分子生物学常用试剂配制与保存
一 . 常用贮液与溶液
1mol/L亚精胺(Spermidine :
溶解 2.55g 亚精胺于足量的水中,使终体积为 10ml 。分装成小份贮存于 -20℃。
1mol/L精胺(Spermine :
溶解 3.48g 精胺于足量的水中,使终体积为 10ml 。分装成小份贮存于 -20℃。
10mol/L乙酸胺(ammonium acetate:
将 77.1g 乙酸胺溶解于水中,加水定容至 1L 后,用 0.22um 孔径的滤膜过滤除菌。
10mg/ml牛血清蛋白 (BSA :加 100mg 的牛血清蛋白 (组分 V 或分子生物学试剂级,无 DNA 酶于 9.5ml 水中(为减少变性,
须将蛋白加入水中,而不是将水加入蛋白,盖好盖后,轻轻摇动,直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到 10ml ,然后分装成小份贮存于 -20℃。
8mol/L乙酸钾(potassium acetate:
溶解 78.5g 乙酸钾于足量的水中,加水定容到 100ml 。
3mol/L乙酸钠(sodium acetate:
溶解 40.8g 的三水乙酸钠于约 90ml 水中, 用冰乙酸调溶液的 pH 至 5.2, 再加水定容到 100ml 。
0.5mol/L EDTA:
配制等摩尔的 Na2EDTA 和 NaOH 溶液 (0.5mol/L , 混合后形成 EDTA 的三钠盐。或称取 186.1g 的 Na2EDTA·2H2O和 20g 的 NaOH ,并溶于水中,定容至 1L 。
1mol/L HCl:
加 8.6ml 的浓盐酸至 91.4ml 的水中。
25mg/ml IPTG:
溶解 250mg 的 IPTG (异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷于 10ml 水中, 分成小份贮存于 -20℃。
100mmol/L PMSF:
溶解 174mg 的 PMSF (苯甲基磺酰氟于足量的异丙醇中, 定容到 10ml 。分成小份并用铝箔将装液管包裹
或贮存于 -20℃。
20mg/ml蛋白酶 K (proteinase K:
将 200mg 的蛋白酶 L 加入到 9.5ml 水中,轻轻摇动,直至蛋白酶 K 完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到 10ml ,然后分装成小份贮存于 -20℃。 10mg/ml Rnase A(无 DNase :
溶解 10mg 的胰蛋白 RNA 酶于 1ml 的 10mmol/L的乙酸钠水溶液中 (pH 5.0 。溶解后于水浴中煮沸 15min , 使 DNA 酶失活。用 1mol/L的 Tris -HCl 调 pH 至 7.5,于 -20℃贮存。(配制过程中要戴手套
10N 氢氧化钠(NaOH :
溶解 400g 氢氧化钠颗粒于约 0.9L 水的烧杯中 (磁力搅拌器搅拌 , 氢氧化钠完全溶解后用水定容至 1L 。
100%三氯乙酸(TCA :
在装有 500gTCA 的试剂瓶中加入 100ml 水, 用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。(稀释液应在临用前配制
2.5%X -gal (5-溴 -4-氯 -3-吲哚-β-半乳糖苷:
溶解 25mg 的 X -gal 于 1ml 的二甲基甲酰胺 (DMF , 用铝箔包裹装液管,贮存于-20℃。
10%SDS (十二烷基硫酸钠:
称取 100gSDS 慢慢转移到约含 0.9L 的水的烧杯中,用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至 1L 。
2mol/L山梨(糖醇(Sorbitol :
溶解 36.4g 山梨(糖醇于足量水中使终体积为 100ml 。
DEPC (焦碳酸二乙酯处理水:
加 100ul DEPC 于 100ml 水中, 使 DEPC 的体积分数为 0.1%。在 37℃温浴至少 12h ,然后在 15 psi 条件下高压灭菌 20min ,以使残余的 DEPC 失活。 DEPC 会与胺起反应,不可用 DEPC 处理 Tris 缓冲液。甲酰胺(deionized formamide:
直接购买或加 Dowex XG8 混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中, 用磁力搅拌器轻轻搅拌 1h ,可去除甲酰胺中的离子。经 Whatman 1号滤纸过滤除去树脂后分成小份,充氮气于 -80℃贮存(防止氧化。
苯酚 /氯仿 /异戊醇:
将 Tris-HCl 平衡苯酚与等体积的氯仿 /异戊醇(24:1均匀混合后,移入棕色玻璃瓶中 4℃保存。
PBS Buffer:
组份 :137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配置方法(1L:
1. 称量下列试剂,置于 1L 烧杯中。
NaCl 8 g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.42 g
KH2PO4 0.27g
2. 向烧杯中加入约 800 mL的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 滴加 HCl 将 pH 值调节至 7.4,然后加入去离子水将溶液定容至 1L 。
4. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:上述 PBS Buffer中无二价阳离子, 如需要, 可在配方中补充 1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。
磷酸缓冲液(phosphate buffer:
按照下表所给定的体积, 混合 1 mol/L 的磷酸二氢钠 (单碱和 1mol/L 磷酸氢二钠 (双碱贮液, 获得所需 pH 的磷酸缓冲液。配制 1 mol/L 的磷酸二氢钠
(NaH2PO4·H2O贮液:溶解 138g 于足量水中,使终体积为 1L;1mol/L 磷酸氢二钠(Na2HPO4贮液 :溶解 142g 于足量水中使终体积为 1L 。
1mol/L 磷酸二氢钠 (ml 1mol/L 磷酸氢二钠(ml 最终 pH 值
77 850 815 775 735 685 625 565 510 450 390 330 280 123
150
185
225
265
315
375
435
490
550
610
670
720
6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8
6.9
7.0 7.1 7.2
Tris 缓冲液(Tris-HCl buffer:
将 121g 的 Tris 碱溶解于约 0.9L 水中,再根据所要求的 pH (25℃下加一定量的浓盐酸(11.6N ,用水调整终体积至 1L 。
浓盐酸的体积(ml pH
8.6 14 21 28.5 38 46 56 66 71.3 76 9.0
8.8
8.6
8.4
8.2
8.0
7.8
7.6
7.4
7.2
TE (用于溶解和贮存 DNA
成分及终浓度配制 100ml 溶液各成分的用量
10mmol/L Tris-HCl
1mmol/L EDTA
水
1ml 1mol/L Tris-HCl(pH7.4-8.0, 25℃
200ul 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0 98.8ml
