收稿日期:2007 02 08
*国家 863 计划项目(2002AA214061)和国家自然科学基金项目(30370647)资助**通讯作者.E mail:lu jie.jane@https://www.doczj.com/doc/6e10330585.html, 钟 雅,女,1980年生,硕士.工作单位:华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074
一个家蝇抗菌肽的分离纯化*
钟 雅 付 康 陈正望 陆 婕
**
(华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074)
摘要 以野生家蝇干燥幼虫为原料,在常规的生化提取基础上,通过反相高效液相色谱(RP H PL C)法进一步纯化,并结合电洗脱技术,利用灵敏的杀菌活性检测手段,从家蝇抗菌肽总组分中分离纯化出1个20ku 的抗菌肽,对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌均有杀灭作用。
关键词 家蝇蛆;抗菌肽;抗菌活性;反相高效液相色谱;电洗脱
中图法分类号 Q 516 文献标识码 A 文章编号 1000 2421(2007)05 0727 03
昆虫抗菌肽是昆虫体液免疫的重要成分,具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广、不易产生耐药性等特点。自从瑞典科学家BOMAN 等从惜古比天蚕的滞育蛹中分离出第1个昆虫抗菌肽之后,科学家陆续从家蚕、柞蚕、蚊虫等昆虫体内分离出170多种抗菌肽[1]
。目前根据昆虫抗菌肽氨基酸组成和结构特点将抗菌肽分为4类[2]。蝇类生活在腐败肮脏的环境中,体内外携带很多病菌而自身却无感染,这种适应恶劣环境的能力预示着它在免疫防御方面有着独特的机制。从蝇类中分离抗菌活性物质,对抗菌药物的开发是1种新的有效途径。国外学者在肉蝇、绿蝇、果蝇[3]
、地中
海实蝇[4]和厩螫蝇[5]
中分离出具有不同抗菌活性的
抗菌肽,但未对家蝇抗菌物质进行研究,我国也长期
停留在免疫应答和血淋巴理化性质的研究阶段,直
到近年来才取得一些进展[6 10]。
家蝇中抗菌肽种类较多,成分复杂,提取得率
低,分离纯化困难。本文除使用了传统的离子交换和凝胶过滤层析的方法外,还使用了分离效果好、分辨率高、回收率高的反相高效液相色谱(RP H PLC)法。目前国内外研究中,能抑制苏云金芽孢杆菌的
抗菌肽报道很少,笔者以此为检测菌株,从野生家蝇蛆中分离出了新抗菌肽M D 7095[11]
,在此基础上又纯化出了1个20ku 的抗菌肽。
1 材料与方法1.1 试验材料
1)材料。家蝇干蝇蛆(Musca d omestica lar
v ae)即市售中药 五谷虫 (湖北省华城医药有限公司);苏云金芽孢杆菌(华中农业大学生命科学与技术学院微生物实验室提供);金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(华中科技大学微生物实验室提供);海藻酸(瑞典Karo linska 学院赠送);Sephadex G25fine 、
CM C23(Amersham);乙腈(Fisher);三氟乙酸T FA (TEDIA);丙烯酰胺、双丙烯酰胺;标准蛋白分子量
(T IANGEN);其它试剂均为进口分装分析纯。2)主要仪器。层析系统(瑞典Amersham );分析兼半制备型高效液相色谱仪(美国A gilent );TSK ODS C18柱(5 m,9.4mm !250mm,美国
Beckman);微量蛋白质垂直电泳仪和电洗脱仪(美国Bio rad);冻干机(美国Savant );高速冷冻离心
机(长沙英泰)。
1.2 试验方法
1)蝇蛆抗菌肽粗品提取。参照文献[11]中的方法,利用海藻酸吸附、
Sephadex G25凝胶过滤、CM C23弱阳离子交换柱层析等方法提取蝇蛆抗菌肽粗品,得到抗菌肽组分T 3。
2)反相高效液相色谱法(RP H PLC)分离抗菌肽粗品。洗脱液A(含0.1%TFA 的超纯水),洗脱液
B(含0.1%TFA 的乙腈),将抗菌肽粗品溶于A 液,
15000r/min 离心10min,取上清液上样,按20%~50%B 液梯度洗脱30min,检测波长214nm,流速
4mL/min 。根据吸收峰情况收集样品,冷冻干燥。3)蛋白质电泳。分离小肽的Tricine SDS PAGE,
参照文献[12]的方法进行,分离胶浓度为17%。
第26卷第5期2007年 10月华 中 农 业 大 学 学 报Journal of H uazhong A g ricult ur al U niv ersity Vo l.26 No.5Oct.2007,727~729
4)电洗脱回收多肽。蛋白质电泳后,固定,染色,用刀片切下已染色的蛋白带,用M odel 422Electro Eluter 电洗脱仪回收目标蛋白带,将目标蛋白放入截留量3500u 的透析袋,置蒸馏水中电磁搅拌透析48h,将透析袋中的溶液冻干,得到回收多肽。
5)微量液体检测法[11]
测定样品杀菌活性。
2 结果与分析
2.1 反相高效液相色谱法分离家蝇抗菌肽粗品
将抗菌肽组分T3进一步用反相高效液相色谱法分离得到T3 1,T 3 2,T3 3,T 3 4,T3 5,T 3 6,T3 7七个组分(图1),其中T3 3对苏云金芽孢杆
菌的抗菌活性最强。
图1 家蝇蛆抗菌肽T 3组分的RP H PLC 分离图谱F i g.1 R P H PLC chrom atogram of antibacterial peptide
T 3fraction from Musca do me stic a larvae
2.2 家蝇蛆抗菌肽的Tricine SDS PAGE 电泳
