae的代时一般为 120 min,其大小一般为~10 X ~21um 。(7)至今已记载的微生物约 20万种(1995);(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ;(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14.血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中,有核酸分子杂交,rRNA寡核苷酸编目分析,全基因组测定,数值分类等方法。 二、选择题: 1.同种菌不同来源的纯培养称为( C ) (A)种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2.试排出生物分类等级的正确顺序(D) (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1.目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2.具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种:是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种:从自然界中分离得到的某一微生物的纯种,如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异,即为新种。 3.培养物:根据一定的目的,在培养基上培养的微生物称为培养物。

微生物的分类和鉴定

第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释: 01.系统学(systematics):是研究生物多样性及其分类和演化关系的科学。分子 系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。 02.系统树:在研究生物进化和系统分类中,常用一种树状分支的图型来概括各 种(类)生物之间的亲缘关系,这种树状分支的图型也称为发育树(phylogenetic tree)。 03.分子系统树:通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系 统树。 04.微生物分类学(microbial taxonomy):是一门按微生物的亲缘关系把它们安 排成条例清楚的各种分类单元或分类群的科学,其具体任务有三,即分类、鉴定和命名。 05.分类(classification):根据文献资料,经过科学的归纳和理性的思考,整理 成一个科学的分类系统。即解决从个别到一般或从具体到抽象的问题。06.鉴定(identification):通过详细观察和描述一个未知名称纯种微生物的各种 性状特征,然后查找现成的分类系统,以达到对其知类、辨名的目的。即解决从一般到特殊或从抽象到具体的问题 07.命名(nomenclature):为一个新发现的微生物确定一个新学名的过程。

08.培养物(culture):是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微 生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。如果某一培养物是由单一微生物细胞繁殖产生的,就称之为该微生物的纯培养物(pure culture)。 09.菌株(strain):从自然界分离得到的任何一种微生物的纯培养物,都可以称 为微生物的一个菌株;用实验方法(如通过诱变)所获得的某一菌株的变异型,也可以称为一个新的菌株,以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。 10.标准菌株:指能代表这个种的各典型性状的一个被指定的菌株。 11.种群(population):也有人译为群体、居群或群丛等,是指一定空间中同种 个体的组合。每一个物种在自然界中的存在,都有一定的空间结构,在其分散的、不连续的居住场所或分布区域内,形成不同的群体单元,这些群体单元就称为居群。 12.种(species):是生物分类中基本的分类单元和分类等级。它是一大群表型特 征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属的其他物种有明显差异的一大群菌株的总称。 13.型(form / type):常指亚种以下的细分,当同种或同亚种不同菌株之间的性 状差异,不足以分为心的亚种时,可以细分为不同的型。例如,按抗原特征的差异分为不同的血清型;按对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等等。

10 微生物的分类与鉴定 试题库-柯野

本科生物技术、生物科学专业《微生物学》分章节试题库 (命题人:柯野) 第八章微生物生态(8分) 第十章微生物的分类和鉴定(8分) 第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释 1 系统发育树: 2 培养物: 3 菌株: 4 种: 6 属: 7 数值分类法: 8 模式(或典型)菌株: 9 DNA(G+C)mol%值: 10 三域学说: 二、是非题 1、“大肠埃希氏菌”才是俗称“大肠杆菌”的学名。() 2、所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内了具代表的菌株。() 3、两种细菌的G+C含量相近,说明它们亲缘关系近,反之,G+C含量差别大说明它们亲缘关系远。() 4、DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究,而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较,则需进行DNA-rRNA杂交。() 5、数值分类由于采用了先进的计算想技术,减少了大量的特征测定的实验操作,所以它是比较科学的现代微生物系统分类方法。() 6、“吹口气查胃病”的原理是:幽门螺杆菌具有人体不具有的尿素酶,受检者口服13C标记的尿素,如有该菌感染,则尿素被尿素酶分解生成NH3和13CO2,用

