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长期免耕与施用有机肥对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响

长期免耕与施用有机肥对土壤微生物

生物量碳、氮、磷的影响

*徐阳春沈其荣

冉炜

(南京农业大学资源与环境科学学院,农业部作物生长与调控重点实验室,南京210095) 摘要通过设置在江苏省句容农科所的田间定位试验研究长期免耕及施用有机肥料对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响。结果表明:经过16年32茬稻麦水旱轮作后,表土层(0~5cm)土壤微生物生物量碳、氮、磷含量比亚表层(5~10cm)分别高27.5%、43.6%和11%。与常规耕翻相比长期免耕处理表土层土壤微生物生物量碳、氮含量分别增加了25.4%和45.4%,而微生物生物量磷无明显变化规律;亚表层的土壤微生物生物量碳、氮、磷免耕与耕翻两种耕作方式间的差异不显著。尽管各施肥处理施用的氮、磷、钾数量完全相等,但土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量却因肥料种类的不同而异。综合0~5和5~10cm 土层,微生物生物量碳、磷为:猪粪+化肥>秸秆+化肥>绿肥+化肥>化肥>不施肥,微生物生物量氮则为:猪粪+化肥>绿肥+化肥>秸秆+化肥>化肥>不施肥。相关分析结果显示,土壤微生物生物量碳、氮与土壤有机碳、土壤全氮和土壤碱解氮之间均呈极显著的正相关,表明其与土壤肥力关系密切,可作为评价土壤肥力性状的生物学指标。

关键词免耕,有机肥料,微生物生物量碳、氮、磷

中图分类号 S154.2

土壤微生物生物量既是土壤有机质和土壤养分转化与循环的动力,又可作为土壤中植物有效养分的储备库。因此,其在土壤肥力和植物营养中具有重要作用。土壤微生物生物量对土壤环境因子的变化极为敏感,土壤的微小变动均会引起其活性变化。

土壤耕作是经过机械耕翻的土壤扰动过程,它不但影响土壤的物理化学性质,而且影响土壤的微生物学特征。Carter 等就曾把土壤微生物碳含量作为由不同耕作法引起的土壤生物学性质变化的一个指标

[1]。向土壤中添加有机物也会引起土壤微生物生物量的改变[2],W orkneh 等发现,同常规农作的土壤相比较,有机农业的土壤具有更高的微生物活

性[3]。以往的这些报道多是作物生长一季或几季的短期研究结果,而长期连续进行这些处理对土壤微生物的效应则鲜见报道。

本文通过对稻麦水旱轮作体系下经16年32茬长期连续免耕与常规耕翻处理、化肥长期单施及其与秸秆、绿肥和猪粪三种有机肥料配合施用后土壤微生物生物量碳、氮、磷含量变化进行的横向比较,旨在研究该两种耕作法及不同肥料种类对土壤微生物学特*国家自然科学基金重点项目(39830220)资助

通讯作者

收稿日期:2001-03-11;收到修改稿日期:2001-09-20

第39卷第1期

2002年1月土壤学报 AC TA PEDOLOGICA SINIC A Vol.39,No.1 Jan .,2002

性的影响,阐明这些土壤管理措施在可持续发展农业中对维护土壤质量的作用。

1 材料与方法

1.1 土壤

供试土壤为第四纪下蜀黄土发育的马肝土(黄棕壤),取自江苏省丘陵地区镇江农科所(119 07 E, 31 56 N)进行了16年32茬连续免耕与常规耕翻和施用不同有机肥处理的长期定位试验田,试验设计及试验开始前的土壤基本性状参见文献[4],1999年5月小麦生长期间在各个处理小区中分别采集0~5和5~10cm土壤样品共60个。新鲜土样通过2mm筛后,部分4 保存(<72h)供分析微生物生物量碳、氮、磷;另一部分土样风干后,用于测定有机碳、全氮、碱解氮和速效磷。