二 . 电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
10mg/ml的溴化乙锭(ethidium bromide:
小心称取 1g 溴化乙锭,转移到广口瓶中,加 100ml 水,用磁力搅拌器搅拌直到溶解,分装成小份 4℃避光保存。
电泳缓冲液
50×Tris-乙酸(TAE 缓冲液
成分及终浓度配制 1L 溶液各成分的用量
2mol/L Tris碱
1mol/L 乙酸
100 mmol/L EDTA
水
242g
57.1 ml的冰乙酸(17.4 mol/L 200ml 的 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0 补足 1L
5×Tris-硼酸(TBE 缓冲液
成分及终浓度配制 1L 溶液各成分的用量
445 mmol/L Tris碱
445 mmol/L 硼酸盐
10 mmol/L EDTA
水
54g
27.5g 硼酸
20 ml的 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0 补足 1L
6×DNA Loading buffer蔗糖凝胶上样液(室温贮存成分及终浓度配制 10ml 溶液各成分用量
0.15%溴酚蓝
0.15%二甲苯青 FF
5 mmol/L EDTA
40%聚蔗糖
水
1.5ml 1%溴酚蓝
1.5ml 1%二甲苯青 FF
100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0 4g
补足到 10ml
10×DNA Loading buffer(终止反应十二烷基硫酸钠 /甘油凝胶上样液 (室温贮存成分及终浓度配制 10ml 溶液各成分用量
0.2%溴酚蓝 0.2%二甲苯青 FF 200 mmol/L EDTA 0.1%SDS
50%甘油
水 20mg
20mg
4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0 100ul 10% SDS
5ml
补足到 10ml
30%(W/V Acrylamide
组份浓度 30%(W/V Acrylamide 0.05%
配制量 1L
配置方法 :
1. 称量下列试剂,置于 1L 烧杯中
Acrylamide 290g
BIS 10g
2. 向烧杯中加入约 600mL 的去离子水,充分搅拌溶解
3. 加入去离子水将溶液定容至 1L ,用0.45μm 滤膜滤去杂质。
4. 于棕色瓶中 4℃保存。
注意:丙稀铣胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成份。
40%(W/V Acrylamide
组份浓度 40%(W/V Acrylamide 0.05%
配制量 1L
配置方法
1. 称量下列试剂,置于 1L 烧杯中
Acrylamide 380g
BIS 20g
2. 向烧杯中加入约 600mL 的去离子水,充分搅拌溶解
3. 加入去离子水将溶液定容至 1L ,用0.45μm 滤膜滤去杂质。
4. 于棕色瓶中 4℃保存。
注意:丙稀铣胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收, 其作用有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成份。
10%(W/V过硫酸铵
组份浓度 10%(W/V过硫酸铵
配制量 10mL 配置方法
1. 称取 1g 过硫酸铵。
2. 加入 10mL 的去离子水后搅拌溶解。
3. 贮存于 4℃。
注意:10%过硫酸胺溶液在 4℃保存时间可使用 2周左右, 超过期限会失去催化作用。
考马斯亮蓝 R-250染色液
组份浓度 0.1%(W/V考马斯亮蓝 R-250, 25%(V/V异丙醇, 10 %(V/V冰醋酸
配制量 1L
配置方法
1. 称取 1g 考马斯亮蓝 R-250, 置于 1L 烧杯中。
2. 量取 250mL 的异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解。
3. 加入 100mL 的冰乙醋酸,均匀搅拌。
4. 加入 650mL 的去离子水,均匀搅拌。
5. 用滤纸出去颗粒物质后,室温保存。
考马斯亮蓝染色脱色液
组份浓度 10%(V/V醋酸, 5%(V/V乙醇
配制量 1L
配置方法
1. 量取下列溶液,置于 1L 烧杯中。
醋酸 100mL
乙醇 50mL
dH2O 850mL
2. 充分混合后使用。
显影液
组份浓度 0.005%(V/V柠檬酸, 0.02%(V/V甲醛 (SDS-PAGE银氨染色用配制量 1L
配置方法
1. 称取下列试剂,置于 1L 试剂瓶中。
柠檬酸 50mg
甲醛 0.2mL
2. 加入 1L 去离子水后,摇动混合后溶解。
3. 室温保存。
5×Tris-GlycineBuffer
组份浓度 0.125M Tris , 1.25M Glycine, 0.5%(w/v SDS
(SDS-PAGE 电泳缓冲液
配制量 1L
配置方法
1. 称取下列试剂,置于 1L 烧杯中。
Tris 15.1g
Glycine 94g SDS 5.0g
2. 加入约 800mL 的去离子水,搅拌溶解。
3. 加去离子水将溶液定容至 1L 后,室温保存。
三 . 常用培养基
LB 培养基
将下列组分溶解在 0.9L 水中:
蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g
如果需要用 1N NaOH(~1ml 调整 pH 至 7.0,再补足水至 1L 。注:琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L。
SOB 培养基
将下列组分溶解在 0.9L 水中:
蛋白胨 20g 酵母提取物 5g
氯化钠 0.5g 1 mol/L 氯化钾 2.5ml
用水补足体积到 1L 。分成 100ml 的小份,高压灭菌。培养基冷却到室温后,再在每 100ml 的小份中加 1ml 灭过菌的 1mol/L氯化镁。
SOC 培养基
成分、方法同 SOB 培养基的配制,只是在培养基冷却到室温后,除了在每
100ml 的小份中加 1ml 灭过菌的 1mol/L氯化镁外, 再加 2ml 灭菌的 1mol/L葡萄糖(18g 葡萄糖溶于足够水中,再用水补足到 100ml , 用 0.22um 的滤膜过滤除菌。
TB 培养基
将下列组分溶解在 0.9L 水中:
蛋白胨 12g 酵母提取物 24g 甘油 4ml
各组分溶解后高压灭菌。冷却到 60℃ ,再加 100ml 灭菌的 170mmol/L
KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液 (2.31g 的 KH2PO4和 12.54gK2HPO4溶在足量的水中,使终体积为 100ml 。高压灭菌或用 2×YT培养基
将下列组分溶解在 0.9L 水中:
蛋白胨 16g 酵母提取物 10g 氯化钠 4ml
如果需要用 1N NaOH(~1ml 调整 pH 至 7.0,再补足水至 1L 。注:琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L。
YPD 培养基
将下列组分溶解在 0.9L 水中:
蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g