质谱仪能快速灵敏地测出受检者呼气中13CO2的量,准确地鉴定是否被幽门螺杆菌感染。() 7、亚种名为三元式组合,即由科名、属名加词和亚种名加词构成。 8、现代微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较,加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多,因此生理生化特征对于微生物的系统仍然是有意义的。 9、蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的,但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速率高。 10.目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。() 11.G+C含量的比较主要用于分类中否定。() 12.菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。() 三、选择题(4个答案选1) 1、血清学试验,尤其在医学细菌的分类鉴定中的重要意义,但它主要用于划分()。 (1)种内血清型(2)种间血清型(3)属间血清型(4)属以上血清型2、根据你所掌握的知识,人为认为形态学特征学特征在以下几类微生物中的哪严分类鉴定中显得更加重要?() (1)病毒(2)细菌(3)酵母菌(4)霉菌 3、现在自动化程度最高、功能最多的微生物专用检测仪是() (1)气相色谱仪(2)高压液相色谱仪 (3)自动微生物检测仪(4)激光拉曼光谱仪 4、目前微生物的快速检测和自动化分析中,广泛地采用的免疫学技术是()。(1)DNA探针(2)聚合酶链反应技术 (3)DNA芯片(4)酶联免疫吸附测定法 5、第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是()。 (1)种名(2)属名(3)人名(4)科名 6. Micrococcus的译名为:() A. 链球菌属 B. 微球菌属 C. 小单胞菌属 D. 四联球菌属 7. Bacillus的译名为:()

第10章 微生物的分类鉴定

第10章微生物的分类鉴定 填空题 1,以进化论为指导思想的分类学,其目的已不仅是物种的识别和归类,而主要是通过分类追溯系统发生,推断进化谱系,这样的分类学也称。 2,大量资料表明:功能重要的分子或功能重要的分子区域比功能不重要的大分子或大分子区域进化变化的。 3.微量多项试验鉴定系统,实际上是一类专门设计制作的特征检测卡。 4.《伯杰氏系统细菌学手册》第一版分卷出版,它将原核生物分成组。 5.微生物种的学名由和两部分构成。 6.分类学的内容涉及3个互相依存又有区别的组成部分,即、命名和。 7.如果相似性系数(S AB)等于1,说明所比较的两菌株rRNA序列,若S AB值小于0.1,则表明两菌株亲缘关系。 8.API/ATB是微量多项试验鉴定系统,它包括众多的,共计有几百种生理生化反应,可鉴定几乎所有常见的。 9.微孔滤膜菌落计数板是一种可携带的检测水中大肠菌数的大肠菌测试卡,适于工作和使用,因可以放在人体内衣口袋中培养。 10.伍斯用寡核苷酸序列编目分析法对微生物的16SrRNA序列进行比较后,提出将生物分成为三界(域):、和。 11.伍斯为了避免把古细菌也看作是细菌的一类,他又把三界(域)改称为:、和。并构建了三界(域)生物的系统树。 选择题(4个答案选1) 1.《伯杰氏系统细菌学手册》第二版把葡萄球菌属和微球菌属分别放在不同的门中,最可能的原因是( )。 (1)生理生化特征不同(2)DNA—DNA杂交同源性不同(3)革兰氏染色反应不同 (4)G+C含量和rRNA序列不同 2.如果需要查阅枯草芽孢杆菌及相关种的分类学资料,并假定《伯杰氏系统细菌学手册》第二版已经全部出版,你将选择该书的( )。 (1)第一卷 (2)第三卷 (3)第四卷 (4)第五卷 3.血清学试验,尤其在医学细菌的分类鉴定中有重要意义,但它主要用于划分( )。 (1)种内血清型 (2)种间血清型 (3)属间血清型 (4)属以上血清型 4.根据你所掌握的知识,你认为形态学特征在以下几类微生物中的哪一类分类鉴定中显得更加重要?( ) (1)病毒 (2)细菌 (3)酵母菌 (4)霉菌 5.在下列4种细菌中,哪一种最有可能属于 (3)自动微生物检测仪 (4)激光拉曼光谱仪 8.目前微生物的快速检测和自动化分析中,广泛地采用的免疫学技术是( )。 (1)DNA探针 (2)聚合酶链反应技术 (3)DNA芯片 (4)酶联免疫吸附测定法 9.第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是( )。 (1)螺旋体 (2)淋病奈瑟氏菌 (3)变形杆菌 (4)詹氏甲烷球菌 10.细菌的种名也用双名法命名,即种的学名由属名和种名加词两部分组合而成。第一个词的首字母要大写,该词是( )。 (1)种名 (2)属名 (3)人名 (4)科名是非题