T3组分经RP H PLC 分离后的7个组分进行Tricine SDS PAGE 电泳(20 g/孔),结果见图2 A 。根据标准蛋白分子量作出回归直线,得到回归方程Y =0.0132X +1.8434(r =0.9945)。经计算可知,各蛋白组分的分子量分布很相似,主要为7.9~18.4ku 的小分子肽,其中含量最高的为分子量7.9ku 的蛋白(即已鉴定的新抗菌肽MD 7095)[11]。
将活性最高的T3 3组分加大上样量电泳(50 g/孔),得到6条清晰的蛋白条带(图2 B 左泳道),1号蛋白带即已鉴定的MD 7095,6号蛋白带的分子量为20ku,进一步用电洗脱方法进行回收。2.3 电洗脱回收家蝇蛆抗菌肽的鉴定
1mg 家蝇蛆抗菌肽T3 3经电洗脱回收得到约200 g 6号蛋白,该回收蛋白再经电泳鉴定为单一条带(图2 B 右泳道)。该蛋白经微量液体检测法检测,对苏云金芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等均有杀菌活性(作用终浓度2.5 g / L)(图3)。
3 讨 论
RP H PLC 法是利用样品的疏水性差异进行分离纯化的层析技术,具有分离效果好、
回收率高等特
图2 家蝇蛆抗菌肽各组分Trici ne SD S PAGE 电泳图
F i g.2 Trici ne SD S PAGE of anti bacterial peptide fractions from Musca domestica larvae
A.T3经RP HPLC 分离所得7个组分的电泳图Electroph orog ram of 7fractions from T3separated by RP HPLC;
B.T 3 3和蛋白带6的回收蛋白电泳图Electroph orogram of T 3 3fraction an d recover ed protein of band
6
图3 蛋白带6的回收蛋白的抗菌效果
Fig.3 Bacteri cidal effect of recovered protein of band 6
A.苏云金芽孢杆菌B acillus thuring ie nsis ;
B.金黄葡萄球菌S tap hyloc occ us aureu s ;
C.枯草芽孢杆菌B ac illus subtilis
728 华中农业大学学报第26卷
点,是目前分离纯化和制备多肽的主要手段。本研究拟通过RP H PLC 法进一步分离纯化家蝇抗菌肽,但从层析图谱和分子量电泳结果看,其分离度并不太好,这表明多种家蝇抗菌肽的疏水性相近,仅用RP H PLC 分离效果不佳。但通过RP H PLC 纯化后,活性组分相对集中,有利于进一步的分离纯化。
在RP H PLC 纯化的基础上,结合电洗脱技术,从活性最高的T3 3组分中回收了分子量20ku 的6号蛋白带,该回收蛋白除对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有杀灭作用外,还能杀灭苏云金芽孢杆菌,很可能即是安春菊等[9]用逐步回归分析法推测存在的1个20ku 的家蝇幼虫抗菌相关蛋白。
利用高灵敏度的微量液体检测法,笔者还检测了其他蛋白带(图2 B 左泳道中的蛋白带2、3、4、5)的抗菌活性,发现它们对苏云金芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有杀灭作用,而且这组多肽有较强的电生理效应(结果未显示)。说明家蝇中抗菌肽的种类很多,并且可能在杀菌功能上存在协同作用,混合物比单一组分杀菌效果更强。
开发抗菌肽作为抗菌药物是目前的研究热点,但利用基因工程方法生产抗菌肽除了工艺等问题外,还可能由于抗菌肽种类单一而抗菌效果欠佳,从来源丰富的天然材料中纯化抗菌肽很有应用前景。家蝇中多种抗菌肽均有较广的抗菌谱和较强的抗菌活性,本研究表明利用制备型RP HPLC 大量制备家蝇抗菌肽具有较高的实用价值和广阔的应用前景。
参
考
文
献
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Purification of an Antibacterial Peptide from Musca domestica Larvae
ZH ONG Ya FU Kang CH EN Zheng w ang LU Jie
(College of L if e S cience and Technology ,H uaz hong Univer sity of Science and T echnology ,
Wuhan 430074,China)Abstract Based on the ro utine biochem ical separating techniques,using RP H PLC and electro elu tion,a 20ku antibacterial peptide had been purified fro m Musca dom estica dry larvae detected by a highly sensitiv e bactericidal m ethod.The peptide has bioactiv ity ag ainst Gram po sitive bacteria such as Bacillus thur ingiensis,Bacillus subtilis and S tap hy lococcus aur eus .T he research has pr ovided theoretic founda tion for purifying antibacterial peptides using pr epar ative scale RP H PLC.