用水补足体积为 1L 后,高压灭菌。建议在高压灭菌之前,对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加 1.6g 色氨酸, 因为 YPD 培养基是色氨酸限制型培养基。为了配制平板,需要在高压灭菌前加入 20g 琼脂粉。四 . 常用抗生素
氨苄青霉素(ampicillin (100mg/ml
溶解 1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水中, 最后定容至 10ml 。分装成小份于 -20℃贮存。常以 25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素(carbenicillin (50mg/ml
溶解 0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中,最后定容至 10ml 。分装成小份于 -20℃贮存。常以 25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
卡那霉素(kanamycin (10mg/ml
溶解 100mg 卡那霉素于足量的水中, 最后定容至 10ml 。分装成小份于 -20℃贮存。常以 10ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林(methicillin (100mg/ml
溶解 1g 甲氧西林钠于足量的水中,最后定容至 10ml 。分装成小份于 -20℃贮存。常以 37.5ug/ml终浓度与 100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。
氯霉素(chloramphenicol (25mg/ml
溶解 250mg 氯霉素足量的无水乙醇中, 最后定容至 10ml 。分装成小份于 -20℃贮存。常以 12.5ug/ml~25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。链霉素(streptomycin (50mg/ml
溶解 0.5g 链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中,最后定容至 10ml 。分装
成小份于 -20℃贮存。常以 10ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
萘啶酮酸(nalidixic acid(5mg/ml
溶解 50mg 萘啶酮酸钠盐于足量的水中,最后定容至 10ml 。分装成小份于 -20℃贮存。常以 15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
四环素(tetracyyline (10mg/ml
溶解 100mg 四环素盐酸盐于足量的水中,或者将无碱的四环素溶于无水乙醇,定容至 10ml 。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光, 于 -20℃贮存。常以10ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。五、核酸及蛋白质常用数据
1.核苷三磷酸的物理常数
化合物分
子
量
λmax(pH7.0
1摩尔溶液(pH7.0
中λmax 时的最大吸
收值
OD 280/OD260
ATP 507
259 15400 0.15 CTP 483
271 9000 0.97 GTP 523
253 13700 0.66 UTP 484
262 10000 0.38
dATP 494
259 15200 0.15 dCTP 467
271 9300 0.98 dGTP 507
253 13700 0.66 dTTP 482
267 9600 0.71 2.常用核酸的长度与分子量
核酸核苷酸数分子量
λDNA 48502(双链环状 3.0×107 pBR322 4363(双链 2.8×106 28SrRNA 4800 1.6×106 23SrRNA 3700 1.2×106 18SrRNA 1900 6.1×105 19SrRNA 1700 5.5×105
5SrRNA 120 3.6×104
tRNA (大肠杆菌 75 2.5×104
3.常用核酸蛋白换算数据
(1重量换算
1μg=10-6g 1pg=10-12g
1ng=10-9g 1fg=10-15g
(2分光光度换算:
1A 260双链DNA=50μg/ml
1A 260单链DNA=30μg/ml
1A 260单链RNA=40μg/ml 4.常用蛋白质分子量标准参照物
(1高分子量标准参照 (2中分子量标准参照 (3低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶 B 97, 400 碳酸酐酶 31, 00 肌球蛋白 212, 000 牛血清白蛋白 66, 200 大豆脻蛋白酶21, 500β-半乳糖甘
酶 B
116, 000 谷氨酶脱氢酶 55, 000 抑制剂
磷酸化酶 B 97, 400 卵白蛋白 42, 700 马心肌球蛋白 16, 900牛血清白蛋
白
66, 200 醛缩酶 40, 000 溶菌酶 14, 400过氧化氢酶 `57, 000 碳酸酐酶 31, 000 肌球蛋白(F1 8, 100 醛缩酶 40, 000 大豆脻蛋白酶 21, 500 肌球蛋白(F2 6, 200 抑制剂肌球蛋白(F3 2, 500 溶菌酶 14, 400
5.常用 DNA 分子量标准参照物
λDNA/HindⅢ λDNA/EcoRⅠ λ/HindⅢ +EcoRⅠ pBR322/HaeⅢ
23130 21226 21227 587
123 9416 7421 5148 405
104 6557 5804 4973 504
89 4361 5643 4268 458
80 2322 4843 3530 434
64 2027 3530 2027 267
57 564 1904 234
51
125 1584 1375 974 831 564 125 213 192 184 124 21 18 11 7 2.常用的电泳缓冲液缓冲液使用液浓贮存液（每升） 50×：242g Tris 碱 57.1ml 冰乙酸 100ml
EDTA(pH8.0 Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris 碱 15.5ml85%
磷酸（1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0 Tris-硼酸（TBE）a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA 5×：54g Tris 碱 27.5 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0 碱性缓冲液 b Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA
0.5mol/L 六、常用缓冲液 1．磷酸缓冲液（1）25℃下 0.1mol/L 磷酸钾缓冲液的配制 pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 1mol/L K2HPO4(ml 8.5 13.2 19.2 27.8 38.1 49.7 61.5 71.7 80.2 86.6 90.8 94.0 ※※ 0.002mol/L EDTA 1mol/L