1.2 分析方法

1.2.1 土壤微生物生物量 (1)微生物生物量碳。采用灭菌-提取法[5]。称取25.0g新鲜土样置于

150ml塑料瓶中,放入内盛100ml无醇CHCl

3烧杯的真空干燥器内,抽真空使CHCl

沸腾5min,保持真空

并在25 黑暗下灭菌24h,将盛CHCl

3的烧杯取出后反复抽真空直至除尽样品中的C HCl

为止。加入

100ml0.5mol L-1的K

2SO

于塑料瓶内,25 恒温振荡30min后过滤,滤液中的碳用TOC 5000A(日本Shi

madzu公司生产)仪测定,同时另取未灭菌的土壤按上述方法提取测定碳。微生物生物量碳为两者之差除以转换系数0.35。(2)微生物生物量氮。采用Ross提出的方法[6]。将由灭菌和未灭菌土壤获得的K2SO4提取液分别置于凯氏瓶内消化,采用半微量蒸馏法测定氮。微生物生物量氮为两者之差除以转换系数0.54。(3)微生物生物量磷。采用灭菌 NaHC O

提取法[7]。灭菌和未灭菌土样用0.5mol L-1的

NaHCO

在25 恒温下振荡提取1h后过滤,滤液经无磷活性碳脱色后采用钼蓝比色法测定磷,微生物生物量磷等于两者之差除以转换系数0.40。

1.2.2 土壤有机碳、全氮、碱解氮和速效磷采用常规方法测定[8]。

2 结果与讨论

2.1 长期免耕施肥对土壤微生物生物量碳的影响

2.1.1 不同耕作处理的土壤微生物生物量碳土壤微生物生物量碳是土壤有机质中活性较高的部分,它是土壤养分重要的源。本试验结果表明,土壤微生物生物量碳因土层不同而异,两种耕作方式下都表现为表土层(0~5cm)>亚表层(5~10cm)(表1),表土层平均比亚表层高27.5%。经16年32茬连续处理后,免耕0~5cm土层微生物生物量碳比常规耕翻增加27.4%,方差分析显示两种耕作方式之间的这种差异达到极显著水平,这与前人报道的免耕下表土层微生物生物量和微生物过程总是显著地高于耕翻土壤的结果相似[9]。产生这种差异的原因是由于土壤微生物以异养型种群为主,其生命活动过程需要消耗一定的能量,免耕不扰动土层,植物残体及连年施入的有机肥主要积累在表土层中,相应地可供微生物维持生命活动的能量充足;同时,长期连续免耕使土壤耕层变浅,植物根系多集中分布于表土层,根的残荐及大量的低分子量的根系分泌物也加剧了土壤微生物的繁衍,使其生命活动旺盛。但在耕翻处理中,植物残体和施入的有机肥则随机械耕翻而均匀地分布于0~20cm的耕作层中,由于稀释效应使0~5cm土层有机碳含量较免耕的低[4],从而导致该土层中土壤微生物生物量C比免耕低。尽管5~10cm土层免耕与耕90土壤学报 39卷

翻两处理间土壤有机碳含量差异显著[4],然而该层中的微生物生物量C 含量两处理间差

异并不显著,Aslam 等也有类似的结果报道[10],原因有待进一步研究。

2.1.2 不同施肥处理与土壤微生物生物量碳与对照相比长期连续施肥可增加土壤微生物生物量碳(表1),但其作用效果因肥料种类而异,单施化肥及化肥与有机肥配合施用,土壤微生物生物量碳分别比对照增加了9.6%和32.2%。在等氮、等磷和等钾使用的条件下,化肥单施的效果远不及有机肥与化肥配合施用,究其原因一方面是由于长期施用化肥,尤其是无机氮肥,虽然增加了植物根茬等的残留,但由于土壤的C N 比下降,加速了土壤中原有有机碳分解,导致土壤中积累的有机碳总量较少[4];另一方面长期施用硫铵、普钙和氯化钾等酸性或生理酸性肥料后土壤pH 下降,使土壤微生物的生命活动减弱[11];此外,长期单施化肥使土壤团聚体受到破坏,微生物的生存环境变劣,很可能也是土壤微生物生物量碳降低的原因之一,因为有许多研究发现,土壤微生物生物量与土壤团