Key words Musca dom estica larv ae;antibacter ial peptide;antibacterial activ ity ;RP H PLC;elec tro elution
(责任编辑:杨锦莲)
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第5期钟 雅等:一个家蝇抗菌肽的分离纯化
抗菌肽（antimicrobial peptide）：抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。 1分类：结构分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成 的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。 来源分类可将其分为6类：（1）昆虫抗菌肽（2）哺乳动物抗菌肽（3）两栖动物抗菌肽（4）鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的抗菌肽（5）植物抗菌肽（6）细菌抗菌 2效应：抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用。 3作用机制：一般认为抗菌肽杀菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象， 造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡，不同类别的抗菌肽的作用机理可能不一样。 4.抗菌肽对细菌的杀伤作用 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。 5.预防败血症：天然抗菌肽具有选择性免疫激活和调节功能，对败血症有良好的预防和保护作用。败血症是由细菌感染引起的，伴随有全身性炎症反应综合症状的一种危重疾病。病原微生物感染诱导促炎症因子大量释放，导致多种重要器官衰竭，具有较高死亡率。 6.总结：抗菌肽要成为药物，还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源 有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而通过基因工程，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。因此，如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，是应用抗菌肽必须解决的问题。其次，与传统抗生素相比，昆虫抗菌肽的抗菌活性还不够理想。改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是创造高活力抗菌肽的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系和作用机理，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
一、概述 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗菌队是1980年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibactetial pepiides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之 为”peptide antibiotics”一多肽抗生素。 二、抗菌肽的理化性质、作用机理和作用范围 天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在l00℃下加热10～15min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。 抗菌肽功能从目前的研究结果来看，一般认为抗菌肽杀菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡，亦有学者提出抗菌肽是否存在特异性的膜受休及有无其它因子的协同作用等问题。不同类别的抗菌肽的作用机理可能不一样。 抗菌肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。 1. 抗菌肽对细菌的杀伤作用 抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道至少有113 种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。
抗菌肽概况 1.1 抗菌肽的基本概况 抗菌肽又称抗微生物肽(antimicrobialpeptide)或肽抗生素(peptide antibiotics)，在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分。 抗菌肽是近年来发现的广泛存在于自然界的一类阳离子抗菌活性肽。越来越多的证据表明它们在宿主先天性免疫和适应性免疫中有着重要的作用。目前国内外对抗菌肽的研究开发正不断深入。 抗菌肽(antibacterialpeptides)广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽。抗菌肽是由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类多肽。 1972年，瑞典科学家Boman对惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)蛹注射蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，首次发现了抗菌肽cecropin。此后，对抗菌肽的研究取得了很大的进展，目前在昆虫、植物、哺乳动物、病毒、两栖类以及人类中已发现类似的抗菌活性物质达2000多种。抗菌肽广泛存在于动物的免疫细胞(如吞噬细胞)、各种脏器的粘膜、皮肤以及植物的花、果、叶中。 有专家推测，抗菌肽在进化意义上最早可能参与了早期真核细胞的噬菌作用，这种作用既是细胞自身防御的需要，而且有可能通过降解微生物为自身生长提供需要的营养，并且最终在生物进化过程中作为防御分子被保留下来。 由于抗菌肽具有小分子的特点，可以快速合成并易于大量存储，与特异性免疫反应相比能更加迅速地对病原菌作出反应，使其成为生物机体先天性非特异性防御系统的重要组分，此外，抗菌肽还具有稳定、水溶性好、抗菌机制独特、对高等动物正常细胞无害等特点，显示了在医学和农业上潜在的研究价值和应用价值。 近年来，有关抗菌肽及其应用逐渐成为动物学、植物学、药理学及生理学等领