KH2PO4(ml 91.5 86.8 80.8 72.2 61.9 50.3 38.5 28.3 19.8 13.4 9.2 6.2 说明： Tris-甘氨酸 c 1×:50mmol/L NaOH 1mmol/L EDTA 1×:25mmol/L Tris 250mmol/L 甘氨酸 0.1% SDS 1×:5ml 10mol/L NaOH 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0 5×:15.1g Tris 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3） 50ml 10% SDS(电泳级①TBE 溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存 5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以 1×TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但 0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以 1：10 稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1×TBE 以提供足够的缓冲容量。②碱性电泳缓冲液应现用现配。③Tris-甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2×SDS 凝胶加样缓冲液： 100mmol/L Tris·HCl(6.8 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS （电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油不含 DTT 的 2×SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取（2）25℃下 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液的配制 pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 1mol/L Na2HPO4(ml 1mol/L NaH2PO4(ml 7.9 12.0 17.8 25.5 35.2 46.3 57.7 68.4 77.4 84.5 89.6 93.2 92.1 88.0 82.2 74.5 64.8 53.7 42.3 31.6 22.6 15.5 10.4 6.8 1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。 3.凝胶加样缓冲液缓冲液类型 6×缓冲液 0.25%溴酚蓝Ⅰ 0.25%二甲苯青 FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 4℃贮存温度※: 用蒸馏水将混合的两种 1mol/L 贮存液稀释至 1000ml ，根据 Henderson-Hasselbalch 方程计算其 pH 值：pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体]在此，
pK’=6.86(25℃。徐州溥博生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/656256016.html, 6
0.25 溴酚蓝Ⅱ 0.25%二甲苯青 FF 15%聚蔗糖(Ficoll400 0.25%溴酚蓝Ⅲ 0.25%二甲苯青 FF 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝Ⅳ 40%(W/V蔗糖水溶液碱性加样缓冲
液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA 18%聚蔗糖(Ficoll400 Ⅴ 0.15%溴甲酚绿
0.25%二甲苯青 FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关。以 0.5×TBF 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同。在琼脂糖浓度为 0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。 4．各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制所需 pH 值（25℃） 7．1 7．2 7．3 7．4 7．5 7．6 7．7 7．8 7．9 8．0 8.1 8.2 8.3 0.1mol/L HCl 的体积 45．7 44．7 43．4 42．0 40．3 38．5 36．6 34．5 室温 4℃ 4℃ 4℃ 5. 常用缓冲液的 pKa 值缓冲液 Tris a b 分子量 12.1 283.3 209.3 304.3 195.2 pKa 值 8.08 7.47 7.15 6.76 6.09 缓冲范围 7.1～7.9 7.2～8.2 6.6～7.8 6.2～7.3 5.4～6.8 HEPES MPOSc PIPES MES e d a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。 32．0 29．2 26.2 22.9 19.9 6．温度对常用缓冲液 pH 的影响缓冲体系 Mes Ada pKa(20℃ 6.15 6.60 △pKa/10℃ -0.110 -0.110 徐州溥博生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/656256016.html, 7
PiPes Aces Bes Mops Tes Hepes Tricine Tris Bicine Glycylglycine 6.80 6.90 7.15 7.20 7.50 7.55 8.15 8.30 8.35 8.40 -0.085 -0.200 -0.160 -0.013 -0.200 -0.014 -0.210 -
0.310 -0.180 -0.280 细级超细 Sephadex G-75 20～80 10～40 30,000 10,000 9～11 5.0±0.3 6 2 40～120 3,000～ 1,000～ 12 ～ 3.92 7.5±0.5 15 24 3 15.86 ～超细 10～40 70,000 950,000 Sephadex G-100 40～120 4,000～ 1,000～ 15 ～超细 10～40
1,500,000 150,000 20 溶胀最少平衡 Sephadex G-150 20 ～柱头压力 40～120
5,000～ 1,000～ 30 18 ～超细 10～40 400,000 150,000 22 Sephadex G-200 15.0±1.5 72 5 3.53 0.88 ～ 10.0±1.0 48 5 9.41 2.35 ～七、常用凝胶的技术参数 1．葡聚糖凝
胶的某些技术数据床体积分子量分级范围毫升/ 干颗粒直径种类（μ）葡聚糖
实验室试剂的分类使用和 存放 The following text is amended on 12 November 2020.