聚体呈紧密的相关[12~14]。化肥与有机肥配合施用,既补充输入了有机碳源又改善土壤物

理性状,这大大刺激了土壤微生物的活性[15]。不同有机肥种类的作用效果为猪粪>秸秆>绿肥,分别比不施肥的对照增加60.1%、19.8%和19.6%。造成这种差异的原因是由于不同有机物料中碳在分解速率上的差异,使各处理土壤中积累有机碳的数量不同。猪粪对土壤微生物生物量作用效果最明显,是由于该处理土壤有机碳含量最高,提供微生物生命活动的能源多;此外,土壤湿度也是重要的影响因子,业已发现土壤水分与微生物量密切相关,且在一定范围内土壤微生物生物量随着含水量的增加而增加

[16]。众所周知长期施用猪粪可增强土壤的持水能力,土壤中的干湿交替作用趋于缓和,从而更有利于土壤微生物的生命活动。

表1 不同耕作方式下长期施用有机肥料对土壤微生物量碳的影响

T able 1 Effects of long term zero tillage and applicati on of manure on s oil microbial biomass C (mg kg -1)

处理Treatment

免耕Zero tillage 耕翻Tillage 0~5c m

5~10c m 0~5cm 5~10cm 对照

611.4(52.3)1)453.9(32.2)530.3(45.9)469.0(75.1)化肥

765.0(66.1)494.1(41.7)541.8(55.2)464.6(46.9)秸秆+化肥

757.6(42.6)548.6(49.8)673.9(82.1)495.9(59.7)绿肥+化肥

857.8(89.4)485.1(58.0)593.0(61.8)539.9(48.6)猪粪+化肥991.5(78.7)807.3(72.4)791.3(80.5)724.7(83.1) 1)括号内为标准差,下同

2.2 长期免耕施肥对土壤微生物生物量氮的影响

微生物生物量氮是土壤氮素的一个重要储备库[17],在土壤氮素循环与转化过程中起着重要的调节作用。虽然土壤微生物量氮在数量上低于或接近于作物的吸氮量,但由于微生物量氮的周转率比土壤有机氮快5倍之多,因此大部分的矿化氮来自于土壤微生物

生物量氮[18,19],可见其在植物营养中的重要性。

不同耕作方式对0~5c m 土层微生物生物量氮的影响与土壤微生物生物量碳相似,免耕比传统耕翻增加27%。而5~10c m 土层耕翻则比免耕高17%。长期单施化肥及化肥与秸秆、绿肥、猪粪配和施用,土壤微生物生物量氮分别比对照增加了6.5%、30.5%、911期徐阳春等:长期免耕与施用有机肥对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响

38.1%和74.6%,化肥与有机肥配合比化肥单施提高39%。有趣的是三种有机肥的作用效果的排序与土壤微生物量碳并不相同,而与土壤全氮的排序完全相同[4],表现为猪粪>绿肥>秸秆。这是由于化肥与秸秆、绿肥、猪粪等有机肥配合施用后,促进了土壤微生物大量繁殖,从而固持了一部分氮素。被微生物固持氮素中的一部分在作物生长期间可逐渐矿化释放出来,供作物吸收;而另一部分则转化为性质稳定的有机氮,最终使土壤氮素含量增加。Singh等的研究发现,在旱地水稻田中,秸秆与化肥配合和秸秆单施,土壤微生物生物量N分别比对照增加77%和84%[20],而本试验中长期秸秆与化肥配合施用的效果远不及他们报道的高,很可能与不同试验地水热条件的差异有关。

表2 不同耕作方式下长期施用不同有机肥料对土壤微生物量氮的影响Table2 Effects of long term zero tillage and application of manure on soil microbial bi omass N(mg kg-1)

处理Treatment

免耕

Zero tillage

耕翻

Tillage

0~5c m5~10c m0~5cm5~10cm

对照53.0(4.8)29.8(2.7)49.2(4.5)34.2(3.3)

化肥54.2(5.4)32.6(3.2)49.9(5.6)40.1(4.7)

秸秆+化肥70.5(7.6)41.1(4.3)62.2(7.8)43.3(5.1)

绿肥+化肥85.7(7.1)38.5(4.0)56.8(8.4)48.7(6.2)