微生物的分类与鉴定 答案

第十章微生物的分类与鉴定(参考答案) 一、填空: 1.微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2.来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3.1969年将生物界分成了五界,分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4.细菌的分类单元分为七个基本的分类等级,由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5.生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6.形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一,其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7.分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分,目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8.微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_,其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用,而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9.核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10.1978年,Woese等提出新的生物分类概念,根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界,即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11.对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12.在生物的界级分类学说研究中,1978年由R.H.whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13.填写以下10个数据:(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度;(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃;(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃:(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150~170 ℃;(5)的代时一般为 17 min;(6)典型的酵母菌S.cerevisiae的代时一般为 120 min,其大小一般为~10 X ~21um 。(7)至今已记载的微生物约 20万种(1995);(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ;(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14.血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中,有核酸分子杂交,rRNA寡核苷酸编目分析,全基因组测定,数值分类等方法。 二、选择题: 1.同种菌不同来源的纯培养称为( C ) (A)种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2.试排出生物分类等级的正确顺序(D) (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1.目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2.具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种:是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种:从自然界中分离得到的某一微生物的纯种,如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异,即为新种。 3.培养物:根据一定的目的,在培养基上培养的微生物称为培养物。

第10章 微生物分类与鉴定 复习题

《微生物学》复习题 第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释 1 系统发育树: 2 培养物: 3 菌株: 4 种: 6 属: 7 数值分类法: 8 模式(或典型)菌株: 9 DNA(G+C)mol%值: 10 三域学说: 二、是非题 1、“大肠埃希氏菌”才是俗称“大肠杆菌”的学名。() 2、所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内了具代表的菌株。() 3、两种细菌的G+C含量相近,说明它们亲缘关系近,反之,G+C含量差别大说明它们亲缘关系远。() 4、DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究,而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较,则需进行DNA-rRNA杂交。() 5、数值分类由于采用了先进的计算想技术,减少了大量的特征测定的实验操作,所以它是比较科学的现代微生物系统分类方法。() 6、“吹口气查胃病”的原理是:幽门螺杆菌具有人体不具有的尿素酶,受检者口服13C标记的尿素,如有该菌感染,则尿素被尿素酶分解生成NH3和13CO2,用质谱仪能快速灵敏地测出受检者呼气中13CO2的量,准确地鉴定是否被幽门螺杆菌感染。() 7、亚种名为三元式组合,即由科名、属名加词和亚种名加词构成。 8、现代微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较,加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多,因此生理生化特征对于微生物的系