目录 第1章文献综述 (1) 1.1 家蝇及其危害 (1) 1.2 昆虫抗菌肽的研究进展 (1) 1.3 家蝇抗菌肽的研究进展 (2) 1.3.1 抗菌肽的鉴定和提取 (2) 1.3.2 抗菌肽构型上的研究 (3) 1.4 研究展望 (3) 第2章实验材料和方法 (5) 2.1 实验材料 (5) 2.1.1 昆虫来源 (5) 2.1.2 实验试剂 (5) 2.1.3 实验菌种 (5) 2.2 实验方法 (6) 2.2.1 总RNA提取和反转录 (6) 2.2.2 muscin和domesticin基因cDNA序列的克隆 (6) 2.2.3 muscin和domesticin基因序列的生物信息学分析 (7) 2.2.4 家蝇幼虫各组织中muscin和domesticin基因表达量分析 (7) 2.2.5 数据统计与分析 (7) 2.2.6 免疫诱导后家蝇muscin和domesticin基因表达量分析 (7) 2.2.7 Muscin和Domesticin成熟肽合成 (8) 2.2.8 Muscin和Domesticin合成肽的抑菌活性测定 (8) 2.2.9 c-Muscin和Domesticin合成肽的溶血活性测定 (8) 第3章实验结果 (10) 3.1 家蝇抗菌肽Muscin的克隆及功能分析 (10) 3.1.1 家蝇muscin基因cDNA序列及分析 (10) 3.1.2家蝇幼虫组织中muscin基因表达量分析 (11)
3.1.3 免疫诱导后muscin基因表达量分析 (12) 3.1.4 Muscin合成肽的纯度检测 (12) 3.1.5 Muscin合成肽的抑菌实验结果 (13) 3.1.6 c-Muscin合成肽溶血实验结果 (14) 3.2 家蝇抗菌肽Domesticin的克隆及功能分析 (15) 3.2.1 家蝇domesticin基因cDNA序列及分析 (15) 3.2.2 家蝇幼虫组织domesticin基因的表达分析 (17) 3.2.3 免疫诱导后domesticin基因表达量分析 (18) 3.2.4 Domesticin合成肽的纯度检测 (18) 3.2.5 Domesticin合成肽的抑菌实验结果 (19) 3.2.6 Domesticin合成肽溶血实验结果 (20) 第4章讨论 (21) 结论 (24) 参考文献 (25) 致谢 (30) 攻读学位期间取得的科研成果 (31)
蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量
基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
昆虫抗菌肽的分离纯化技术Technical standard for isolation and purification of insect antimicrobial peptides
昆虫抗菌肽的分离纯化技术标准 1范围 本标准规定了昆虫抗菌肽的分离纯化技术要求，本标准以家蝇作为材料提纯血淋巴的抗菌肽。 本标准适用于以家蝇为材料的抗菌肽分离纯化，对于其他昆虫等作为材料纯化抗菌肽可参照执行。 本规程规定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS-PAGE电泳、抗菌肽活性测定方法等技术要求。 本规程适用于抗菌肽的快速分离。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。 GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 GB/T6682-2016《分析实验室用水规格和试验方法》 GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 3术语 下列术语和定义适用于本文件： 3.1抗菌肽（antimicrobial peptides） 抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是一种基因编码的、在体内诱导的、具有抗菌活性的碱性多肽物质，强碱性、热稳定性、对细菌、真菌、病毒等微生物与寄生虫有抑杀活性。某些抗菌肽还具有抑杀肿瘤、中和内毒素、促进伤口愈合、调节免疫等多种生物学功能。 3.2家蝇（Musca domestica） 在25℃，相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。幼虫以人工饲料（发酵麦麸）喂养。 3.3多肽（polypeptides） 介于氨基酸与蛋白质之间，有2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
抗菌肽 一、抗菌肽概述 抗菌肽是本公司历经数年研发准备，于2013年发布的全新生物动物营养保健产品品牌，致力于从根本上减少人类食物链中抗生素使用，改善食品安全状况，增加饲料价值和养殖回报。 二、抗菌肽研究背景 近年来滥用抗生素引发耐药性病菌产生，又因抗生素残留在肉、奶、蛋中有害于人的健康，加以我国进入WTO以后，欧共体、日本及美国以抗生素超标问题用技术壁垒限制我国动物源产品出口，为此寻求新型饲料添加剂是人们迫切要求解决的问题。 随着传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，许多致病菌几乎对现有的抗生素均产生耐药性，对人类的健康构成了巨大的威胁。寻找真正安全、高效的抗细菌和病毒感染药物已成为人们关注的焦点。抗菌肽及其衍生物以其广谱抗菌、独特的作用机制、无残留无耐药性和绿色安全，成为后抗生素时代的最佳选择，已经在医药、食品、畜牧业、农业等领域显示出广泛的应用前景。 三、抗菌肽 抗菌肽是一类很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。抗菌肽在医药、食品和农业都有广泛应用。抗菌肽用于饲料