猪粪+化肥97.2(8.9)58.9(4.6)65.7(6.9)68.5(5.5)

在等量施氮条件下,化肥与有机肥长期配合施用后土壤微生物生物量氮显著高于化肥长期单施,意味着这些处理中有较多的氮素通过同化作用转入到微生物体内暂时固定,相应地通过NH3挥发和NO-3淋失以及反硝化脱氮等途径造成的氮素损失减少了,这对调节土壤氮素供应,提高氮肥利用率,保护大气环境、防止水资源污染、保证农业的可持续发展具有积极意义。

2.3 长期免耕施肥对土壤微生物生物量磷的影响

相对于土壤微生物生物量碳、氮,有关微生物生物量磷的研究很少。本试验的结果表明,不同耕作措施对微生物生物量磷的影响远不及微生物生物量碳、氮明显(表3),t测定显示,0~5及5~10cm土层微生物生物量磷免耕与耕翻之间均无显著差异,原因有待进一步研究。

施肥可显著提高土微微生物生物量磷,与对照相比化肥单施及其与秸秆、绿肥、猪粪配合施用,土壤微生物生物量磷分别增加了117%,125%,122%和174%。即使长期单施化肥,土壤微生物生物量磷也有较大幅度的增加,究其原因可能是施磷后增加了微生物对磷的同化固定。Aslam等在研究土壤微生物生物量磷的季节变化规律时发现冬季显著高于其他季节,他们认为此现象与播利前化学磷肥的施用有关[9]。化肥和秸秆、绿肥配合施用,土壤微生物生物量磷也明显增加,但与化肥单施之间差异不显著。化肥与猪粪配合施用土壤微生物生物量磷增加最多,且与化肥单施之间差异显著,可能由于在等量施磷条件下,该处理由猪粪补充的有机磷较其他处理多,在植物生长期间这些有机磷在微生物的参与下逐步矿化,部分矿化的磷又同化为微生物生物量磷。

92土壤学报 39卷

表3 不同耕作方式下长期施用不同有机肥料对土壤微生物量磷的影响

Table 3 Effects of long term z ero tillage and application of manure on s oil microbial biomas s P (mg kg -1)

处理Treatment

免耕Zero tillage 耕翻Tillage 0~5c m

5~10c m 0~5cm 5~10cm 对照

25.3(2.8)17.5(2.1)31.6(2.6)35.1(2.2)化肥

51.4(4.6)47.3(3.8)56.7(5.1)82.4(7.3)秸秆+化肥

84.7(10.7)67.4(7.3)47.5(6.8)47.0(6.0)绿肥+化肥

65.7(9.5)62.9(7.9)59.9(6.2)54.3(5.7)猪粪+化肥81.8(8.4)54.8(6.7)85.4(10.1)78.7(8.9)2.4 土壤微生物商

微生物商是指土壤微生物生物量碳与土壤有机碳总量的比值,即:

土壤微生物商=

土壤微生物生物量碳土壤有机全碳有研究者认为用微生物商来表示土壤过程或土壤质量的变化,比单独应用微生物生物量碳或土壤有机总碳要有效的多[21],因为商是一个比值,它能够避免在使用绝对量或

有机质含量不同的土壤进行比较时出现的一些问题。本试验中不同土层的微生物商因耕作措施不同而异(表4),在免耕下为亚表层高于表土层,而常规耕翻下则无规律。就同一土层而言,0~5cm 的微生物商长期免耕低于耕翻,而5~10c m 免耕则高于耕翻。施肥后微生物商均降低,综合0~5和5~10c m 两个层次,不同施肥处理的微生物商排序为:对照>猪粪>秸秆>化肥>绿肥。Sparling 等认为,如果土壤被过度使用,土壤微生物C 库将会以较快的速率下降,最终导致土壤微生物商的降低[22]。由本试验所获的结果,我们认为能否使用微生物商作为长期培肥过程中土壤质量演变的评价指标值得商榷。

表4 不同耕作方式下长期施用不同有机肥料对土壤微生物商的影响

T able 4 Effects of long term zero tillage and applicati on of manure on microbial quotient