常用化学试剂的分类、存放和使用 （一）化学试剂的分类 （二）化学试剂的等级标准，化学试剂的取用 （三）部分特殊试剂的存放和使用 化学试剂又叫化学药品，简称试剂。它是工农业生产、文教卫生、科学研究以及国防建设等多方面进行化验分析的重要药剂。化学试剂是指具有一定纯度标准的各种单质和化合物（也可以是混合物)。要进行任何实验都离不了试剂，试剂不仅有各种状态，而且不同的试剂其性能差异很大。有的常温非常安定、有的通常就很活泼，有的受高温也不变质、有的却易燃易爆：有的香气浓烈，有的则剧毒……。只有对化学试剂的有关知识深入了解，才能安全、顺利进行各项实验。既可保证达到预期实验目的，又可消除对环境的污染。因此，首先要知道试剂的分类情况。然后掌握各类试剂的存放和使用。 一、化学试剂的分类 试剂分类的方法较多。如按状态可分为固体试剂、液体试剂。按用途可分为通用试剂、专用试剂。按类别可分为无机试剂、有机试剂。按性能可分为危险试剂、非危险试剂等。 从试剂的贮存和使用角度常按类别和性能2种方法对试剂进行分类。 （一）无机试剂和有机试剂 这种分类方法与化学的物质分类一致，既便于识别、记忆，又便于贮存、取用。 无机试剂按单质、氧化物、碱、酸、盐分出大类后，再考虑性质进行分类。 有机试剂则按烃类、烃的衍生物、糖类蛋白质、高分子化合物、指示剂等进行分类。 （二）危险试剂和非危险试剂 这种分类既注意到实用性，更考虑到试剂的特征性质。因此，既便于安全存放，也便于实验工作者在使用时遵守安全操作规则。 1．危险试剂的分类 根据危险试剂的性质和贮存要求又分为： （1）易燃试剂
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
（pH7.4，7.6，8.0）□配制量1L □配制方法1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 pH值浓HCl 7.4 约70mL 7.6 约60mL 8.0 约42mL 4. 将溶解定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 2、1.5 M Tris-HCl□组份浓度1.5 M Tris-HCl （pH8.8）□配制量1L □配制方法1.称取181.7gTris置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 用浓盐酸调pH值至8.8。 4. 将溶液定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 3、10×TE Buffer□组份浓度100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA （pH 7.4，7.6，8.0）□配制量1L □配制方法1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1 M Tris-HCl Buffer（pH7.4，7.6，8.0）100mL 500 mM EDTA（pH8.0）20mL 2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定至1L后，高温高压灭菌。 4. 室温保存。
（pH5.2）□配制量100mL □配制方法1. 称取40.8gNaOAc?3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。 2. 加入冰乙酸调节pH值至5.2。 3. 加入去离子水将溶液定容至100mL。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 5、PBS Buffer□组份浓度137 mM NaCl，2.7mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4 □配制量1L □配制方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。 NaCl 8 g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.27g 2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加HCl将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 6、10 M醋酸铵□组份浓度10 M醋酸铵 □配制量100mL □配制方法1. 称量77.1g醋酸铵置于100～200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。 2.加去离子水将溶液定容至100mL。 3.使用0.22μm滤膜过滤除菌。 4.密封瓶口于室温保存。 注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。 7、Tris- HCl平衡苯酚□配制方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。 2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱
实验室常用溶液及试剂配制 一、实验室常用溶液、试剂的配制-------------------------------------------------------1 表一普通酸碱溶液的配制 表二常用酸碱指示剂配制 表三混合酸碱指示剂配制 表四容量分析基准物质的干燥 表五缓冲溶液的配制 1、氯化钾-盐酸缓冲溶液 2、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钾缓冲溶液 3、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钾缓冲溶液 4、乙酸-乙酸钠缓冲溶液 5、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液 6、硼砂-氢氧化钠缓冲溶液 7、氨水-氯化铵缓冲溶液 8、常用缓冲溶液的配制 二、实验室常用标准溶液的配制及其标定-----------------------------------------------4 1、硝酸银（C AgNO3=0.1mol/L）标准溶液的配制 2、碘（C I2=0.1mol/L）标准溶液的配制 3、硫代硫酸钠（C Na2S2O3=0.1mol/L）标准溶液的配制 4、高氯酸（C HClO4=0.1mol/L）标准溶液的配制 5、盐酸（C HCl=0.1mol/L）标准溶液的配制 6、乙二胺四乙酸二钠（C EDTA =0.1mol/L）标准溶液的配制 7、高锰酸钾（C K2MnO4=0.1mol/L）标准溶液的配制 8、氢氧化钠（C NaOH=1mol/L）标准溶液的配制 三、常见物质的实验室试验方法 ----------------------------------------------------------6 1、柠檬酸（C6H8O7·H2O） 2、钙含量测定（磷酸氢钙CaHPO4、磷酸二氢钙Ca（H2PO4）2·H2O、钙粉等） 3、氟（Fˉ）含量的测定 4、磷（P）的测定 5、硫酸铜（CuSO4·5H2O） 6、硫酸锌（ZnSO4·H2O） 7、硫酸亚铁（FeSO4·H2O） 8、砷 9、硫酸镁（MgSO4） 四、维生素检测--------------------------------------------------------------------------------8 1、甜菜碱盐酸盐 2、氯化胆碱