添加剂既可以增强动物抵抗力，促进动物生长，同时还减少药物残留，是一种绿色饲料添加剂。 抗菌肽来源于天然抗菌物，具有两亲性α-螺旋和β- 折叠结构，最佳作用分子量分布在5000-10000道尔顿之间，是采用现代生物基因工程技术将设计合成的抗菌肽基因转化于芽孢中表达并分泌到胞外，通过发酵工程生产获得对革兰氏阳性如金黄葡萄球菌，绿脓杆菌有效，对革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌有效又能抑制真菌白色念珠菌及曲霉菌等，抗菌肽能抑制乙型肝炎病毒DNA的增殖，有选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常细胞无毒副作用。本产品易溶于水可直接吸收到体内，对消化酶钝性，对热稳定，100℃水浴30分钟，不影响其杀菌作用。 四、抗菌肽作用机理 1、桶板模型：首先，由于抗菌肽带正电荷，与细胞膜负电荷相互吸引而结合在细胞膜表面；然后，单体的抗菌肽分子形成多聚体，其疏水基团插到磷脂双分子层，以与膜表面垂直的方式排列，形成横跨细胞膜的离子通道，离子通道一旦形成，外界的水分即可渗入细胞内部，细胞质也可渗透到外部，细胞膜崩解而导致细胞死亡。 2地毯模型：与前一种机制相比，抗菌肽并不插人细胞膜内部，同样在电荷作用下，抗菌肽在膜表面的展开，像地毯平行排列在细胞膜表面；在疏水作用和分子张力作用下改变细胞膜的表面张力，从而在细胞膜上出现暂时的孔洞，除了细胞液的相互渗透，抗菌肽分子也可通过此孔洞进入细胞。 五、抗茵肽作用机理的特点 1、作用部位的有效性
抗菌肽的概念 抗菌肽（Antibacterial peptide）又叫抗微生物肽（Antimicrobial peptide）、抗生素肽（Antibiotics peptide），是在多种生物体内存在的具有广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤细胞等多种作用的一类活性多肽。1974年，瑞典科学家Boman等人向眉纹天蚕蛾(Samia cynthia)蛹注射阴沟通杆菌及大肠杆菌时，在血淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质。随后诱导惜古比天蚕(Hyalophra Cecropia)蛹也发现了类似的抗菌活性物质。1981年，这种具有抗菌活性的物质被命名为cecropin，这是人们第一次真正意义上发现抗菌肽。目前科学家已在昆虫、哺乳动物、两栖动物和细菌的体内或分泌物中发现了上千种的抗菌肽。 1．抗菌肽理化特性和结构 抗菌肽一般由10～50 个AA组成，分子量较小，无（弱）免疫原性。富含疏水和碱性aa，所以多数抗菌肽都带正电荷。由于抗菌肽分子量小，大多数抗菌肽只具有二级结构，这就决定了抗菌肽耐高温能力较强，并且在较大的离子强度和较低或较高的pH值下仍可保持较强的活性。 抗菌肽的二级结构包括（1）α-螺旋结构，如天蚕素（Cecropins），蛙皮素（ Magainins）等。（2）β-折叠型，该类抗菌肽是在分子内有2～6个二硫键的抗菌肽类，有代表性的是动物防御素。β-防御素广泛存在于不同的上皮组织中，可能参与上皮和黏膜的抗感染防御。利用射线晶体衍射研究人嗜中性粒细胞中分离到的防御素(HNP-2)的结构时发现，在晶体状态下，防御素是以二聚体形式存在的。每个单体都有3股反平行的折叠片以二硫键连接，不对称的2个单体分子紧密靠近，并对二次旋转轴对称。（3）伸展性螺旋结构，该类抗菌肽不含半胱氨酸，但富含脯氨酸和精氨酸或色氨酸等，由15～34个氨基酸残基组成，在两性分子内部形成分子内α-螺旋，如从蜜蜂体内分离到的apidaecins中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达33% 和17 %。（4）环链结构，该类抗菌肽在C末端有一个分子内二硫键，在C末端形成一个环链结构，而N末端为线状结构。如青蛙皮肤细胞产生的brevinins和bactenecin。 2 .抗菌肽的分类 目前，抗菌肽的分类还比较复杂，没有统一的标准。本文就对目前大家普遍比较认可的几种分类方式做一概述。 2.1根据抗菌肽对不同病原体的作用分 根据抗菌肽对细菌、真菌及肿瘤细胞的作用不同，可将抗菌肽分为抗细菌肽、抗真菌肽、抗肿瘤肽、既抗真菌又抗细菌的抗菌肽、既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等。 2.2根据抗菌肽的结构分 根据其化学组成、二级结构以及功能来划分，Hoffmann1966年将抗菌肽根据空间结构分为线肽和环肽两类，随后Bomalm1998年根据抗菌肽基因研究的成果，将抗菌肽分为四大类[3]，（1）不含半胱氨酸的线肽，包括具有α-螺旋和不具有α-螺旋两类；（2）含等量半胱氨酸的抗菌肽；（3）富含1-2种氨基酸的线肽，最早发现的该类抗菌肽是蜜蜂中的apidaecin，富含脯氨酸和精氨酸；（4）高突变的防御肽。 2.3根据抗菌肽的来源分 : 根据来源可将抗菌肽分为哺乳动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽、病毒抗菌肽等。
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