处理Treatment

免耕Zero tillage 耕翻Tillage 0~5c m

5~10c m 0~5cm 5~10cm 对照

0.2660.2750.2900.278化肥

0.2540.2820.2490.245秸秆+化肥

0.2470.3080.2670.220绿肥+化肥

0.2330.2620.2340.242猪粪+化肥0.2310.3330.2660.246

需要指出的是本试验中土壤微生物生物量碳占土壤有机碳的比值仅为0.22%~0.34%,远远低于一些文献中报道的1%~5%,这可能与试验地土壤有机碳的含量较高有关。

2.5 土壤微生物生物量碳、氮、磷与土壤有机碳、全氮、碱解氮、速效磷的关系

相关分析结果表明,土壤微生物生物量碳与土壤有机碳、全氮和碱解氮均呈极显著正相关(表5);土壤微生物生物量氮也与上述三者呈极显著正相关,该结果与Kushwaha 等的93

1期徐阳春等:长期免耕与施用有机肥对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响

报道相似[23]。土壤微生物生物量磷与土壤速效磷呈极显著正相关,但与土壤有机碳之间的相关不显著。表明土壤微生物量C、N与土壤肥力关系紧密,可作为评价土壤质量的生物学指标。

表5 土壤微生物生物量碳、氮、磷与土壤有机碳、全氮、碱解氮、磷的相关Table5 The relationshi ps between s oil microbial biomass C,N and P and total organic C,N and available P

项目

Item

土壤微生物生物量的测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完

全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法）土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下基本原理（茚三酮比色法）

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。一、基本原理熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。二、试剂配制（1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。（2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶解。（3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g，用蒸馏水溶解并定溶至1L。

凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定

土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。（1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。（2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至

常见的微生物检测方法

摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。概述：一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同

时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。生长量测定法体积测量法：又称测菌丝浓度法。经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。称干重法：

土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展(精)

土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展3 黄辉(1陈光水(1谢锦升(1黄朝法(2 (1.福建师范大学福州350007;2.福建省林业调查规划院福州350003 摘要:笔者较为全面地综述了国内外土壤微生物生物量碳的研究成果。笔者针对土壤微生物生物量碳主要受到碳氮限制、树种类型、土地利用方式、管理措施、土壤湿度和温度、土壤质地等因素的影响,提出了今后的研究应集中在以下几个方面:(1加强不同尺度土壤微生物生物量碳的影响因子及调控机理研究;(2进一步加强不同土壤类型下土壤微生物生物量碳动态及调控机理研究;(3对影响土壤微生物生物量碳高低不确定性的因子进行深入研究;(4加强其他因子对土壤微生物生物量碳影响的研究;(5探讨全球气候变化对土壤微生物生物量碳的影响。关键词:微生物生物量碳;土壤;影响因子;全球变化 Adva nces on Soil Microbial Biomass Ca rbon a nd Its Effect Factor Huang Hui(1Che n Gua ngshui(1Xie J ingsheng(1Huang Chaof a(1 (1.Fujia n N or mal U niversity Fuzhou350007;2.Fujian Provincial Forest ry Survey a nd Planning Institute Fuzhou350003 Abstract:The aut hors review current knowledge of t he p roperty and deter mination of soil microbial biomass carbon a nd several f act ors cont rolling its dynamics bot h at home a nd abroad.By now,t here are several f ac2 t ors influe ncing soil microbial biomass carbon w hich include inhere nt p roperties of t he soil like texture,mois2 ture and temp erature a nd etc.Besides t hese,external f act ors(C a nd N limitation,sp ecies typ e,ma nageme nt measures and diff ere nces in la nd usealso cont rol on soil microbial biomass carbon.Despite intensive resear2 ches in recent years,t he uncertainties of soil microbial biomass still re main f or f urt her studies:(1St re ngt he2 ning eff ect f act ors of soil microbial biomass carbon a nd its cont rol mecha nism at diff erent scale;(2Paying

土壤微生物量测定方法

土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃

土壤微生物测定方法

土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。（4）结果计算

土壤微生物生物量的测定(滴定法)(精)

1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。二、实验材料和用具仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于