分子生物学实验室常用试剂配方：医药观察之我见 2. 常用试剂配方（Prescriptions of Ordinary Reagents）（高媛）. (217) (1) PBS (217) (2) 胰酶Trypin (217) (3) Tris-NH4Cl (217) (4) Running buffer (218) (5) Washing buffer (218) (6) 湿转液 (218) (7) LB培养基 (218) (8) LB培养板 (218) PBS:PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。 配置方法： NaCl : 320g 优级纯 Na2HPO4. 12H2O 61.44g KCl 8g KH2PO4 8g 三蒸水4L 烧杯溶解后用HCl调PH为7.2-7.4，细胞用需要高温灭菌，放于超净台冷却，贴上封口膜及标签。 胰酶：Trypsin 一种胰蛋白酶，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养皿壁结合处蛋白降解，使两者分离。细胞消化胰酶常用工作浓度为0.25%，PH为7.2-7.4，储存液放在-20冻存，使用液放在4度。 Tris-NH4Cl :红细胞裂解液，是一种从人，鼠及其他哺乳动物等体内烦人组织样品或血液中裂解并去除无核红细胞的溶液，应用低渗的原理，改变红细胞渗透压，使得红细胞胀大破裂。 配置方法： 2L 体系： NH4Cl : 14.94g 溶于1800mL ddH2O 混匀HCl调节PH为7.2-7.4 过滤
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
Western blot常用试剂配方 1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml） 丙烯酰胺29 g 双丙烯酰胺1g 加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。 2. 10% SDS：（10ml） 电泳级SDS 1 g 蒸馏水9 ml 初始PH约为，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至，定容至10ml。（四甲基乙二胺）（成品） 4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH ）：50ml Tris-base 9.085 g 蒸馏水45 ml 加浓盐酸（约）调PH至后定容至50ml，4℃保存。 5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH ）：50ml Tris-base 6.055 g 蒸馏水44 ml 加浓盐酸调PH至后定容至50ml，4℃保存。 6. 10%过硫酸铵（10% AP）：新鲜配制 称取0.05g AP于EP管中，储存于-20℃，用时溶于蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50ml upper buffer ml 甘油（丙三醇）ml 25ml
SDS g 5g DTT 0.0385 g 溴酚蓝 加蒸馏水溶解后定容至1ml。取加蒸馏水配成工作液。8. 5 × running buffer：（1000ml） Tris-base 15.1 g 甘氨酸（Glycine）94 g SDS 5 g 加蒸馏水溶解后定容至1000ml。用时加4000 ml蒸馏水。 9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用） 甲醇30 ml 冰乙酸10 ml 蒸馏水60 ml 考马斯亮-250 0.05 g 10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配 乙酸（10%）50ml 甲醇（30%）150ml 加蒸馏水定容至500ml。 11. Transbuffer（PH ）：100ml 现用现配 Tris-base 0.3028 g 甘氨酸 1.4872 g 甲醇20 ml 加蒸馏水定容至100ml。 12. 10 x 丽春红染液（储存液）：（可重复利用） （用时用蒸馏水稀释为1 X 的）染色后用纯水脱色
1DEPC水(1‰) 1000ml 水 1ml DEPC 根据需要确定要配的体积，泡实验器具的DEPC水静止4小时后备用，泡24小时。配液体的DEPC水37℃过夜，送至高压，然后配相关溶液。 20.1M tris(ph 7.5) 12.114g tris 1000ml DEPC水 用HCL调ph至7.5，高压备用。 3 4%PFA的配制(ph 7.0)40g PFA 1000ml 0.1m tris(DEPC水配制高压) 将溶液持续加热至60℃左右，搅拌之至完全溶解，注意温度不要超过65℃，否则PFA降解失效。 30.2% 甘油/0.1M tris 20ml 甘油 980ml 0.1Mtris 4 20XSSC Nacl 175.3g （ph 7.0）柠檬酸钠88.2g DEPC水1000ml 分别稀释至2XSSC和0.2XSSC备用 5 HEPES 溶液HEPES 23.8g (ph6.8-8.0)DEPC H2O 100ml 6 50X Denhaldt′s 液 聚蔗糖（Ficoll 400）0.2g 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone) 0.2g 牛血清蛋白（BSA）0.2g DEPC 水20ml 7 预杂交buffer Deinoized formanmid 5ml 20X SSC 1.5ml 1M HEPES 0.5ml 50X Denhanldt′s液1ml 龟精DNA 0.6ml(4ug/ul) DEPC水 1.4ml 龟精DNA 要先95℃10-15min加热变性，随即冰浴。杂交buffer分装后-20℃保存。 8Washing buffer (ph7.5) maleic acid 5.8g NACL 4.4g Tween（吐温） 1.5ml 定容至500ml溶质浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 0.3% Tween 9Maleic acid buffer (ph7.5) Maleic acid 5.8g Nacl 4.4g 定容至500ml 溶质的浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 10Detection buffer
1、2，4－二硝基苯肼溶液 I．在15mL浓硫酸中，溶解3克2，4－二硝基苯肼。另在70mL95％乙醇里加20mL 水，然后把硫酸苯肼倒入稀乙醇溶液中，搅动混合均匀即成橙红色溶液（若有沉淀应过滤）。 Ⅱ．将1.2克2，4一二硝基苯肼溶于50mL30％高氯酸中，配好后储于棕色瓶中，不易变质。 I法配制的试剂，2，4－二硝基苯肼浓度较大，反应时沉淀多便于观察。Ⅱ法配制的试剂由于高氯酸盐在水中溶解度很大，因此便于检验水中醛且较稳定，长期贮存不易变质。2、卢卡斯（Lucas）试剂 将34克无水氯化锌在蒸发皿中强热熔融，稍冷后放在干燥器中冷至室温。取出捣碎，溶于23mL浓盐酸中（比重1.187）。配制时须加以搅动，并把容器放在冰水浴中冷却，以防氯化氢逸出。此试剂—般是临用时配制。 3、托伦（Tollens）试剂 I．取0.5mL10％硝酸银溶液于试管里，滴加氨水，开始出现黑色沉淀，再继续滴加氨水，边滴边摇动试管，滴到沉淀刚好溶解为止，得澄清的硝酸银氨水溶液，即托伦试剂。 Ⅱ．取一支干净试管．加入1mL5％硝酸银，滴加5％氢氧化钠2滴，产生沉淀，然后滴加5％氨水，边摇边滴加，直到沉淀消失为止，此为托伦试剂。 无论I法或Ⅱ法，氨的量不宜多，否则合影响试剂的灵敏度。I法配制的Tollens试剂较Ⅱ法的碱性弱，在进行糖类实验时，用I法配制的试剂较好。 4、谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂 将0.05g间苯二酚溶于50mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100mL。 5、希夫（Schiff）试剂 在100mL热水中溶解0.2g品红盐酸盐，放置冷却后，加入2g亚硫酸氢钠和2mL浓盐酸，再用蒸馏水稀释至200mL。 或先配制l0mL二氧化硫的饱和水溶液，冷却后加入0.2g品红盐酸盐，溶解后放置数小时使溶液变成无色或淡黄色，用蒸馏水稀释至200mL。 此外，也可将0.5g品红盐酸盐溶于l00mL热水中，冷却后用二氧化硫气体饱和至粉红色消失，加入0.5g活性炭，振荡过滤，再用蒸馏水稀释至500mL。 本试剂所用的品红是假洋红（Para-rosaniline或Para-Fuchsin），此物与洋红（Rosaniline或Fuchsin）不同。希夫试剂应密封贮存在暗冷处，倘若受热或见光，或露置空气中过久，试剂中的二氧化硫易失，结果又显桃红包。遇此情况，应再通入二氧化硫，使颜色消失后使用。但应指出，试剂中过量的二氧化硫愈少，反应就愈灵敏。 6、0.1％茚三酮溶液 将0.1g茚三酮溶于124.9mL95％乙醇中，用时新配。 7、饱和亚硫酸氢钠 先配制40％亚硫酸氢钠水溶液，然后在每100mL的40％亚硫酸氢钠水溶溶液中，加不含醛的无水乙醇25mL，溶液呈透明清亮状。 由于亚硫酸氢钠久置后易失去二氧化硫而变质，所以上述溶液也可按下法配制：将研细的碳酸钠晶体（Na2CO3?10H2O）与水混合，水的用量使粉末上只覆盖一薄层水为宜，然后在混合物中通入二氧化硫气体，至碳酸钠近乎完全溶解，或将二氧化硫通入1份碳酸钠与3份水的混合物中，至碳酸钠全部溶解力止，配制好后密封放置，但不可放置太久，最好是用时新配。 8、饱和溴水 溶解15克溴化钾于100mL水中，加入10g溴，振荡即成。 9．莫利许（Molish）试剂