抗菌肽 抗菌肽概述 抗菌肽(Antibacterial Peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides),是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞等活性作用的多肽。由于抗生素的广泛使用导致了微生物耐药性,新型抗菌药物研发成为近年研究热点,而抗菌肽是生物天然免疫重要的效应分子,具有调节宿主免疫的作用,所以有极大的临床应用潜力。目前已有2200 多种的抗菌肽,来源有细菌、真菌、人体、昆虫等,其中有些抗菌肽的基因序列已得到测定。抗菌肽具有多种优点,如无毒副作用(仅少数种类具有溶血活性)、无污染、无残留,难以产生耐药性,能抑制癌细胞扩增,调节机体免疫反应、抗炎功能,已经成为近些年来生物学及药学领域研究的热点。 抗菌肽是带有正电荷的、螺旋的、序列较短的具有抑菌作用物质的总称,一般是指从各个生物体包括单细胞生物、植物、昆虫、鱼类、鸟类以及哺乳动物等分离出来的，由12~60个氨基酸残基组成的多肽,分子质量一般小于 10 ku,被认为是先天免疫的重要组成部分,因为其可以抵抗外来微生物的入侵。抗菌肽由于富含疏水基团,通常存在疏水区和亲水区,并且对细胞膜显现出两亲性。目前已经有很多学者从食源性蛋白质中分离出抗菌肽,其中研究最早的是 1966 年从牛乳酪蛋白中分离得到的对多种细菌均具有抑菌作用的 抗菌肽。在 1972 和 1980 年,瑞典科学家Boman 等和 Hultmark 等分别通过诱导眉纹天蚕蛾蛹和惜古比天蚕( Hyalophora cecropia) 发现了类似的具有抑菌活性的物质。而第一个真正意义上的抗菌肽就是由 Boman 命名的天蚕素( cecropins) , 该物质对革兰氏阳性和阴性菌都有抑制作用。此 后各种抗菌物质陆续被发现,其中昆虫和某些非 脊椎动物被广泛研究，迄今为止已发现超过 2 000种天然存在的抗菌肽。 1 抗菌肽的来源 1.1 来源于昆虫的抗菌肽 昆虫家族抗菌肽的一个典型例子就是天蚕素(cecropins),包括天蚕素A、B、C、D、E5 种结构。天蚕素具有广谱抗菌活性,其作用机理是天蚕素抗菌肽分子可以在细菌细胞膜上穿孔后形成离子孔道, 造成细菌细胞膜结构破坏而发挥抑菌作用。它们的分子中不含半胱氨酸,呈线性α- 螺旋结构,对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强活性,并且所有昆虫抗菌肽的 C 端都被酰胺化,这一性质对其广谱抗菌性极为重要。 昆虫抗菌肽的另一大家族是昆虫防御素( insect defensins)。所有昆虫防御素均带一个净的正电荷, 都含有 6 个Cys 并形成 3 个分子内二硫键,呈反平行β-折叠结构。昆虫防御素对革兰氏阴性菌的抗菌活性较弱,且对真核细胞和真菌不起作用,但可以抗革兰氏阳性菌。 除以上两种,还有多种昆虫抗菌肽,如来自蜜蜂的apidaecin 和abaecin,来自天蚕H.cecropia 的attacin A – F,来自家蚕 B.mori 的moricin。 1.2 来源于植物的抗菌肽 自第一种植物抗菌肽(Triticumaestivum)从禾本科植物小麦中被分离出以来,至今已有多种有活性的植物抗菌肽被发现并鉴定,除了硫堇蛋白( Thionins),还有环蛋白、富含甘氨酸的蛋白、snakins 和hevein 状蛋白。硫堇蛋白是一类分子量约5kD、氨基酸残基数45~47、富含半胱氨酸的碱性蛋白。近来研究表明,硫堇蛋白能抑制多种病原细菌(如革兰氏阳性和革兰氏阴性菌)及真菌的生长。 目前关于防御素的研究是最多的,细胞防御素(Defensin)对许多种细菌有抑制作用,尤其能抑制病原体的增殖。不同种类的植物防御素的一级结构呈多样性,氨基酸组成相差较大,高含量的Cys 形成稳定的二硫键,可能与其生物学特异性功能相关。然而某些抗菌肽,如椰汁中以及石榴种子中富含甘氨酸的肽,只有多个正电荷不含二硫键。目前,已分离的大多数植物
抗菌肽及其在饲料中的应用 抗菌肽概述 ?1972年，瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能，随后从惜古比天蚕蛹诱导分离到并命名为cecropin。此后人们相继从细菌、真菌、两栖类、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有类似性质的活性蛋白。 ?抗菌肽又称抗微生物肽（antimicrobial peptide）或肽抗生素（peptide antibiotics），在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分。 ?抗菌肽不仅具有广谱抗细菌能力，而且对真菌、病毒、及癌细胞也有作用。其对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。具有广阔的应用前景。 抗菌肽的分类 ?抗菌肽按结构、功能大致分为四类：cecropin（天蚕素）类；富含pro残基(脯氨酸）的magainin（蛙皮素）；富含gly残基（甘氨酸）的melittin(蜂毒素）；富含cys 残基（半胱氨酸）的defensin（防御素）。 ?抗菌肽按来源一般分为六类：哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽、病毒抗菌肽 抗菌肽的结构和特性 ?通常由数十个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4KD。?含有4个或多于4个带正电荷的氨基酸，N端亲水C端硫水具有双亲的性质； ?具有热稳定性，在100℃加热10-15分钟仍能保持其活性。等电点大于7，表现出较强的阳离子特性。 ?对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性； ?具备抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。 抗菌肽的作用机理 ?抗菌肽是以一端插入细菌细胞膜，通过?°打孔?±形成一个通道，使细菌细胞膜破裂，原生质?°泄漏?±而死亡。 ?（对于G阴性菌，抗菌肽易与其外膜上的带负电荷脂多糖相互作用，从而破坏外膜结构以穿越内膜，而G阳性菌不具有脂多糖，但其表面由于肽聚糖中的胞壁酸、
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