统仍然是有意义的。 9、蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的,但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速率高。 10.目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。() 11.G+C含量的比较主要用于分类中否定。() 12.菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。() 三、选择题(4个答案选1) 1、血清学试验,尤其在医学细菌的分类鉴定中的重要意义,但它主要用于划分()。 (1)种内血清型(2)种间血清型(3)属间血清型(4)属以上血清型2、根据你所掌握的知识,人为认为形态学特征学特征在以下几类微生物中的哪严分类鉴定中显得更加重要?() (1)病毒(2)细菌(3)酵母菌(4)霉菌 3、现在自动化程度最高、功能最多的微生物专用检测仪是() (1)气相色谱仪(2)高压液相色谱仪 (3)自动微生物检测仪(4)激光拉曼光谱仪 4、目前微生物的快速检测和自动化分析中,广泛地采用的免疫学技术是()。(1)DNA探针(2)聚合酶链反应技术 (3)DNA芯片(4)酶联免疫吸附测定法 5、第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是()。 (1)种名(2)属名(3)人名(4)科名 6. Micrococcus的译名为:() A. 链球菌属 B. 微球菌属 C. 小单胞菌属 D. 四联球菌属 7. Bacillus的译名为:() A. 假单胞菌属 B. 乳酸杆菌属 C. 梭菌属 D. 芽孢杆菌属 8. 假单胞菌属的拉丁文属名为:() A. Xanthomonas B. Nitrobacter C. Pseudomonas D. Escherichia 9. 下列传统指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是() A 形态学特征 B 生理特征 C 生态学特征

11微生物的分类及其分类方法

第三章微生物的分类及其分类方法 本章的核心内容是微生物的分类单元、微生物的命名法则;目前国内外最权威的原核微生物分类系统;用于分离菌株分类鉴定的方法和技术;微生物菌种的保藏。 微生物的分类单元有界、门、纲、目、科、属、种;微生物的命名依林奈氏双名法法则进行;《伯杰氏细菌学鉴定手册》,《伯杰氏系统细菌学手册》是当今进行细菌鉴定的最权威的手册;微生物分离菌株的分类鉴定有经典分类鉴定法、数值分类鉴定法、化学分类鉴定法、遗传学分类鉴定法, DNA中GC mol%分析、DNA-DNA杂交、DNA-rRNA杂交、16Sr RNA(16S rDNA)寡核苷酸的序列分析,微生物系统发育地位分析等不同层次的技术方法。微生物菌种的保藏对于研究和发酵生产都具有不可忽视的意义。保藏方法可依不同条件选择不同方法。 第一节微生物的分类单元和命名 分类是人类认识微生物,进而利用和改造微生物的一种手段,微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上,才能对纷繁的微生物类群有一清晰的轮廊,了解其亲缘关系与演化关系,为人类开发利用微生物资源提供依据。 微生物分类学 (microbial taxonomy) 是一门按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群 (taxon) 的科学,它的具体任务有三,即分类(classification) 、命名 (nomenclature) 和鉴定 (identification) 。分类指的是根据相似性或亲缘关系,将一个有机体放在一个单元中。命名是按照国际命名法规给有机体一个科学名称。鉴定则是确定一个新的分离物是否归属于已经命名的分类单元的过程。因此,概括来说,微生物分类学是对各个微生物进行鉴定,按分类学准则排列成分类系统,并对已确定的分类单元进行科学命名的科学。 一、微生物的分类单元 微生物的主要分类单位,依次为界 (kingdom) 、门( phylum 或 division )、纲(class) 、目 (order) 、科 (fami1y) 、属 (genus) 、种 (species) 。其中种是最基本的分类单位。具有完全或极多相同特点的有机体构成同种。性质相似、相互有关的各种组成属。相近似的届合并为科。近似的科合并为目。近似的目归纳为纲。综合各纲成为门。由此构成一个完整的分类系统。以下以柠檬浮霉状菌为例加以说明。

菌种鉴定手段

菌种鉴定手段 (1)常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征;理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 (2)BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础,检测微生物的特征指纹图谱,建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比,得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可,已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统,涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 (3)分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系,是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室,配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA(D1/D2)序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列,提供科学的鉴定结果。 (4)API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列,约有1000种生化反应,目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中,可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列,通过软件将待测细菌与数据库参比,得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)和相关细菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)和库克菌属(Locuria sp.)进行鉴定。 (5)功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究,目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定,在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 (6)RAPD、SSCP技术

微生物常规鉴定的技术

微生物常规鉴定的技术 一、形态结构和培养特性观察 1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况 2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛状菌落。 二、生理生化试验 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 微生物检验中常用的生化反应有: 1、糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置

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