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30
注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；
生物试剂分类 欧阳家百（2021.03.07） 生物试剂（BR：Biological reagent） 涉及到化学试剂分类。 我国的试剂规格基本上按纯度（杂质含量的多少）划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯等7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3 种。 （1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。 （2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。 （3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。 （4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。 除了上述四个级别外，目前市场上尚有： 基准试剂（PT：Primary Reagent）：专门作为基准物用，可直接配
制标准溶液。 光谱纯试剂（SP：Spectrum pure）：表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分达不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。 纯度远高于优级纯的试剂叫做高纯试剂（≥ 99.99%）。 目前，国外试剂厂生产的化学试剂的规格趋向于按用途划分，常见的如下： 生化试剂（BC：Biochemical） 生物试剂（BR：Biological reagent） 生物染色剂（BS：Biological Stain） 络合滴定用（FCM：For Complexometry） 层析用（FCP：For chromatography purpose） 荧光分析（FIA） 微生物用（FMB） 显微镜用（FMP：For microscopic purpose） 合成用（FS：For synthesis） 气相色谱（GC：Gas chromatography） 高压液相色谱（HPLC：High Pressure Liquid chromatography） 指示剂（Ind：Indicator） 红外吸收（IR）
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
实验室药品的取用和溶液的配制 1 固体试剂的取用规则 （1）要用干净的药勺取用。用过的药勺必须洗净和擦干后才能再使用，以免沾污试剂。 （2）取用试剂后立即盖紧瓶盖。 （3）称量固体试剂时，必须注意不要取多，取多的药品，不能倒回原瓶。 2 液体试剂的取用规则 （1）从滴瓶中取液体试剂时，要用滴瓶中的滴管，滴管绝不能伸入所用的容器中，以免接触器壁而沾污药品。从试剂瓶中取少量液体试剂时，则需要专用滴管。装有药品的滴管不得横置或滴管口向上斜放，以免液体滴入滴管的胶皮帽中。 （2）使用胶头滴管“四不能”：不能伸入和接触容器内壁，不能平放和倒拿，不能随意放置，未清洗的滴管不能吸取别的试剂。 （3）配制一定物质的量溶液时，溶解或稀释后溶液应冷却再移入容量瓶。 （4）配制一定物质的量浓度溶液，要引流时，玻璃棒的上面不能靠在容量瓶口，而下端则应靠在容量瓶刻度线下的内壁上（即下靠上不靠，下端靠线下）。 （5）容量瓶不能长期存放溶液，更不能作为反应容器，也不能互用。（一般用于配制标准溶液的容量瓶最好专用） 3 溶液的配制 （1）配制溶质质量分数一定的溶液 计算：算出所需溶质和水的质量。把水的质量换算成体积。如溶质是液体时，要算出液体的体积。 称量：用天平称取固体溶质的质量；用量筒量取所需液体、水的体积。 溶解：将固体或液体溶质倒入烧杯里,加入所需的水,用玻璃棒搅拌使溶质完全溶解。（2）配制一定物质的量浓度的溶液 计算：算出固体溶质的质量或液体溶质的体积。 称量：用托盘天平称取固体溶质质量，用量筒量取所需液体溶质的体积。 溶解：将固体或液体溶质倒入烧杯中，加入适量的蒸馏水用玻璃棒搅拌使之溶解，冷却到室温后，将溶液引流注入容量瓶里。 转移：用适量蒸馏水将烧杯及玻璃棒洗涤2－3 次，将洗涤液注入容量瓶，振荡，使溶液混合均匀。
1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。 2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。 3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。 4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。 5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。 7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。 8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。 9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。 10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。
1、RT-PCR的基本原理 将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类 基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。 分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳 3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度 （1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。 (2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。
实验常用试剂、缓冲液的配制方法 Ampicillin（氨卡青霉素）100mg/ml □组份浓度100mg/ml Ampicillin □配制量50mL □配置方法 1.称量5g Ampicillin置于50mL离心管中。 2.加入40mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至50mL。 3.用0.22μm滤膜过滤除菌。 4.小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。 Kan（卡那霉素）50mg/ml □组分浓度50mg/ml卡那霉素 □配制量50mL □配制方法 1.称取2.5g卡那霉素置于50ml塑料离心管中。 2.加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至50mL。 3.用0.22μm 滤膜过滤除菌。 4.小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 24 mg/ml □组份浓度24mg/L IPTG □配制量50mL □配置方法 1.称量1.2gIPTG置于50mL离心管中。