抗菌肽的研究进展 摘要：由于细菌对抗生素耐药性不断出现, 研发新型抗菌物质已迫在眉睫。而抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。本文介绍了抗菌肽的结构，抗菌肽的生物学活性，抗菌肽的作用机理和作用机制，以及抗菌肽的应用和前景。 关键词：耐药性，抗菌肽；作用机理；前景 抗菌肽，简称ABP,是由宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽。广泛存在于各种生物体内。1980 年，瑞典科学家Boman 等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( cecropin ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识。目前世界上已知的抗菌肽共有1 700余种。由于热稳定性强，且对较高离子强度环境有较强的适应性，不仅有广谱抗细菌能力, 而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又极少破坏动物体内的正常细胞，因此，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学、生理学、药理学研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域及农业、食品等领域具有广阔的应用前景。 1 .抗菌肽的结构 1 .1 一级结构 据报道，已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种，且一级结构都比较相似，具有以下典型的特征：由20~70多个氨基酸残基组成的肽链，其N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，C 端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，中间部分则富含脯氨酸，且在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基，这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的， 1. 2 二级结构 通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征，结果表明，抗菌肽在一定条件下形成a-螺旋和β-折叠结构。a-螺旋是一个近乎完美的水脂两亲结构,即圆柱形分子的纵轴一边为带正电-的亲水区，而对称面为疏水区。这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键，改变a-螺 旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。抗菌肽有许多保守序列,在N端易形成a-螺旋,中间部分易形成β-折叠或铰链。a-螺旋肽主要包括天蚕素、爪蟾抗菌肽ma g a i n i n 、c a t h e l i n d i a 等，β-折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等。 2 抗菌肽的来源 2.1微生物抗菌肽
基金项目遵义医学院硕士科研启动基金资助项目（Ｆ－２７６）。 作者简介岳昌武（１９７５－），男，河南洛阳人，硕士，讲师，从事基因的分子生物学研究。 收稿日期 ２００７!１０!１５ 传统抗生素的大量使用造成耐药菌株不断产生，使得许多曾经高度有效的抗生素药物失效，因此寻求新的抗生素越来越重要。人们发现，生物受到微生物感染后，迅速、大量产生具有抗菌活性的小分子多肽（即抗菌肽）参与机体免疫，抗菌肽几乎是所有生命物种都有的重要免疫分子，具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性。目前已从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽，这类抗菌肽在合成机制、氨基酸组成和作用机制等方面不同于传统的微生物（包括细菌、 真菌和链霉菌等）产生的多肽类抗生素［１－３］。抗菌肽的作用与其２级结构有密切的联系（表１）［２］，抗菌肽通过与膜相互作用改变了脂双层的构造，增加了膜的通透性，导致膜去极化，从而发挥抗菌作用。尽管多数抗菌肽表现出很低的１级结构同源性，但对某些抗菌肽氨基酸序列比对后发现，在某些特定的位点，不同来源的抗菌肽表现出高度的一致性。从２级结构水平上看，抗菌肽分子同时具有α!ｈｅｌｉｘ、β!ｓｈｅｅｔ和ｓ!ｓ!ｂｒｉｄｇｅ以及无规则结构等几种类型，这为设计新的抗菌肽提供了一定的依据。 抗菌肽的发现为发展新型肽类抗生素提供了丰富的资源，其独特的作用方式使其有望解决传统抗生素长期使用带来的细菌耐药性问题，在医药卫生、农业生产、食品工业等领域都有广泛的应用前景。随着对抗菌肽的作用机理和结构特点认识的深入，人们除了利用生物化学方法从生物体内分离出天然抗菌肽外，还可以通过化学合成法在短时间内获得大量的抗菌肽，基因工程的发展为人们提供了一个获得大量廉价抗菌肽的新途径。近年来，越来越多的研究倾向于用基因工程的办法获得重组抗菌肽。 １抗菌肽的生物活性与作用机制１．１ 抗菌肽的生物活性 现有的绝大多数抗菌肽都具有 抗Ｇ＋、Ｇ!细菌的活性，有些抗菌肽还具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤活性，有些则偏好其中１种，如ａｎｄｒｏｐｉｎ和昆虫抗菌肽偏好于杀死Ｇ＋细菌；ａｐｏｄａｅｃｉｎ、ｄｒｏｓｏｃｉｎ和ｃｅｃｒｏｐｉｎＰ１偏好于杀死Ｇ!细菌；ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ和植物抗菌肽偏好于杀死真菌。某些抗菌肽具有体外抗病毒活性，例如防御素能使单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）、水泡性口膜炎病毒（ＶＳＶ）、流感病毒（ＩＶ）失活；鲎肽（ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎｓ）具有抗ＶＳＶ、ＩＶ!Ａ和人获得性免疫缺陷综合症病毒（ＨＩＶ）的活性；天蚕素具有抗ＨＩＶ活性。部分抗菌肽具有抑制或者杀灭肿瘤作用，如ｍａｇａｉｎｉｎｓ能溶解造血肿瘤细胞和实体瘤细胞，中国鲎肽能够抑制肿瘤细胞，从欧洲林蛙（Ｒａｎａｔｅｍｐｏｒａｉａ）体内分离的ｔｅｍｐｏｒｉｎＬ（含有１３个氨基酸残基）能诱导肿瘤细胞坏死，其他的抗菌肽如防御素、天蚕素、乳铁蛋白素和乳铁蛋白也具有抗肿瘤活性。