速效氮磷钾测定方法

土壤水解性氮的测定(碱解扩散法) 土壤水解性氮，包括矿质态氮和有机态氮中比较易于分解的部分。其测定结果与作物氮素吸收有较好的相关性。测定土壤中水解性氮的变化动态，能及时了解土壤肥力，指导施肥。测定原理在密封的扩散皿中，用1.8mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液水解土壤样品，在恒温条件下使有效氮碱解转化为氨气状态，并不断地扩散逸出，由硼酸(H3BO3)吸收，再用标准盐酸滴定，计算出土壤水解性氮的含量。旱地土壤硝态氮含量较高，需加硫酸亚铁使之还原成铵态氮。由于硫酸亚铁本身会中和部分氢氧化钠，故需提高碱的浓度(1.8mol/L，使碱保持 1.2mol/L 的浓度)。水稻土壤中硝态氮含量极微，可以省去加硫酸亚铁，直接用1.2mol/L氢氧化钠水解。操作步骤 1.称取通过18号筛(孔径1mm)风干样品2g(精确到0.001g)和1g硫酸亚铁粉剂，均匀铺在扩散皿外室内，水平地轻轻旋转扩散皿，使样品铺平。(水稻土样品则不必加硫酸亚铁。) 2.用吸管吸取2%硼酸溶液2ml，加入扩散皿内室，并滴加1滴定氮混合指示剂，然后在皿的外室边缘涂上特制胶水，盖上毛玻璃，并旋转数次，以便毛玻璃与皿边完全粘合，再慢慢转开毛玻璃的一边，使扩散皿露出一条狭缝，迅速用移液管加入10ml1.8mol/L氢氧化钠于皿的外室(水稻土样品则加入10ml1.2mol/L氢氧化钠)，立即用毛玻璃盖严。 3.水平轻轻旋转扩散皿，使碱溶液与土壤充分混合均匀，用橡皮筋固定，贴上标签，随后放入40℃恒温箱中。24小时后取出，再以0.01mol/LHCl标准溶液用微量滴定管滴定内室所吸收的氮量，溶液由蓝色滴至微红色为终点，记下盐酸用量毫升数V。同时要做空白试验，滴定所用盐酸量为V0。结果计算水解性氮(mg/100g土)= N×(V-V0)×14／样品重×100 式中： N—标准盐酸的摩尔浓度； V—滴定样品时所用去的盐酸的毫升数； V0—空白试验所消耗的标准盐酸的毫升数；14—一个氮原子的摩尔质量mg/mol； 100—换算成每百克样品中氮的毫克数。注意事项(1)滴定前首先要检查滴定管的下端是否充有气泡。若有，首先要把气泡排出。 (2)滴定时，标准酸要逐滴加入，在接近终点时，用玻璃棒从滴定管尖端沾取少量标准酸滴入扩散皿内。 (3)特制胶水一定不能沾污到内室，否则测定结果将会偏高。 (4)扩散皿在抹有特制胶水后必须盖严，以防漏气。主要仪器扩散皿、微量滴定管、1/1000分析天平、恒温箱、玻璃棒毛玻璃、皮筋、吸管(2ml和10ml)，腊光纸、角匙、瓷盘。试剂 (1)1.8mol/L氢氧化钠溶液。称取化学纯氢氧化钠72g，用蒸馏水溶解后冷却定容到1000ml。 (2)1.2mol/L氢氧化钠溶液。称取化学纯氢氧化钠48g,用蒸馏水溶解定容到1000ml。 (3)2%硼酸溶液。称取20g硼酸，用热蒸馏水(约60℃)溶解，冷却后稀释至1000ml，用稀盐酸或稀氢氧化钠调节pH至4.5(定氮混合指示剂显葡萄酒红色)。 (4)0.01mol/L盐酸标准溶液。先配制1.0mol/L盐酸溶液，然后稀释100倍，用标准碱标定。 (5)定氮混合指示剂。与土壤全氮的测定配法相同。 (6)特制胶水。阿拉伯胶(称取10g粉状阿拉伯胶，溶于15ml蒸馏水中)10份、甘油10份，饱和碳酸钾5份混合即成(最好放置在盛有浓硫酸的干燥器中以除去氨)。 (7)硫酸亚铁(粉状)。将分析纯硫酸亚铁磨细保存于阴凉干燥处。