2.加入40mL 灭菌水，充分混合溶解后，定容至50mL。 3.用0.22μm 滤膜过滤除菌。 4.小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。 X- Gal 20mg/m □组份浓度20mg/L X-Gal □配制量50mL □配置方法 1.称取1gX-Gal置于50mL离心管中。 2.加入40mL DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解， 定容至50mL。 3.小份分装（1mL/份）后，-20℃避光保存。 LB培养基 □组份浓度1％（W/V）Tryptone，0.5％（W/V）Yeast Extract，1％（W/V）NaCl □配制量1L □配置方法 1.称量下列试剂，置于1L烧杯中 Tryptone（胰化蛋白胨）10g Yeast Extract（酵母提取物）5g NaCl（氯化钠）10g 2.加入约800mL 的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5N NaOH（约0.2mL），调节pH值至7.2-7.3。
氨苄青霉素 ﹡组分浓度 100mg/ml 氨苄青霉素 ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 5g Ampicillin置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容至 50ml 。 3. 0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。卡那霉素 (可配 25mL ﹡组分浓度 50mg/ml卡那霉素 ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 2.5g 卡那霉素置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3. 0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。RNase A ﹡组分浓度 10mg/ml RNase A ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.取 0.5g RNase A置于 50ml 塑料离心管中。
2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3. 100℃煮沸 15min, 缓慢冷却至室温,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。IPTG ﹡组分浓度 24mg/ml IPTG ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 1.2g IPTG置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3.用0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。 X-Gal ﹡组分浓度 20mg/ml X-Gal ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 1g X-Gal置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40mlDMF (二甲基甲酰胺 ,充分混合溶解之后定容至 50ml 。 3.小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。 DTT ﹡组分浓度 1M DTT ﹡配制量 10ml
一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性， 须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇 至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。 25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。 1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。
常用试剂配方 1、1M pH8.5或pH8.0 Tris-HCl 1L：800ml H2O中加121.1g Tris，用HCl调pH 8.5定容至1升或用HCl调pH 8.0定容至1升，灭菌。 2、0.5M pH8.0 EDTA 1L：800ml H2O中加186.1g EDTANa2·2H2O，用NaOH调pH 8.0后定容至1升（在加有EDTA二钠盐的悬浊液中加入适量氢氧化钠，同时搅拌，直至溶液澄清，此时溶液pH约为8）。 3、20% SDS 2L：在2L热水中缓慢加入400g SDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存。 4、5M NaCl 1L：750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定容至1升，灭菌。 5、缓冲液“S” 100 mM Tris·Cl pH8.5 100 mM NaCl 50 mM EDTA pH8.0 2% SDS 6、10xTE 1L：800ml H2O 中加12.11g Tris，3.72 gEDTANa2 ·2H2O，用HCl调pH 8.0，定容，灭菌。 7、50xTAE 1L：500ml H2O 中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M pH8.0 EDTA和57.1ml冰乙酸，定容。 8、蛋白酶K溶液 用20mM pH8.0Tris·Cl，2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10μg/μl的蛋白酶K溶液或用超纯水配制成相同的浓度。 9、RNAase 用水溶解RNAase，终浓度为10mg/ml，煮沸20min，缓慢冷却，分装，-20℃下保存。 10、3M pH5.2 NaAc 1L：600ml H2O 中加408.24g NaAc·3H2O, 溶解后, 用冰乙酸调pH 5.2，定容灭菌。 11、5M KAc 1L：600ml H2O 中加490.8g KAc·3H2O, 溶解后, 定容灭菌。 12、Loadind-Buffer（琼脂糖电泳） 200ml：100ml H2O 中加80g蔗糖和0.5g溴酚蓝，定容，分装后4℃保存。 13、Bind-Silence配制 500ml 无水乙醇加2ml Bind-Silence原液。 14、Repel配制 500ml 三氯甲烷加10ml 硅烷化试剂。 15、PCR引物配制 引物粉剂5000rpm/min离心1min，1OD值加50μl超纯水，2OD值加100μl超纯水；混匀离心配成原液，-20℃保存，使用时原液稀释10倍（RAPD原液10μl，超纯水90μl；STS或SSR上下引物原液各10μl，超纯水180μl）。 16、EB配制 100mg EB加超纯水10ml溶解。 17、APS配制 APS（过硫酸铵）10g加水定容至100ml。 18、氯仿︰异戊醇（24︰1）、氯仿︰异戊醇︰酚（24︰1︰25）配制 480ml氯仿中加异戊醇20ml配成氯仿异戊醇；氯仿异戊醇与Tris饱和重蒸酚等体积混合配成酚氯仿。 19、2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%