也有一些抗菌肽如蜜蜂的蜂毒素（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、黄蜂毒素（ｓｃｏｒ－ｐｉｏｎｓ）、蝎子的蝎毒素（ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ）等对正常人体细胞具有溶血毒性［３－７］。 １．２抗菌肽的作用机制［２］人们对抗菌肽的作用机理有多 种不同的看法。很多学者认为，抗菌肽通过与细胞膜作用，使膜蛋白凝聚、失活，形成离子通道，引起膜通透性改变，最后导致细菌死亡，即细胞膜损伤机理。也有人认为，抗菌肽是通过与细胞膜上存在的特异性受体及其他因子协同作用而导致细菌死亡的，即胞内损伤机理。图１描述了抗菌肽的 抗菌肽的结构特点? 作用机理及其应用前景岳昌武，莫宁萍，刘坤祥，凌锌，曾霓 （遵义医学院中心实验室，贵州遵义５６３０００） 摘要抗菌肽是一种广泛存在于生物界的抵抗病原微生物入侵的重要防御分子，是生物先天免疫的重要防御物质，不仅具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性，还具有随物种适应环境而产生的结构多样性以及区别于传统抗生素杀菌机理的独特性，且不易产生耐药性，是一类极具潜力的肽类抗生素。抗菌肽对靶细胞表现出选择性，有助于设计出活性更高的新型肽类抗生素。从抗菌肽的作用机制、结构特点、新型抗菌肽分子设计、抗菌肽基因工程等方面阐述了抗菌肽研究的新进展。关键词抗菌肽；作用机制；基因工程；分子设计；研究进展中图分类号Ｑ５１６文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００８）０５－０１７３６－０４ ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，ＥｆｆｅｃｔＭｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｆＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅｓＹＵＥＣｈａｎｇ!ｗｕｅｔａｌ（ＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｆＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５６３０００） ＡｂｓｔｒａｃｔＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＡＭＰｓ）ａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｍｏｌｅｃｕｌｅｗｈｉｃｈｅｘｉｓｔｓｗｉｄｅｌｙｉｎｌｉｖｉｎｇｎａｔｕｒｅａｎｄｃａｎｋｅｅｐｆｒｏｍｐａｔｈｏｇｅｎｙｍｉｃｒｏｂｅ．ＡＭＰｓａｒｅｋｅｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｏｆｍｏｓｔｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒｏｒｇａｎｉｓｍｓ．ＡＭＰｓｈａｖｅｔｈｅｂｒｏａｄｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｇａｉｎｓｔｖｉｒｕｓｅｓ，ｃａｎｃｅｒ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｆｕｎｇｉａｎｄｐｒｏｔｏｚｏａｗｉｔｈｏｕｔｄｒｕｇｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＡＭＰｓｈａｖｅｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｔｏｔａｒｇｅｔｃｅｌｌ，ｗｈｉｃｈｃａｎｈｅｌｐｔｏｄｅｓｉｇｎｎｅｗｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＡＭＰｓｉｓｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｆｆｅｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＡＭＰｓａｎｄｓｏｏｎ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；Ｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｓｉｇｎ；Ｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 名称 Ｎａｍｅ结构特征 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ－ ｔｉｃｓ来源Ｏｒｉｇｉｎ作用机制 Ａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｍａｇａｉｎｉｎ α!螺旋蛙穿透细菌细胞壁ＣｅｃｒｏｐｉｎＡα!螺旋丝蛾破坏细胞膜稳定性Ｍｅｌｌｉｔｉｎα!螺旋蜜蜂破坏细胞膜稳定性 ＬＬ!３７α!螺旋人类破坏细胞膜稳定性，离子外流ＢｕｆｏｒｉｎＩＩα!螺旋／松散蟾蜍结合核酸防御素 β!折叠哺乳类 离子外流、破坏细胞膜，抑制大分子合成 Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎβ!折叠人类，猪穿透细胞膜Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎβ!折叠马蹄蟹穿透细胞膜Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ松散结构牛抑制大分子合成，钙离子相互作用ＰＲ!３９松散结构 猪抑制ＤＮＡ／ＲＮＡ／蛋白质合成 表１部分天然抗菌肽来源、结构及作用机制 Ｔａｂｌｅ１Ｏｒｉｇｉｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｓｏｍｅｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ 安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００８，３６（５）：１７３６－１７３９责任编辑金琼琼责任校对王淼