土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)

土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，

用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算

土壤可溶性有机氮,硝态氮,铵态氮和微生物量氮测定

土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法 1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。其中熏蒸后的土壤过滤液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存 2.测定可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮）要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方便的。以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。

土壤可溶性全氮测定氧化剂:将6g NaOH 和30g K2S2O8溶于蒸馏水中并定容至1 L(K2S2O8 比较难溶，在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，致其温度达到常温后与K2S2O8 溶液混合定容至1L) 测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A220和A275，空白需加入1ml氧化剂并同时作水浴处理。（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。）标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为100mg/L的氮标准贮存液。稀释10倍即为10mg/L 的氮标准溶液。吸取氮标准溶液（梯度为0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；对应浓度分别为0 mg/L，0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加入1ml 氧化剂并定容，得氮的标准系列，与样品同样消煮测定A220和A275。以A（A= A220-A275）为纵标，氮浓度为横标绘制标准曲线。硝态氮测定1 注：硝态氮测定1仅适合于农田土壤，腐殖质含量比较低的土壤，森林土壤和腐殖质含量比较高的土壤不适用，因为森林土壤和腐殖质高的土壤有腐植酸的颜色，干扰比色可采用硝态氮测定2进行测定

生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法） 1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。 2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。 1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表 6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口（图6–1 土壤熏蒸抽真空装置） 3、操作步骤（1）土样前处理新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不

土壤微生物量碳氮测定方法

1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。四、操作步骤称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。五、结果计算土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定一、方法原理土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸

微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法

二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶液邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%，分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而

土壤微生物量氮

茚三酮反应-N法测定微生物量N 试剂制备 1. 还原水合茚三酮(hydridantin) 称取80g茚三酮放入2升90℃热水中, 加入400ml 40℃抗坏血酸(V.C.80g)水溶液, 放置30分钟; 流水冷却1小时至室温, 过滤冲洗, 在闭光真空干燥器中放入P2O5干燥, 可得约75g, 放置于暗色瓶中. 2. 乙酸钠缓冲液(pH5.5) 每配100ml茚三酮试剂用25ml。配500ml 200ml水中加入27.20g NaOAc.3H2O 放入水浴中使其充分溶解，冷却至室温加入50ml冰醋酸标定至500ml，pH应为5.51±0.03。该缓冲液在4℃下可保存。 3. 茚三酮试剂每样用1.00 ml，100ml配制方法：2g 水合茚三酮(ninhydrin)和0.3g的还原水合茚三酮溶解于75ml的二甲基亚砜DMSO (DiMethylSulfOxide)和25ml 的乙酸钠缓冲液；然后用无氧氮气通气30分钟，4℃下密闭一天备用。 4. 柠檬酸缓冲液(pH 5.0) 每样用2.00 ml，250ml配制方法：10.50克柠檬酸和4.00克NaOH加入到225ml 蒸馏水中, 用10M NaOH调整到pH 5.0, 标定至250ml。保存于4℃。 5. 稀释乙醇：95%加入同体积的蒸馏水。每样用5.0 ml。 6. 标准液：0，50, 100, 200, 250, 500，1000μM.l-1 N的(NH4)2SO4溶液。保存于4℃。准确称取0.0661g 分析纯(NH4)2SO4 (FW=132.1)，定容至1000ml。 50, 100, 200, 250, 500μM.l-1N：分别吸取5ml,10ml, 20ml, 25ml,50ml的1000μM.l-1(NH4)2SO4-N溶液定容至100ml。操作步骤 -准确吸取1.00 ml的浸提液(或标准液)加入20ml试管中； -加入2.00 ml的柠檬酸缓冲液； -慢慢加入1.00 ml茚三酮试剂并充分混匀，放上橡胶塞（注意不要塞紧）； -在沸水中加热25分钟； -冷水浴冷却至室温后加入5. 00ml稀释乙醇，充分混匀，在570nm处比色。

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